Name: Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj ilościową proteomikę z wykorzystaniem monitorowania wielu reakcji (MRM) do wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę biomarkerów w badaniach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy projektowi MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projektowi #34_IITB do SS i MASSFIITB Facility w IIT Bombay wspieranym przez Departament Biotechnologii (BT/PR13114/INF/22/206/2015) do przeprowadzenia wszystkich eksperymentów związanych z MS.
Specjalne podziękowania kierujemy do Pana Rishabha Yadava za wykonanie i montaż całego filmu oraz Pana Nishanta Nerurkara za jego pracę przy edycji dźwięku.

To badanie obejmuje próbki tkanki mózgowej od uczestników, sprawdzone i zatwierdzone przez TMH i IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Uczestnicy wyrazili świadomą i pisemną zgodę na udział w tym badaniu.
1 Ekstrakcja białka z tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Zważyć około 50 mg tkanki mózgowej i przemyć ją 300 μl 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) za pomocą mikropipety. 
	UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia krwi z zewnętrznej powierzchni tkanki i należy go powtórzyć w razie potrzeby. Wskazane jest usunięcie jak największej ilości krwi z tkanki, ponieważ zakłóca to ocenę i przetwarzanie białek w dalszej kolejności.</li>
	<li>Po przemyciu PBS dodać 300 μl buforu do lizy (buforu A) do probówki zawierającej tkankę. Bufor A zawiera 8 M mocznika, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2 i koktajl inhibitorów proteazy (zgodnie z instrukcjami producenta). 
	UWAGA: Wydajność białka różni się w zależności od kilku czynników, począwszy od warunków, w jakich próbki są przechowywane, ilości materiału wyjściowego i efektywności obchodzenia się z próbkami podczas przetwarzania. Proporcjonalnie zmniejszyć objętość buforu A podczas pracy z ilością tkanki mniejszą niż 50 mg.</li>
	<li>Zneutralizować tkankę za pomocą sonografu sondowego, trzymając probówkę w łaźni lodowej. Użyj następujących parametrów do sonikacji: 40% amplituda, 5 sekund cyklu włączania i wyłączania przez 2:30 min.</li>
	<li>Kontynuuj homogenizację tkanek za pomocą ubijaka do kulek, aby całkowicie zlizować tkankę. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonywać ze średnią prędkością przez 90 sekund, a następnie inkubować na lodzie przez 3-5 minut.</li>
	<li>Odwirować zawartość probówki o stężeniu 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do świeżej probówki i jednorodnie wymieszać. 
	UWAGA: Pobrać porcje próbki i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
2 Kwantyfikacja białka i kontrola jakości
<ol>
	<li>Określić ilościowo próbki przed mineralizacją, korzystając ze standardowego wykresu wykonanego ze znanymi stężeniami BSA. 
	UWAGA: Upewnij się, że test używany do oznaczania białka jest zgodny z buforem używanym do wytwarzania lizatu białkowego. Sprawdź jakość lizatu białkowego, uruchamiając żel SDS-PAGE.</li>
</ol>
3 Trawienie białka
<ol>
	<li>Weź 50 μg białka do probówki mikrowirówkowej i zredukuj białka, dodając Tris 2-karboksyetylofosfinę (TCEP) tak, aby końcowe stężenie wynosiło 20 mM. Inkubować zawartość w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po inkubacji alkilować zredukowane białka poprzez dodanie jodoacetamidu (IAA) do probówki tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 40 mM. Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut. 
	UWAGA: Przygotuj IAA na świeżo tuż przed dodaniem go do tuby.</li>
	<li>Dodać bufor B do probówki zawierającej zredukowane i alkilowane białka tak, aby końcowe stężenie mocznika w probówce było mniejsze niż 1 M. 
	UWAGA: Bufor B składa się z 25 mM Tris (pH 8,0) i 1 mM CaCl2 i służy do rozcieńczania próbek. Po rozcieńczeniu upewnić się, że zawartość probówki ma pH 8 dla optymalnego trawienia białka po dodaniu trypsyny.</li>
	<li>Dodać trypsynę w stosunku enzymu do białka w stosunku 1:30 i inkubować probówki przez noc w temperaturze 37 °C, ciągle wstrząsając.</li>
