Name: Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj szybką metodę oczyszczania syntazy tryptofanu z Salmonella typhimurium w jeden dzień. Protokół obejmuje frakcjonowanie siarczanem amonu i chromatografię żelową, umożliwiając badanie form dzikich i zmutowanych enzymu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Zdrowia Stanów Zjednoczonych (GM097569).

<ol><li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+synthase%3A+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Record%22%5BJournal%5D)">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li>
<li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+synthase%3A+a+mine+for+enzymologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life%22%5BJournal%5D)">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li>
<li>Dunn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+substrate+channeling+and+catalysis+in+the+tryptophan+synthase+bienzyme+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).</li>
<li>Chaudhary, K., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protozoan+genomics+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protozoan genomics for drug discovery.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).</li>
<li>Caldwell, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+in+Chlamydia+trachomatis+tryptophan+synthase+genes+differentiate+between+genital+and+ocular+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).</li>
<li>Kulik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+structural+basis+of+the+catalytic+mechanism+and+the+regulation+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium+and+BX1+from+maize%2C+two+evolutionarily+related+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).</li>
<li>Barends, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanistic+implications+of+a+tryptophan+synthase+quinonoid+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate.</a> Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).</li>
<li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase%2C+a+two-component+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li>
<li>Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A+protein+of+the+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+Purification%2C+crystallization%2C+and+composition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).</li>
<li>Wilson, D. A., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+the+B+component+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase.</a> Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).</li>
<li>Adachi, O., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+preparing+crystalline+beta+2+subunit+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli+in+high+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).</li>
<li>Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+alpha2+beta2+complexes+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+A+comparison+between+the+native+complex+and+the+reconstituted+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li>
<li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li>
<li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li>
<li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86%2C+lysine+87%2C+arginine+148%2C+cysteine+170%2C+and+cysteine+230%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li>
<li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+K%2B+or+Cs%2B+for+Na%2B+induces+local+and+long-range+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+the+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex.</a> Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+a+mutant+%28betaK87T%29+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+with+ligands+bound+to+the+active+sites+of+the+alpha-+and+beta-subunits+reveal+ligand-induced+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes.</a> Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).</li>
<li>Schneider, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li>
<li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-crystallography+of+a+true+substrate%2C+indole-3-glycerol+phosphate%2C+bound+to+a+mutant+%28alphaD60N%29+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li>
<li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li>
<li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li>
<li>Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+mutagenesis+and+overexpression+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium%3A+On+the+roles+of+beta+%282%29+subunit+Lys-382%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382.</a> Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Lowry, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Measurement+with+the+Folin+Phenol+Reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.</a> Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+mutagenesis+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium.+Changing+arginine+179+to+leucine+alters+the+reciprocal+transmission+of+substrate-induced+conformational+changes+between+the+alpha+and+beta+2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).</li>
<li>Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iMOSFLM%3A+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).</li>
<li>Evans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+and+Assessment+of+Data+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Scaling and Assessment of Data Quality.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).</li>
<li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+replacement+with+MOLREP%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+macromolecular+structures+by+the+maximum-likelihood+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).</li>
<li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+content+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li>
<li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coefficient+probabilities%3A+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins%2C+DNA%2C+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Udało nam się zaprojektować zmutowane formy α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T i α2β2 βS377A StTS do badań korelacji struktura-funkcja. Początkowo próbowaliśmy oczyścić mutanty przy użyciu poprzedniego protokołu oczyszczania22, który wymaga krystalizacji kompleksu α2β2 StTS za pomocą PEG 8000 i sperminy podczas oczyszczania. Chociaż szybkość krystalizacji zależy od zmutowanej formy i stężenia kompleksu ...

