Name: Oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł przez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Naucz się oczyszczania tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi metodą cykli polimeryzacji-depolimeryzacji. Protokół ten umożliwia uzyskanie czystego białka do badań dynamiki mikrotubuli in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 oraz Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ jest wspierany przez Instytut Curie, Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) przyznaje nagrody ANR-12-BSV2-0007 i ANR-17-CE13-0021, grant Institut National du Cancer (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1 oraz grant Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) DEQ20170336756. MMM jest wspierany przez Fondation Vaincre Alzheimer grant FR-16055p oraz przez France Alzheimer Grant AAP SM 2019 n°2023. JAS był wspierany przez program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji nr 675737 w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie" oraz grant w ramach FRM FDT201904008210. SB otrzymał wsparcie z grantu FRM FDT201805005465.
Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Janke, w szczególności J. Souphronowi, a także G. Lakisicowi (Institut MICALIS, AgroParisTech) i A. Gautreau (Ecole Polytechnique) za pomoc podczas tworzenia protokołu. Chcielibyśmy podziękować zwierzętom Instytutu Curie za pomoc w hodowli i opiece nad myszami.
Przeciwciało 12G10, opracowane przez J. Frankela i M. Nelsona, zostało uzyskane z Developmental Studies Hybridoma Bank, opracowanego pod auspicjami NICHD i utrzymywanego przez University of Iowa.

<ol><li>Verhey, K. J., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The tubulin code.</a> Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).</li>
<li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%3A+Molecular+components%2C+readout+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li>
<li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li>
<li>Margolis, R. L., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+end+assembly+and+disassembly+of+microtubules+at+steady+state+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro.</a> Cell. 13 (1), 1-8 (1978).</li>
<li>Borisy, G. G., Olmsted, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleated+assembly+of+microtubules+in+porcine+brain+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts.</a> Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).</li>
<li>Kirschner, M. W., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+microtubule+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Supramolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The mechanism of microtubule assembly in vitro.</a> Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).</li>
<li>Baas, P. W., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooks+and+comets%3A+The+story+of+microtubule+polarity+orientation+in+the+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron.</a> Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).</li>
<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li>
<li>Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li>
<li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li>
<li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li>
<li>Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+the+motility+of+isolated+intracellular+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes.</a> Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).</li>
<li>Dogterom, M., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization in vitro.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).</li>
<li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+assembly+purification+of+microtubules+without+assembly-promoting+agents+and+further+purification+of+tubulin%2C+microtubule-associated+proteins%2C+and+MAP+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments.</a> Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Widlund, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+assembly-competent+tubulin+from+diverse+eukaryotic+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Uchimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flipped+ion+pair+at+the+dynein-microtubule+interface+is+critical+for+dynein+motility+and+ATPase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).</li>
<li>Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structured+core+of+human+beta+tubulin+confers+isotype-specific+polymerization+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties.</a> Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).</li>
<li>Vemu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+single-isoform+recombinant+neuronal+Human+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).</li>
<li>Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta-tubulin+isotypes+can+regulate+microtubule+protofilament+number+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability.</a> Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).</li>
<li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).</li>
<li>Barisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+detyrosination+guides+chromosomes+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis.</a> Science. 348 (6236), 799-803 (2015).</li>
<li>Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tubulin+tyrosination+and+CLIP-170+phosphorylation+regulate+the+initiation+of+dynein-driven+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons.</a> Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).</li>
<li>Guedes-Dias, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+responds+to+local+microtubule+dynamics+to+target+synaptic+cargo+delivery+to+the+presynapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse.</a> Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+dynamic+protein+interactions+involving+human+microtubules+using+solid-state+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 18(2020).</li>
<li>Even, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAT1-enriched+vesicles+promote+microtubule+acetylation+via+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport.</a> Science Advances. 5 (12), 2705(2019).</li>
<li>Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation+selective+promotion+of+tubulin+polymerization+by+alkali+metal+chlorides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides.</a> Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).</li>
<li>Magiera, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+tubulin+polyglutamylation+causes+neurodegeneration+and+perturbs+neuronal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport.</a> EMBO Journal. 37 (23), 100440(2018).</li>
<li>Lacroix, B., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+differentially+polyglutamylated+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of differentially polyglutamylated microtubules.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Magiera, M. M., Janke, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagiera%2C+MM+%22Methods+in+Cell+Biology+Vol.+115+Microtubules%2C+in+vitro%22">Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro</a>. Correia, J. J., Wilson, L. , Academic Press. 247-267 (2013).</li>
<li>Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-+and+beta-tubulin+isotypes+are+differentially+expressed+during+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li>
<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylase+enzymes+are+members+of+the+TTL+domain+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family.</a> Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).</li>
<li>Newton, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+slow+dynamic+instability+of+HeLa+cell+microtubules+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).</li>
<li>Belvindrah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+alpha-tubulin+Tuba1a+leads+to+straighter+microtubules+and+perturbs+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration.</a> Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).</li>
<li>Breuss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+murine+homologue+of+TUBB5+cause+microcephaly+by+perturbing+cell+cycle+progression+and+inducing+p53+associated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis.</a> Development. , (2016).</li>
<li>Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal-specific+TUBB3+is+not+required+for+normal+neuronal+function+but+is+essential+for+timely+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration.</a> Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).</li>
<li>Morley, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylated+tubulin+is+essential+for+touch+sensation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice.</a> Elife. 5, (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda zapewnia platformę do szybkiego generowania wysokiej jakości, kompetentnej do składania tubuliny w średnich i dużych ilościach z linii komórkowych i pojedynczych mózgów myszy. Opiera się na złotym standardzie oczyszczania tubuliny z mózgów bydlęcych, stosowanym w tej dziedzinie od wielu lat 16,17. Szczególną zaletą tego podejścia jest wykorzystanie kultur zawiesinowych komórek HeLa S3, które po ustaleniu dają duże ilości komórek, a jednocześn...

