Name: Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę karmienia i ilościowego oznaczania krwi u komarów Aedes aegypti przy użyciu sztucznego podajnika z fluorescyną. Protokół umożliwia precyzyjne pomiary objętości pobranego posiłku w badaniach entomologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Nipun Basrur, Adrianie K. Rosas Villegas, Nadavowi Shai i Trevorowi Sorrellsowi za komentarze do manuskryptów, a także Zhongyanowi Gongowi i Kyrollosowi Barsoumowi za pomoc techniczną. Dziękujemy Alexowi Wildowi za zdjęcia wykorzystane w Rysunek 1. K.V. był wspierany przez stypendium doktoranckie Boehringer Ingelheim Fonds. V.J. był częściowo wspierany przez NIH T32-MH095246. Praca ta została częściowo wsparta grantem dla Uniwersytetu Rockefellera z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa w ramach programu James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study dla V.J. Materiał ten opiera się na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program w ramach grantu nr. NSF DGE-1325261 do V.J. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

<ol><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+distribution+and+burden+of+dengue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).</li>
<li>Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+distribution+of+yellow+fever+and+dengue%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The global distribution of yellow fever and dengue.</a> Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).</li>
<li>Chouin-Carneiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibilities+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+from+the+Americas+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).</li>
<li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+Zika+virus+infection%2C+Chiapas+State%2C+Mexico%2C+2015%2C+and+first+confirmed+transmission+by+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+the+Amercias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li>
<li>Weaver, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+history%2C+emergence%2C+biology%2C+and+prospects+for+control%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control.</a> Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).</li>
<li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+regulation+of+vitellogenesis+in+mosquitoes%3A+implications+for+anautogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).</li>
<li>Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+agonists+of+Ae.+aegypti+neuropeptide+Y+receptor+block+mosquito+biting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting.</a> Cell. 176 (4), 687-701 (2019).</li>
<li>Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acids+required+for+egg+production+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Entomologist%22%5BJournal%5D)">The amino acids required for egg production in Aedes aegypti.</a> The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).</li>
<li>Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+mosquito+salivary+components+and+their+effect+on+the+immune+response+to+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).</li>
<li>Raquin, V., Lambrechts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+virus+replicates+and+accumulates+in+Aedes+aegypti+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands.</a> Virology. 507, 75-81 (2017).</li>
<li>Farjana, T., Tuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+blood+feeding+and+host-seeking+behavior+in+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+%28diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).</li>
<li>Scott, T. W., Takken, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+strategies+of+anthropophilic+mosquitoes+result+in+increased+risk+of+pathogen+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).</li>
<li>Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+membrane+feeding+compromise+the+quality+of+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes.</a> PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).</li>
<li>Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+Aedes+aegypti+mosquitoes+infected+with+wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).</li>
<li>Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+during+sequential+gonotrophic+cycles+in+large+and+small+female+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).</li>
<li>McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+integration+of+carbon+dioxide+and+other+sensory+cues+drives+mosquito+attraction+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans.</a> Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).</li>
<li>Pakes, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPakes%2C+SP+%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).</li>
<li>Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mosquito+feeding+system+for+routine+blood-feeding+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus.</a> Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).</li>
<li>Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+blood+sources+and+artificial+blood+feeding+methods+in+rearing+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+for+sterile+insect+technique+and+incompatible+insect+technique+approaches+in+Sri+Lanka%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka.</a> BioMed Research International. 2017, 3196924(2017).</li>
<li>Costa-da-Silva, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glytube%3A+a+conical+tube+and+parafilm+M-based+method+as+a+simplified+device+to+artificially+blood-feed+the+Dengue+vector+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> PLoS ONE. 8 (1), 53816(2013).</li>
<li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+genetically+modified+Aedes+aegypti+for+field+releases+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil.</a> Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).</li>
<li>Kogan, P. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).</li>
<li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+diets+for+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Artificial diets for mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), (2016).</li>
<li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142(2017).</li>
<li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+stimuli+and+artificial+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Feeding stimuli and artificial feeding.</a> Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).</li>
<li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+response+in+Aedes+aegypti%3A+stimulation+by+adenosine+triphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate.</a> Science. 142, 1674-1675 (1963).</li>
<li>Jové, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+Discrimination+of+Blood+and+Floral+Nectar+by+Aedes+aegypti+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Neuron. 108, 1-18 (2020).</li>
<li>Petersen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+age+of+first+blood+meal+and+Zika+virus+infection+on+Aedes+aegypti+egg+production+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity.</a> PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).</li>
<li>Sissoko, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+sugar+feeding+behavior+by+Aedes+aegypti+in+Bamako%2C+Mali+makes+them+ideal+candidates+for+control+with+Attractive+Toxic+Sugar+Baits+%28ATSB%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB).</a> PLoS ONE. 14 (6), 0214170(2019).</li>
<li>Houseman, J. G., Downe, A. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+measuring+blood+meal+size+and+proteinase+activity+for+determining+the+effects+of+mated+state+of+digestive+processes+of+female+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diperta%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Entomologist%22%5BJournal%5D)">Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae).</a> The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).</li>