Kompleks bienzymów syntazy tryptofanu (TS) (α2β2) jest enzymem allosterycznym, katalizującym dwa ostatnie etapy biosyntezy aminokwasu L-tryptofanu w bakteriach, roślinach i grzybach1,2,3. Bakteria Salmonella enterica serowar typhimurium (St) powoduje poważne zakażenie przewodu pokarmowego u ludzi i innych zwierząt. Ponieważ ludzie i zwierzęta wyższe nie mają TS (EC 4.2.1.20), hamowanie S. typhimurium α kompleksu2β 2 TS (α2β2 StTS) zostało zbadane jako potencjalny cel leków w leczeniu kryptosporydiozy i gruźlicy4, infekcje narządów płciowych i oczu5, oraz potencjalne zastosowanie herbicydów w rolnictwie6. Podjednostka α katalizuje aldolityczne rozszczepienie fosforanu indolo-3-glicerolu (IGP) do aldehydo-3-fosforanu glicerynowego (GAP) i indolu, poprzez tworzenie pośredniego tautomeru indolininy, a następnie rozszczepienia wiązania węgiel-węgiel w celu wytworzenia GAP i indol3,6. Miejsce β-katalityczne zawiera cząsteczkę kofaktora 5′-fosforanu pirydoksalu (PLP) związaną z β-Lys87 za pośrednictwem zasady Schiffa, która działa jako pochłaniacz elektronów w przebiegu reakcji w enzymie β-podjednostka3,7. Miejsce β katalizuje zastąpienie hydroksylu łańcucha bocznego L-seryny przez indol w celu uzyskania L-tryptofanu i cząsteczki wody w reakcji zależnej od PLP. StTS służy jako długotrwały model do badania kanalizacji substratów i komunikacji allosterycznej w kompleksach wieloenzymatycznych2,3. Dwukierunkowa komunikacja allosteryczna między α- i β-podjednostkami TS jest niezbędna do synchronizacji etapów katalitycznych i zapobiegania uwalnianiu indolu podczas syntezy L-tryptofanu 3. Aby rozszerzyć ten wysiłek, przygotowaliśmy kilka mutantów (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr i β-Ser377Ala) przez mutację jednopunktową, które zostaną wykorzystane w dalszych badaniach związku między strukturą, mechanizmem i funkcją enzymu w miejscu katalitycznym podjednostki β StTS.
Szczegółowe badania nad mechanizmem katalitycznym α2β2StTS zostały zainicjowane przez grupę badawczą Edith W. Miles. Wczesne badania nad rodzimym kompleksem Escherichia coli α2β2 TS koncentrowały się na oczyszczeniu i charakterystyce izolowanej podjednostki α8,9, izolowany β-subunit10,11 oraz odtworzeniu kompleksu α2β2 TS z izolowanych podjednostek12. Oczyszczanie przeprowadzono przez wytrącanie siarczanu amonu, dializę próbki, chromatografię DEAE-Sephadex, dializę i drugą rundę chromatograficzną na kolumnie DEAE-Sephadex12. W innym protokole oczyszczanie tego samego kompleksu zostało ulepszone poprzez załadowanie oczyszczonego lizatu komórkowego do kolumny DEAE-Sephadex, a następnie etap chromatograficzny na kolumnie Sepharose 4B, wytrącanie siarczanu amonu i dializę13. Oba protokoły oczyszczania utrzymują się przez 4-5 dni. Kompleks Escherichia coli α2β2 TS krystalizował, ale kryształy nie nadawały się wówczas do dyfrakcji rentgenowskiej.
W nowym badaniu, rekombinowane i dzikie formy kompleksu S. typhimurium α2β2 TS zostały oczyszczone i skrystalizowane14,15. Rekombinowany kompleks α2β 2 StTS ulegał nadekspresji w szczepie E. coli CB149 przenoszącym wektor ekspresyjny pEBA-10. Przedstawiono wstępne zbieranie i analizę danych dotyczących krystalizacji i dyfrakcji rentgenowskiej kompleksu α2 β 2 StTS14. Jednak długa i cienka igła, taka jak kryształy α2β2 StTS, upośledzała badania strukturalne. Próbując zebrać lepsze dane dyfrakcji rentgenowskiej, opisano inny protokół oczyszczania w celu oczyszczenia typu dzikiego i zmutowanych form kompleksu α2β2 StTS15. Oczyszczanie przeprowadzono ze wstępnym wytrąceniem przy użyciu sperminy i PEG 8 000 do oczyszczonego lizatu komórkowego, a duży, masywny osad usunięto przez odwirowanie. Frakcję supernatantu zawierającą duże ilości kompleksu α2β2 StTS przechowywano przez 16–48 godzin w temperaturze 4 °C do momentu wytrącenia się żółtych kryształów. Kryształy przemyto i intensywnie dializowano w stosunku do różnych. Kompleks białkowy poddano rekrystalizacji w buforze zawierającym siarczan amonu i dializowano15. Chociaż krystalizacja białek zależy od stężeń białka i strącania w roztworze, trudno jest monitorować, przewidywać i odtwarzać oczyszczanie dla innych zmutowanych form kompleksu α2β2 StTS w roztworze. Protokół ten ma tę zaletę, że nie wykorzystuje żadnych metod chromatograficznych; Jednak wadą jest długi czas oczyszczania niezbędny do krystalizacji, dializy i rekrystalizacji, zwykle wymagający 5-7 dni. Aby uzyskać kryształy nadające się do zbierania danych rentgenowskich, oceniono ponad 600 warunków krystalizacji przy użyciu kombinacji i zmienności stężenia białka, temperatury, środków strącających (PEG 4 000, 6 000 i 8 000) i dodatków (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, kadaweryna, putrescyna, spermina lub spermidyna)15. Kryształy miały lepszą formę krystaliczną i rosły szybciej w warunkach zawierających 12% PEG 8 000 i 2 mM sperminy. Krystalizacja była bardziej korzystna w temperaturze 25 °C niż w temperaturze 4, 30 lub 42 °C i osiągnęła maksymalne wymiary w ciągu 3 dni15. W tym czasie (1996-1999) zgłoszono kilka α2β2 struktur krystalicznych StTS)16,17,18,19,20,21 i wiele innych struktur zostało opublikowanych do tej pory.
Tutaj głównym celem jest przedstawienie alternatywnych protokołów oczyszczania syntazy tryptofanu i optymalizacji krystalizacji białek. Niniejsza praca wykazała znaczące ulepszenia w zakresie oczyszczania izolowanej α podjednostki typu dzikiego (αStTS), izolowanej podjednostki β (βStTS), odtworzonej αkompleksu 2β2 StTS z izolowanych podjednostek oraz typu dzikiego i form zmutowanych kompleksu α2 β 2 StTS. Korzyści w porównaniu z wcześniejszymi protokołami są znaczące, ponieważ czas oczyszczania został znacznie skrócony, a krystalizacja i krioprotekcja zostały zoptymalizowane. Zmutowane formy kompleksu α2 β 2 StTS zaprojektowane w tej pracy wykrystalizowały się w pobliżu tego samego stanu, w którym zastosowano formę dzikiego. Jednak optymalizacja drobnej krystalizacji była konieczna, aby uzyskać duże monokryształy o jakości wystarczającej do określenia struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej. Do tej pory w Banku Danych Białkowych (PDB) zdeponowano 134 struktury krystaliczne syntazy tryptofanu, które odpowiadają odpowiednio 101, 31 i 2 strukturom krystalicznym dla bakterii, archeonów i eukariontów. Co ciekawe, 73 struktury należą do S. enterica serowar typhimurium, a 5 struktur krystalicznych kompleksu α2β2 StTS ma granice rozdzielczości wyższe niż 1,50 angstremów. Nic dziwnego, że w naszej grupie badawczej przygotowano 4 na 5 (identyfikatory PDB: 5CGQ przy 1,18 A, 4HT3 przy rozdzielczości 1,30 A, 4HPJ przy rozdzielczości 1,45 A, 6DZ4 przy rozdzielczości 1,45 A). Oczekuje się, że wyrafinowane struktury krystaliczne zmutowanej formy kompleksu α 2 β 2 StTS dostarczą nowych informacji na temat mechanizmu i ról odgrywanych przez niezbędne reszty aminokwasowe biorące udział w syntezie L-tryptofanu.

