Name: Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę kotranslacyjnej insercji białek błonowych do nanodysków bez użycia detergentów. Technika umożliwia badanie składania i funkcji białek w kontrolowanych środowiskach lipidowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) grant BE1911/8-1, projektowi GLUE LOEWE oraz wspólnemu centrum badawczemu Transport and Communication across Membranes (SFB807) za wsparcie finansowe.

<ol><li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li>
<li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li>
<li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li>
<li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li>
<li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li>
<li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+expression%3A+no+cells+required%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li>
<li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters%2C+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li>
<li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein%2C+forming+soluble+nanolipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li>
<li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors%3A+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li>
<li>Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor%2Fnanodisc+complexes+with+different+lipid+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li>
<li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li>
<li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li>
<li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li>
<li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li>
<li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li>
<li>Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li>
<li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li>
<li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li>
<li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li>
<li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li>
<li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li>
<li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E.+coli+S30+lysate+proteome%3A+A+prototype+for+cell-free+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li>
<li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li>
<li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4%3A+Linkages+in+substrate+binding%2C+spin+state%2C+uncoupling%2C+and+product+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li>
<li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li>
<li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes%3A+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano konfigurację i strategie optymalizacji ekspresji mukowiscydozy i kotranslacyjnej insercji funkcjonalnych MP do nanodysków. Wymagane wyposażenie składa się z bioreaktora, prasy francuskiej lub podobnego, czytnika UV/VIS i fluorescencji, naczyń reakcyjnych CF odpowiednich do konfiguracji dwukomorowej oraz inkubatora z kontrolowaną temperaturą. Kolejnym standardowym wyposażeniem są wirówki do zbierania komórek E. coli, a także wirówki stołowe o wydajności co najmniej 30 000 x g do przygotowania liz...