<li>Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+estimating+blood+meal+volume+in+Aedes+aegypti+using+a+radioisotope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope.</a> Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).</li>
<li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+SkitoSnack%2C+an+artificial+blood+meal+replacement%2C+on+Aedes+aegypti+life+history+traits+and+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endogenous+regulation+of+mosquito+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior.</a> Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).</li>
<li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486(2013).</li>
<li>Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+of+the+response+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+uninfected+and+infected+with+Dengue+virus+to+Deet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet.</a> Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).</li>
<li>Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+mosquitoes+use+their+legs+to+sense+DEET+on+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact.</a> Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).</li>
<li>Harrington, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+feeding+patterns+of+the+Dengue+vector%2C+Aedes+aegypti%2C+on+individual+human+hosts+in+rural+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048(2014).</li>
<li>Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiteOscope%2C+an+open+platform+to+study+mosquito+biting+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior.</a> eLife. 9, 1-24 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przypadku wielu zastosowań laboratoryjnych karmniki ze sztuczną membraną oferują wyraźne korzyści w porównaniu z żywymi żywicielami, umożliwiając naukowcom bezpośrednie manipulowanie zawartością posiłku. Chociaż dostępnych jest wiele metod karmienia sztuczną membraną, opisana tutaj metoda oferuje korzyści w zakresie elastyczności, kosztów i przepustowości. W porównaniu z innymi komercyjnymi podajnikami membranowymi, test Glytube wymaga małej objętości mączki, co czyni go wydajnym mechanizmem dostarczania kosztownych odczynników, w tym leków lub patogenów, poprzez zminimalizowanie całkowitej wymaganej objętości 7,35. Ponieważ zarówno bezbiałkowy roztwór soli fizjologicznej, jak i sztuczne posiłki z krwi sprzyjają obrzękowi, związki lub patogeny mogą być dodawane do każdego posiłku jako wysokoprzepustowa i nieinwazyjna alternatywa dla zastrzyków. Dodatkowo, każdy składnik Glytube może być łatwo myty, wymieniany lub zwiększany, aby dostarczyć i określić ilościowo wiele rodzajów posiłków bez zanieczyszczenia krzyżowego aparatu do karmienia.
Aby określić ilościowo objętość posiłków spożywanych przez komary, metoda oparta na fluorescencji umożliwia bardziej precyzyjne określenie ilościowe wielkości posiłku niż ważenie komarów przed i po karmieniu. Należy zauważyć, że ta metoda jest testem punktu końcowego. W przeciwieństwie do tego, ważenie pozwala utrzymać komary przy życiu w celu dalszych eksperymentów. Korzystając z czytnika płytek, metodę opartą na fluorescencji można łatwo rozszerzyć w celu wysokoprzepustowej kwantyfikacji posiłków spożywanych przez setki pojedynczych samic.
Aby osiągnąć wysokie wskaźniki karmienia, musi być obecna kombinacja wystarczających sygnałów żywiciela, aby aktywować zachowanie samicy w poszukiwaniu żywiciela i przyciągnąć samice do karmnika. Jeśli komary nie tłoczą się pod rurką glikulacyjną, posiłek może nie być odpowiednio podgrzany lub dostarczanie CO2 może być niewystarczające. Dodanie ludzkiego zapachu do powierzchni membrany niezawodnie zwiększa atrakcyjność sztucznej membrany. Jeśli komary zostaną zaobserwowane pod rurką Glytube, ale nie będą się odżywiać, może to oznaczać wadliwy skład posiłku. Samice mogą nie jeść, jeśli sam posiłek nie jest ciepły, krew jest zbyt stara lub jeśli dodatki do posiłku są wewnętrznie awersyjne lub powodują niepożądaną reakcję chemiczną36. Dodatkowe ATP niezawodnie zwiększa również dawki karmienia i może być skalowane do końcowego stężenia 2 mM w każdej z dostarczonych receptur. Samice nie mogą karmić się, jeśli parafilm nie jest napięty w poprzek nasadki Glytube; Parafilm powinien być jednolicie przezroczysty i nie powinien się wyginać, ponieważ uniemożliwia to samicy skuteczne przebicie parafilmu swoim styletem. Jeśli mączka przecieka przez rurkę glikulową na siatkę, parafilm mógł się rozerwać podczas rozciągania i należy go wymienić.
Zmiana składu posiłku może również pozwolić naukowcom na manipulowanie czasem potrzebnym do usunięcia posiłku z jelita środkowego, a także późniejszym zachowaniem związanym z poszukiwaniem żywiciela. Prezentowane tu posiłki wymagają 24–36 godzin na trawienie7 podobnie jak krew pochodzenia zwierzęcego. Po zjedzeniu któregokolwiek z tych posiłków samice będą tłumić poszukiwanie żywiciela w oknie trawienia. Ponieważ w solankowym posiłku brakuje białka, samice wracają do poszukiwania żywiciela po oczyszczeniu posiłku. Jeśli pożądany jest szybszy powrót, naukowcy mogą wybrać alternatywne posiłki solne "szybko oczyszczające", które są wydalane w ciągu około 6 godzin27. Podczas gdy skład prezentowanej tutaj mączki solankowej jest dopasowany do bezpośredniego porównania wyników ze sztuczną mączką z krwi, posiłek "szybkiego oczyszczania" bardziej odpowiada fizjologicznym poziomom soli znajdującym się we krwi kręgowców.
Opisane tutaj metody mają ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę przed wyborem testu, który jest najbardziej odpowiedni dla celów eksperymentalnych badacza. Opisane pomiary fluoresceiny nie pozwalają na ponowne wykorzystanie komarów do dodatkowych eksperymentów. Jednak pomiary masy ciała można wykonać przed ilościowym określeniem wielkości posiłku za pomocą testu fluoresceiny. Jeśli waga i wielkość posiłku są spójne w wielu badaniach dla danego posiłku, waga może być używana jako wskaźnik zastępczy w przyszłych eksperymentach. Co więcej, protokół ten nie rozróżnia deficytów w zachowaniach związanych z poszukiwaniem żywiciela a zachowaniami związanymi z karmieniem krwią; Komary, które wykazują trudności w znalezieniu karmnika membranowego, będą miały zmniejszone tempo żerowania i/lub wielkość posiłku. Dodając kamerę do rejestrowania zachowania podczas trwania testu, naukowcy mogą określić, czy samice nie mogą znaleźć glituby, czy też znajdują glirurkę, ale nie żerują.
Opisany tutaj test można zaadaptować do zbadania wielu nierozstrzygniętych kwestii związanych z zachowaniami żywieniowymi komarów. Na przykład udział określonych białek krwi można zbadać, zmieniając stosunek białek składowych lub całkowite stężenie białka w sztucznej mączce z krwi. Aby ocenić wielkość posiłków na podstawie wielu zdarzeń żywieniowych, można dodać barwniki o wyraźnych widmach fluorescencji, aby odróżnić posiłki od unikalnych źródeł37. Protokół ten można również zmodyfikować, aby oddzielnie stymulować wewnętrzne aparaty gębowe, które wykrywają krew i które są używane do spożycia (tj. Stylet), oraz przydatki chemosensoryczne, które stykają się ze skórą (tj. Wargi sromowe, nogi), gdy komar ląduje, aby rozpocząć karmienie krwią36. Na przykład, jeśli ligandy zostaną dodane bezpośrednio do posiłku, nie stykają się z wargami sromowymi i nogami, ponieważ błona jest przebijana tylko przez trzonek. Jeśli zamiast tego ligandy zostaną dodane do zewnętrznej powierzchni parafilmu, pozostają one oddzielone od mączki i mogą mieć kontakt z wargą sromową i nogami36. Wreszcie, szczegółowa kinetyka zachowań związanych z karmieniem krwią nie jest dobrze poznana, a przedstawiona tutaj metoda może zostać zmodyfikowana, aby połączyć śledzenie w wysokiej rozdzielczości z narzędziami uczenia maszynowego w celu wyodrębnienia odczytów behawioralnych lokomocji, postawy i dynamiki karmienia38.
Protokół ten ma być przyjazny dla użytkownika i opłacalny, z możliwością służenia naukowcom stosującym manipulacje farmakologiczne i genetyczne do badania zachowań komarów związanych z karmieniem krwią i po karmieniu krwią.