<table><tbody><tr><td>Filtr 15 ml 10 kDa</td><td>MilliporeJednostka</td><td>filtra odśrodkowego</td>Sigma <td>UFC901024</td></tr><tr><td>Filtr 15 ml 100 kDa</td><td>MiliporeJednostka</td><td>filtra odśrodkowego</td>Sigma <td>UFC910024</td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne 2 ml Fiolki kriogeniczne</td><td>Corning</td><td>CLS430489</td><td>Fiolki kriogeniczne</td></tr><tr><td>2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-141</td><td>probówki do mikrowirówek</td></tr><tr><td>24-dołkowe Płyta Cryschem</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-158</td><td>24-dołkowe płytki opadowe do siedzenia</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td>Chemiczne</td></tr><tr><td>probówki stożkowe wirówki wirówkowe 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-270</td><td>Wirówka stożkowa</td></tr><tr><td>AB15 ACCUMET Basic</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-636-AB15</td><td>pH-metr</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>Żel agarozowy</td></tr><tr><td>siarczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>ampicylina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator bakterii</td> antybiotykowych <td>Inkubator</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S35836</td>.</tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>bicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Branson 450 Digital Sonifier</td><td>Brason</td><td>B450</td><td>Zakłócacz komórek</td></tr><tr><td>Chlorek cezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-100</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Wodorotlenek cezu</td><td>Acros Organics</td><td>AC213601000</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1391</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>polimeraza DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td> Zestaw <td>polimerazy</td></tr><tr><td>HF dNTP</td><td>Zestaw Invitrogen</td><td>10-297-018</td><td>dNTPs</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Excella E25R Wytrząsarka orbitalna</td><td>Eppendorf New Brunswick</td><td>M1353-0004</td><td>Inkubator orbitalny</td></tr><tr><td>GE AKTA Prime Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-0004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td> FPLC <td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td>zestaw do oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Kolumny His-Trap</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5255-01</td><td>5 ml Kolumna Histrap</td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196-500</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0392</td><td>Induktor</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Kelwinator Seria-100</td><td>Kelwinator</td><td>wycofany</td><td>z produkcji Bulion LB w ultra niskiej zamrażarce</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>Płynny bulion</td></tr><tr><td>Luria Bertani</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>Bulion stały</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>NcoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0193S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Koraliki powinowactwa Ni-NTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R90115</td><td>Koraliki agarozy Ni-NTA</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-865-0</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Fosforan pirydoksalu</td><td>Acros Organics</td><td>AC228170010</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>S-200 HR</td><td>Cytiva</td><td>45-000-196</td><td>Kolumna wykluczająca rozmiar</td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td>Wirówka chemiczna</td></tr><tr><td>Sorvall RC-5B</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1004</td><td>Cetrifuge podłogowy</td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Acros Organics</td><td>AC132750010</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Superdex 200 klasa</td><td>przygotowawcza Cytiva</td><td>45-002-491</td><td>Kolumna wykluczająca rozmiar</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>DNA liagse</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>proteaza specyficzna dla Ubl 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12588018</td><td>SUMO Proteazy</td></tr></tbody></table>