Białka błonowe (MPs) są trudnym celem w badaniach produkcji białek ze względu na ich nierozpuszczalność w środowisku wodnym. Konwencjonalne platformy produkcyjne MP obejmują systemy oparte na komórkach, takich jak E. coli, drożdże lub komórki eukariotyczne. Zsyntetyzowane rekombinowane MP są albo ekstrahowane z błon komórkowych, albo ponownie składane z ciał inkluzyjnych1. Po rozpuszczeniu detergentu, MPs mogą być przenoszone do odpowiednich środowisk membranowych za pomocą ustalonych protokołów rekonstytucji in vitro. Oprócz pęcherzyków i liposomów, MP rekonstytucja w płaskie błony w postaci nanodysków2 lub salipro3 cząstki stały się w ostatnim czasie rutynowymi technikami. Jednak wszystkie te strategie implikują kontakt detergentu z MP, który może skutkować destabilizacją, dysocjacją oligomerów, a nawet utratą struktury i aktywności białek4. Badanie przesiewowe pod kątem optymalnych warunków rozpuszczania i rozpuszczania detergentu może być zatem żmudne i czasochłonne5.
Otwarta natura systemów bezkomórkowych (CF) pozwala na bezpośrednie zaopatrywanie reakcji ekspresji przez wstępnie uformowane błony o określonym składzie lipidowym. W tym trybie ekspresji opartej na lipidach (L-CF) zsyntetyzowane MP mają możliwość wspólnego translacyjnego wstawiania do dostarczonych dwuwarstw6,7 (Rysunek 1). Nanodyski składające się z białka rusztowania błonowego (MSP) otaczającego płaski dwuwarstwowy dysk lipidowy8 wydają się być szczególnie odpowiednie dla tej strategii9,10. Nanodyski mogą być rutynowo składane in vitro z różnymi lipidami, są bardzo stabilne, a zapasy mogą być skoncentrowane do 1 mM. Konieczna jest jednak ekspresja MSP w E. coli i jej oczyszczenie. Jako alternatywna strategia, MSP może być równolegle wyrażany razem z docelowym MP w reakcjach CF dostarczanych liposomami11,12,13. Matryce DNA zarówno dla MSP, jak i MP są dodawane do reakcji, a MP/nanodyski mogą tworzyć się po ekspresji. Chociaż unika się produkcji MSP, strategia koekspresji wymaga starannego dostrojenia końcowych stężeń matryc DNA i można spodziewać się większych wahań w wydajności produkcji próbek.
Współtranslacyjne wprowadzanie MPS do błon wstępnie uformowanych nanodysków jest niefizjologicznym i wciąż w dużej mierze nieznanym mechanizmem, niezależnym od maszynerii translokonowych i sekwencji sygnałowych13,14,15,16. Głównymi wyznacznikami skuteczności insercji są rodzaj białka błonowego, a także skład lipidowy dostarczonej błony, z częstą preferencją dla ujemnie naładowanych lipidów15,17. Ponieważ błony nanodysków mają stosunkowo ograniczony rozmiar, znaczna ilość lipidów jest uwalniana po wstawieniu MP18. Zmienność rozmiaru nanodysku umożliwia wprowadzanie i strojenie wyższych oligomerycznych kompleksów MP15,18. Wykazano m.in. prawidłowy montaż kompleksów homooligomerycznych dla kanału jonowego KcsA, dla pompy jonowej proteorodopsyny (PR) oraz dla transportera wielolekowego EmrE15,18. Jest prawdopodobne, że MP wejdą do symetrycznej membrany nanodysku z obu stron ze stosunkowo równą częstotliwością. Należy zatem wziąć pod uwagę, że różne monomery lub oligomery wprowadzone do jednego nanodysku mogą mieć przeciwstawne orientacje. Jednak odchylenie w orientacji może być spowodowane przez współpracujące mechanizmy insercji, jak opisano w przypadku tworzenia heksamerów PR i tetramerów KcsA18. Dalsze odchylenie w orientacji MP może wynikać z przełączników orientacji wstawionych MP, prawdopodobnie na krawędzi membran nanodysków.
Produkcja lizatów CF ze szczepów E. coli jest niezawodną rutynową techniką i może być przeprowadzona w prawie każdym laboratorium biochemicznym19,20. Należy wziąć pod uwagę, że oprócz tworzenia mostków dwusiarczkowych, większość innych modyfikacji potranslacyjnych jest nieobecna, jeśli MP jest syntetyzowany przy użyciu lizatów E. coli. Chociaż może to spowodować wygenerowanie bardziej jednorodnych próbek do badań strukturalnych, konieczne może być wykluczenie potencjalnego wpływu na funkcję poszczególnych celów MP. Jednak wydajna produkcja wysokiej jakości próbek receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR)14,21,22, transportery eukariotyczne23 lub duże zespoły heteromeryczne24 w lizatach CF E. coli wskazuje na ich przydatność nawet dla złożonych celów. Ilości skali preparatywnej (≈ 1 mg/ml) próbki można uzyskać w konfiguracji dwukomorowej z ciągłą wymianą bezkomórkową (CECF), składającej się z komory mieszaniny reakcyjnej (RM) i mieszanki zasilającej (FM). Objętość FM przekracza objętość RM od 15 do 20 razy i stanowi rezerwuar związków energetycznych i prekursorów o niskiej masie cząsteczkowej19. W ten sposób reakcja ekspresji zostaje przedłużona o kilka godzin, a ostateczna wydajność celu MP zostaje zwiększona. Przedziały RM i FM są oddzielone membraną dializacyjną z odcięciem 10-14 kDa. Obie komory wymagają specjalnej konstrukcji pojemnika reakcyjnego CECF (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Odpowiednimi przykładami są komercyjne kasety do dializy jako pojemniki RM w połączeniu z dostosowanymi do potrzeb pojemnikami z pleksiglasu zawierającymi FM. Wydajnością MP można dalej manipulować, modyfikując proporcje RM:FM lub wymieniając FM po pewnym okresie inkubacji.
