Badanie aktywności neuropeptydów i innych regulatorów układu wydalniczego u dorosłego komara

Protokół ten opisuje techniki, które mogą być wykorzystane przez fizjologów małych zwierząt w celu wyjaśnienia roli neuropeptydów i innych czynników hormonalnych regulujących pracę układu trawiennego i/lub wydalniczego. Techniki te pozwalają na pomiary próbek biologicznych o rozmiarach mikro, które w innym przypadku nie byłyby możliwe przy użyciu technik zaprojektowanych specjalnie dla większych modeli zwierzęcych, w tym na przykład gryzoni i teleusów. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji endokrynologicznej jelit, w tym transportu nabłonka, a także mięśni gładkich związanych z przewodem pokarmowym u owadów i gatunków innych niż owady o podobnej wielkości.

Zabiegi na jajowodach nerkowych zademonstruje Farwa Sajadi, doktorantka z mojego laboratorium. Dodatkowo, były doktorant z mojego laboratorium, Aryan Lajevardi, będzie demonstrował protokoły skoncentrowane na jelicie tylnym. Zacznij od przygotowania naczyń z testami Ramsaya i skurczu do eksperymentów.

Użyj pipety i napełnij studzienki do 20 mikrolitrów roztworu. W przypadku niestymulowanych kontroli napełnij studzienki 20 mikrolitrami pożywki Schneidera z solą fizjologiczną Aedes. Po napełnieniu wszystkich studzienek wlej uwodniony olej mineralny do naczynia testowego, aż studzienki i szpilki Minutien zostaną zanurzone.

Po zanurzeniu kanalika w studzience podnieś bliższy koniec kanalika za pomocą kleszczy, usuń go z kropli kąpieli i owiń koniec wokół szpilki. Owiń kanalik wokół szpilki dwukrotnie, utrzymując długość kanalika pozostałą w kropli kąpieli zgodną z innymi kanalikami. Aby wykonać selektywną mikroelektrodę sodową, użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby wypełnić elektrodę 100-milimolowym chlorkiem sodu.

Upewnij się, że roztwór zasypki napełnia się, aż końcówka elektrody. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, delikatnie przesuń mikroelektrodę lub usuń roztwór i napełnij ponownie. Zanurz końcówkę pipety o pojemności 10 mikrolitrów w selektywnym roztworze jonoforu sodu.

Ustaw elektrodę prostopadle do pipety, a następnie umieść palec w rękawiczce na spodzie końcówki, aby wytworzyć ciśnienie i usunąć niewielką kroplę jonoforu. Ostrożnie przyłóż kroplę jonoforu do końcówki mikroelektrody, uważając, aby jej nie złamać. Napełnij małą zlewkę do połowy 100-milimolowym chlorkiem sodu i umieść trochę plasteliny w środku na górze zlewki.

Po pobraniu jonoforu umieścić końcówkę elektrody na ściance zlewki, pozwalając końcówkom zanurzyć się w chlorku sodu. Przechowywać ISME w zlewce do czasu, aż będzie gotowy do użycia. Aby wykonać elektrodę referencyjną ISME, należy wypełnić elektrodę 500 milimolowym chlorkiem potasu i przechowywać ją w zlewce.

Pokryj końcówki elektrod roztworem około 3,5% polichlorku winylu, rozpuszczonego w tetrahydrofuranie, aby uniknąć przemieszczenia jonoforu po zanurzeniu w oleju parafinowym. Aby skalibrować elektrodę sodową, umieść 10 mikrolitrów kropelek chlorku sodu o standardowych stężeniach na krawędzi szalki Ramseya z inkubowanymi kanalikami Malpighiego. Umieść standardowe kropelki w odległości dwóch centymetrów od siebie, a wyższe stężenie na górze.

Włóż zarówno elektrodę referencyjną, jak i elektrodę jonoselektywną na druty srebra chlorkowego i przymocuj je bezpiecznie za pomocą uchwytów elektrod, które są przymocowane do mikromanipulatorów. Skieruj obie elektrody w kierunku 200-milimolowej kropli chlorku sodu za pomocą mikromanipulatorów, upewniając się, że końcówki elektryczne nie dotykają dna naczynia. Włącz elektrometr, aby rozpocząć nagrywanie i poczekaj, aż odczyt się ustabilizuje.

Nagraj odczyt i przejdź do następnego standardu. Po wykonaniu pomiarów szybkości wydzielania płynu, ostrożnie przenieś elektrody referencyjne i jonoselektywne do wydzielanej kropli za pomocą mikromanipulatorów. Włącz nagrywanie i poczekaj, aż odczyt się ustabilizuje, a następnie nagrywaj.

Włącz IPA-2 Ion/Polarographic Amplifier, mikroskop świetlny i komputery. Umieść mikroelektrodę selektywną sodową na uchwycie składającym się z drutu z chlorku srebra i podłącz ją do żeńskiego gniazda złącza. Wyjąć z zlewki jedną elektrodę odniesienia z chlorkiem potasu, umieszczając jeden palec na jednym końcu i przechylając szklaną kapilarnę w kierunku tego palca, aby zapobiec wypadnięciu agaru.