Przedstawiamy protokół podawania komarom Aedes aegypti zmodyfikowanych posiłków z krwi za pomocą karmnika z sztuczną membraną i precyzyjnego pomiaru objętości posiłku spożywanego przez każdego komara. Protokół ten może być elastycznie dostosowywany w celu zmiany zawartości posiłku lub porównania objętości posiłku spożywanego przez różne eksperymentalne grupy komarów.
Komar Ae. aegypti zagraża globalnemu zdrowiu, rozprzestrzeniając patogeny wywołujące choroby, w tym żółtą febrę, dengę, chikungunyę i Zika1,2,3,4,5. Samice Ae. aegypti są obowiązkowymi żywicielami krwi; Muszą spożywać krew kręgowców, aby uzyskać białko niezbędne do rozwoju jaj, a każde lęg jaj wymaga pełnego posiłku z krwi od co najmniej jednego gospodarza6,7,8. Samica komara najpierw gryzie swojego żywiciela, przebijając skórę swoim styletem i wstrzykując ślinę, która zawiera związki wywołujące odpowiedź immunologiczną gospodarza9. Następnie karmi się, pompując krew przez stylik do jelita środkowego. Podczas spożywania posiłku z krwi zakażonego żywiciela może ona połknąć patogeny przenoszone przez krew6,8, które następnie migrują z jelita środkowego komara do jego gruczołów ślinowych10. Samice komarów zarażone w ten sposób mogą rozprzestrzeniać chorobę poprzez wstrzykiwanie patogenów wraz ze śliną podczas gryzienia kolejnych gospodarzy11,12. Zrozumienie i ilościowe określenie mechanizmów zachowań związanych z odżywianiem się krwią jest kluczowym krokiem w kontrolowaniu przenoszenia chorób przenoszonych przez komary.
Wiele protokołów laboratoryjnych dotyczących hodowli komarów i eksperymentów wykorzystuje żywe zwierzęta, w tym myszy, świnki morskie lub ludzi, jako źródło krwi13,14,15,16. Wykorzystywanie żywych zwierząt wiąże się z problemami etycznymi, a także złożonymi wymaganiami dotyczącymi szkolenia personelu, trzymania i opieki nad zwierzętami oraz zgodności z polityką Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC). Ogranicza również rodzaje związków, które mogą być dostarczane komarom, co ogranicza badania, które można przeprowadzić17.
Sztuczne urządzenia do podawania krwi, które zazwyczaj używają systemu membranowego do symulacji skóry gospodarza, są użytecznymi narzędziami do badania zachowań związanych z karmieniem krwią, które omijają potrzebę utrzymywania żywych gospodarzy. Krew pełną można kupić u wielu sprzedawców i karmić komary za pomocą podgrzewanych, sztucznych karmników membranowych z płaszczem wodnym lub podobnych urządzeń18,19. W tym protokole demonstrujemy użycie małych, jednorazowych podajników membranowych zwanych "glirurkami". Ten podajnik membranowy, wcześniej opublikowany przez Costa-da-Silva et al. (2013)20, można łatwo zmontować ze standardowego sprzętu laboratoryjnego, dzięki czemu idealnie nadaje się do dostarczania posiłków z krwi umiarkowanej liczbie komarów i można go łatwo skalować w celu testowania większych grup lub wielu preparatów posiłków. Glytube jest niedrogą i wydajną alternatywą dla innych komercyjnych sztucznych karmników, które mogą wymagać większych objętości posiłków i są bardziej odpowiednie do grupowego karmienia dużych grup komarów na jednym posiłku formulation21.
Ten protokół zawiera dwie sekcje: przygotowywanie/dostarczanie sztucznych posiłków i ilościowe określanie konsumpcji. W pierwszej sekcji glirurki są używane jako skuteczny środek do dostarczania zmanipulowanej diety. Krew pełna może być zastąpiona całkowicie sztucznym posiłkiem w celu porównania skutków substytutów krwi zamiast mączki z krwi. Przepis zaczerpnięty z Kogan (1990)22 jest tutaj przedstawiony, chociaż opracowano wiele receptur sztucznych posiłków23,24. Ponadto karmienie jest mniej inwazyjną i mniej pracochłonną metodą wprowadzania związków farmakologicznych niż iniekcja. Ze względu na niewielką całkowitą objętość wymaganą do każdego posiłku (1–2 ml), protokół ten stanowi atrakcyjną metodę dostarczania w celu zmniejszenia ilości drogich odczynników. Samice Ae. aegypti chętnie spożywają bezbiałkowe posiłki z roztworem soli fizjologicznej z adenozyno-5′-trifosforanem (ATP)25,26, co stanowi punkt odniesienia do pomiaru wpływu pojedynczych składników posiłku. Na przykład receptor podobny do neuropeptydu Y 7 (NPYLR7) w Ae. aegypti jest znany z tego, że pośredniczy w supresji poszukiwania gospodarza po bogatym w białko posiłku z krwi, a gdy agoniści NPYLR7 są dodawani do bezbiałkowego posiłku solnego, samice komarów wykazują supresję poszukiwania żywiciela podobną do tych, które spożywały krew pełną7.
W drugiej sekcji przedstawiono kroki do ilościowego określania objętości każdego posiłku spożywanego przez pojedynczą samicę komara. Test ten jest oparty na fluorescencji i rejestruje stan karmienia w wyższej rozdzielczości niż metody, w których samice są klasyfikowane jako "karmione" lub "niekarmione" na podstawie samej wizualnej oceny wzdęcia brzucha. Dodając fluoresceinę do posiłku przed karmieniem, objętości posiłków spożywanych przez osobniki można określić ilościowo poprzez homogenizację każdego komara na 96-dołkowej płytce i pomiar intensywności fluorescencji jako odczyt. Test ten może mierzyć różnice w wigorze karmienia w odpowiedzi na zmienne, takie jak skład posiłku lub tło genetyczne komarów. Precyzyjna kwantyfikacja ma kluczowe znaczenie dla posiłków o średniej wielkości, na przykład, gdy samicom podaje się nieoptymalne posiłki zawierające środki odstraszające od karmienia lub gdy spożywają posiłki z sacharozy o różnych rozmiarach27. Jeśli karmione komary są wymagane do kolejnych testów behawioralnych po ilościowym określeniu wielkości posiłku, wielkość posiłku można zamiast tego obliczyć, ważąc znieczulone samice w grupach i szacując średnią zwiększoną masę na osobnika. Chociaż znakowanie fluoresceiną jest mniej precyzyjne niż oznaczanie fluoresceiną, ważenie nadal zapewnia zagregowane oszacowanie objętości posiłku i umożliwia zbadanie wpływu posiłku na dalsze procesy, takie jak płodność lub późniejsze przyciąganie gospodarza. Chociaż wielkość mączki z krwi jest zmienna i może na nią wpływać niezliczona ilość czynników11,28,29, spożywane posiłki mierzone za pomocą opisanych tutaj metod są zgodne z poprzednimi ocenami ilościowymi7,30,31.

