Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

Technika ta pozwala naukowcom na karmienie i samodzielne wykonywanie pomiarów o wysokiej przepustowości w celu porównania objętości posiłków spożywanych przez setki pojedynczych komarów. Może być adaptacyjny do zmiany zawartości posiłku lub do porównywania objętości spożywanej przez różne grupy eksperymentalne. Protokół ten ma być przyjazny dla użytkownika i tani

Do manipulacji farmakologicznych i genetycznych, do badania zachowań komarów związanych z karmieniem krwią i po powodzi. Organizacja ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu. Przygotuj wcześniej zestaw i odczynniki, abyś mógł szybko dostarczyć posiłki komarom.

Aby rozpocząć, przenieś 1,98 do dwóch mililitrów zdefibrynowanej krwi owczej do 15-mililitrowej stożkowej probówki. W przypadku wykonywania fluorescencyjnego oznaczania ilościowego wielkości posiłku należy dodać roztwór fluoresceiny do końcowego stężenia 0,002%, zmniejszając objętość krwi o tę samą ilość, co dodana fluoresceina. Zachowaj jeden mililitr końcowej formuły posiłku, aby wygenerować wzorcową krzywą odniesienia.

Wszystkie posiłki i roztwory zawierające fluoresceinę należy zawinąć w folię aluminiową lub przechowywać w ciemności. Aby przygotować bezbiałkowe posiłki solankowe, połącz 600 mikrolitrów 400-milimolowego wodorowęglanu sodu z 1,39 mililitra podwójnie destylowanej wody w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Jeżeli następnie ma być przeprowadzone ilościowe oznaczanie wielkości posiłku na podstawie fluorescencji, należy dodać roztwór fluoresceiny do końcowego stężenia 0,002%Zmniejszając objętość wody o tę samą ilość, co dodana fluoresceina.

Zachować co najmniej jeden mililitr końcowej formuły posiłku zawierającej 0,002% fluoresceiny w celu wygenerowania wzorcowej krzywej odniesienia. Odłóż przygotowane posiłki na bok, aż będziesz gotowy do ich dostarczenia. Wszystkie posiłki i roztwory zawierające fluoresceinę należy zawinąć w folię aluminiową lub przechowywać w ciemności.

Umieść eksperymentalną grupę samic komarów w pojemniku i przykryj je siatką. Pozwól tym samicom zaaklimatyzować się w komorze karmienia. Odłóż na bok grupę kontrolną niekarmionych komarów, którym nie zostanie zaoferowany posiłek.

Aby skonstruować rurkę GLI, napełnij 50-mililitrową rurkę stożkową 40 mililitrami 100% glicerolu. Uszczelnij otwartą stożkową rurkę dwoma kawałkami parafilmu, aby zminimalizować ryzyko wycieku. Opcjonalnie przytrzymaj parafilm na miejscu za pomocą gumek recepturkach.

Odwróć rurkę, aby upewnić się, że nie ma ani szczelin. Aby stworzyć urządzenie do dostarczania posiłków, wytnij wyśrodkowany 2,5-centymetrowy otwór w zakrętce stożkowej rurki za pomocą ostrej żyletki lub lawy. Rozciągnij równomiernie kawałek parafilmu, aby z grubsza podwoił swoją objętość.

Parafilm powinien być na tyle cienki, aby komary mogły go łatwo przebić, ale nie powinno być żadnych przecieków. Uszczelnij zewnętrzną powierzchnię nakrętki parafilmem, aby całkowicie zakryć otwór, i odłóż nakrętkę na bok. Podgrzewaj zarówno szczelnie zamkniętą probówkę z glicerolem, jak i krew i sól fizjologiczną oraz łaźnię wodną o temperaturze od 42 do 45 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut.

Dodaj ATP do podgrzanego posiłku i dokładnie wymieszaj. Odpipetuj dwa mililitry podgrzanego posiłku do wewnętrznej komory zakrętki i delikatnie umieść na niej odwróconą, podgrzaną stożkową rurkę wypełnioną glicerolem. Częściowo przykręć nakrętkę z mączką do rurki wypełnionej glicerolem, tylko na tyle, aby zapobiec wyciekowi mączki lub glicerolu.

Umieść zmontowaną rurkę gly na pojemniku na komary, nałóż dwutlenek węgla i pozwól komarom na dostęp do pożywienia przez co najmniej 15 minut, aby osiągnąć maksymalne dawki karmienia. Po karmieniu nakrętkę rurki GLI można wyrzucić jako odpad stanowiący zagrożenie biologiczne lub ponownie użyć po namoczeniu w niskoprocentowym roztworze wybielacza i dokładnym spłukaniu w wodzie. Aby wygenerować wzorcową krzywą odniesienia, należy przygotować seryjne rozcieńczenie tego samego posiłku zawierającego 0,002% fluoresceiny, który zaoferowano grupie eksperymentalnej komarów.

