Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

Protokół jest bardzo wydajny i wszechstronny. Można go nakładać na prawie każde białko błonowe, a cała procedura produkcyjna jest zakończona w ciągu jednego dnia. Zsyntetyzowane białka błonowe mogą być stabilizowane już kotranslacyjnie przez dostarczone ligandy.

Całkowicie unika się kontaktu z detergentem, a białka wkładają się i fałdują bezpośrednio w dostarczonym i dostosowanym środowisku membranowym. Podejścia strukturalne, charakterystyka funkcjonalna i wytwarzanie przeciwciał to główne obszary zastosowań. Technika ta jest ponadto prosta w analizie wpływu lipidów na fałdowanie i funkcję białek błonowych.

W trzecim dniu hodowli zaszczepij 10 litrów sterylnej pożywki YPTG o temperaturze 37 stopni Celsjusza w 15-litrowym reaktorze z mieszadłem ze 100 mililitrami kultury wstępnej. I hoduj bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 500 obrotów na minutę w wysokim napowietrzeniu. Aby zapobiec nadmiernemu pienieniu, dodaj sterylny środek przeciwpieniący.

Gdy komórki osiągną fazę mid-log-, dodaj 300 mililitrów etanolu do kultury i inkubuj komórki w temperaturze 42 stopni Celsjusza z 500 obrotami na minutę w wysokim napowietrzeniu przez kolejne 45 minut. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i użyć szpatułki i pipety, aby całkowicie zawiesić komórki w 300 mililitrach buforu S30A. Odwiruj zawieszone bakterie dwa razy, myjąc granulat 300 mililitrami świeżego S30A na pranie.

Po drugim płukaniu ponownie zawiesić ogniwa w 1,1 objętości buforu S30B. Załaduj zawieszenie do wstępnie schłodzonej komory ciśnieniowej prasy francuskiej i jednorazowo rozerwij ogniwa o masie 1,000 funtów na cal kwadratowy. Aby usunąć wszelkie niestabilne składniki i uwolnić mRNA z rybosomów, dostosuj lizat do 0,4 molowego chlorku sodu i inkubuj próbkę przez 45 minut w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza.

Aby złożyć nanodyski białkowe rusztowania błonowego, wymieszaj roztwór MSP1E3D1 z roztworem lipidowym i dodaj DPC do końcowego stężenia 0,1%Dostosuj reakcję do odpowiedniej objętości końcowej zgodnie z tabelą i inkubuj reakcje przez godzinę w temperaturze 21 stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem. Pod koniec inkubacji należy wstępnie zwilżyć membranę kasety dializacyjnej buforem do tworzenia krążków i za pomocą strzykawki załadować mieszaninę montażową do kasety. Następnie dializować reakcję z trzema pięciolitrowymi objętościami buforu do tworzenia dysku przez 10 do 20 godzin w temperaturze pokojowej z mieszaniem przed przeniesieniem mieszaniny do zrównoważonych odśrodkowych jednostek filtrujących do tworzenia krążków i z odcięciem masy cząsteczkowej 10 kilodaltonów.

Następnie zagęścić reakcję do co najmniej 300 mikromolów przez odwirowanie za pomocą czytnika UV-Vis w celu zmierzenia stężenia. Aby przygotować trzymililitrową reakcję bezkomórkową z ciągłą wymianą, należy zrównoważyć membranę trzymililitrowej kasety dializacyjnej w 100-milimolowym trioctanie. I użyj strzykawki, aby przenieść mieszaninę reakcyjną do kasety.

Za pomocą strzykawki usunąć nadmiar powietrza z komory mieszaniny reakcyjnej i umieścić kasetę w komorze dializy. Napełnij komorę 60 mililitrami mieszanki paszowej i umieść pokrywę na komorze. Po zamocowaniu pokrywy na miejscu inkubuj komorę przez 12 do 16 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza w 200 obrotach na minutę.