Mikrotubule odgrywają kluczową rolę w wielu procesach komórkowych. Nadają komórkom ich kształt, budują wrzeciona mejotyczne i mitotyczne do segregacji chromosomów i służą jako ścieżki transportu wewnątrzkomórkowego. Aby pełnić te różnorodne funkcje, mikrotubule organizują się na różne sposoby. Jednym z intrygujących pytań w tej dziedzinie jest zrozumienie mechanizmów molekularnych, które pozwalają strukturalnie i ewolucyjnie zachowanym mikrotubulom przystosować się do tej mnogości organizacji i funkcji. Jednym z potencjalnych mechanizmów jest dywersyfikacja mikrotubul, która jest zdefiniowana przez koncepcję znaną jako "kod tubuliny"1,2,3. Kod tubuliny obejmuje dwa główne składniki: różnicową inkorporację produktów genów α- i β-tubuliny (izotypów tubuliny) do mikrotubul oraz modyfikacje potranslacyjne tubuliny (PTM).
Od lat siedemdziesiątych, eksperymenty z rekonstytucją in vitro, w połączeniu z rozwijającymi się technikami mikroskopii świetlnej, utorowały drogę do ważnych odkryć dotyczących właściwości mikrotubul: dynamicznej niestabilności4 i bieżnia5, oraz ich inne mechanizmy i funkcje6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Prawie wszystkie przeprowadzone do tej pory eksperymenty in vitro opierały się na tubulinie oczyszczonej z tkanki mózgowej za pomocą powtarzających się cykli polimeryzacji i depolimeryzacji16,17. Chociaż oczyszczanie z tkanki mózgowej ma tę zaletę, że pozwala uzyskać wysokiej jakości tubulinę w dużych ilościach (zwykle w gramach), jedną z ważnych wad jest niejednorodność, ponieważ tubulina oczyszczona z tkanki mózgowej jest mieszaniną różnych izotypów tubuliny i jest wzbogacona o wiele tubulinowych PTM. Ta niejednorodność uniemożliwia określenie roli konkretnego tubuliny PTM lub izotypu w kontroli właściwości i funkcji mikrotubul. W związku z tym wytwarzanie tubuliny kompetentnej do składania z kontrolowanymi tubulinami PTM i jednorodnym składem izotypu jest niezbędne do zajęcia się mechanizmami molekularnymi kodu tubuliny.
Ostatnio opracowano metodę oczyszczania tubuliny metodą chromatografii powinowactwa przy użyciu domeny TOG (gen z nadekspresją nowotworu) wiążącej mikrotubule drożdży Stu2p18. W tej metodzie tubulina w surowych lizatach komórek lub tkanek przepuszczana jest przez kolumnę, w której wiąże się z unieruchomioną matrycowo domeną TOG, co pozwala na analizę całej puli tubuliny w danej, nawet bardzo małej, próbce. W ostatnich latach opisano również długo oczekiwane podejście do oczyszczania rekombinowanej tubuliny. Opiera się na systemie bakulowirusowym, w którym wektor bi-cistroniczny zawierający geny α- i β-tubuliny ulega ekspresji w komórkach owadów19. Metoda ta jest jednak bardzo kłopotliwa i czasochłonna, dlatego jest najczęściej stosowana do badania wpływu mutacji tubuliny20 i izotypów tubuliny21,22,23 in vitro.
W obecnym protokole opisujemy metodę, która wykorzystuje dobrze znane i szeroko stosowane podejście do polimeryzacji i depolimeryzacji jako plan generowania tubuliny o różnych poziomach modyfikacji, zarówno z linii komórkowych, jak i z tkanki mózgowej myszy24. W tej procedurze tubulina jest cyklicznie przenoszona między formą rozpuszczalną (dimer tubuliny w temperaturze 4 °C) a formą spolimeryzowaną (mikrotubula w temperaturze 30 °C w obecności 5'-trifosforanu guanozyny [GTP]). Każda forma jest rozdzielana w kolejnych etapach wirowania: dimery tubuliny pozostaną w supernatancie po zimnym (4 °C) wirowaniu, podczas gdy mikrotubule zostaną ogranulowane w temperaturze 30 °C. Ponadto jeden etap polimeryzacji przeprowadza się przy wysokim stężeniu piperazyno-N,N′-bis(kwas 2-etanosulfonowy) (PIPES), co pozwala na usunięcie białek związanych z mikrotubulami z mikrotubul, a tym samym z ostatecznie oczyszczonej tubuliny. Tubulina oczyszczona z komórek HeLa S3 wyhodowanych jako zawiesina lub kultury przylegające jest praktycznie wolna od jakiegokolwiek tubuliny PTM i została wykorzystana w ostatnich eksperymentach rekonstytucji in vitro25,26,27,28. Dalej dostosowaliśmy metodę oczyszczania tubuliny z pojedynczych mózgów myszy, która może być stosowana w przypadku dużej liczby modeli myszy ze zmianami w izotypach tubuliny i PTM.
W protokole najpierw opisujemy wytwarzanie materiału źródłowego (masa komórkowa lub tkanka mózgowa), jego lizę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), a następnie kolejne etapy polimeryzacji i depolimeryzacji tubuliny w celu oczyszczenia tubuliny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Dalej opisujemy proces oceny czystości (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A,B) i ilość (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A,B) oczyszczonej tubuliny. Metodę można dostosować do produkcji tubuliny wzbogaconej o wybrany PTM poprzez nadekspresję enzymu modyfikującego w komórkach przed oczyszczaniem tubuliny (<klasa silna = "xfig" >Figura 4B). Alternatywnie, enzymy modyfikujące tubulinę mogą być dodawane do tubuliny podczas procesu oczyszczania. Wreszcie, możemy oczyścić tubulinę pozbawioną określonych izotypów lub PTM z mózgów myszy z niedoborem odpowiednich enzymów modyfikujących tubulinę (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B) < klasa sup = "xref">29.
Metoda, którą tutaj opisujemy, ma dwie główne zalety: (i) pozwala na produkcję wystarczająco dużych ilości tubuliny w stosunkowo krótkim czasie, oraz (ii) generuje wysokiej jakości, czystą tubulinę, o specyficznym składzie izotypu tubuliny lub PTM. W filmie dołączonym do tego manuskryptu podkreślamy niektóre z kluczowych kroków związanych z tą procedurą.

