Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji

Ukierunkowane podejścia proteomiczne szybko stają się metodą pierwszego wyboru do walidacji białek z krótkoterminowych eksperymentów opartych na proteomice lub z eksperymentów opartych na biologii molekularnej. Jednym z takich ukierunkowanych podejść jest monitorowanie wielu reakcji, które jest coraz częściej stosowane do wykrywania i ilościowego oznaczania białek w próbkach biologicznych. W tym badaniu przeszliśmy przez różne etapy związane z wykrywaniem i ilościowym określaniem białek z ludzkiej tkanki mózgowej z zamiarem zapoznania czytelników z podstawowymi wymaganiami eksperymentu MRM.

Zważ około 50 mg tkanki mózgowej i umyj tkankę 300 mikrolitrami 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia krwi z zewnętrznej powierzchni tkanki, dlatego zaleca się usunięcie jak największej ilości krwi. Po przemyciu PBS dodać 300 mikrolitrów buforu do lizy do probówki zawierającej tkankę.

Zneutralizować tkankę za pomocą sonografu sondowego, trzymając probówkę w łaźni lodowej. Kontynuuj homogenizację tkanek za pomocą ubijaka do kulek, aby całkowicie zlizować tkankę. Odwirować zawartość probówki o masie 6000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieść supernatant do świeżej probówki i jednorodnie wymieszać. Pobrać małą porcję supernatantu i określić ilościowo zawartość białka za pomocą standardowego testu białkowego. Tutaj pokazujemy przykład szacowania białka za pomocą testu Bradforda.

Pobrać 50 mikrogramów białka do probówki do mikrowirówki i zmniejszyć zawartość, dodając TCEP tak, aby końcowe stężenie wynosiło 20 milimolów. Inkubować zawartość w temperaturze 37 stopni przez godzinę. Po inkubacji alkilować zredukowane białka, dodając jodoacetamid do probówki, tak aby końcowe stężenie wynosiło 40 milimolów.

Inkubuj probówkę w ciemności przez 30 minut. Teraz dodaj bufor B do probówki zawierającej zredukowane i alkilowane białka tak, aby końcowe stężenie mocznika było mniejsze niż jeden molowiec. Dodaj trypsynę w stosunku enzymu do białka 1 do 30 i inkubuj probówki przez noc w temperaturze 37 stopni przy ciągłym wstrząsaniu.

Po roztrawieniu skoncentrować strawione peptydy w koncentratorze próżniowym. Na tym etapie peptydy mogą być albo odtworzone i odsolone, albo przechowywane w temperaturze minus 80 do wykorzystania w przyszłości. Odsalanie, czyli oczyszczanie peptydów, jest niezbędne przed załadowaniem próbek do dowolnego LC-MS MS. Sole i inne zanieczyszczenia w próbce mogą zatkać kolumnę i wpłynąć na czułość instrumentu w dłuższej perspektywie.

Proces ten można przeprowadzić przy użyciu dostępnych na rynku końcówek lub kolumn C18 STAGE. Tutaj przedstawiliśmy przebieg procesu odsalania peptydów za pomocą końcówki C18 STAGE. Po odsoleniu wysuszyć peptydy w koncentratorze próżniowym.

Rozpuść te czyste peptydy i przystąp do oznaczania ilościowego przy użyciu metody Scopes. W tym celu załaduj dwa mikrolitry próbki do płytki z mikrokroplami i oblicz stężenie, jak pokazano na slajdzie. Przygotowanie listy przejść jest kluczowym krokiem w eksperymencie SRM lub MRM.

Lista przejść zawiera wszystkie informacje wymagane przez spektrometr mas do monitorowania przejścia. Obejmuje to wartości m i z jonów prekursorowych i produktowych, energię zderzenia przejścia, polaryzację instrumentu oraz zakres czasu pozyskiwania danych. Przygotuj listę przejść za pomocą Skyline.

Przygotuj proteom tła za pomocą pliku Human Proteome Fasta z UniProt i upewnij się, że jest on wybrany na karcie Tło w Ustawieniach peptydów. Na karcie Filtr ustaw minimalną długość 8 i maksymalną długość 25. Kontynuuj korzystanie z ustawień domyślnych, jeśli nie ma innych modyfikacji peptydów.

Po wprowadzeniu ustawień peptydów kliknij Ustawienia przejścia. Na karcie Filtr ustaw ładunki prekursorów jako 2 i 3. Ustaw ładunki jonowe na 1 i ustaw typy jonów na y.