mutageneza pcr, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Badania strukturalne z kompleksem bienzymatycznym syntazy tryptofanu (TS) (α2β2 TS) z Salmonella typhimurium zostały przeprowadzone w celu lepszego zrozumienia jego mechanizmu katalitycznego, zachowania allosterycznego i szczegółów enzymatycznej transformacji substratu w produkt w enzymach zależnych od PLP. W niniejszej pracy nowatorski system ekspresji do produkcji izolowanej podjednostki α i izolowanej β pozwolił na oczyszczenie dużych ilości czystych podjednostek i αkompleksu 2β2 StTS z izolowanych podjednostek w ciągu 2 dni. Oczyszczanie przeprowadzono za pomocą chromatografii powinowactwa, a następnie rozszczepienia znacznika powinowactwa, wytrącenia siarczanu amonu i chromatografii wykluczania wielkości (SEC). Aby lepiej zrozumieć rolę kluczowych reszt w enzymie β miejscu, we wcześniejszych badaniach strukturalnych przeprowadzono mutagenezę bezpośrednią. Kolejny protokół został stworzony w celu oczyszczenia typu dzikiego i zmutowanego α kompleksach2β2 StTS. Prosty, szybki i wydajny protokół wykorzystujący frakcjonowanie siarczanu amonu i SEC pozwolił na oczyszczenie kompleksu α2β2 StTS w ciągu jednego dnia. Oba protokoły oczyszczania opisane w tej pracy mają znaczne zalety w porównaniu z poprzednimi protokołami oczyszczania tego samego kompleksu przy użyciu PEG 8000 i sperminy do krystalizacji kompleksu α2 β 2 StTS wzdłuż protokołu oczyszczania. Krystalizacja typu dzikiego i niektórych form zmutowanych zachodzi w nieco innych warunkach, upośledzając oczyszczanie niektórych mutantów przy użyciu PEG 8000 i sperminy. Aby przygotować kryształy nadające się do badań krystalograficznych rentgenowskich, podjęto szereg wysiłków w celu optymalizacji krystalizacji, jakości kryształów i krioprotekcji. Przedstawione tutaj metody powinny być ogólnie stosowane do oczyszczania podjednostek syntazy tryptofanu oraz kompleksów typu dzikiego i zmutowanego α2β2 StTS.