Ostrożnie umieść jeden koniec w uchwycie, upewniając się, że nie tworzą się bąbelki. Jeśli pojawi się pęcherzyk, wyjmij elektrodę odniesienia, napełnij uchwyt trzema molowymi roztworami chlorku potasu i powtórz czynność. Umieść uchwyt elektrody w gnieździe złącza żeńskiego.

Po kalibracji należy przeprowadzić sekcję narządu. Umieścić naczynie z poli-L-lizyny z wypreparowaną próbką na stoliku mikroskopu i włożyć końcówkę elektrody referencyjnej do soli fizjologicznej. Zanurz końcówkę mikroelektrody jonoselektywnej w soli fizjologicznej, uważając, aby nie złamać końcówki.

Użyj pokręteł regulacji ręcznej, aby wyregulować położenie mikroelektrody podczas patrzenia pod mikroskop świetlny. Dostosuj pionowe położenie mikroelektrody tak, aby jej końcówka znajdowała się w tej samej płaszczyźnie co narząd lub tkanka, a następnie obróć przełącznik silnika, aby włączyć. Za pomocą strzałek komputera przesuń mikroelektrodę poziomo do pozycji oddalonej o trzy milimetry od tkanki, aby zmierzyć nagrania tła.

Gdy wszystko będzie gotowe, rozpocznij nagrywanie, naciskając F5, uzyskaj pięć pomiarów aktywności w tle. Przesuń końcówkę mikroelektrody blisko tkanki, uważając, aby nie przebić narządu. Zmniejsz czułość na uderzenie, aby umieścić końcówkę mikroelektrody dwa mikrometry bezpośrednio w prawo, prostopadle do tkanki.

Uzyskaj trzy zapisy w miejscu wzdłuż poduszki doodbytniczej, aby zidentyfikować miejsce największej aktywności jonów, a następnie uzyskaj podstawowe pomiary soli fizjologicznej w miejscu wykazującym największą aktywność. Aby zarejestrować skurcze jelita tylnego, napełnij jedną z studzienek w naczyniu znaną objętością soli fizjologicznej Aedes. Po sekcji ostrożnie przenieś wypreparowane jelito tylne przyczepione do jelita środkowego do dołka w innym naczyniu, uważając, aby nie uszczypnąć jelita krętego.

Zanurz jelito w soli fizjologicznej wewnątrz studzienki i umieść szpilki Minutien w jelicie środkowym i odbytnicy. Jelito kręte nie powinno być napięte i należy obserwować spontaniczne skurcze rozpoczynające się w zastawce odźwiernika w przedniej części jelita krętego. Podłącz kamerę wideo do mikroskopu stereoskopowego.

Następnie umieść naczynie zawierające wypreparowany narząd pod mikroskopem i nagrywaj wideo przez dwie minuty. Zastosowanie DH31 przeciwko niestymulowanym kanalikom Malpighiego powoduje znaczny wzrost szybkości wydzielania płynów, co potwierdza jego rolę jako hormonu moczopędnego u komarów Aedes. Gdy kanaliki są traktowane AedaeCAPA-1, obserwuje się zmniejszenie szybkości wydzielania w kanalikach Malpighiego stymulowanych DH31.

Do pomiaru stężenia sodu w wydzielanych kropelkach użyto elektrod jonoselektywnych. Leczenie DH31 MT nie miało wpływu na stężenie sodu w wydzielanej kropli. Jednak po zastosowaniu AedaeCAPA-1 stężenie sodu w wydzielanym płynie uległo znacznemu zwiększeniu.

Dodatkowo, w porównaniu z niestymulowanymi kontrolami, DH31 doprowadził do znacznie większego tempa transportu sodu, podczas gdy AedaeCAPA-1 zniósł ten wzrost kanalików stymulowanych DH31. SIET wykorzystano do oceny zmian w transporcie sodu wzdłuż nabłonka poduszki odbytnicy u dorosłych samic komarów. Analog leukokininy użyto do zbadania zmian we wchłanianiu sodu, co spowodowało czterokrotne zmniejszenie wchłaniania sodu w porównaniu z kontrolą soli fizjologicznej.

Aby ocenić rolę neuropeptydu pyrokininy2 w motoryce jelita krętego, użyto analogu Rhodnius prolixus, który, jak wykazano wcześniej, aktywuje receptor PK2 A.aegypti wzbogacony w jelicie krętym komara. W stosunku do poziomów wyjściowych PK2 znacząco hamuje skurcze jelita krętego. Podczas wykonywania testu Ramsaya z kanalikami Malpighiego i pomiaru szybkości wydzielania jonów lub płynów, konieczne jest, aby kanaliki nie zostały uszkodzone podczas sekcji lub podczas przenoszenia do naczynia testowego.

Po teście Ramsaya, specyficzne transportery błonowe mogą być celowane farmakologicznie lub molekularnie przy użyciu technik odwrotnej genetyki, aby określić ich specyficzny wkład w transepiteliczny transport substancji rozpuszczonych w nabłonku prostym.