<table><tbody><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Koralik borokrzemianowy z litego szkła o średnicy 3 mm</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z143928</td><td>Do stosowania do homogenizatora młynka perełkowego; nie jest wymagane w przypadku używania młynka do peletów</td></tr><tr><td>32 uncje plastikowy kubek z polietylenu o dużej gęstości (HDPE)</td><td>VWR</td><td>89009-668</td><td>Pokazano przykładowy pojemnik na komary używany do testów karmienia; można użyć alternatywnych opcji</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td> 96-dołkowa <td></td></tr><tr><td>płytka polistyrenowa</td><td>ThermoFisher</td><td>12-566-09</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa folia uszczelniająca do płytek PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Można zastosować alternatywne</td></tr><tr><td>opcje 96-dołkowe płytki PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9621</td><td>Można zastosować alternatywne opcje</td></tr><tr><td>Sól disodowa 5&prime;-trifosforanu (ATP) adenozyny hydrat</td><td>MilliporeSigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Albumina (surowica ludzka)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A9511</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213</td><td>Alternatywne opcje mogą być użyte do zablokowania światła wpadającego do pojemnika z fluoresceiną</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-911</td><td>Można zastosować alternatywne opcje</td></tr><tr><td>Homogenizator młyna perełkowego</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>Nie jest wymagane w przypadku korzystania z młynka do peletów</td></tr><tr><td>Wacik</td><td>Fisher Scientific</td><td>22456880</td><td>Do karmienia nektarem; można użyć alternatywnych opcji</td></tr><tr><td>Defibrynowana krew owcza</td><td>Hemostat Laboratories</td><td>DSB100</td><td>Można użyć alternatywnych opcji</td></tr><tr><td>Drosophila CO2 podkładka przeciw muchom</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td>Można użyć alternatywnych opcji</td></tr><tr><td>Fluoresceina</td><td>MilliporeSigma</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny czytnik płytek</td><td>ThermoFisher</td><td>VL0000D0</td><td>Można zastosować alternatywne opcje</td></tr><tr><td>Gamma-globulina (krew ludzka)</td><td>MiliporeSigma</td><td>H7379</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>MiliporeSigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Hemoglobina (ludzka)</td><td>MiliporeSigma</td><td>G4386</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjna folia do pakowania - parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>90-691</td><td>Można stosować alternatywne mieszadła magnetyczne</td></tr><tr><td>Mikrowirówka do płytki 96-dołkowej</td><td>VWR</td><td>80094-180</td><td>Można zastosować alternatywne opcje</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>MilliporeSigma</td><td>2236412</td><td>Można zastosować alternatywne opcje</td></tr><tr><td>Młynek do peletów</td><td>VWR</td><td>KT749521-1500</td><td>Nie jest wymagane w przypadku korzystania z homogenizatora młyna perełkowego</td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-516F</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>Można zastosować alternatywne opcje, takie jak tokarka dla lepszej spójności cięcia</td></tr><tr><td>Gumki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>McMaster Carr</td><td></td><td>Potrzebne w przypadku używania podkładki przeciwmuchowej do dostarczania CO2</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>MiliporeSigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512</td><td>Można użyć alternatywnych mieszadeł magnetycznych</td></tr><tr><td>Przezroczyste pudełko do przechowywania z polipropylenu ze zdejmowaną pokrywą</td><td></td><td></td><td>Pokazano przykładowe pudełko używane do testów karmienia</td></tr><tr><td>Mieszalnik</td><td></td><td></td><td></td>wirowy</tr><tr><td>Łaźnia</td><td></td><td></td> wodna <td>Można zastosować alternatywne urządzenie grzewcze</td></tr><tr><td>Biała moskitiera poliestrowa 0,8 mm American</td><td>Home & Nawyk Inc.</td><td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td><td>Można użyć alternatywnych opcji</td></tr></tbody></table>

karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów aedes aegypti

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Samice niektórych gatunków komarów mogą przenosić choroby podczas gryzienia kręgowców, aby uzyskać bogate w białko posiłki z krwi, niezbędne do rozwoju jaj. W laboratorium naukowcy mogą dostarczać komarom sztuczne posiłki z krwi pochodzenia zwierzęcego za pomocą karmników membranowych, które pozwalają na manipulowanie składem posiłków. W tym miejscu przedstawiamy metody podawania komarom Aedes aegypti krwi krwi i sztucznych posiłków z krwi oraz ilościowego określania objętości spożywanej przez poszczególne samice.
Ukierunkowane karmienie i kwantyfikacja posiłków sztucznych/krwistych mają szerokie zastosowanie, w tym testowanie wpływu składników posiłku na zachowanie i fizjologię komarów, dostarczanie związków farmakologicznych bez wstrzykiwań i infekowanie komarów określonymi patogenami. Dodanie barwnika fluoresceinowego do posiłku przed karmieniem pozwala na późniejsze określenie ilościowe wielkości posiłku. Objętość posiłku spożywanego przez komary może być mierzona albo na podstawie masy, jeśli samice mają być później wykorzystane do eksperymentów behawioralnych, albo poprzez homogenizację pojedynczych samic na 96-dołkowych płytkach i pomiar poziomu fluorescencji za pomocą czytnika płytek jako testu końcowego. Kwantyfikacja wielkości posiłku może być wykorzystana do określenia, czy zmiana składników posiłku zmienia objętość spożywanego posiłku, czy też spożycie posiłku różni się w zależności od szczepu komarów. Precyzyjna kwantyfikacja wielkości posiłku ma również kluczowe znaczenie dla dalszych testów, takich jak te, które mierzą wpływ na przyciąganie lub płodność żywiciela. Przedstawione tutaj metody mogą być dalej dostosowywane do śledzenia trawienia posiłków w ciągu dni lub do włączenia wielu rozróżnialnych markerów dodawanych do różnych posiłków (takich jak nektar i krew) w celu ilościowego określenia spożycia każdego posiłku przez jednego komara.
Te metody pozwalają badaczom samodzielnie przeprowadzać pomiary o wysokiej przepustowości w celu porównania objętości posiłku spożywanego przez setki pojedynczych komarów. Narzędzia te będą zatem szeroko przydatne dla społeczności badaczy komarów w celu uzyskania odpowiedzi na różne pytania biologiczne.