	<li>Po roztrawieniu skoncentrować strawiony produkt w koncentratorze próżniowym. Na tym etapie peptydy mogą być albo odtworzone i odsolone, albo przechowywane w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
4 Odsalanie i kwantyfikacja peptydów
UWAGA: Odsalanie lub czyszczenie peptydów jest niezbędne przed załadowaniem próbek do LC-MS/MS. Sole i inne zanieczyszczenia w próbce mogą zatkać kolumny i spowodować uszkodzenie instrumentu. Proces ten można przeprowadzić za pomocą dostępnych na rynku końcówek lub kolumn C18.
<ol>
	<li>Aktywuj końcówkę stopnia za pomocą 20 μl 50% acetonitrylu (ACN) w 0,1% kwasie mrówkowym (FA). Odwirować zawartość przy 1 000 x g przez 1 minutę i odrzucić przepływ. 
	UWAGA: Warunki wirowania są takie same do końca procedury.</li>
	<li>Dodać 20 μl 100% ACN w 0,1% FA i odwirować zawartość jak w kroku 4.1. 
	UWAGA: Kroki aktywacji można powtórzyć kilka razy.</li>
	<li>Po aktywacji przepuścić 20 μl odtworzonej próbki peptydu przez końcówkę sceny, a następnie odwirować zgodnie z czynnością opisaną w kroku 4.1. 
	UWAGA: Nie odrzucaj przepływu na tym etapie.</li>
	<li>Powtórz krok 4.3 z przepływem co najmniej 5 razy, aby zapewnić maksymalne wiązanie peptydu z końcówką etapu.</li>
	<li>Przepuścić 20 μl 0,1% FA przez końcówkę sceny, a przepływ odrzucić przez. 
	UWAGA: Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać lepsze wyniki.</li>
	<li>Eluować związane peptydy w świeżej probówce do mikrofuge, przepuszczając rosnące stężenia ACN, tj. odpowiednio 40%, 60% i 80%.</li>
	<li>Wysuszyć peptydy w koncentratorze próżniowym i przystąpić do oznaczania ilościowego peptydów.</li>
	<li>Rozpuść wysuszone peptydy w 0,1% FA i określ ilościowo za pomocą metody Scopes5.</li>
</ol>
5 Przygotowanie listy przejść dla sfinalizowanych celów
UWAGA: Przejście odnosi się do pary prekursorów (Q1) do wartości produktu (Q3) m/z w eksperymencie MRM. Peptyd może mieć od jednego do wielu przejść, z tą samą wartością Q1, ale różnymi wartościami Q3. Spektrometr masowy z potrójnym kwadrupolem wymaga informacji o przejściach peptydów i ich produktów, które mają zostać wykryte. Dlatego przed rozpoczęciem ukierunkowanego eksperymentu należy przygotować listę przejść. Można to zrobić za pomocą internetowego repozytorium SRMAtlas6 (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) lub oprogramowania open source o nazwie Skyline7 (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).
<ol>
	<li>Pobierz najnowszy plik FASTA ludzkiego proteomu z UniProt (https://www.uniprot.org/) i utwórz plik proteomu w tle, wstawiając go do Skyline. W ustawieniach peptydów przejdź do listy rozwijanej Proteom w tle i kliknij Dodaj. Podaj plik sekwencji FASTA ludzkiego proteomu. Upewnij się, że ta baza danych jest wybrana, a dozwolona wartość pominiętego rozszczepienia jest ustawiona na 0 przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Teraz w zakładce Filtr w Ustawieniach peptydów ogranicz długość akceptowanych peptydów od 8 do 25 aminokwasów.</li>
	<li>W Ustawieniach przejścia, na karcie Filtr, ustaw Ładunki prekursora na 2,3, ustaw Ładunki jonowe na 1 i ustaw Typy jonów na y. Jony produktu można wybrać w zależności od wyboru użytkownika. Wybierz N-terminal do proliny dla jonów specjalnych i pozostaw wszystkie inne parametry jako domyślne. 
	UWAGA: Ustawienia peptydu i przejścia mogą się różnić w zależności od eksperymentu.</li>
	<li>Wstaw interesujące Cię peptydy lub białka, klikając Edytuj i przechodząc do Wstaw. Aby wstawić białka, skopiuj ich identyfikatory dostępu, a aby wstawić określone peptydy, skopiuj sekwencje peptydowe. Oprogramowanie mapuje identyfikatory dostępu do proteomu tła, a lista przejść jest tworzona na podstawie ustawień peptydu i przejścia.</li>
	<li>Wyeksportuj listę przejść. Upewnij się, że z listy rozwijanej Typ instrumentu wybrano odpowiedni instrument. W przypadku eksperymentów optymalizacyjnych można podzielić listy przejść na mniejsze liczby, ustawiając żądaną liczbę przejść na plik w Skyline. Zapewni to, że instrument nie zostanie przeciążony przez przesiewanie zbyt wielu przejść w jednym przebiegu. Liczba przejść musi być dodatkowo zoptymalizowana, aby uzyskać pojedynczą metodę - wspominamy o tym w dalszej części sekcji dotyczącej udoskonalania metody.</li>