<table><tbody><tr><td>1&nbsp; M MgCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M1028</td><td></td></tr><tr><td>1-L naczynia do hodowli komórkowych</td><td>Techne F7610&nbsp;</td><td></td><td>Używany do kultur przędzarki. Nigdy nie mieszaj pustych butelek po przędzarce. Gdy butelki z przędzarką znajdują się w inkubatorze do hodowli komórkowych, należy zawsze trzymać boczne zawory butelek z przędzarką lekko otwarte, aby ułatwić zrównoważenie pożywki z inkubatorem" s atmosfera. Po użyciu należy natychmiast napełnić butelki z przędzarką wodą z kranu, aby uniknąć wysuszenia pozostałych komórek na ściankach butelki. Umyj butelki wodą dejonizowaną, dodaj około 200 ml wody dejonizowanej i przeprowadź autoklaw. Pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych usuń wodę i pozostaw butelki do całkowitego wyschnięcia, nadal pod kapturem, przez kilka godzin. Nigdy nie używaj detergentów do czyszczenia butelek z przędzarką, ponieważ wszelkie śladowe ilości detergentu mogą być szkodliwe dla komórek.</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 i 2 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>okrągłodenne 14 ml Sterylne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki</td><td></td><td></td><td></td>hodowlane o średnicy</tr><tr><td>15 cm Probówki z nakrętką 15 ml</td> 2-merkaptoetanol<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#M3148</td><td>2-merkaptoetanol jest toksyczny i powinien być stosowany pod maską.</td></tr><tr><td>Fluorek 4-(2-aminoetylo)-benzenosulfonylu&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A8456</tr><tr><td>40% akrylamid&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 5-, 10-20-ml Sterylne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipety 5-, 10-ml, 25-ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr> z <tr><td>nakrętką 50 ml Nadsiarczan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amonu (APS)</td><td>Sigma</td><td>#A3678</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-alfa-tubulinowe, 12G10&nbsp;</td><td>Opracowany przez J. Frankela i M. Nelsona, uzyskany z Developmental Studies Hybridoma Bank, opracowany pod auspicjami NICHD i utrzymywany przez University of Iowa</td><td></td><td>Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko glutamylowanej tubulinie, GT335&nbsp;</td><td>AdipoGen&nbsp;</td><td>#AG-20B-0020</td><td>rozcieńczenie: 1/20 000</td></tr><tr><td>Aprotynina&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A1153</tr><tr><td>Balance (0,1 &ndash; 10 g)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelki polipropylenowe Beckman 1 l&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Do zbierania kultur przędzarkowych</td></tr><tr><td>Wirówka Beckman Avanti J-26 XP Do</td><td></td><td></td><td>zbierania kultur przędzarki</td></tr><tr><td>Mieszadło biologiczne&nbsp;</td><td>Techne MCS-104L&nbsp;</td><td></td><td>Zainstalowany w inkubatorze do hodowli komórkowych (do hodowli spinnerowych), 25 obr./min dla komórek Hela S3 i HEK 293</td></tr><tr><td>Bis N,N'-Metyleno-Bis-Akrylamid&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>#161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Blender IKA Ultra-Turrax&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Do lizy tkanki mózgowej należy użyć sondy 5 mm, z maszyną ustawioną na moc 6 lub 7. Zmiksuj tkankę mózgową 2-3 razy przez 15 s na lodzie.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A7906</tr><tr><td>Błękit bromofenolowy&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#1.08122</td><td></td></tr><tr><td>Karboksypeptydaza A (CPA)</td><td>Sigma</td><td>#C9268</td><td>Stężenie: 1.7&nbsp; U/&mikro; l</td></tr><tr>Kaptur <td></td><td></td><td></td><td>do hodowli</td></tr><tr><td>komórkowych Inkubator do hodowli komórkowych ustawiony na 37&deg; C, 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>&nbsp; Sigma&nbsp;</td><td>#D8418</td><td>DMSO może zwiększyć przepuszczalność komórek i skóry dla innych związków. Unikać kontaktu i stosować ochronę skóry i oczu.