Wydajność i jakość MP często wymagają intensywnej optymalizacji parametrów reakcji. Ważną zaletą ekspresji CF jest możliwość modyfikacji i precyzyjnego dostrojenia prawie każdego związku zgodnie z indywidualnymi wymaganiami MP. Prostą strategią jest skupienie się najpierw na poprawie wydajności MP poprzez ustanowienie podstawowego protokołu produkcyjnego, a następnie na optymalizacji jakości MP poprzez precyzyjne dostrojenie warunków reakcji i składania. Brak procesów fizjologicznych w lizatach mukowiscydozy i ich zmniejszona złożoność skutkują wysokimi wskaźnikami sukcesu w wydajnej produkcji MPs25. Rutynowe rozważania dotyczące projektowania matrycy DNA i optymalizacji stężenia jonów Mg2+ są w większości przypadków wystarczające do uzyskania zadowalających plonów26. W zależności od trybu wyrażenia, optymalizacja jakości MP może stać się czasochłonna, ponieważ konieczne jest prześwietlenie większej liczby parametrów14,17,22.
Aby ustanowić opisaną platformę ekspresji CF, niezbędne są protokoły do produkcji lizatu CF E. coli (i), polimerazy T7 RNA (ii), nanodysków (iii) i podstawowych związków reakcyjnych CECF (iv) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Pochodne szczepu E. coli K12 A1927 lub BL21 są często używane do przygotowania wydajnych lizatów S30 (wirowanie przy 30 000 x g). Oprócz lizatów S30 można stosować odpowiednie lizaty odwirowane przy innych siłach g (np. S12). Lizaty różnią się wydajnością ekspresji i złożonością proteomu. Proteom lizatu S30 przygotowany za pomocą opisanego protokołu został szczegółowo przebadany28. Proteom S30 nadal zawiera pewne szczątkowe białka błony zewnętrznej, które mogą powodować problemy z tłem podczas ekspresji i analizy kanałów jonowych. W przypadku takich celów zaleca się stosowanie lizatów S80-S100. Cenną modyfikacją podczas przygotowywania lizatu jest indukcja odpowiedzi SOS przez połączony szok cieplny i dostarczanie etanolu w środkowej fazie wzrostu komórek. Powstałe w ten sposób lizaty HS30 są wzbogacone w białka opiekuńcze i mogą być używane w mieszankach z lizatami S30 w celu poprawy składania MP22. Ekspresja mukowiscydozy w lizatach E. coli przebiega jako sprzężony proces transkrypcji/translacji z matrycami DNA zawierającymi promotory kontrolowane przez polimerazę T7 RNA (T7RNAP). Enzym może być efektywnie wytwarzany w komórkach gwiazdowych BL21(DE3) zawierających plazmid pAR1219 29.
Dwie kopie MSP1E3D1 łączą się w jeden nanodysk o średnicy 10-12 nm, ale protokół opisany poniżej może również działać dla innych pochodnych MSP. Jednak nanodyski większe niż te utworzone z MSP1E3D1 są zwykle mniej stabilne, podczas gdy mniejsze nanodyski utworzone z pochodnych MSP, takich jak MSP1, mogą nie pomieścić większych MP lub kompleksów MP. MSP1E3D1 nanodyski mogą być składane in vitro z dużą różnorodnością różnych lipidów lub mieszanin lipidów. Wstępnie uformowane nanodyski są zwykle stabilne przez > 1 rok w temperaturze -80 °C, przy czym stabilność może się różnić w zależności od składników lipidowych. W celu przeprowadzenia badań przesiewowych wpływu lipidów na fałdowanie i stabilność MP konieczne jest przygotowanie kompleksowego zestawu nanodysków połączonych z reprezentatywną różnorodnością mieszanin lipidów/lipidów. Dobrym wyborem wyjściowym mogą być następujące lipidy: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) i 1-palmitoilo-2-oleoilo-glycero-3-fosfocholina (POPC).
Opisano protokół przygotowania 3 ml reakcji CECF. Możliwe jest dalsze skalowanie w górę lub w dół w stosunku 1:1. Dla dwukomorowej konfiguracji CECF należy przygotować RM zawierający wszystkie związki i FM zawierający tylko związki o niskiej masie cząsteczkowej. Komercyjne urządzenia do dializy o pojemności 3 ml z MWCO 10-14 kDa mogą być używane jako pojemniki RM, które są następnie umieszczane w specjalnie wykonanych pojemnikach z pleksiglasu zawierających FM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D)30. Stosunek RM:FM wynosi 1:20, więc 60 ml FM musi być przygotowane na 3 ml RM. Jakość, stężenie lub rodzaj kilku składników mogą mieć kluczowe znaczenie dla końcowej wydajności i/lub jakości zsyntetyzowanego MP (Tabela 1). Matryce DNA powinny być przygotowywane zgodnie z opublikowanymi wytycznymi, a optymalizacja kodonów ramki odczytu celu może jeszcze bardziej znacznie poprawić wydajność produktu26. Dla reakcji CECF w skali preparatywnej opisano ustalony protokół wytwarzania PR. Aby ustalić protokoły ekspresji dla nowych MP, zwykle konieczne jest przeprowadzenie badań optymalizacyjnych niektórych związków (Tabela 1) w celu poprawy wydajności i jakości. W przypadku jonów Mg2+ istnieje dobrze skoncentrowane optimum stężenia, które często wykazuje znaczną zmienność dla różnych matryc DNA. Inne związki reakcyjne CF, takie jak nowe partie lizatów T7RNAP lub S30, mogą dodatkowo przesuwać optymalne stężenieMg2+. Jako przykład opisano typowy ekran Mg2+ w zakresie stężeń 14-24 mM i w krokach co 2 mM. Każde stężenie jest badane przesiewowo w duplikatach i w reakcjach CECF w skali analitycznej. Jako pojemnik reakcyjny CECF, wykonane na zamówienie pojemniki z pleksiglasu Mini-CECF 30 zawierające RM są używane w połączeniu ze standardowymi 24-dołkowymi mikropłytkami zawierającymi FM (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). Alternatywnie można zastosować komercyjne wkłady dializacyjne w połączeniu z mikropłytkami o głębokości 96 lub innymi komercyjnymi urządzeniami dializacyjnymi w odpowiednich konfiguracjach (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sól sodowa) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (sól sodowa) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sól sodowa) (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sól sodowa) (POPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-(hydroksymetylo)- propan-1,3-diol (Tris)</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>9781</td><td></td></tr><tr><td>[3H]-dihydroalprenolol</td><td>Chlorowodorek