</ol>
6 parametrów LC
<ol>
	<li>Stosować dwuskładnikowy system rozpuszczalników z rozpuszczalnikiem wodnym zawierającym 0,1% FA (rozpuszczalnik A) i rozpuszczalnikiem organicznym zawierającym 80% ACN (rozpuszczalnik B).</li>
	<li>Ustaw temperaturę kolumny na 45 °C.</li>
	<li>Ustawić gradient LC 10 min przy natężeniu przepływu 450 μl/min (jak pokazano w tabeli S1).</li>
</ol>
7 parametrów MS
UWAGA: Opisany test został opracowany i zoptymalizowany dla spektrometru masowego TSQ Altis Triple Quadrupol.
<ol>
	<li>Optymalizuj parametry przebiegów, takie jak rozdzielczość Q1 i Q3, czas przebywania i czas cyklu - jeden parametr na raz. Uważamy, że rozdzielczość 0,7 dla Q1 i Q3 działa najlepiej. Czas cyklu lub czas przebywania może wymagać dostosowania w zależności od liczby przejść i średniej szerokości pików monitorowanych peptydów.</li>
	<li>Użyj parametrów MS w tabeli S2 i tabeli S3. Całkowity czas trwania metody wynosi 10 min. 
	UWAGA: Parametry pozostają takie same dla wszystkich przebiegów w trakcie i po uściśleniu metody, chyba że zaznaczono inaczej. W przypadku nowego eksperymentu może zaistnieć potrzeba zmiany niektórych parametrów w zależności od rodzaju próbki i etapów przetwarzania próbki.</li>
</ol>
8 Uruchom sekwencję i kontrolę jakości instrumentu
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę wody: metanol: izopropanol: acetonitryl w stosunku 1:1:1:1. Użyj tej mieszaniny jako pustego miejsca.</li>
	<li>Przygotuj peptydy dla dowolnej próbki wzorcowej, które można wykorzystać do konsekwentnego monitorowania wydajności urządzenia. Zostanie to wykorzystane jako standard kontroli jakości. Wykrywamy peptydy z trawienek BSA, które zostały zoptymalizowane i dają dobrą i spójną odpowiedź przez kilka dni (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Aby uruchomić próbki, sekwencja powinna zaczynać się od kilku ślepych prób, a następnie standardu kontroli jakości i próbek klinicznych. Zawsze upewnij się, że między dwiema kolejnymi próbkami znajduje się jedna ślepa próba.</li>
	<li>Aby ułatwić porównanie, należy upewnić się, że za każdym razem wstrzykiwane są równe ilości i objętości każdej próbki.</li>
</ol>
9 Udoskonalenie metody
<ol>
	<li>Przeanalizuj wstępne dane uzyskane z połączonych próbek za pomocą Skyline. Poszukaj odpowiedniego szczytu, przejść i parametrów, takich jak kształt i intensywność szczytu, aby wybrać najlepsze wyniki. Zapisz plik jako nowy projekt Skyline.</li>
	<li>Użyj biblioteki, aby znaleźć najlepiej pasujący szczyt, a co za tym idzie, zalecana jest najlepsza możliwa lista przejść. Biblioteka to zestaw pików MS/MS dostępnych w literaturze lub eksperymentach wewnętrznych.</li>
	<li>Wyeksportuj nową listę przejść z nowo zapisanego projektu Skyline i użyj tej listy przejść, aby utworzyć nową metodę. Pozyskaj dane z nowo utworzonej metody i powtórz proces udoskonalania przejść za pomocą Skyline.</li>
	<li>Gdy lista peptydów i przejść zostanie sfinalizowana po analizie danych za pomocą Skyline, dostosuj metodę, wypróbowując różne permutacje czasu cyklu i czasu przebywania. 
	UWAGA: Zastosowanie ciężkich, znakowanych syntetycznych peptydów i peptydów o indeksowanym czasie retencji (iRT) ułatwia udoskonalanie metody8, 9. Dlatego zaleca się, aby precyzyjne dostrojenie metody było wykonywane przy użyciu tych peptydów.</li>
	<li>Korzystając z informacji o czasie przechowywania z eksperymentów uściślania, utwórz ostateczną metodę, która jest zaplanowana (ze zdefiniowanym oknem pozyskiwania).</li>
	<li>Przygotuj próbki dla poszczególnych tematów. Dane dla tych próbek zostaną pozyskane przy użyciu ostatecznej zaplanowanej metody.</li>
	<li>Po uzyskaniu danych można przeprowadzić dalszą analizę i porównanie grupowe, importując surowe pliki do Skyline.</li>
</ol>