</td></tr><tr><td>DMEM średnie&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>#41965062</td><td></td></tr><tr><td>naziemna telewizja cyfrowa, DL-Dithiothreitol&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#D9779</tr><tr><td>EDTA</td><td>Euromedex</td><td>#EU0007-C</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#E3889</tr><tr><td>Absolutny etanol&nbsp;</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>#E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#F7524</tr><tr><td>Francuska prasa ciśnieniowa&nbsp;</td><td>Thermo electron corporation</td><td>&nbsp;#FA-078A</td><td>z ogniwem #FA-032; do lizy dużych ilości komórek. Ustawione na średni stosunek, a ciśnienie manometryczne wynosi 1,000 psi (odpowiada 3,000 psi wewnątrz komory rozrywającej).</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>&nbsp; Chemikalia VWR&nbsp;</td><td>#24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>#G8898</td><td></td></tr><tr><td>GTP&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#G8877</tr><tr><td>Blok grzewczy&nbsp;</td><td>Stuart&nbsp;</td><td></td><td></td>#SBH130D</tr><tr><td>Komórki Hela&nbsp;</td><td></td><td>ATCC&reg; CCL-2 i handel;</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa Hela S3&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CCL-2.2 i handel;</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td> <td>VWR</td><td>#20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Z fluorescencją, jeśli ma być zweryfikowana transfekcja komórek</td></tr><tr><td>Izopropanol&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>#20842.298</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus&nbsp;</td><td>#101</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik JLA-8.1000&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Do zbierania kultur przędzalniczych</td></tr><tr><td>KOH&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#P1767</td><td>KOH jest i powoduje oparzenia; należy stosować ochronę oczu i skóry.</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>#25030123</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna do probówek 50 ml</td><td>Sigma</td><td>4-16 K&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#L2884</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety p2.5, p10, p20, p100, p200 i p1000 oraz odpowiadające im końcówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotłuczki</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120.973</td><td></td></tr><tr><td>Tkanka mózgowa myszy&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Opieka nad zwierzętami i ich użytkowanie w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Wspólnoty Europejskiej (2010/63/UE). Procedury eksperymentalne zostały specjalnie zatwierdzone przez komisję etyczną Instytutu Curie CEEA-IC #118 (autoryzacja nr 04395.03 wydana przez władze krajowe) zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi.</td></tr><tr><td>Igły 18G x 1 i frac12; &rdquo; (1,2 x 38 mm</td><td>Terumo</td><td>#18G</td><td></td></tr><tr><td>Igły 20G x 1 i frac12; &rdquo; (0,9 x 38 mm</td><td>Terumo</td><td>#20G</td><td></td></tr><tr><td>Igły 21G x 4 i frac34; &rdquo; (0,8 x 120 mm</td><td>B.Braun</td><td>#466 5643</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>#14190169</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>#15140130</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#P7626</td><td>proszku PMSF jest niebezpieczny. Podczas przygotowywania roztworów PMSF należy stosować ochronę skóry i oczu.