Oczyszczanie α- i β-podjednostek syntazy tryptofanu 
Podjednostka α (αStTS) oraz podjednostka β (βStTS) syntazy tryptofanu z Salmonella typhimurium zostały subklonowane w zmodyfikowanym wektorze pET SUMO. Rysunek 1A przedstawia reprezentatywne wyniki SDS-PAGE z dwoma wyraźnymi prążkami odpowiadającymi białkom fuzyjnym His6-SUMO-αStTS (ścieżka ...

Ten artykuł przedstawia szereg następujących po sobie metod ekspresji i oczyszczania syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium w tym protokole, szybkim systemie do oczyszczania kompleksu białkowego w ciągu jednego dnia. Omówione metody to mutageneza ukierunkowana na miejsce, ekspresja białek w Escherichia coli, chromatografia powinowactwa, chromatografia filtracji żelowej i krystalizacja.

Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ten protokół oczyszczania enzymu syntazy tryptofanu z Salmonella typhimurium jest szybki, prosty i krótki. Frakcjonowanie siarczanu amoniaku i chromatografia wykluczania wielkości umożliwiają oczyszczenie kompleksu syntazy tryptofanu typu dzikiego i zmutowanego w ciągu jednego dnia. Technika ta może być stosowana do oczyszczania innych powiązanych białek, ponieważ frakcjonowanie siarczanu amoniaku i chromatografia wykluczania wielkości są powszechnie stosowane do oczyszczania nieznakowanych białek.Na początek rozbij osad komórkowy przez sonikację w lodowatej kąpieli wodnej o amplitudzie 80% przez 20 cykli przy użyciu 10-sekundowych impulsów i 20-sekundowych odpoczynków. Odwirować lizat komórkowy w ilości 30 000 g przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza i odessać supernatant bez usuwania osadu. Przefiltrować oczyszczoną frakcję supernatantu za pomocą filtra 0,45 mikrometra w temperaturze pokojowej.Powoli dodawać niewielkie ilości siarczanu amonu do filtratu, aż do osiągnięcia 20% nasycenia. Przeprowadzić frakcjonowanie siarczanu amonu w temperaturze 25 stopni Celsjusza i delikatnie mieszać roztwór przez 10 minut, uważając, aby nie powstały pęcherzyki. Ponownie odwirować roztwór przez 10 minut i przenieść supernatant do czystej kolby w celu dalszego użycia.Delikatnie ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach buforu do próbki i przygotować próbkę do uruchomienia SDS-PAGE. Dodać siarczan amonu do supernatantu do osiągnięcia 30% nasycenia i mieszać roztwór, unikając pęcherzyków. Ponownie odwirować roztwór przez 10 minut i przenieść supernatant do czystej kolby w celu dalszego użycia.Delikatnie zawiesić otrzymaną 40% frakcję osadu w 10 mililitrach drugiego bufora próbki i przygotować próbkę do uruchomienia SDS-PAGE. Następnie należy przeprowadzić mikrowirowanie 40% próbki białka w temperaturze 10 000 razy g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i załadować otrzymany supernatant na wcześniej zrównoważoną kolumnę HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR podłączoną do przyrządu do szybkiej chromatografii cieczowej białek przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę. Oceń zebrane frakcje pikowe i frakcje siarczanu amonu na 12%SDS-PAGE żelu barwionym błękitem brylantowym Coomassie.Skoncentrować kompleks syntazy tryptofanu Salmonella typu dzikiego lub zmutowanego alfa-dwa-beta-dwa za pomocą 100-kilodaltonowego filtra odśrodkowego, wirując z prędkością 3000 razy g, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść skoncentrowane białko do świeżej dwumililitrowej probówki i ponownie odwirować przy 10 000 g przez 10 minut w czterech stopniach w celu usunięcia agregatów. Po określeniu stężenia białka w próbce należy przygotować porcje o pojemności 0,5 mililitra w stężeniu od 20 do 25 miligramów na mililitr.Błyskawicznie zamroź je w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni. Przygotuj pięciomililitrowy roztwór podstawowy 200-milimolowej sperminy w wodzie i przechowuj go w 500 mikrolitrowych porcjach w temperaturze minus 20 stopni. Następnie przygotuj 50-mililitrowy roztwór podstawowy 30% glikolu polietylenowego 8 000 w wodzie i trzymaj 25 mililitrów w 50-mililitrowej jednorazowej kolbie stożkowej wirówki