<ol><li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring-based+proteomics%3A+Workflows%2C+potential%2C+pitfalls+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li>
<li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine%3A+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li>
<li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li>
<li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li>
<li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li>
<li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+SRMAtlas%3A+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li>
<li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+iRT%2C+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li>
<li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li>
<li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li>
<li>Hüttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94(2012).</li>
<li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRM%2FMRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li>
<li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A%CE%B2+aggregation+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li>
<li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li>
<li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li>
<li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li>
</ol>

Autorzy otrzymali wsparcie od firmy Thermofisher na pokrycie opłaty za publikację.

Techniki takie jak immunohistochemia i Western blotting przez wiele lat były uważane za złote standardy walidacji docelowych białek. Metody te znajdują zastosowanie nawet dzisiaj, z niewielkimi modyfikacjami protokołu i niewielką zależnością od technologii, co czyni je bardzo kłopotliwymi i żmudnymi. Poza tym wiążą się one również z zastosowaniem drogich przeciwciał, które nie zawsze wykazują taką samą swoistość we wszystkich partiach i wymagają dużej wiedzy specjalistycznej. Ponadto tylko niewielka część białek zidentyf...

W ciągu ostatniej dekady, szybki rozwój spektrometrii mas (MS) w połączeniu z lepszym zrozumieniem technik chromatograficznych znacznie pomógł w rozwoju proteomiki opartej na MS. Techniki oparte na biologii molekularnej, takie jak western blotting i immunohistochemia, od dawna cierpią z powodu problemów z odtwarzalnością, powolnym czasem realizacji, zmiennością między obserwatorami i niezdolnością do dokładnego ilościowego określenia białek, by wymienić tylko kilka. W związku z tym wyjątkowa czułość wysokoprzepustowych podejść proteomicznych nadal oferuje biologom molekularnym alternatywne i bardziej niezawodne narzędzie w ich dążeniu do lepszego zrozumienia roli białek w komórkach. Jednak podejścia proteomiczne typu shotgun (Data Dependent Acquisition lub DDA) często nie wykrywają białek o niskiej obfitości w złożonych tkankach, poza tym, że są w dużym stopniu zależne od czułości i rozdzielczości instrumentu. W ciągu ostatnich kilku lat laboratoria na całym świecie opracowywały techniki takie jak Data Independent Acquisition (DIA), które wymagają zwiększonej mocy obliczeniowej i niezawodnego oprogramowania, które może obsłużyć te bardzo złożone zestawy danych. Jednak te techniki są nadal w toku i nie są zbyt przyjazne dla użytkownika. Ukierunkowane podejścia proteomiczne oparte na stwardnieniu rozsianym zapewniają doskonałą równowagę między wysokoprzepustowym charakterem podejść do stwardnienia rozsianego a czułością podejść biologii molekularnej, takich jak ELISA. Ukierunkowany eksperyment proteomiczny, oparty na spektrometrii mas, koncentruje się na wykrywaniu białek lub peptydów opartych na hipotezach w eksperymentach proteomicznych opartych na odkryciach lub za pośrednictwem dostępnej literatury1,2. Monitorowanie reakcji wielokrotnych (MRM) jest jednym z takich ukierunkowanych podejść MS, które wykorzystuje tandemowy kwadrupolowy spektrometr masowy do dokładnego wykrywania i kwantyfikacji białek/peptydów ze złożonych próbek. Technika ta oferuje wyższą czułość i swoistość, mimo że wymaga użycia instrumentu o niskiej rozdzielczości.
Kwadrupol składa się z 4 równoległych prętów, z których każdy jest połączony z przeciwległym prętem po przekątnej. Między prętami kwadrupolowymi powstaje zmienne pole poprzez przyłożenie zmiennych napięć RF i DC. Na trajektorię jonów wewnątrz kwadrupola wpływa obecność tych samych napięć na przeciwległych prętach. Przykładając RF do napięcia stałego, można ustabilizować trajektorię jonów. To właśnie ta właściwość kwadrupola pozwala na stosowanie go jako filtra masowego, który może selektywnie przepuszczać określone jony. W zależności od potrzeb kwadrupol może pracować zarówno w trybie statycznym, jak i skanowania. Tryb statyczny przepuszcza tylko jony o określonym m/z, co sprawia, że tryb jest wysoce selektywny i specyficzny dla jonu będącego przedmiotem zainteresowania. Z drugiej strony tryb skanowania umożliwia przechodzenie jonów w całym zakresie m/z. Tak więc tandemowe kwadrupolowe spektrometry masowe mogą działać na 4 możliwe sposoby: i) pierwszy kwadrupol pracuje w trybie statycznym, a drugi w trybie skanowania; ii) pierwszy kwadrupol pracujący w trybie skanowania, natomiast drugi pracujący w trybie statycznym; iii) obie kwadrupole pracujące w trybie skanowania; oraz iv) oba kwadrupole działające w trybie statycznym3. W typowym eksperymencie MRM obie kwadrupole działają w trybie statycznym, co pozwala na monitorowanie określonych prekursorów i powstałych przez nie produktów po rozdrobnieniu. To sprawia, że technika ta jest bardzo czuła i selektywna, co pozwala na dokładną kwantyfikację.