American Radiolabeled Chemicals (USA)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>Sól litowo-potasowa fosforanu acetylu (ACP)</td><td>Merck ( Niemcy)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>5'-trifosforan adenozyny (ATP)</td><td>Sigma Aldrich (Niemcy)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek alprenololu</td><td>Merck (Niemcy)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>Materiał kolumny do chromatografii anionowej: Q-sepharose&reg;</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw Typ GE 446EC-1</td><td>Gettinge (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktor Typ 884 124/1</td><td>B.Braun (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Niemcy); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Niemcy); Mikro 22 R; Hettich (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas cholowy</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>Kolby hodowlane Kolby z przegrodami 500 ml, kolby z przegrodami 2 l</td><td>Schott Duran (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa 5'-trifosforanu cytydyny</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza jednowodna</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>Di-potaswodorofosforan trójwodny</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do dializy SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standardowe rurki RC</td><td>Fisher Scientific (Niemcy)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy, hydrat soli wapniowej</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Francuski zaburzacz ogniw ciśnieniowych</td><td>SLM; Amico Instruments (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa 5'-trifosforanu guanozyny (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna IMAC: HiTrap IMAC HP 5 mL</td><td>GE Life Sciences (Niemcy)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>Izopropylo-&beta;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-alanina</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagina</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-glicyna</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-izoleucyna</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-leucyna</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-lizyna</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-fenyloalanina</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofan</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrozyna</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>Jednostki dializ MD100</td><td>Scienova (Niemcy)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>N-2-hydroksyetylopiperazyna-N'-2-etanasulfonowy kwas (HEPES)</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecylofosfocholina</td><td>Antrace (USA)</td><td>F308S</td><td></td></tr><tr><td>Komora PAGE: Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System odlewania żelu PAGE: Mini Protean Systemy Handcast</td><td>Biorad (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz żelowy PAGE: Power Pac 3000</td><td>Biorad (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton/pepton z kazeiny</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna: ip-12</td><td>Ismatec (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól monopotasowa pirogronianu fosfoenolu</td><td>Sigma Aldrich (Niemcy)</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza pirogronianowa</td><td>Roche (Niemcy)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny: Hidex 300 SL</td><td>Hidex (Finlandia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granulki SDS</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>Peqlab (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr/czytnik fluorescencji Spark&reg;</td><td>Tecan (Szwajcaria)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli)</td><td>Roche (Niemcy)</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonificator</td><td>Labsonic U, B. Braun (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól trisodowa 5'-trifosforanu urydyny (UTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 przeciwpieniący</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Carl Roth (Niemcy)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Bezkomórkowe systemy ekspresji pozwalają na indywidualne projektowanie środowisk reakcji, aby wspierać funkcjonalne fałdowanie nawet złożonych białek, takich jak białka błonowe. Zademonstrowano eksperymentalne procedury kotranslacyjnej insercji i fałdowania białek błonowych do wstępnie uformowanych i zdefiniowanych błon dostarczanych w postaci nanodysków. Protokół jest całkowicie wolny od detergentów i może wygenerować miligramy oczyszczonych próbek w ciągu jednego dnia. Uzyskane w ten sposób próbki białek błonowych/nanodysków można wykorzystać do różnych badań funkcjonalnych i zastosowań strukturalnych, takich jak krystalizacja, magnetyczny rezonans jądrowy lub mikroskopia elektronowa. Opisano przygotowanie podstawowych kluczowych składników, takich jak lizaty bezkomórkowe, nanodyski z zaprojektowanymi membranami, krytyczne roztwory podstawowe, a także montaż dwukompartmentowych bezkomórkowych reakcji ekspresji. Ponieważ wymagania dotyczące fałdowania białek błonowych mogą być bardzo zróżnicowane, głównym celem tego protokołu jest modulacja parametrów i etapów reakcji ważnych dla jakości próbki, takich jak krytyczne podstawowe związki reakcyjne, skład błony nanodysków, środowisko redoks i opiekuńcze lub projekt matrycy DNA. Cały proces demonstruje się za pomocą syntezy proteorodopsyny i receptora sprzężonego z białkiem G.