Rycina 1 przedstawia schemat montażu Glytube, natomiast Rycina 2 pokazuje ogólny zarys projektu eksperymentalnego służącego do pomiaru wielkości posiłku przy użyciu opisanego tutaj testu opartego na fluorescencji. Rycina 3 prezentuje reprezentatywne pomiary wielkości posiłku z fluoresceiną z eksperymentu z pobieraniem krwi. Rycina 4, Rycina 5 oraz Rycina 6 ilustrują przykłady pytań biologicznych, na które można odpowiedzieć, stosując niniejszy protokół. Zastosowania tego protokołu są szerokie i obejmują m.in. zmianę składu posiłku z krwi, podawanie związków farmakologicznych, precyzyjne ilościowe określanie suboptymalnych posiłków z krwi lub mniejszych posiłków z nektaru, a także porównywanie zachowań żerownych różnych genotypów komarów.
W celu wygenerowania krzywej wzorcowej do obliczeń objętości pokarmu, wartości fluorescencji nanosi się na wykres z wyznaczonych doń dołków referencyjnych, z których każdy zawiera niekarmionego komara oraz znaną objętość pokarmu z 0,002% fluoresceiny (Rysunek 3A). Odczyty fluorescencji z pozostałych dołków, zawierających komary z grupy kontrolnej ujemnej (niekarmione) lub z grupy eksperymentalnej (którym zaoferowano pokarm), porównuje się z tą krzywą wzorcową, aby określić objętość pokarmu (µL) spożytego przez każdego komara (Rysunek 3B). Aby zwalidować odczyty bazowe w tym teście, należy potwierdzić, że komarom z niekarmionej grupy kontrolnej ujemnej nie przypisano dodatniej wartości spożytego pokarmu w µL (Rysunek 3B, lewo). Mimo że wszystkim samicom w grupie eksperymentalnej zaoferowano posiłek z krwi, niektóre komary go spożyły (Rysunek 3B, środek), a niektóre nie (Rysunek 3B, prawo). Wynik ten pokazuje, że za pomocą tego protokołu można uzyskać dwa rodzaje danych: 1) procent całkowitej liczby samic, które żerują na danym pokarmie, oraz 2) objętość spożytą przez samice, które żerują na danym pokarmie.
Niniejszy protokół można wykorzystać do podawania i ilościowego oznaczania posiłków o różnych składach białkowych. Rycina 4A,B przedstawia dane zebrane przy użyciu posiłków z dodatkiem fluoresceiny. Na podstawie odczytów fluorescencji obliczono odpowiednio odsetek komarów, które żerowały, oraz objętość spożytego posiłku. Odczyty te są bardzo czułe i pozwalają na precyzyjne ilościowe oznaczenie w µL, jednak mają ograniczenie polegające na tym, że komary nie mogą być wykorzystane w przyszłych eksperymentach in vivo. Rycina 4C,D przedstawia dane zebrane w niezależnym eksperymencie z komarami, które po zaoferowaniu posiłków bez fluoresceiny oceniono wizualnie jako żerujące lub nieżerujące. Wielkość posiłku obliczono jako średnią masę na samicę dla grup 5 komarów. Chociaż pomiary masy są mniej czułe niż pomiary fluorescencji, pozwalają one na odzyskanie samic i ich wykorzystanie w dalszych eksperymentach in vivo. Odsetek komarów żerujących może się różnić w zależności od dni eksperymentalnych, co odzwierciedlają Rycina 4A oraz Rycina 4C.
Rysunek 5 przedstawia objętość spożytych posiłków zawierających leki regulujące zachowanie komarów podczas poszukiwania żywiciela. W tych eksperymentach samicom oferowano posiłki składające się z krwi, soli fizjologicznej + ATP lub soli fizjologicznej + ATP z dodatkiem 100 μM agonisty ludzkiego receptora NPY Y2, TM30338. Lek ten zmienia zachowanie podczas poszukiwania żywiciela poprzez aktywację receptora podobnego do NPY 7 u Ae. aegypti. Pomiar wielkości posiłku jest kluczowy dla interpretacji eksperymentów oceniających wpływ tego leku na zachowanie po spożyciu krwi, ponieważ pozwala badaczowi obliczyć dawkę przyjętą przez każdą samicę.
W poprzednich przykładach samice były karmione krwią lub zamiennikiem krwi, co w każdym przypadku skutkowało przyjęciem posiłków o objętości 3–5 µL (Rycina 3, Rycina 4, Rycina 5). Ten test oparty na fluorescencji może być również wykorzystany do pomiaru mniejszych i/lub bardziej zróżnicowanych wielkości posiłków, których nie można precyzyjnie określić na podstawie pomiarów średniej masy grupy. Na Rycynie 6 ten sam protokół kwantyfikacji fluorescencji zastosowano do pomiaru zachowań związanych z pobieraniem nektaru, zastępując Glytube kulką waty nasączoną 10% sacharozą zawierającą 0,002% fluoresceiny. Cukry nektarowe nie mogą być podawane w teście z użyciem Glytube, ponieważ samice nie są w stanie wykryć obecności cukrów nektarowych za pomocą styletu i nie rozpoczynają żerowania27. Dane te pozwalają badaczowi stwierdzić, że posiłki cukrowe są konsekwentnie mniejsze niż posiłki krwiste, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami34 (Rycina 6).
<img alt="Układ do karmienia komarów; probówki stożkowe w 45°C, schemat procesu pobierania pokarmu i obrazy z wynikami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Konfiguracja metody Glytube stosowanej do karmienia komarów. (A) Schemat rozłożonej konstrukcji Glytube używanej do podawania krwi oraz innych pokarmów komarom. (B) Schemat Glytube umieszczonego na pojemniku z komarami z pokrywką z siatki. Samice komarów mogą przebić się przez siatkę, aby pobrać pokarm. (C) Fotografie Glytube (góra) oraz samic Aedes aegypti przed, w trakcie i po karmieniu (dół, od lewej do prawej) za pomocą Glytube. Przedstawiono komary przebijające się przez siatkę pokrywającą pojemnik w celu uzyskania dostępu do karmnika membranowego. (D) Fotografie przedstawiające wygląd niekarmionych samic Ae. aegypti (lewo) oraz samic, które nasyciły się sztucznym pokarmem krwiowym (prawo, góra) lub roztworem soli fizjologicznej + ATP (prawo, dół). Metoda Glytube została wcześniej opisana w publikacji Costa-da-Silva et al. (2013)20. Fotografie w częściach (C) i (D) udostępnił Alex Wild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat eksperymentu karmienia komarów z analizą opartą na fluoresceinie w grupach kontrolnych karmionych krwią i niekarmionych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat ilościowego oznaczania wielkości posiłku po zastosowaniu protokołu karmienia krwią z użyciem Glytube.