Dla biologów molekularnych ludzka tkanka mózgowa i jej komórki są skarbnicą. Te niezwykłe jednostki zawsze interesującego narządu ludzkiego ciała mogą dostarczyć molekularnego i komórkowego wglądu w jego funkcjonowanie. Badania proteomiczne tkanki mózgowej mogą nie tylko pomóc nam zrozumieć systemowe funkcjonowanie zdrowego mózgu, ale także szlaki komórkowe, które ulegają rozregulowaniu, gdy są spowodowane jakąś chorobą4. Jednak tkanka mózgowa z całą swoją niejednorodnością jest bardzo złożonym narządem do analizy i wymaga skoordynowanego podejścia w celu lepszego zrozumienia zmian na poziomie molekularnym. Poniższa praca opisuje cały proces pracy, począwszy od ekstrakcji białek z tkanki mózgowej, tworzenia i optymalizacji metod oznaczania MRM, aż po walidację celów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). W tym miejscu systematycznie podkreślaliśmy główne kroki związane z udanym eksperymentem opartym na MRM z wykorzystaniem ludzkiej tkanki mózgowej w celu przedstawienia tej techniki i związanych z nią wyzwań szerszej społeczności badawczej.

<table><tbody><tr><td><silny>Odczynniki</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl (klasa MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0620/21</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>HiMedia</td><td>TC194-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fischer Sicific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (klasa MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>147930250</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma</td><td>1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol (klasa MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Q13827</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fischer Scienific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (klasa MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy MS</td><td>Pierce</td><td>51140</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna</td><td>HiMedia</td><td>TL1006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>DF6D661300</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Merck</td><td>648310</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (klasa MS)</td><td>Pierce</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Merck</td><td>MB1D691237</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypersil Gold C18 kolumna</td><td>Thermo</td><td>25002-102130</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Stage</td><td>MilliPore</td><td>ZTC18M008</td><td></td></tr><tr><td>Kulki cyrkonowe/krzemionkowe</td><td>Produkty BioSpec</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead bijak (homogenizator)</td><td>Bertin Minilys</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek (spektrofotometr)</td><td>Termo</td><td>MultiSkan Go</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Eutech</td><td>CyberScan pH 510</td><td></td></tr><tr><td>Probe Sonicator</td><td>Sonics Materials, Inc</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsający Drybath</td><td>Thermo</td><td>88880028</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy TSQ Altis</td><td>Thermo</td><td>TSQ02-10002</td><td></td></tr><tr><td>uHPLC - Vanquish</td><td>Thermo</td><td>VQF01-20001</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżni</td><td>Thermo</td><td>Savant ISS 110</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Analiza proteomiczna ludzkiej tkanki mózgowej w ciągu ostatniej dekady znacznie poszerzyła nasze zrozumienie mózgu. Jednak zaburzenia związane z mózgiem nadal są głównym czynnikiem przyczyniającym się do zgonów na całym świecie, co wymaga jeszcze lepszego zrozumienia ich patobiologii. Tradycyjne techniki oparte na przeciwciałach, takie jak western blotting lub immunohistochemia, mają niską przepustowość, a ponadto są pracochłonne i jakościowe lub półilościowe. Nawet konwencjonalne podejścia oparte na spektrometrii mas nie dostarczają rozstrzygających dowodów na poparcie pewnej hipotezy. Ukierunkowane podejścia proteomiczne są w dużej mierze oparte na hipotezach i różnią się od konwencjonalnych podejść proteomicznych, które są od dawna stosowane. Monitorowanie wielu reakcji jest jednym z takich ukierunkowanych podejść, które wymaga użycia specjalnego spektrometru masowego zwanego tandemowym kwadrupolowym spektrometrem masowym lub potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym. W obecnym badaniu systematycznie podkreślaliśmy główne kroki związane z przeprowadzeniem udanego przepływu pracy proteomiki opartej na tandemowej kwadrupolowej spektrometrii mas z wykorzystaniem ludzkiej tkanki mózgowej w celu wprowadzenia tego przepływu pracy do szerszej społeczności badawczej.