w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Przygotuj 25-mililitrowe roztwory podstawowe jednomolowego chlorku cezu i chlorku sodu, każdy w wodzie, i utrzymuj je w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przygotować trzy zestawy 50-mililitrowych roztworów podstawowych jednomolowej bicyny i miareczkować je wodorotlenkiem cezu lub wodorotlenkiem sodu, aby otrzymać roztwory buforowe o pH 7,6, 7,8 i ośmiu. Przechowywać 25-mililitrowe porcje roztworów w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Rozmrozić próbkę kompleksu syntazy tryptofanu alfa-dwóch beta-dwóch Salmonella typhimurium w łaźni lodowej. Następnie odwiruj go w temperaturze 10 000 razy g przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przenieść klarowną frakcję supernatantu do czystej probówki wirówkowej.Oszacować stężenie białka w supernatance i rozcieńczyć podwielokrotności do 15 miligramów na mililitr 50-milimolowym wodorotlenkiem cezu bicyny lub wodorotlenkiem sodu biciyny o pH 7,8, zawierającym 50-milimolowy cez lub chlorek sodu. Przygotuj 500 mikrolitrów roztworów zbiornikowych dla trzech 24-dołkowych płytek osadowych w sterylnych 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Zmieniaj stężenie PEG 8, 000 i sperminy oraz zmieniaj pH buforu zgodnie z opisem w manuskrypcie dla każdego zestawu.Zakryj probówki i energicznie wiruj przez 10 sekund, a następnie odwiruj je w temperaturze 10 000 razy g przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Dozować 500 mikrolitrów tego roztworu do każdego zbiornika. Dozować pięć mikrolitrów roztworu białkowego w ilości 15 mikrogramów na litr do każdej kropli do siedzenia za pomocą mikropipety P-10.Następnie dodaj pięć mikrolitrów każdego odpowiedniego roztworu zbiornika do kropli białka. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas mieszania i nie pipetuj w górę i w dół. Na koniec przykryj płytkę przezroczystą taśmą klejącą i przechowuj ją w temperaturze 25 stopni.Kryształy pojawiają się w ciągu dwóch do pięciu dni i rosną do pełnych wymiarów w ciągu dwóch tygodni. Protokół ten został wykorzystany do subklonacji podjednostki alfa i podjednostki beta syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium do zmodyfikowanego wektora pET SUMO. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki SDS-PAGE dwóch silnych prążków odpowiadających białku fuzyjnemu syntazy tryptofanu His6-SUMO-alpha i His6-SUMO-beta.Każde białko oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa kwasu niklowo-nitrylotrioctowego i wytrącania siarczanu amonu, a następnie rozszczepienia znacznika His-SUMO, usunięcia śladów znacznika His-SUMO i pomiaru stężenia białka. Przedstawiono tutaj profil elucji podjednostki alfa, podjednostki beta i kompleksu syntazy tryptofanu alfa-dwóch beta-dwóch Salmonella typhimurium na SEC oraz czystość ich frakcji szczytowych. Po wygenerowaniu zmutowanych form kompleksu syntazy tryptofanu, zastosowano frakcjonowanie siarczanu amonu w celu usunięcia białek zanieczyszczających z heterologicznego systemu ekspresji.Przedstawiono tutaj reprezentatywny profil elucji ze względną pozycją elucji kompleksu syntazy tryptofanu alfa-dwóch beta-dwóch Salmonella typhimurium na kolumnie chromatografii wykluczającej. Czystość wykluczonych frakcji pikowych analizowano za pomocą SDS-PAGE przed łączeniem. Duże monokryształy uzyskano poprzez optymalizację dokładnej krystalizacji poprzez zmianę stężenia PEG 8, 000 i sperminy oraz pH buforu biciny.Kryształy o różnej morfologii pojawiły się w ciągu dwóch do pięciu dni i osiągnęły pełny rozmiar w ciągu dwóch tygodni. Walidacja map gęstości elektronów dla struktury krystalicznej kompleksu syntazy tryptofanu Salmonella typu dzikiego alfa-dwa beta-dwa została wyjaśniona po udoskonaleniu struktury krystalicznej. Wykonując ten protokół, należy jak najszybciej zakończyć początkowe etapy oczyszczania w temperaturze pokojowej, aby zapobiec utracie aktywności syntazy tryptofanu.Oczekuje się, że struktury krystaliczne mutantów dostarczą nowych informacji na temat mechanizmu i ról odgrywanych przez kluczowe reszty w syntezie L-tryptofanu.