Przedstawiono przykład wpływu optymalizacji składników reakcyjnych na końcową wydajność lub jakość syntetyzowanych białek membranowych (MP). Powszechnie stosowanym podejściem jest dostrajanie optymalnego stężenia Mg2+ w reakcjach CF poprzez ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), które służy jako wygodny wskaźnik wydajności systemu. Przykładowo, GFP syntetyzowano z wektora pET-21a(+) przy stężeniach Mg2+ od 14 do 24 mM (Rysunek 2). Analiza SDS-PAGE pozwoliła...

Kotranslacyjna insercja do wstępnie uformowanych nanodysków umożliwia badanie bezkomórkowych syntetyzowanych białek błonowych w określonych środowiskach lipidowych bez kontaktu z detergentami. Protokół ten opisuje przygotowanie podstawowych komponentów systemu oraz parametry krytyczne dla poprawy wydajności odciągania i jakości próbki.

Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Protokół jest bardzo wydajny i wszechstronny. Można go nakładać na prawie każde białko błonowe, a cała procedura produkcyjna jest zakończona w ciągu jednego dnia. Zsyntetyzowane białka błonowe mogą być stabilizowane już kotranslacyjnie przez dostarczone ligandy.Całkowicie unika się kontaktu z detergentem, a białka wkładają się i fałdują bezpośrednio w dostarczonym i dostosowanym środowisku membranowym. Podejścia strukturalne, charakterystyka funkcjonalna i wytwarzanie przeciwciał to główne obszary zastosowań. Technika ta jest ponadto prosta w analizie wpływu lipidów na fałdowanie i funkcję białek błonowych.W trzecim dniu hodowli zaszczepij 10 litrów sterylnej pożywki YPTG o temperaturze 37 stopni Celsjusza w 15-litrowym reaktorze z mieszadłem ze 100 mililitrami kultury wstępnej. I hoduj bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 500 obrotów na minutę w wysokim napowietrzeniu. Aby zapobiec nadmiernemu pienieniu, dodaj sterylny środek przeciwpieniący.Gdy komórki osiągną fazę mid-log-, dodaj 300 mililitrów etanolu do kultury i inkubuj komórki w temperaturze 42 stopni Celsjusza z 500 obrotami na minutę w wysokim napowietrzeniu przez kolejne 45 minut. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i użyć szpatułki i pipety, aby całkowicie zawiesić komórki w 300 mililitrach buforu S30A. Odwiruj zawieszone bakterie dwa razy, myjąc granulat 300 mililitrami świeżego S30A na pranie.Po drugim płukaniu ponownie zawiesić ogniwa w 1,1 objętości buforu S30B. Załaduj zawieszenie do wstępnie schłodzonej komory ciśnieniowej prasy francuskiej i jednorazowo rozerwij ogniwa o masie 1,000 funtów na cal kwadratowy. Aby usunąć wszelkie niestabilne składniki i uwolnić mRNA z rybosomów, dostosuj lizat do 0,4 molowego chlorku sodu i inkubuj próbkę przez 45 minut w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza.Aby złożyć nanodyski białkowe rusztowania błonowego, wymieszaj roztwór MSP1E3D1 z roztworem lipidowym i dodaj DPC do końcowego stężenia 0,1%Dostosuj reakcję do odpowiedniej objętości końcowej zgodnie z tabelą i inkubuj reakcje przez godzinę w temperaturze 21 stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem. Pod koniec inkubacji należy wstępnie zwilżyć membranę kasety dializacyjnej buforem do tworzenia krążków i za pomocą strzykawki załadować mieszaninę montażową do kasety. Następnie dializować reakcję z trzema pięciolitrowymi objętościami buforu do tworzenia dysku przez 10 do 20 godzin w temperaturze pokojowej z mieszaniem przed przeniesieniem mieszaniny do zrównoważonych odśrodkowych jednostek filtrujących do tworzenia krążków i z odcięciem masy cząsteczkowej 10 kilodaltonów.Następnie zagęścić reakcję do co najmniej 300 mikromolów przez odwirowanie za pomocą czytnika UV-Vis w celu zmierzenia stężenia. Aby przygotować trzymililitrową reakcję bezkomórkową z ciągłą wymianą, należy zrównoważyć membranę trzymililitrowej kasety dializacyjnej w 100-milimolowym trioctanie. I użyj strzykawki, aby przenieść mieszaninę reakcyjną do