Przeprowadzono względną kwantyfikację 3 białek z 10 próbek, po 5 próbek z każdej grupy pacjentów z nieprawidłowościami w mózgu. Białka te obejmowały apolipoproteinę A-I (APOA-I), wimentynę (VIM) oraz nikotynamidofosforoborylotransferazę (NAMPT), o których wiadomo, że pełnią różnorodne funkcje w komórkach mózgowych. Analiza danych po pomiarze została wykonana przy użyciu programu Skyline-daily (Wersja 20.2.1.286). Monitorowano łącznie 10 peptydów odpowiadających 3 białkom. Były to: 3 peptydy dla APOA-I, 4 peptydy dla VIM ...

Protokół ma na celu wprowadzenie użycia potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego do monitorowania wielu reakcji (MRM) białek z próbek klinicznych. Zapewniliśmy systematyczny przepływ pracy, począwszy od przygotowania próbki po analizę danych dla próbek klinicznych, z zachowaniem wszystkich niezbędnych środków ostrożności, które należy podjąć.

Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Ukierunkowane podejścia proteomiczne szybko stają się metodą pierwszego wyboru do walidacji białek z krótkoterminowych eksperymentów opartych na proteomice lub z eksperymentów opartych na biologii molekularnej. Jednym z takich ukierunkowanych podejść jest monitorowanie wielu reakcji, które jest coraz częściej stosowane do wykrywania i ilościowego oznaczania białek w próbkach biologicznych. W tym badaniu przeszliśmy przez różne etapy związane z wykrywaniem i ilościowym określaniem białek z ludzkiej tkanki mózgowej z zamiarem zapoznania czytelników z podstawowymi wymaganiami eksperymentu MRM.Zważ około 50 mg tkanki mózgowej i umyj tkankę 300 mikrolitrami 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia krwi z zewnętrznej powierzchni tkanki, dlatego zaleca się usunięcie jak największej ilości krwi. Po przemyciu PBS dodać 300 mikrolitrów buforu do lizy do probówki zawierającej tkankę.Zneutralizować tkankę za pomocą sonografu sondowego, trzymając probówkę w łaźni lodowej. Kontynuuj homogenizację tkanek za pomocą ubijaka do kulek, aby całkowicie zlizować tkankę. Odwirować zawartość probówki o masie 6000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieść supernatant do świeżej probówki i jednorodnie wymieszać. Pobrać małą porcję supernatantu i określić ilościowo zawartość białka za pomocą standardowego testu białkowego. Tutaj pokazujemy przykład szacowania białka za pomocą testu Bradforda.Pobrać 50 mikrogramów białka do probówki do mikrowirówki i zmniejszyć zawartość, dodając TCEP tak, aby końcowe stężenie wynosiło 20 milimolów. Inkubować zawartość w temperaturze 37 stopni przez godzinę. Po inkubacji alkilować zredukowane białka, dodając jodoacetamid do probówki, tak aby końcowe stężenie wynosiło 40 milimolów.Inkubuj probówkę w ciemności przez 30 minut. Teraz dodaj bufor B do probówki zawierającej zredukowane i alkilowane białka tak, aby końcowe stężenie mocznika było mniejsze niż jeden molowiec. Dodaj trypsynę w stosunku enzymu do białka 1 do 30 i inkubuj probówki przez noc w temperaturze 37 stopni przy ciągłym wstrząsaniu.Po roztrawieniu skoncentrować strawione peptydy w koncentratorze próżniowym. Na tym etapie peptydy mogą być albo odtworzone i odsolone, albo przechowywane w temperaturze minus 80 do wykorzystania w przyszłości. Odsalanie, czyli oczyszczanie peptydów, jest niezbędne przed załadowaniem próbek do dowolnego LC-MS MS. Sole i inne zanieczyszczenia w próbce mogą zatkać kolumnę i wpłynąć na czułość instrumentu w dłuższej perspektywie.Proces ten można przeprowadzić przy użyciu dostępnych na rynku końcówek lub kolumn C18 STAGE. Tutaj przedstawiliśmy przebieg procesu odsalania peptydów za pomocą końcówki C18 STAGE. Po odsoleniu wysuszyć peptydy w koncentratorze próżniowym.Rozpuść te czyste peptydy i przystąp do oznaczania ilościowego przy użyciu metody Scopes. W tym celu załaduj dwa mikrolitry próbki do płytki z mikrokroplami i oblicz stężenie, jak pokazano na slajdzie. Przygotowanie listy przejść jest kluczowym krokiem w eksperymencie SRM lub MRM.Lista przejść zawiera wszystkie informacje wymagane przez spektrometr mas do monitorowania przejścia. Obejmuje to wartości m i z jonów prekursorowych i produktowych, energię zderzenia przejścia, polaryzację instrumentu oraz zakres czasu pozyskiwania danych. Przygotuj listę przejść za pomocą Skyline.Przygotuj proteom tła za pomocą pliku