</td></tr><tr><td>RURY&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#P6757</tr><tr><td>Rotory do pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; i TLA 55</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE sprzęt do elektroforezy&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>#1658001FC</tr><tr><td>SDS, Dodecylosiarczan sodu&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>#442444H</td><td>Do przygotowania bufora Laemmeli&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS, Dodecylosiarczan sodu&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#L5750</td><td>Do przygotowania żeli "TUB" SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sonicator&nbsp;</td><td>Branson</td><td>#101-148-070</td><td>Służy do lizy komórek hodowanych jako kultury przylegające. Użyj sondy o średnicy 6.5 mm, ustaw sonikator na " Sterowanie wyjściem" 1, " Cykl pracy" 10% i czas w zależności od użytego typu ogniwa.</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa do probówek 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEMED, N, N, N&prime;, N&prime;-Tetrametyloetylenodiamina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#9281</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatyna A (TSA)</td><td>Sigma</td><td>#T8552</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#T9284</tr><tr><td>Podstawa Trizma (Tris)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#T1503</tr><tr><td>Trypsyna&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>#15090046</td><td></td></tr><tr><td>Wirniki ultrawirówek&nbsp;</td><td></td><td>Wirniki TLA-55, TLA-100.3 i 70.1 Ti</td><td>Ustawione na 4& C lub 30&deg; C w oparciu o potrzeby eksperymentu&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek&nbsp;</td><td>Beckman</td><td>#357448&nbsp;</td><td>do stosowania z wirnikiem TLA-55</td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek&nbsp;</td><td>Beckman</td><td>#349622</td> do stosowania z probówkami ultrawirówkowymi <td>z wirnikiem TLA-100.3</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman</td><td>#355631&nbsp;</td><td>do stosowania z wirnikiem 70.1 Ti</td></tr><tr><td>Ultrawirówki</td><td>Beckman</td><td>Optima L80-XP (lub odpowiednik) i Optima MAX-XP (lub odpowiednik)</td> <td>Ustawione na 4&deg; C lub 30&deg; C w oparciu o potrzeby eksperymentu&nbsp;</td></tr><tr><td>Mieszacz</td><td></td><td></td><td></td>Vortex</tr><tr><td>Łaźnia wodna wyposażona w pływaki lub uchwyty</td><td></td><td></td> na rurki <td>Zestaw na 30&deg; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł przez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Jednym ważnym aspektem badań nad cytoszkieletem mikrotubul jest badanie zachowania mikrotubul w eksperymentach rekonstytucji in vitro. Umożliwiają one analizę wewnętrznych właściwości mikrotubul, takich jak dynamika, oraz ich interakcji z białkami związanymi z mikrotubulami (MAP). "Kod tubuliny" to pojawiająca się koncepcja, która wskazuje na różne izotypy tubuliny i różne modyfikacje potranslacyjne (PTM) jako regulatory właściwości i funkcji mikrotubul. Aby zbadać mechanizmy molekularne kodu tubuliny, kluczowe znaczenie ma przeprowadzenie eksperymentów rekonstytucji in vitro z użyciem oczyszczonej tubuliny o określonych izotypach i PTM.
Do tej pory było to technicznie trudne, ponieważ tubulina mózgowa, która jest szeroko stosowana w eksperymentach in vitro, zawiera wiele PTM i ma określony skład izotypowy. W związku z tym opracowaliśmy ten protokół oczyszczania tubuliny z różnych źródeł i o różnym składzie izotypowym oraz kontrolowanych PTM, przy użyciu klasycznego podejścia cykli polimeryzacji i depolimeryzacji. W porównaniu z istniejącymi metodami opartymi na oczyszczaniu z powinowactwem, podejście to daje czystą, zdolną do polimeryzacji tubulinę, ponieważ tubulina odporna na polimeryzację lub depolimeryzację jest odrzucana podczas kolejnych etapów oczyszczania.
Opisujemy oczyszczanie tubuliny z linii komórkowych, hodowanych w zawiesinie lub jako kultury przylegające, oraz z pojedynczych mózgów myszy. Metoda najpierw opisuje wytwarzanie masy komórkowej zarówno w zawiesinie, jak i w warunkach przylegania, etap lizy, a następnie kolejne etapy oczyszczania tubuliny przez cykle polimeryzacji i depolimeryzacji. Nasza metoda pozwala uzyskać tubulinę, która może być wykorzystana w eksperymentach dotyczących wpływu kodu tubuliny na wewnętrzne właściwości mikrotubul i interakcji mikrotubul z powiązanymi białkami.

