Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu
26 września 2020
Ten artykuł przedstawia szereg następujących po sobie metod ekspresji i oczyszczania syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium w tym protokole, szybkim systemie do oczyszczania kompleksu białkowego w ciągu jednego dnia. Omówione metody to mutageneza ukierunkowana na miejsce, ekspresja białek w Escherichia coli, chromatografia powinowactwa, chromatografia filtracji żelowej i krystalizacja.
Ten protokół oczyszczania enzymu syntazy tryptofanu z Salmonella typhimurium jest szybki, prosty i krótki. Frakcjonowanie siarczanu amoniaku i chromatografia wykluczania wielkości umożliwiają oczyszczenie kompleksu syntazy tryptofanu typu dzikiego i zmutowanego w ciągu jednego dnia. Technika ta może być stosowana do oczyszczania innych powiązanych białek, ponieważ frakcjonowanie siarczanu amoniaku i chromatografia wykluczania wielkości są powszechnie stosowane do oczyszczania nieznakowanych białek.
Na początek rozbij osad komórkowy przez sonikację w lodowatej kąpieli wodnej o amplitudzie 80% przez 20 cykli przy użyciu 10-sekundowych impulsów i 20-sekundowych odpoczynków. Odwirować lizat komórkowy w ilości 30 000 g przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza i odessać supernatant bez usuwania osadu. Przefiltrować oczyszczoną frakcję supernatantu za pomocą filtra 0,45 mikrometra w temperaturze pokojowej.
Powoli dodawać niewielkie ilości siarczanu amonu do filtratu, aż do osiągnięcia 20% nasycenia. Przeprowadzić frakcjonowanie siarczanu amonu w temperaturze 25 stopni Celsjusza i delikatnie mieszać roztwór przez 10 minut, uważając, aby nie powstały pęcherzyki. Ponownie odwirować roztwór przez 10 minut i przenieść supernatant do czystej kolby w celu dalszego użycia.
Delikatnie ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach buforu do próbki i przygotować próbkę do uruchomienia SDS-PAGE. Dodać siarczan amonu do supernatantu do osiągnięcia 30% nasycenia i mieszać roztwór, unikając pęcherzyków. Ponownie odwirować roztwór przez 10 minut i przenieść supernatant do czystej kolby w celu dalszego użycia.
Delikatnie zawiesić otrzymaną 40% frakcję osadu w 10 mililitrach drugiego bufora próbki i przygotować próbkę do uruchomienia SDS-PAGE. Następnie należy przeprowadzić mikrowirowanie 40% próbki białka w temperaturze 10 000 razy g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i załadować otrzymany supernatant na wcześniej zrównoważoną kolumnę HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR podłączoną do przyrządu do szybkiej chromatografii cieczowej białek przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę. Oceń zebrane frakcje pikowe i frakcje siarczanu amonu na 12%SDS-PAGE żelu barwionym błękitem brylantowym Coomassie.
Skoncentrować kompleks syntazy tryptofanu Salmonella typu dzikiego lub zmutowanego alfa-dwa-beta-dwa za pomocą 100-kilodaltonowego filtra odśrodkowego, wirując z prędkością 3000 razy g, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść skoncentrowane białko do świeżej dwumililitrowej probówki i ponownie odwirować przy 10 000 g przez 10 minut w czterech stopniach w celu usunięcia agregatów. Po określeniu stężenia białka w próbce należy przygotować porcje o pojemności 0,5 mililitra w stężeniu od 20 do 25 miligramów na mililitr.
Błyskawicznie zamroź je w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni. Przygotuj pięciomililitrowy roztwór podstawowy 200-milimolowej sperminy w wodzie i przechowuj go w 500 mikrolitrowych porcjach w temperaturze minus 20 stopni. Następnie przygotuj 50-mililitrowy roztwór podstawowy 30% glikolu polietylenowego 8 000 w wodzie i trzymaj 25 mililitrów w 50-mililitrowej jednorazowej kolbie stożkowej wirówki w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Przygotuj 25-mililitrowe roztwory podstawowe jednomolowego chlorku cezu i chlorku sodu, każdy w wodzie, i utrzymuj je w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przygotować trzy zestawy 50-mililitrowych roztworów podstawowych jednomolowej bicyny i miareczkować je wodorotlenkiem cezu lub wodorotlenkiem sodu, aby otrzymać roztwory buforowe o pH 7,6, 7,8 i ośmiu. Przechowywać 25-mililitrowe porcje roztworów w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Rozmrozić próbkę kompleksu syntazy tryptofanu alfa-dwóch beta-dwóch Salmonella typhimurium w łaźni lodowej. Następnie odwiruj go w temperaturze 10 000 razy g przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przenieść klarowną frakcję supernatantu do czystej probówki wirówkowej.