Human Proteome Fasta z UniProt i upewnij się, że jest on wybrany na karcie Tło w Ustawieniach peptydów. Na karcie Filtr ustaw minimalną długość 8 i maksymalną długość 25. Kontynuuj korzystanie z ustawień domyślnych, jeśli nie ma innych modyfikacji peptydów.Po wprowadzeniu ustawień peptydów kliknij Ustawienia przejścia. Na karcie Filtr ustaw ładunki prekursorów jako 2 i 3. Ustaw ładunki jonowe na 1 i ustaw typy jonów na y.Jony produktu mogą być dobierane w zależności od wyboru użytkownika. Pozostaw wszystkie parametry jako domyślne. Teraz wstaw identyfikatory dostępu wybranych białek docelowych.Można to zrobić, klikając zakładkę Edytuj, a następnie wybierając Wstaw i na końcu wklejając identyfikatory dostępu. Identyfikatory zostaną zmapowane do białek w proteomie tła i utworzona zostanie lista przejść na podstawie ustawionych wcześniej ustawień peptydu i przejścia. Wyeksportuj tę listę przejść.Upewnij się, że wybrano właściwy instrument, klikając opcję rozwijaną Typ instrumentu. W tym przypadku instrumentem jest Thermo Altis. Ponieważ niezdefiniowana lista przejść zawiera zbyt wiele przejść, należy zachować limit tylko 350 przejść na listę i eksportować je jako wiele metod.Stosowany jest binarny system rozpuszczalników. Rozpuszczalnik A to 1% FA, a rozpuszczalnik B to 80% ACN. Utrzymuj natężenie przepływu na poziomie 450 mikrolitrów na minutę i gradient, jak pokazano.Ustaw temperaturę komory kolumny na 45 stopni Celsjusza. Aby uzyskać więcej informacji na temat systemu kolumnowego i LC, zapoznaj się z tekstem. Upewnij się, że ustawienia MS w Twoim TSQ Altis są takie, jak pokazano tutaj.Zaimportuj pojedynczą listę przejść, aby utworzyć nową metodę. Sugerujemy, aby rozdzielczość dla kwadrupola 1 i kwadrupola 3 wynosiła 7. W razie potrzeby można je dodatkowo zoptymalizować.Aby zapewnić spójność przebiegów, a co za tym idzie jakość danych, przygotuj sekwencję przebiegów, jak pokazano. Zacznij od kilku ślepych prób, zapoznaj się z tekstem, aby zapoznać się ze składem ślepej mieszanki, a następnie wzorcowym lekkim BSA kontroli jakości o znanym stężeniu w celu monitorowania wszelkich zmian w dziennej reakcji przyrządu. Kontrola jakości powinna być wykonana tuż przed próbkami.Następnie wyrównaj wszystkie próbki z półfabrykatami pomiędzy nimi. Wstrzyknąć równe objętości każdej próbki, co odpowiada 25 do 1 nanograma peptydów na wstrzyknięcie. Aby utworzyć udoskonaloną metodę, najpierw uruchom niezdefiniowane metody na całych próbkach.Zaimportuj wyniki do Skyline i ręcznie sprawdź każdy peptyd. Dla każdego peptydu należy wybrać jeden prekursor wykazujący niezmiennie dobre piki we wszystkich próbkach. Usuń prekursory i peptydy, które nie wykazują dobrych pików.Upewnij się, że wszystkie szczyty są prawidłowo oznaczone. Aby wybrać odpowiedni pik i jeszcze bardziej doprecyzować przejścia pod każdym prekursorem, można skorzystać z biblioteki. Biblioteka to zestaw danych spektralnych MS-MS dopasowanych do peptydów i przejść bieżących danych eksperymentalnych.Wybierz szczyty, które mają wartości P DART bliższe 1 i usuń przejścia, które nie pasują do biblioteki. Wartość P DART oznacza, jak dobre jest dopasowanie między szczytem eksperymentalnym a szczytem biblioteki. Po jednej lub dwóch rundach optymalizacji doprecyzowana lista będzie gotowa.Ta uściślona lista może być uruchamiana dla poszczególnych próbek. Zaimportuj udoskonalone przebiegi do Skyline i poprawnie dodawaj adnotacje do szczytów. Użyj karty Adnotacja w obszarze Ustawienia dokumentu, aby starannie dodać adnotacje do każdej próbki w siatce dokumentu.Użyj funkcji Porównanie grup, aby utworzyć porównania między warunkiem 1 i warunkiem 2 eksperymentu. Spowoduje to wyświetlenie tabeli z dostosowanymi wartościami P i wartościami zmiany krotności między dwiema grupami. Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie wykorzystujące MRM do wykrywania peptydów dla białek apolipoproteiny A-1, wimentyny i fosforybozylotransferazy nikotynamidu w próbkach ludzkiej tkanki mózgowej.Optymalizacja różnych parametrów, takich jak gradient LC, czas przebywania, czas cyklu i energia zderzenia, może znacznie wpłynąć na powodzenie eksperymentu MRM. Uważamy, że technika ta może być wykorzystana do opracowania wzorców biomarkerów ze zdolnością do rozróżniania różnych stanów klinicznych i chorób.