Głównym celem tej metody jest otrzymanie wysokiej jakości tubuliny zdolnej do polimeryzacji w ilościach wystarczających do przeprowadzenia powtarzalnych eksperymentów in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników. Mikrotubule zmontowane z tej tubuliny mogą być wykorzystywane w testach rekonstrukcyjnych opartych na technice mikroskopii fluorescencyjnej z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRF) z użyciem mikrotubul dynamicznych lub stabilnych, w eksperymentach badających dynamikę mikrotubul, oddziaływania z białkami MAP...

Ten protokół opisuje oczyszczanie tubuliny z małych/średnich źródeł, takich jak hodowane komórki lub pojedyncze mózgi myszy, przy użyciu cykli polimeryzacji i depolimeryzacji. Oczyszczona tubulina jest wzbogacona w określone izotypy lub ma specyficzne modyfikacje potranslacyjne i może być stosowana w testach rekonstytucji in vitro do badania dynamiki i interakcji mikrotubul.

Oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł przez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Metoda ta pozwala na wytworzenie czystej tubuliny zdolnej do składania z określonymi modyfikacjami potranslacyjnymi w ilościach wystarczających do przeprowadzenia całych zestawów eksperymentów in vitro. Ten protokół oparty na cyklach polimeryzacji i depolimeryzacji tubuliny jest łatwy do wykonania w każdym laboratorium biologii komórki. Pozwala to na wygenerowanie dużych ilości tubuliny przy bardzo krótkim czasie pracy.Aby oczyścić tubulinę z kultur zawiesinowych, dziewięć dni przed przygotowaniem tubuliny, ożywić i amplifikować pożądany typ komórek, aby uzyskać sześć zlejących się 15-centymetrowych szalek. Osiem dni przed przygotowaniem tubuliny dodaj jeden litr wstępnie podgrzanej pożywki do każdej butelki z przędzarką na naczynie pod szafką do hodowli komórkowych i umieść wirówki na stole do mieszania wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych. Pozostaw boczne nasadki przędzalni lekko otwarte, aby umożliwić zrównoważenie podłoża z atmosferą inkubatora.Następnego dnia użyj komórek z naczyń zlewających się do zaszczepienia butelek z przędzalnią. Umieść butelki z przędzarką w inkubatorze na tydzień z lekko otwartymi zaworami bocznymi. Aby zebrać komórki, przenieś kultury z butelek wirujących do jednolitrowych butelek wirówek i zbierz komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić każdą granulkę w 10 mililitrach lodowatego PBS i zebrać zawieszone komórki w 50-mililitrowej probówce do odwirowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przypadku 10-mililitrowego granulatu komórkowego dodaj 10 mililitrów buforu do lizy do osadu i kilkakrotnie odwróć rurkę, aby ponownie zawiesić ogniwa. Aby oczyścić tubulinę z przylegających kultur komórkowych, ożywić i amplifikować pożądany typ komórek, aby uzyskać 10 zlewających się 15-centymetrowych szalek w dniu przygotowania tubuliny.Aby zebrać przylegające komórki, traktując trzy szalki na raz, przechyl szalki hodowlane, aby usunąć pożywkę, podczas gdy druga osoba delikatnie myje komórki siedmiomililitrami PBS-EDTA. Po umyciu druga osoba powinna potraktować komórki pięcioma mililitrami PBS-EDTA na naczynie, zanim trzecia osoba użyje podnośnika komórkowego, aby delikatnie popchnąć komórki do jednej krawędzi naczynia. Po odłączeniu komórek połącz komórki ze wszystkich trzech naczyń w 50-mililitrowej probówce na lodzie i przepłucz każdą płytkę dodatkowymi dwoma mililitrami PBS-EDTA, aby