Oszacować stężenie białka w supernatance i rozcieńczyć podwielokrotności do 15 miligramów na mililitr 50-milimolowym wodorotlenkiem cezu bicyny lub wodorotlenkiem sodu biciyny o pH 7,8, zawierającym 50-milimolowy cez lub chlorek sodu. Przygotuj 500 mikrolitrów roztworów zbiornikowych dla trzech 24-dołkowych płytek osadowych w sterylnych 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Zmieniaj stężenie PEG 8, 000 i sperminy oraz zmieniaj pH buforu zgodnie z opisem w manuskrypcie dla każdego zestawu.
Zakryj probówki i energicznie wiruj przez 10 sekund, a następnie odwiruj je w temperaturze 10 000 razy g przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Dozować 500 mikrolitrów tego roztworu do każdego zbiornika. Dozować pięć mikrolitrów roztworu białkowego w ilości 15 mikrogramów na litr do każdej kropli do siedzenia za pomocą mikropipety P-10.
Następnie dodaj pięć mikrolitrów każdego odpowiedniego roztworu zbiornika do kropli białka. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas mieszania i nie pipetuj w górę i w dół. Na koniec przykryj płytkę przezroczystą taśmą klejącą i przechowuj ją w temperaturze 25 stopni.
Kryształy pojawiają się w ciągu dwóch do pięciu dni i rosną do pełnych wymiarów w ciągu dwóch tygodni. Protokół ten został wykorzystany do subklonacji podjednostki alfa i podjednostki beta syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium do zmodyfikowanego wektora pET SUMO. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki SDS-PAGE dwóch silnych prążków odpowiadających białku fuzyjnemu syntazy tryptofanu His6-SUMO-alpha i His6-SUMO-beta.
Każde białko oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa kwasu niklowo-nitrylotrioctowego i wytrącania siarczanu amonu, a następnie rozszczepienia znacznika His-SUMO, usunięcia śladów znacznika His-SUMO i pomiaru stężenia białka. Przedstawiono tutaj profil elucji podjednostki alfa, podjednostki beta i kompleksu syntazy tryptofanu alfa-dwóch beta-dwóch Salmonella typhimurium na SEC oraz czystość ich frakcji szczytowych. Po wygenerowaniu zmutowanych form kompleksu syntazy tryptofanu, zastosowano frakcjonowanie siarczanu amonu w celu usunięcia białek zanieczyszczających z heterologicznego systemu ekspresji.
Przedstawiono tutaj reprezentatywny profil elucji ze względną pozycją elucji kompleksu syntazy tryptofanu alfa-dwóch beta-dwóch Salmonella typhimurium na kolumnie chromatografii wykluczającej. Czystość wykluczonych frakcji pikowych analizowano za pomocą SDS-PAGE przed łączeniem. Duże monokryształy uzyskano poprzez optymalizację dokładnej krystalizacji poprzez zmianę stężenia PEG 8, 000 i sperminy oraz pH buforu biciny.
Kryształy o różnej morfologii pojawiły się w ciągu dwóch do pięciu dni i osiągnęły pełny rozmiar w ciągu dwóch tygodni. Walidacja map gęstości elektronów dla struktury krystalicznej kompleksu syntazy tryptofanu Salmonella typu dzikiego alfa-dwa beta-dwa została wyjaśniona po udoskonaleniu struktury krystalicznej. Wykonując ten protokół, należy jak najszybciej zakończyć początkowe etapy oczyszczania w temperaturze pokojowej, aby zapobiec utracie aktywności syntazy tryptofanu.
Oczekuje się, że struktury krystaliczne mutantów dostarczą nowych informacji na temat mechanizmu i ról odgrywanych przez kluczowe reszty w syntezie L-tryptofanu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szybki i wydajny protokół ekspresji i oczyszczania syntazy tryptofanu z Salmonella typhimurium. Opisane metody pozwalają na oczyszczenie zarówno kompleksów białkowych typu dzikiego, jak i zmutowanych w ciągu jednego dnia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Oczyszczanie białek
- Charakterystyka enzymów
Wstęp
- Syntaza tryptofanu jest kluczowym enzymem w biosyntezie tryptofanu.
- Salmonella typhimurium służy jako organizm modelowy do badania tego enzymu.
- Wydajne metody oczyszczania są niezbędne do prowadzenia badań biochemicznych.
- Powszechnie stosowane techniki obejmują frakcjonowanie siarczanem amonu oraz chromatografię żelową.
Cel badania
- Opracowanie zoptymalizowanego protokołu oczyszczania syntazy tryptofanu.
- Umożliwienie badania enzymu zarówno w formie typu dzikiego, jak i w formach zmutowanych.