Jony produktu mogą być dobierane w zależności od wyboru użytkownika. Pozostaw wszystkie parametry jako domyślne. Teraz wstaw identyfikatory dostępu wybranych białek docelowych.

Można to zrobić, klikając zakładkę Edytuj, a następnie wybierając Wstaw i na końcu wklejając identyfikatory dostępu. Identyfikatory zostaną zmapowane do białek w proteomie tła i utworzona zostanie lista przejść na podstawie ustawionych wcześniej ustawień peptydu i przejścia. Wyeksportuj tę listę przejść.

Upewnij się, że wybrano właściwy instrument, klikając opcję rozwijaną Typ instrumentu. W tym przypadku instrumentem jest Thermo Altis. Ponieważ niezdefiniowana lista przejść zawiera zbyt wiele przejść, należy zachować limit tylko 350 przejść na listę i eksportować je jako wiele metod.

Stosowany jest binarny system rozpuszczalników. Rozpuszczalnik A to 1% FA, a rozpuszczalnik B to 80% ACN. Utrzymuj natężenie przepływu na poziomie 450 mikrolitrów na minutę i gradient, jak pokazano.

Ustaw temperaturę komory kolumny na 45 stopni Celsjusza. Aby uzyskać więcej informacji na temat systemu kolumnowego i LC, zapoznaj się z tekstem. Upewnij się, że ustawienia MS w Twoim TSQ Altis są takie, jak pokazano tutaj.

Zaimportuj pojedynczą listę przejść, aby utworzyć nową metodę. Sugerujemy, aby rozdzielczość dla kwadrupola 1 i kwadrupola 3 wynosiła 7. W razie potrzeby można je dodatkowo zoptymalizować.

Aby zapewnić spójność przebiegów, a co za tym idzie jakość danych, przygotuj sekwencję przebiegów, jak pokazano. Zacznij od kilku ślepych prób, zapoznaj się z tekstem, aby zapoznać się ze składem ślepej mieszanki, a następnie wzorcowym lekkim BSA kontroli jakości o znanym stężeniu w celu monitorowania wszelkich zmian w dziennej reakcji przyrządu. Kontrola jakości powinna być wykonana tuż przed próbkami.

Następnie wyrównaj wszystkie próbki z półfabrykatami pomiędzy nimi. Wstrzyknąć równe objętości każdej próbki, co odpowiada 25 do 1 nanograma peptydów na wstrzyknięcie. Aby utworzyć udoskonaloną metodę, najpierw uruchom niezdefiniowane metody na całych próbkach.

Zaimportuj wyniki do Skyline i ręcznie sprawdź każdy peptyd. Dla każdego peptydu należy wybrać jeden prekursor wykazujący niezmiennie dobre piki we wszystkich próbkach. Usuń prekursory i peptydy, które nie wykazują dobrych pików.

Upewnij się, że wszystkie szczyty są prawidłowo oznaczone. Aby wybrać odpowiedni pik i jeszcze bardziej doprecyzować przejścia pod każdym prekursorem, można skorzystać z biblioteki. Biblioteka to zestaw danych spektralnych MS-MS dopasowanych do peptydów i przejść bieżących danych eksperymentalnych.

Wybierz szczyty, które mają wartości P DART bliższe 1 i usuń przejścia, które nie pasują do biblioteki. Wartość P DART oznacza, jak dobre jest dopasowanie między szczytem eksperymentalnym a szczytem biblioteki. Po jednej lub dwóch rundach optymalizacji doprecyzowana lista będzie gotowa.

Ta uściślona lista może być uruchamiana dla poszczególnych próbek. Zaimportuj udoskonalone przebiegi do Skyline i poprawnie dodawaj adnotacje do szczytów. Użyj karty Adnotacja w obszarze Ustawienia dokumentu, aby starannie dodać adnotacje do każdej próbki w siatce dokumentu.

Użyj funkcji Porównanie grup, aby utworzyć porównania między warunkiem 1 i warunkiem 2 eksperymentu. Spowoduje to wyświetlenie tabeli z dostosowanymi wartościami P i wartościami zmiany krotności między dwiema grupami. Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie wykorzystujące MRM do wykrywania peptydów dla białek apolipoproteiny A-1, wimentyny i fosforybozylotransferazy nikotynamidu w próbkach ludzkiej tkanki mózgowej.

Optymalizacja różnych parametrów, takich jak gradient LC, czas przebywania, czas cyklu i energia zderzenia, może znacznie wpłynąć na powodzenie eksperymentu MRM. Uważamy, że technika ta może być wykorzystana do opracowania wzorców biomarkerów ze zdolnością do rozróżniania różnych stanów klinicznych i chorób.