quantitative-proteomics-workflow-using-multiple-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Wulf, M., et.al.  Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny. J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia analizę próbek peptydów z granulek neuromelaniny (NMG) wyizolowanych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej. Peptydy są najpierw rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), a następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu określenia ich stosunku masy do ładunku (m / z). Docelowe...

Analiza LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny wyizolowanych z ludzkiej tkanki mózgowej

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Opisujemy wysokoprzepustowy, multipleksowy i celowany test proteomicznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), opracowany z potencjałem do klinicznego tłumaczenia. Test może określić ilościowo potencjalne markery i czynniki ryzyka neurodegeneracji, takie jak warianty apolipoproteiny E (E2, E3 i E4), oraz zmierzyć ich ekspresję alleli.

Wysokoprzepustowy, multipleksowany i ukierunkowany test proteomiczny, płyn mózgowo-rdzeniowy do ilościowego określania biomarkerów neurodegeneracyjnych i statusu izoform apolipoproteiny E

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Protokół ten skutecznie przygotował wystarczającą ilość wysokiej jakości tkanki neowaskularnej z próbek glejaka za pomocą mikrodyssekcji laserowej do ilościowej analizy proteomicznej angiogenezy guza, przezwyciężając ograniczenia badań tradycyjnie koncentrujących się głównie na czynnikach angiogennych oraz dostarczając szeroko zakrojonego profilu proteomicznego angiogenezy glejaka.

Przygotowanie tkanek neowaskularnych z tkanek glejaka ludzkiego do ilościowej analizy proteomiki angiogenezy guza

Poznaj ilościową proteomikę z wykorzystaniem monitorowania wielu reakcji (MRM) do wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę biomarkerów w badaniach klinicznych.

Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji

Przeglądaj więcej filmów