(A) Komary otrzymują posiłek z fluoresceiną (góra, grupa eksperymentalna) lub nie otrzymują posiłku (dół, niekarmiona grupa kontrolna ujemna). (B) Po zakończeniu eksperymentu karmienia poszczególne komary przenosi się do płytki 96-dołkowej. (C) Krzywa wzorcowa jest generowana przy użyciu znanych ilości posiłku zawierającego 0,002% fluoresceiny. (D) Komary są homogenizowane w celu uwolnienia spożytej fluoresceiny, a poziomy fluorescencji w każdym dołku są oznaczane ilościowo za pomocą czytnika płytek. Niniejsza metoda ilościowego oznaczania fluorescencji została zmodyfikowana na podstawie pracy Liesch et al. (2013)34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Krzywa wzorcowa pomiaru fluorescencji i wykres porównawczy wielkości posiłku z danymi dla osobników po żerowaniu na krwi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Eksperyment żerowania na krwi w systemie Glytube z kwantyfikacją opartą na fluoresceinie. (A) Pomiary krzywej wzorcowej uzyskane z dołków, do których dodano komara z grupy kontrolnej niepożywionej do znanej ilości posiłku zawierającego 0,002% fluoresceiny (skala osi y = jednostki umowne). (B) Objętość posiłku obliczona na podstawie odczytów fluorescencji dla samic w grupie kontrolnej niepożywionej (lewo, czarny, n = 40), grupie eksperymentalnej, która żerowała na krwi (środek, czerwony, n = 37), oraz grupie eksperymentalnej, która nie żerowała na krwi (prawo, czerwony, n = 23). Każdy punkt reprezentuje pomiar od pojedynczej samicy. Dane przedstawiono jako medianę z zakresem. Litery oznaczają grupy statystycznie różne, test Kruskala-Wallisa z wielokrotnym porównaniem Dunna, p&lt;0,01. Dane te zostały opublikowane w Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment karmienia komarów; wykres skrzypcowy przedstawiający pobranie posiłku z krwi: owcza, sztuczna, sól fizjologiczna+ATP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Ilościowe oznaczenie posiłków o różnym składzie białkowym. Samicom oferowano posiłki składające się z krwi owczej (czerwony), sztucznej krwi z ludzkimi białkami krwi (Kogan (1990)22) (pomarańczowy) lub posiłku z soli fizjologicznej + ATP bez białek (błękitny)7. (A) Procent nakarmionych samic oceniony na podstawie odczytów fluorescencji. Każdy punkt reprezentuje grupę 12–16 samic. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami, n = 12. (B) Objętość posiłku obliczona na podstawie odczytów fluorescencji. Każdy punkt reprezentuje pomiar od pojedynczej samicy w jednej próbie z Rysunku 4A. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami, n = 12. (C) Procent samic całkowicie nasyconych po karmieniu przez sztuczną membranę, oceniony wizualnie. Każdy punkt reprezentuje procent nasyconych samic z grup liczących 20–30 osobników. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami, n = 23. (D) Wielkość posiłków oceniona jako masa/samica po wizualnej ocenie statusu karmienia. Masę obliczono jako średnią z grup po 5 komarów. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami, n = 23. A–D: Litery oznaczają grupy statystycznie różne, test Kruskala-Wallisa z wielokrotnym porównaniem Dunna, p&lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres skrzypcowy wielkości posiłków komarów w zależności od roztworu pokarmowego (krew, sól fizjologiczna+ATP, sól fizjologiczna+ATP+agonista NPYR)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Ilościowe oznaczenie posiłków z zastosowaniem związków farmakologicznych. Samice przyjmują posiłki o tej samej wielkości w przypadku krwi owczej (czerwony), soli fizjologicznej + ATP (akwamaryna) oraz soli fizjologicznej + ATP + dawką 100 µM ludzkiego agonisty receptora NPY Y2 TM30338 (ciemnoniebieski). Objętość posiłku obliczono na podstawie odczytów fluorescencji. Każdy punkt reprezentuje pomiar od pojedynczej samicy. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami, n = 12. Litery oznaczają grupy istotnie statystycznie różne, test Kruskala-Wallisa z wielokrotnym porównaniem Dunna, p&lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Test żerowania na nektarze; schemat z użyciem bawełnianej kulki; wykres wielkości posiłków dla wyników karmienia cukrem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Kwantyfikacja mniejszych porcji nektaru. (A) Schemat testu żerowania na nektarze. (B) Objętość posiłku obliczona na podstawie odczytów fluorescencji dla samic typu dzikiego, którym w teście żerowania na nektarze oferowano posiłki składające się z wody (kolor niebieski, n = 36) lub 10% sacharozy (kolor zielony, n = 53), z dodatkiem 0,002% fluoresceiny. Każdy punkt reprezentuje pomiar od pojedynczej samicy. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami. Litery oznaczają grupy statystycznie różne, test Manna-Whitneya, p&lt;0.05. Dane te zostały opublikowane w pracy Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="4">Sztuczny posiłek z krwi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Stężenie roztworu zapasu (mg/mL)</td>
			<td >Objętość roztworu zapasu w posiłku (μL/mL)</td>
			<td >Końcowe stężenie w posiłku (mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4">Komponenty białkowe*</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >γ-Globuliny</td>
			<td >50</td>
			<td >300</td>
			<td >15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemoglobina</td>
			<td >35</td>
			<td >230</td>
			<td >8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Albumina</td>
			<td >300</td>
			<td >340</td>
			<td >102</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Całkowite białko</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >125</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4">Komponenty niebiałkowe</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Stężenie roztworu zapasu (mM)</td>
			<td >Objętość roztworu zapasu w posiłku (μL/mL)</td>
			<td >Końcowe stężenie w posiłku (mM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >W zapasie γ-globuliny</td>
			<td >-</td>
			<td >5-10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaHCO3</td>
			<td >W zapasie γ-globuliny</td>
			<td >-</td>
			<td >120</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATP</td>
			<td >200</td>
			<td >5</td>
			<td >1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Woda</td>
			<td >-</td>
			<td >125</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4">*Komponenty białkowe przygotowuje się w roztworze zapasu z wody dwukrotnie destylowanej, z wyjątkiem γ-globulin, które rozpuszcza się w 400 mM NaHCO3 i zawierają zmienną ilość NaCl (2-4%) w produkcie.</td >
		</tr>
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Receptura przygotowania sztucznych posiłków krwi (zaadaptowana z Kogan (1990)22). Sztuczna krew składa się z komponentów białkowych i niebiałkowych regularnie występujących w ludzkiej krwi i umożliwia zmianę proporcji tych składników. Komary mogą składać jaja po żywieniu się sztuczną krwią7,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Posiłek solny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Stężenie roztworu zapasowego (mM)</td>
			<td>Objętość roztworu zapasowego w posiłku (μL/mL)</td>
			<td>Końcowe stężenie posiłku (mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO₃3</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Receptura posiłku solnego z ATP (adaptowana z Duvall et al. (2019)7). Bezbiałkowe posiłki solne mogą być wykorzystywane do podawania interesujących związków komórkom komarów, naśladując rozciągnięcie odwłoka występujące po żerowaniu na krwi, ale bez wywoływania rozwoju jaj, który następuje po spożyciu białek.