pcr-mutagenesis-cloning-expression-fast-protein-purification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Opisujemy strukturę obejmującą prostą analizę biochemiczną i obliczeniową, aby kierować charakterystyką i krystalizacją dużych domen o zwiniętych zwojach. Struktura ta może być dostosowana do białek globularnych lub rozszerzona w celu uwzględnienia różnych technik wysokoprzepustowych.

Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Ten protokół przedstawia metodę oceny aktywności proteolitycznej proteazy o niskiej aktywności i pojedynczej rotacji w kontekście komórkowym. W szczególności metoda ta jest stosowana do oceny aktywności proteolitycznej PCSK9, kluczowego czynnika napędzającego metabolizm lipidów, którego aktywność proteolityczna jest wymagana do jego ostatecznej funkcji hipercholesterolemicznej.

Wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy jednoobrotowej PCSK9

Opisana tutaj jest prosta metoda oczyszczania produktu genowego u Streptococcus mutans. Technika ta może być korzystna w oczyszczaniu białek, zwłaszcza białek błonowych i białek o dużej masie cząsteczkowej, i może być stosowana z różnymi innymi gatunkami bakterii.

Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić znakowanie białek specyficznych dla typu komórki za pomocą azydonorleucyny (ANL) przy użyciu linii myszy wyrażającej zmutowaną syntetazę tRNA L274G-metioniny (MetRS*) oraz niezbędne kroki do izolacji białek specyficznych dla znakowanego typu komórki. Przedstawiamy dwie możliwe drogi podawania ANL żywym myszom poprzez (1) picie wody i (2) wstrzyknięcia dootrzewnowe.

Oczyszczanie i identyfikacja białek specyficznych dla typu komórki ze złożonych tkanek przy użyciu zmutowanej linii myszy syntetazy tRNA metioniny

Poznaj szybką metodę oczyszczania syntazy tryptofanu z Salmonella typhimurium w jeden dzień. Protokół obejmuje frakcjonowanie siarczanem amonu i chromatografię żelową, umożliwiając badanie form dzikich i zmutowanych enzymu.

Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu (Wideo) | JoVE Journal

Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu

Przeglądaj więcej filmów