- Zapewnienie metody możliwej do zastosowania w przypadku innych powiązanych białek.
Zastosowane metody
- Mutageneza celowana
- Ekspresja białek w Escherichia coli
- Chromatografia powinowactwa
- Chromatografia filtracyjna żelowa
Główne wyniki
- Protokół umożliwia przeprowadzenie oczyszczania w ciągu jednego dnia.
- Zarówno syntaza tryptofanu typu dzikiego, jak i mutanty mogą zostać skutecznie oczyszczone.
- Kluczowymi etapami są frakcjonowanie siarczanem amonu oraz chromatografia wykluczania rozmiarów.
- Metoda ta jest możliwa do adaptacji w celu oczyszczania innych białek nieoznaczonych znacznikiem.
Wnioski
- Niniejszy protokół zapewnia szybki i wydajny sposób oczyszczania syntazy tryptofanu.
- Może on ułatwić dalsze badania nad funkcją i strukturą enzymu.
- Opisane metody są uniwersalne i mogą być stosowane w innych zadaniach dotyczących oczyszczania białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybkie oczyszczanie kompleksów syntazy tryptofanu typu dzikiego i zmutowanych umożliwia efektywne badania strukturalne i funkcjonalne enzymów zależnych od PLP, wspierając walidację celu w fazie wczesnego odkrywania. Uproszczony schemat postępowania skraca czas produkcji białek, przyspieszając przejście z etapu hit-to-lead w programach odkrywania leków ukierunkowanych na enzymy. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną poprzez dostarczenie wysokiej czystości, powtarzalnych próbek białek do analizy mechanistycznej w celu minimalizacji ryzyka oraz do opracowania testów analitycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów katalitycznych i zachowania allosterycznego syntazy tryptofanu w celu walidacji hipotez terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia otrzymywanie czystych kompleksów typu dzikiego oraz mutantów w celu minimalizacji ryzyka związanego z celami terapeutycznymi w oparciu o analizę strukturalną.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Dostarcza standaryzowane, wysokowydajne preparaty białek odpowiednie do opracowywania testów biochemicznych i biofizycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia spójność czystości i stężenia białek między poszczególnymi partiami, co jest kluczowe dla powtarzalności testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera ciągłość procesu od walidacji celu do badań przedklinicznych, umożliwiając analizę strukturalną form mutantów powiązanych ze zmianami funkcjonalnymi.
- Wartość operacyjna: Pozwala na generowanie dobrze scharakteryzowanych wariantów białek w celu oceny relacji struktura-funkcja w kontekstach istotnych dla danej choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych (discovery workflows), dostarczając oczyszczone kompleksy białkowe do dalszych zastosowań w enzymologii i biologii strukturalnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez szybki dostęp do kompleksów enzymatycznych typu dzikiego oraz mutantów.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki powtarzalnemu oczyszczaniu rozpuszczalnych, aktywnych białek odpowiednich do analiz wiązania ligandów i testów aktywności.
- Analityka: Generuje dane ilościowe, takie jak wydajność białka i wskaźniki czystości, które stanowią podstawę do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu walidacji celu.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z pracami przedklinicznymi, dostarczając próbek białek do badań mechanistycznych, które pomagają w wyborze celu.
- Wykorzystanie w organizacji: Tworzy wielokrotnego użytku platformę oczyszczania, którą można zastosować do innych białek bez znaczników w wielu różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki wglądom strukturalnym.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność produkcji białek, redukując zmienność wyników eksperymentalnych.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową poprzez skrócenie czasu produkcji białek i umożliwienie równoległego testowania wielu mutantów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie wiarygodnych danych strukturalnych i funkcjonalnych na wczesnym etapie procesu odkrywania.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie biologii molekularnej, ekspresji białek oraz technik oczyszczania chromatograficznego.
- Zależy od dostępu do sonikatora, wirówek, systemów FPLC oraz aparatury do SDS-PAGE w celu przeprowadzenia analizy.
- Wymaga standaryzacji protokołów frakcjonowania siarczanem amonu i SEC pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności wyników w różnych laboratoriach.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy stosowaniu metody dla różnych systemów białkowych, w szczególności w odniesieniu do składu buforów i stężeń soli.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność niezwłocznego wykonania początkowych etapów, aby zapobiec utracie aktywności syntazy tryptofanu podczas oczyszczania.
Najczęściej zadawane pytania dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Purification of Wild Type or Mutant Form of α2β2 StTS Complex
3:53
Optimized Crystallization for Wild Type and Mutant Form of the α2β2 StTS Comple
6:49
Results: Purification of the α- and β -Subunits of the Tryptophan Synthase and the Wild Type and Mutant α2β2 StTS Complexes
8:50
Conclusion