Aby uzyskać pierwszy roztwór krzywej wzorcowej, dodaj 50 mikrolitrów mączki zawierającej 0,002% fluoresceiny do 950 mikrolitrów PBS i dokładnie odwiruj. Wykonać dwukrotne rozcieńczenia dla pozostałych roztworów krzywej wzorcowej, dobrze wirując przed każdym rozcieńczeniem. Odpipetować 100 mikrolitrów każdego z roztworów krzywej wzorcowej do każdego z ośmiu dołków w pierwszej kolumnie 96-dołkowej płytki PCR.

Dodaj jednego znieczulonego lub zamrożonego, niekarmionego komara kontrolnego do każdej z tych samych ośmiu studzienek. Powtórzyć czynności w drugiej kolumnie płytki dla powtórzonego pomiaru. Dodaj 100 mikrolitrów PBS do każdej pozostałej studzienki dla niekarmionych grup kontrolnych i eksperymentalnych.

Jako kontrolę ujemną dodaj jednego niekarmionego komara do każdej studzienki w następnych dwóch kolumnach płytki. Dodaj jednego komara na studzienkę do pozostałych studzienek z grup eksperymentalnych, którym zaoferowano posiłek. Dodaj trzy milimetrowe kulki ze szkła borokrzemianowego do każdej studzienki, jeśli rozbijasz tkankę za pomocą homogenizatora do młynków perełkowych.

Ostrożnie uszczelnij płytkę i rozbij tkankę, a następnie odwiruj płytkę z prędkością 2000 obr./min przez jedną do dwóch minut, aby zebrać lizat. Przygotuj czarną 96-dołkową płytkę ze 180 mikrolitrami PBS w każdym dołku. Następnie dodaj 20 mikrolitrów lizatu do każdej studzienki i wymieszaj.

Zmierz intensywność fluoresceiny za pomocą czytnika płytek z 485 kanałami wzbudzenia i 520 kanałami emisyjnymi. Proszę wygenerować wzorcową krzywą odniesienia, wykreślając znaną objętość mączki w stosunku do odpowiedniego pomiaru intensywności fluorescencji. Korzystając z wygenerowanej referencyjnej krzywej wzorcowej, ekstrapolować objętość posiłku spożytego przez każdy z komarów z grupy doświadczalnej.

Odejmij średni odczyt intensywności fluorescencji niekarmionej ujemnej grupy kontrolnej od odczytu intensywności fluorescencji każdej grupy eksperymentalnej, aby skorygować wyjściową autofluorescencję tkanek. Aby zmierzyć wielkość posiłku fluoresceinowego z eksperymentu z karmieniem krwią, wygenerowano krzywą standardową, wykreślając odczyty fluorescencji z wyznaczonych studzienek referencyjnych zawierających niekarmionego komara i znaną objętość mączki z 0,002% fluoresceiny. Odczyty fluorescencji z pozostałych studzienek, w których znajdują się komary z niekarmionej grupy kontroli negatywnej komarów lub eksperymentalnej grupy komarów, którym zaoferowano posiłek, są porównywane z tą krzywą standardową w celu ilościowego określenia objętości spożytego posiłku.

Chociaż wszystkim samicom w grupie eksperymentalnej zaoferowano posiłek z krwi, niektóre komary karmiły, a niektóre nie. Protokół ten może być stosowany do dostarczania i ilościowego oznaczania posiłków o różnym składzie białkowym. Dane zebrane przy użyciu posiłków z dodatkiem fluorycyny przedstawiono tutaj.

Przeprowadzono również niezależny eksperyment, w którym komary oceniano jako karmione lub niekarmione naocznie, po zaoferowaniu im posiłków bez fluorycyny. Protokół ten został wykorzystany do określenia objętości spożywanych posiłków za pomocą leków, które regulują zachowanie poszukiwania komarów. W tych eksperymentach samicom podawano sól fizjologiczną i posiłki ATP z ludzkim agonistą receptora NPY dwa.

Technika ta została również wykorzystana do pomiaru zachowań żywieniowych nektaru, poprzez wymianę rurki gly na wacik nasycony 10% sacharozą zawierającą 0,002% fluoresceiny, wykazując, że można ją wykorzystać do pomiaru mniejszych lub bardziej zmiennych rozmiarów posiłków, których nie można dokładnie odróżnić od pomiarów masy ciała grupy. Najważniejszą rzeczą podczas wykonywania tego protokołu jest uporządkowanie próbek w zdarzeniach i odłożenie na bok niekarmionych komarów i jednego ML każdego posiłku w celu wygenerowania krzywej standardowej. Po tej procedurze można obserwować zachowanie zwierząt po karmieniu krwią i śledzić trawienie.

Metoda ta pozwala naukowcom ocenić zmiany w spożyciu posiłków u komarów modyfikowanych genetycznie. Zapewnia również prosty, szybki i nieinwazyjny sposób dostarczania komarom leków i testowania ich wpływu na zachowanie.