zebrać pozostałe komórki.Po zebraniu komórek przez odwirowanie należy odrzucić supernatant w celu określenia objętości osadu komórkowego. Dodaj bufor do lizy, ponownie zawieś komórki i przenieś je do 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem. Sonikuj komórki przez około 45 impulsów.W przypadku lizy mózgu myszy dodaj 500 mikrolitrów licencjonowanego buforu do pojedynczego mózgu pobranego od dorosłej myszy i użyj blendera do tkanek do lizy tkanki. Po uzyskaniu lizatu w ilości 1/100 jego objętości do równej objętości 2X buforu Laemmli i gotować roztwór przez pięć minut. Przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu oznaczania ilościowego.Pobieraj próbkę w ten sposób na każdym etapie przygotowania tubuliny. Aby sklarować lizat, odwirować próbkę i użyć długiej igły, aby ostrożnie przenieść klarowny supernatant do nowej probówki, uważając, aby uniknąć górnej warstwy pływającej. Po klarowaniu lizatu konieczne jest usunięcie materiału unoszącego się w supernatancie, w przeciwnym razie może to negatywnie wpłynąć na skuteczność oczyszczania tubuliny.Aby spolimeryzować tubulinę z oczyszczonego lizatu, należy wymieszać całą objętość supernatantu z 1/200 objętości 0,2 molowego GTP i połową objętości ciepłego glicerolu w probówce o odpowiedniej wielkości. Delikatnie odpipetować mieszaninę, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Uszczelnij probówki parafilmem i umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 30 stopni Celsjusza na 20 minut.Po odwirowaniu przenieść supernatant do nowej probówki. Aby zdepolimeryzować mikrotubule obecne w pastylce drugiej, ponownie zawieś osad w lodowatym BRB 80 na pięć minut na lodzie. Odpipetować próbkę najpierw pipetą P1000, a następnie pipetą P200, co pięć minut przez 20 minut na lodzie.Gdy próbka jest jednorodna, należy ją odwirować i przenieść otrzymany supernatant do nowej probówki. Aby usunąć białka związane z mikrotubulami z tubuliny, należy wymieszać całą objętość supernatantu trzy z równą objętością podgrzanej jednej rurki molowej S, tą samą objętością podgrzanego glicerolu i 1/100 objętości 0,2 mola GTP. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza przed odwirowaniem.Przenieś związany z mikrotubulami supernatant cztery zawierający białko do nowej probówki, osad zawiera spolimeryzowane mikrotubule. Po wykonaniu trzeciej polimeryzacji i depolimeryzacji, ilość zebranej tubuliny można określić ilościowo za pomocą analizy strony SDS. Powodzenie procesu oczyszczania można potwierdzić na stronie karty charakterystyki barwionej Coomassie.Niższa niż oczekiwano wydajność oczyszczonej tubuliny może wynikać z nieefektywnej polimeryzacji tubuliny, o czym świadczy mniejsza ilość tubuliny w drugiej, czwartej i szóstej frakcji osadu oraz wyższa ilość w drugiej, czwartej i szóstej frakcji supernatantu. Aby określić ilościowo oczyszczoną tubulinę, próbki można badać obok znanych ilości albuminy surowicy bydlęcej. Ilościowa densytometria prążków białkowych pozwala następnie na obliczenie ilości oczyszczonej tubuliny.Status modyfikacji tubuliny można potwierdzić za pomocą analizy immunoblot próbek. Nasz protokół pozwala na izolację tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi. Dzięki tej tubulinie możemy przeprowadzić eksperymenty rekonstytucji in vitro, które pozwolą nam określić wpływ modyfikacji tubuliny na właściwości mikrojajowodów, a także na ich interakcje z białkami związanymi z mikrotubulami.