Aby przygotować 60-mikrolitrową konfigurację do bezkomórkowej wymiany komórek do przesiewania jonów magnezu, dodaj 60 mikrolitrów naszego świeżo przygotowanego 3X Master Mix do mieszaniny reakcyjnej i 825 mikrolitrów do mieszanki paszowej. I napełnij mieszankę do karmienia wodą. Po wirowaniu dodaj 825 mikrolitrów mieszanki paszowej do każdego z trzech dołków 24-dołkowej mikropłytki.

Pokrój rurki do dializy z regenerowanej celulozy z odcięciem masy cząsteczkowej od 10 do 14 kilodaltonów na kawałki o wymiarach około 25 na 20 milimetrów i przechowuj je w wodzie uzupełnionej 0,05% azydkiem sodu. Przed montażem pojemnika bezkomórkowego do wymiany minikomórek należy użyć chusteczki do usunięcia nadmiaru wody z membran dializy i umieścić jeden kawałek membrany na każdym pojemniku. Zamocuj membrany za pomocą pierścienia z politetrafluoroetylenu i przenieś mini pojemnik do jednej studzienki mieszanki paszowej.

Dodać składniki wysokocząsteczkowe do mieszaniny reakcyjnej, jak wskazano w tabeli, i wymieszać przez pipetowanie. Dodać 60 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do pojemnika reakcyjnego, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. I owiń dwa arkusze uszczelniającej folii termoplastycznej o wymiarach osiem na 10 centymetrów wokół 24-dołkowej płytki.

Zamocuj pokrywę płytki studzienki na miejscu za pomocą taśmy i umieść płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w 200 obrotach na minutę z mieszaniem przez 12 do 16 godzin. Następnego ranka za pomocą końcówki pipety przebić membranę dializacyjną w bezkomórkowym pojemniku do wymiany minikomórek i zassać mieszaninę reakcyjną. Przenieść mieszaninę reakcyjną do nowych probówek wirówkowych i odwirować w celu usunięcia osadów.

Następnie przenieść supernatant do nowej probówki. W tym miejscu przedstawiono reprezentatywny wpływ dostrajania związków reakcyjnych na końcową wydajność lub jakość syntetyzowanych białek błonowych. W tej analizie ogólna synteza i rozpuszczalność nanokrążków receptora adrenergicznego T-beta-one była podobna we wszystkich analizowanych składach błonowych.

Natomiast znacznie większą zmienność wykryto w jakości syntetyzowanego receptora sprzężonego z białkiem G, przy czym najniższą aktywność uzyskano przy użyciu lipidów DMPC i POPC, a najwyższą zaobserwowano po zastosowaniu DOPG i POPG. Podsumowując, wyniki te wskazują, że ładunek lipidowej grupy głównej, a także elastyczność łańcucha kwasów tłuszczowych są ważnymi modulatorami fałdowania i aktywności tego białka błony komórkowej. Końcowe stężenie nanodysku może być również ważnym czynnikiem wpływającym na jakość białek błonowych.

Na przykład, jeśli stężenie nanodysku jest badane w zakresie od 3,75 do 60 mikromolowych, uzyskuje się całkowitą rozpuszczalność receptora sprzężonego z białkiem G przy około 30-mikromolowych nanodyskach, co daje stosunek białka do nanodysku błonowego jeden do trzech. W przeciwieństwie do tego, całkowitą rozpuszczalność proteorodopsyny można osiągnąć za pomocą około 10-mikromolowych nanodysków, co daje stosunek proteorodopsyny do nanodysku 10 do jednego. Dokładne pipetowanie i wysokiej jakości komponenty są z pewnością obowiązkowe.

Krytycznymi etapami przygotowania lizatu jest zbieranie komórek w połowie fazy logarytmicznej i zastosowanie etapu o wysokiej zawartości soli. Technika ta drastycznie zmniejsza złożoność syntezy białek błonowych. Dawniej trudne cele są efektywnie syntetyzowane, co pozwala na pracę nad strukturami molekularnymi dotychczas niezbadanych białek o znaczeniu farmaceutycznym.