Celem tego protokołu jest dostarczanie komarom Aedes aegypti pokarmów pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków z krwi za pomocą sztucznego karmnika membranowego i precyzyjne określenie ilościowe ilości spożytego posiłku.

Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Technika ta pozwala naukowcom na karmienie i samodzielne wykonywanie pomiarów o wysokiej przepustowości w celu porównania objętości posiłków spożywanych przez setki pojedynczych komarów. Może być adaptacyjny do zmiany zawartości posiłku lub do porównywania objętości spożywanej przez różne grupy eksperymentalne. Protokół ten ma być przyjazny dla użytkownika i tani.Do manipulacji farmakologicznych i genetycznych, do badania zachowań komarów związanych z karmieniem krwią i po powodzi. Organizacja ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu. Przygotuj wcześniej zestaw i odczynniki, abyś mógł szybko dostarczyć posiłki komarom.Aby rozpocząć, przenieś 1,98 do dwóch mililitrów zdefibrynowanej krwi owczej do 15-mililitrowej stożkowej probówki. W przypadku wykonywania fluorescencyjnego oznaczania ilościowego wielkości posiłku należy dodać roztwór fluoresceiny do końcowego stężenia 0,002%, zmniejszając objętość krwi o tę samą ilość, co dodana fluoresceina. Zachowaj jeden mililitr końcowej formuły posiłku, aby wygenerować wzorcową krzywą odniesienia.Wszystkie posiłki i roztwory zawierające fluoresceinę należy zawinąć w folię aluminiową lub przechowywać w ciemności. Aby przygotować bezbiałkowe posiłki solankowe, połącz 600 mikrolitrów 400-milimolowego wodorowęglanu sodu z 1,39 mililitra podwójnie destylowanej wody w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Jeżeli następnie ma być przeprowadzone ilościowe oznaczanie wielkości posiłku na podstawie fluorescencji, należy dodać roztwór fluoresceiny do końcowego stężenia 0,002%Zmniejszając objętość wody o tę samą ilość, co dodana fluoresceina.Zachować co najmniej jeden mililitr końcowej formuły posiłku zawierającej 0,002% fluoresceiny w celu wygenerowania wzorcowej krzywej odniesienia. Odłóż przygotowane posiłki na bok, aż będziesz gotowy do ich dostarczenia. Wszystkie posiłki i roztwory zawierające fluoresceinę należy zawinąć w folię aluminiową lub przechowywać w ciemności.Umieść eksperymentalną grupę samic komarów w pojemniku i przykryj je siatką. Pozwól tym samicom zaaklimatyzować się w komorze karmienia. Odłóż na bok grupę kontrolną niekarmionych komarów, którym nie zostanie zaoferowany posiłek.Aby skonstruować rurkę GLI, napełnij 50-mililitrową rurkę stożkową 40 mililitrami 100% glicerolu. Uszczelnij otwartą stożkową rurkę dwoma kawałkami parafilmu, aby zminimalizować ryzyko wycieku. Opcjonalnie przytrzymaj parafilm na miejscu za pomocą gumek recepturkach.Odwróć rurkę, aby upewnić się, że nie ma ani szczelin. Aby stworzyć urządzenie do dostarczania posiłków, wytnij wyśrodkowany 2,5-centymetrowy otwór w zakrętce stożkowej rurki za pomocą ostrej żyletki lub lawy. Rozciągnij równomiernie kawałek parafilmu, aby z grubsza podwoił swoją objętość.Parafilm powinien być na tyle cienki, aby komary mogły go łatwo przebić, ale nie powinno być żadnych przecieków. Uszczelnij zewnętrzną powierzchnię nakrętki parafilmem, aby całkowicie zakryć otwór, i odłóż nakrętkę na bok. Podgrzewaj zarówno szczelnie zamkniętą probówkę z glicerolem, jak i krew i sól fizjologiczną oraz łaźnię wodną o temperaturze od 42 do 45 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut.Dodaj ATP do podgrzanego posiłku i dokładnie wymieszaj. Odpipetuj dwa mililitry podgrzanego posiłku do wewnętrznej komory zakrętki i delikatnie umieść na niej odwróconą, podgrzaną stożkową rurkę wypełnioną glicerolem. Częściowo przykręć nakrętkę z mączką do rurki wypełnionej glicerolem, tylko na tyle, aby zapobiec wyciekowi mączki lub glicerolu.Umieść zmontowaną rurkę gly na pojemniku na komary, nałóż dwutlenek węgla i pozwól komarom na dostęp do pożywienia przez co najmniej 15 minut, aby osiągnąć maksymalne dawki karmienia. Po karmieniu nakrętkę rurki GLI można wyrzucić jako odpad stanowiący zagrożenie biologiczne lub ponownie użyć po namoczeniu w niskoprocentowym roztworze wybielacza i dokładnym spłukaniu w wodzie. Aby wygenerować wzorcową krzywą odniesienia, należy przygotować seryjne rozcieńczenie tego samego posiłku zawierającego 0,002% fluoresceiny, który zaoferowano grupie eksperymentalnej komarów.Aby uzyskać pierwszy roztwór krzywej wzorcowej, dodaj 50 mikrolitrów mączki zawierającej 0,002% fluoresceiny do 950 mikrolitrów PBS i dokładnie odwiruj. Wykonać dwukrotne rozcieńczenia dla pozostałych roztworów krzywej wzorcowej, dobrze wirując przed każdym rozcieńczeniem. Odpipetować 100 mikrolitrów każdego z roztworów krzywej wzorcowej do każdego z ośmiu dołków w pierwszej kolumnie 96-dołkowej płytki PCR.Dodaj jednego znieczulonego lub zamrożonego, niekarmionego komara kontrolnego do każdej z tych samych ośmiu studzienek. Powtórzyć czynności w drugiej kolumnie płytki dla powtórzonego pomiaru. Dodaj 100 mikrolitrów PBS do każdej pozostałej studzienki dla niekarmionych grup kontrolnych i eksperymentalnych.Jako kontrolę ujemną dodaj jednego niekarmionego komara do każdej studzienki w następnych dwóch kolumnach płytki. Dodaj jednego komara na studzienkę do pozostałych studzienek z grup eksperymentalnych, którym zaoferowano posiłek. Dodaj trzy milimetrowe kulki ze szkła borokrzemianowego do każdej studzienki, jeśli rozbijasz tkankę za pomocą homogenizatora do młynków perełkowych.Ostrożnie uszczelnij płytkę i rozbij tkankę, a następnie odwiruj płytkę z prędkością 2000 obr./min przez jedną do dwóch minut, aby zebrać lizat. Przygotuj czarną 96-dołkową płytkę ze 180 mikrolitrami PBS w każdym dołku. Następnie dodaj 20 mikrolitrów lizatu do każdej studzienki i wymieszaj.Zmierz intensywność fluoresceiny za pomocą czytnika płytek z 485 kanałami wzbudzenia i 520 kanałami emisyjnymi. Proszę wygenerować wzorcową krzywą odniesienia, wykreślając znaną objętość mączki w stosunku do odpowiedniego pomiaru intensywności fluorescencji. Korzystając z wygenerowanej referencyjnej krzywej wzorcowej, ekstrapolować objętość posiłku spożytego przez każdy z komarów z grupy doświadczalnej.Odejmij średni odczyt intensywności fluorescencji niekarmionej ujemnej grupy kontrolnej od odczytu intensywności fluorescencji każdej grupy eksperymentalnej, aby skorygować wyjściową autofluorescencję tkanek. Aby zmierzyć wielkość posiłku fluoresceinowego z eksperymentu z karmieniem krwią, wygenerowano krzywą standardową, wykreślając odczyty fluorescencji z wyznaczonych studzienek referencyjnych zawierających niekarmionego komara i znaną objętość mączki z 0,002% fluoresceiny. Odczyty fluorescencji z pozostałych studzienek, w których znajdują się komary z niekarmionej grupy kontroli negatywnej komarów lub eksperymentalnej grupy komarów, którym zaoferowano posiłek, są porównywane z tą krzywą standardową w celu ilościowego określenia objętości spożytego posiłku.Chociaż wszystkim samicom w grupie eksperymentalnej zaoferowano posiłek z krwi, niektóre komary karmiły, a niektóre nie. Protokół ten może być stosowany do dostarczania i ilościowego oznaczania posiłków o różnym składzie białkowym. Dane zebrane przy użyciu posiłków z dodatkiem fluorycyny przedstawiono tutaj.Przeprowadzono również niezależny eksperyment, w którym komary oceniano jako karmione lub niekarmione naocznie, po zaoferowaniu im posiłków bez fluorycyny. Protokół ten został wykorzystany do określenia objętości spożywanych posiłków za pomocą leków, które regulują zachowanie poszukiwania komarów. W tych eksperymentach samicom podawano sól fizjologiczną i posiłki ATP z ludzkim agonistą receptora NPY dwa.Technika ta została również wykorzystana do pomiaru zachowań żywieniowych nektaru, poprzez wymianę rurki gly na wacik nasycony 10% sacharozą zawierającą 0,002% fluoresceiny, wykazując, że można ją wykorzystać do pomiaru mniejszych lub bardziej zmiennych rozmiarów posiłków, których nie można dokładnie odróżnić od pomiarów masy ciała grupy. Najważniejszą rzeczą podczas wykonywania tego protokołu jest uporządkowanie próbek w zdarzeniach i odłożenie na bok niekarmionych komarów i jednego ML każdego posiłku w celu wygenerowania krzywej standardowej. Po tej procedurze można obserwować zachowanie zwierząt po karmieniu krwią i śledzić trawienie.Metoda ta pozwala naukowcom ocenić zmiany w spożyciu posiłków u komarów modyfikowanych genetycznie. Zapewnia również prosty, szybki i nieinwazyjny sposób dostarczania komarom leków i testowania ich wpływu na zachowanie.