kasety.Za pomocą strzykawki usunąć nadmiar powietrza z komory mieszaniny reakcyjnej i umieścić kasetę w komorze dializy. Napełnij komorę 60 mililitrami mieszanki paszowej i umieść pokrywę na komorze. Po zamocowaniu pokrywy na miejscu inkubuj komorę przez 12 do 16 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza w 200 obrotach na minutę.Aby przygotować 60-mikrolitrową konfigurację do bezkomórkowej wymiany komórek do przesiewania jonów magnezu, dodaj 60 mikrolitrów naszego świeżo przygotowanego 3X Master Mix do mieszaniny reakcyjnej i 825 mikrolitrów do mieszanki paszowej. I napełnij mieszankę do karmienia wodą. Po wirowaniu dodaj 825 mikrolitrów mieszanki paszowej do każdego z trzech dołków 24-dołkowej mikropłytki.Pokrój rurki do dializy z regenerowanej celulozy z odcięciem masy cząsteczkowej od 10 do 14 kilodaltonów na kawałki o wymiarach około 25 na 20 milimetrów i przechowuj je w wodzie uzupełnionej 0,05% azydkiem sodu. Przed montażem pojemnika bezkomórkowego do wymiany minikomórek należy użyć chusteczki do usunięcia nadmiaru wody z membran dializy i umieścić jeden kawałek membrany na każdym pojemniku. Zamocuj membrany za pomocą pierścienia z politetrafluoroetylenu i przenieś mini pojemnik do jednej studzienki mieszanki paszowej.Dodać składniki wysokocząsteczkowe do mieszaniny reakcyjnej, jak wskazano w tabeli, i wymieszać przez pipetowanie. Dodać 60 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do pojemnika reakcyjnego, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. I owiń dwa arkusze uszczelniającej folii termoplastycznej o wymiarach osiem na 10 centymetrów wokół 24-dołkowej płytki.Zamocuj pokrywę płytki studzienki na miejscu za pomocą taśmy i umieść płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w 200 obrotach na minutę z mieszaniem przez 12 do 16 godzin. Następnego ranka za pomocą końcówki pipety przebić membranę dializacyjną w bezkomórkowym pojemniku do wymiany minikomórek i zassać mieszaninę reakcyjną. Przenieść mieszaninę reakcyjną do nowych probówek wirówkowych i odwirować w celu usunięcia osadów.Następnie przenieść supernatant do nowej probówki. W tym miejscu przedstawiono reprezentatywny wpływ dostrajania związków reakcyjnych na końcową wydajność lub jakość syntetyzowanych białek błonowych. W tej analizie ogólna synteza i rozpuszczalność nanokrążków receptora adrenergicznego T-beta-one była podobna we wszystkich analizowanych składach błonowych.Natomiast znacznie większą zmienność wykryto w jakości syntetyzowanego receptora sprzężonego z białkiem G, przy czym najniższą aktywność uzyskano przy użyciu lipidów DMPC i POPC, a najwyższą zaobserwowano po zastosowaniu DOPG i POPG. Podsumowując, wyniki te wskazują, że ładunek lipidowej grupy głównej, a także elastyczność łańcucha kwasów tłuszczowych są ważnymi modulatorami fałdowania i aktywności tego białka błony komórkowej. Końcowe stężenie nanodysku może być również ważnym czynnikiem wpływającym na jakość białek błonowych.Na przykład, jeśli stężenie nanodysku jest badane w zakresie od 3,75 do 60 mikromolowych, uzyskuje się całkowitą rozpuszczalność receptora sprzężonego z białkiem G przy około 30-mikromolowych nanodyskach, co daje stosunek białka do nanodysku błonowego jeden do trzech. W przeciwieństwie do tego, całkowitą rozpuszczalność proteorodopsyny można osiągnąć za pomocą około 10-mikromolowych nanodysków, co daje stosunek proteorodopsyny do nanodysku 10 do jednego. Dokładne pipetowanie i wysokiej jakości komponenty są z pewnością obowiązkowe.Krytycznymi etapami przygotowania lizatu jest zbieranie komórek w połowie fazy logarytmicznej i zastosowanie etapu o wysokiej zawartości soli. Technika ta drastycznie zmniejsza złożoność syntezy białek błonowych. Dawniej trudne cele są efektywnie syntetyzowane, co pozwala na pracę nad strukturami molekularnymi dotychczas niezbadanych białek o znaczeniu farmaceutycznym.