purification-tubulin-with-controlled-posttranslational-modifications

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Celem tego protokołu jest tworzenie zespołów silników molekularnych na nanostrukturach origami DNA i obserwowanie ruchliwości zespołu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek

Celem tego protokołu jest wykorzystanie temperatury do kontrolowania prędkości przepływu trójwymiarowych płynów aktywnych. Zaletą tej metody jest nie tylko regulacja prędkości przepływu in situ, ale także dynamiczna kontrola, taka jak okresowe dostrajanie prędkości przepływu w górę i w dół.

Sterowanie prędkościami przepływu aktywnych płynów 3D na bazie mikrotubul za pomocą temperatury

Mikrotubule, które są polimerami tubuliny, odgrywają kluczową rolę jako składnik cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych i są znane ze swojej dynamicznej niestabilności. W badaniu tym opracowano metodę frakcjonowania mikrotubul w celu rozdzielenia ich na stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolną tubulinę w celu oceny stabilności mikrotubul w różnych tkankach myszy.

Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

W tym artykule przedstawiamy protokół wykrywania oligodendrocytów obciążonych mikrotubulami w modelu tubulinopatii za pomocą prostego, innowacyjnego podejścia do mikroskopii drugiej harmonicznej.

Bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania zależnych od tubuliny defektów w centralnej mielinie

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Przedstawione tutaj są metody przygotowania aktywnych nematyków z mikrotubul i silników kinezynowych, w tym przygotowanie i budowa białek oraz wykorzystanie studni do aktywnego uwięzienia nematycznego.

Formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach

Ten protokół opisuje technikę wysokowydajnej izolacji tubuliny z mózgu świni, zoptymalizowaną pod kątem oprzyrządowania na małą skalę. Procedury izolacji są uzupełnione procedurami oznaczania aktywności polimeryzacji tubuliny in vitro przy użyciu testów kosedymentacyjnych i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Optymalizacja wydajności tubuliny z tkanki mózgowej świni

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji endogennej tubuliny z komórek ssaków, które mogą nie mieć lub zawierać specyficzne enzymy modyfikujące mikrotubule, w celu uzyskania mikrotubul wzbogaconych o określoną modyfikację. Następnie opisujemy, w jaki sposób wyekstrahowane mikrotubule można ozdobić oczyszczonymi białkami wiążącymi mikrotubule w celu przygotowania siatek do mikroskopii krioelektronowej.

Ekstrakcja zmodyfikowanych mikrotubul z komórek ssaków w celu badania kompleksów mikrotubula-białko za pomocą mikroskopii krioelektronowej

Naucz się oczyszczania tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi metodą cykli polimeryzacji-depolimeryzacji. Protokół ten umożliwia uzyskanie czystego białka do badań dynamiki mikrotubuli in vitro.

Oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł przez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł przez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji

Przeglądaj więcej filmów