Oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł przez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji

Metoda ta pozwala na wytworzenie czystej tubuliny zdolnej do składania z określonymi modyfikacjami potranslacyjnymi w ilościach wystarczających do przeprowadzenia całych zestawów eksperymentów in vitro. Ten protokół oparty na cyklach polimeryzacji i depolimeryzacji tubuliny jest łatwy do wykonania w każdym laboratorium biologii komórki. Pozwala to na wygenerowanie dużych ilości tubuliny przy bardzo krótkim czasie pracy.

Aby oczyścić tubulinę z kultur zawiesinowych, dziewięć dni przed przygotowaniem tubuliny, ożywić i amplifikować pożądany typ komórek, aby uzyskać sześć zlejących się 15-centymetrowych szalek. Osiem dni przed przygotowaniem tubuliny dodaj jeden litr wstępnie podgrzanej pożywki do każdej butelki z przędzarką na naczynie pod szafką do hodowli komórkowych i umieść wirówki na stole do mieszania wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych. Pozostaw boczne nasadki przędzalni lekko otwarte, aby umożliwić zrównoważenie podłoża z atmosferą inkubatora.

Następnego dnia użyj komórek z naczyń zlewających się do zaszczepienia butelek z przędzalnią. Umieść butelki z przędzarką w inkubatorze na tydzień z lekko otwartymi zaworami bocznymi. Aby zebrać komórki, przenieś kultury z butelek wirujących do jednolitrowych butelek wirówek i zbierz komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić każdą granulkę w 10 mililitrach lodowatego PBS i zebrać zawieszone komórki w 50-mililitrowej probówce do odwirowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przypadku 10-mililitrowego granulatu komórkowego dodaj 10 mililitrów buforu do lizy do osadu i kilkakrotnie odwróć rurkę, aby ponownie zawiesić ogniwa. Aby oczyścić tubulinę z przylegających kultur komórkowych, ożywić i amplifikować pożądany typ komórek, aby uzyskać 10 zlewających się 15-centymetrowych szalek w dniu przygotowania tubuliny.

Aby zebrać przylegające komórki, traktując trzy szalki na raz, przechyl szalki hodowlane, aby usunąć pożywkę, podczas gdy druga osoba delikatnie myje komórki siedmiomililitrami PBS-EDTA. Po umyciu druga osoba powinna potraktować komórki pięcioma mililitrami PBS-EDTA na naczynie, zanim trzecia osoba użyje podnośnika komórkowego, aby delikatnie popchnąć komórki do jednej krawędzi naczynia. Po odłączeniu komórek połącz komórki ze wszystkich trzech naczyń w 50-mililitrowej probówce na lodzie i przepłucz każdą płytkę dodatkowymi dwoma mililitrami PBS-EDTA, aby zebrać pozostałe komórki.

Po zebraniu komórek przez odwirowanie należy odrzucić supernatant w celu określenia objętości osadu komórkowego. Dodaj bufor do lizy, ponownie zawieś komórki i przenieś je do 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem. Sonikuj komórki przez około 45 impulsów.

W przypadku lizy mózgu myszy dodaj 500 mikrolitrów licencjonowanego buforu do pojedynczego mózgu pobranego od dorosłej myszy i użyj blendera do tkanek do lizy tkanki. Po uzyskaniu lizatu w ilości 1/100 jego objętości do równej objętości 2X buforu Laemmli i gotować roztwór przez pięć minut. Przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu oznaczania ilościowego.

Pobieraj próbkę w ten sposób na każdym etapie przygotowania tubuliny. Aby sklarować lizat, odwirować próbkę i użyć długiej igły, aby ostrożnie przenieść klarowny supernatant do nowej probówki, uważając, aby uniknąć górnej warstwy pływającej. Po klarowaniu lizatu konieczne jest usunięcie materiału unoszącego się w supernatancie, w przeciwnym razie może to negatywnie wpłynąć na skuteczność oczyszczania tubuliny.

Aby spolimeryzować tubulinę z oczyszczonego lizatu, należy wymieszać całą objętość supernatantu z 1/200 objętości 0,2 molowego GTP i połową objętości ciepłego glicerolu w probówce o odpowiedniej wielkości. Delikatnie odpipetować mieszaninę, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Uszczelnij probówki parafilmem i umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 30 stopni Celsjusza na 20 minut.

Po odwirowaniu przenieść supernatant do nowej probówki. Aby zdepolimeryzować mikrotubule obecne w pastylce drugiej, ponownie zawieś osad w lodowatym BRB 80 na pięć minut na lodzie. Odpipetować próbkę najpierw pipetą P1000, a następnie pipetą P200, co pięć minut przez 20 minut na lodzie.

Gdy próbka jest jednorodna, należy ją odwirować i przenieść otrzymany supernatant do nowej probówki. Aby usunąć białka związane z mikrotubulami z tubuliny, należy wymieszać całą objętość supernatantu trzy z równą objętością podgrzanej jednej rurki molowej S, tą samą objętością podgrzanego glicerolu i 1/100 objętości 0,2 mola GTP. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza przed odwirowaniem.

Przenieś związany z mikrotubulami supernatant cztery zawierający białko do nowej probówki, osad zawiera spolimeryzowane mikrotubule. Po wykonaniu trzeciej polimeryzacji i depolimeryzacji, ilość zebranej tubuliny można określić ilościowo za pomocą analizy strony SDS. Powodzenie procesu oczyszczania można potwierdzić na stronie karty charakterystyki barwionej Coomassie.

Niższa niż oczekiwano wydajność oczyszczonej tubuliny może wynikać z nieefektywnej polimeryzacji tubuliny, o czym świadczy mniejsza ilość tubuliny w drugiej, czwartej i szóstej frakcji osadu oraz wyższa ilość w drugiej, czwartej i szóstej frakcji supernatantu. Aby określić ilościowo oczyszczoną tubulinę, próbki można badać obok znanych ilości albuminy surowicy bydlęcej. Ilościowa densytometria prążków białkowych pozwala następnie na obliczenie ilości oczyszczonej tubuliny.

Status modyfikacji tubuliny można potwierdzić za pomocą analizy immunoblot próbek. Nasz protokół pozwala na izolację tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi. Dzięki tej tubulinie możemy przeprowadzić eksperymenty rekonstytucji in vitro, które pozwolą nam określić wpływ modyfikacji tubuliny na właściwości mikrojajowodów, a także na ich interakcje z białkami związanymi z mikrotubulami.