co-translational-insertion-membrane-proteins-into-preformed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Nanodyski to małe dyskoidalne cząstki, które zawierają białka błonowe w małym fragmencie dwuwarstwy fosfolipidowej.  Udostępniamy protokół wizualny, który pokazuje krok po kroku wbudowywanie transportera MalFGK2 w dysk.

Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc

Źródło: Gilmore, S. F., et al. Bezkomórkowa skalowana produkcja i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje bezkomórkową syntezę stabilizowanych nanodyskami błonowych antygenów białkowych przy użyciu systemu dwukompartmentowego. Urządzenie utrzymuje optymalne warunki do wydajnej syntezy białek, prawidłowego fałdowania i stabilnej integracji w nanodyski.

Synteza stabilizowanych nanodyskami antygenów białek błonowych przy użyciu systemu bezkomórkowego

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Tutaj opisujemy produkcję i charakterystykę czynników bioaktywnych zawierających nanodyski. Nanodyski amfoterycyny B są traktowane jako przykład, aby opisać protokół w sposób krokowy.

Formulacja i charakterystyka czynnika bioaktywnego zawierającego nanodyski

Tutaj opisany jest protokół do generowania regulowanych światłem i odwracalnych wzorców białkowych z wysoką precyzją czasoprzestrzenną na sztucznych błonach lipidowych. Metoda polega na zlokalizowanej fotoaktywacji białka iLID (ulepszonego dimeru indukowanego światłem) unieruchomionego na błonach modelowych, które w świetle niebieskim wiąże się ze swoim białkiem partnerskim Nano (SspB typu dzikiego).

Dynamiczne wzorce białek indukowane światłem na błonach modelowych

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Niniejsze badanie opisuje procedurę rekonstrukcji błonowego białka TWIK, kanału K+ wrażliwego na kwasy 2 (Zadanie 2) w nanodyski. Pomyślny montaż potwierdzono za pomocą mikroskopii krio-elektronowej z pojedynczą cząstką, która dała dobrze określone dwuwymiarowe średnie klasowe.

Technika stabilizacji białek błonowych w nanodyskach

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Poznaj metodę kotranslacyjnej insercji białek błonowych do nanodysków bez użycia detergentów. Technika umożliwia badanie składania i funkcji białek w kontrolowanych środowiskach lipidowych.

Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

Przeglądaj więcej filmów