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Opisano metody wykorzystania systemów transdukcyjnych alfawirusów do ekspresji reporterów fluorescencyjnych in vitro oraz u dorosłych komarów. Technikę tę można dostosować w celu ekspresji dowolnego białka docelowego zamiast reportera lub dodatkowo do niego.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Ten film demonstruje test odżywiania krwią w celu oceny śmiertelności i płodności badanych związków o nowych sposobach działania na samice komarów. Technika ta pomaga w badaniach przesiewowych nowych klas insektycydów w celu zabicia opornej populacji komarów i kontrolowania rozprzestrzeniania się choroby.

Test żerowania komarów: metoda oceny wpływu badanego związku na śmiertelność i płodność dorosłych samic komarów

Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.

Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Przedstawiono protokół tworzenia sztucznej diety bez krwi do karmienia komarów Anopheles w niewoli. Dieta ta ma podobną wydajność do krwi kręgowców i wyzwala oogenezę i dojrzewanie jaj oraz daje zdolne do życia dorosłe potomstwo.

Bezkrwawa dieta do hodowli komarów Anopheline

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Obecny protokół opisuje, jak mierzyć dane dotyczące typowych parametrów życia komarów Aedes aegypti, w tym płodności, rozmiaru skrzydeł, płodności, stosunku płci, żywotności, czasu rozwoju, wkładu samców i długowieczności dorosłych. Pomiary te można wykorzystać do oceny przydatności komarów transgenicznych.

Ilościowe określanie kosztów przystosowania u transgenicznych komarów Aedes aegypti

Poznaj metodę karmienia i ilościowego oznaczania krwi u komarów Aedes aegypti przy użyciu sztucznego podajnika z fluorescyną. Protokół umożliwia precyzyjne pomiary objętości pobranego posiłku w badaniach entomologicznych.

Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

Przeglądaj więcej filmów