Name: Badanie aktywności neuropeptydów i innych regulatorów układu wydalniczego u dorosłego komara (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj metody badania aktywności neuropeptydów w układzie wydalniczym komara Aedes za pomocą testu Ramsaya i techniki SIET. Protokół umożliwia pomiar sekrecji płynów i transportu jonów w cewkach Malpighiego oraz jelicie tylnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants dla AD i J-PP. AL i FS otrzymały nagrody NSERC CGS-M w ramach wsparcia swoich badań magisterskich.

Żaden.

Po spożyciu posiłku z krwi owady hematophagu stają przed wyzwaniem związanym z nadmiarem substancji rozpuszczonych i wody w hemolimfie2. Aby sobie z tym poradzić, mają wyspecjalizowany układ wydalniczy, który jest ściśle kontrolowany przez czynniki hormonalne, co pozwala owadom szybko zainicjować diurezę poposiłkową. Test Ramsaya i zastosowanie mikroelektrod jonoselektywnych pozwala na pomiar szybkości wydzielania płynu wraz ze stężeniami jonów i szybkościami transportu w izolowanych MT owadów. Kr...

Utrzymanie poziomu soli i wody u owadów pozwala im odnieść sukces w wielu niszach ekologicznych i środowiskowych, wykorzystując różne strategie żywieniowe1. Większość owadów wyewoluowała mechanizmy regulujące skład ich hemolimfy w wąskich granicach, aby sprostać różnym wyzwaniom związanym z ich konkretnym środowiskiem2. Owady lądowe często stają przed wyzwaniem oszczędzania wody, a układ wydalniczy ulega antydiurezie, aby zapobiec utracie wody i niektórych niezbędnych soli, unikając w ten sposób wysuszenia. Natomiast diureza występuje, gdy owad żeruje i jest narażony na nadmiar wody i potencjalnie sole3,4. Dzięki wyspecjalizowanemu i wysoce aktywnemu układowi wydalniczemu owady wykształciły mechanizmy regulacyjne działające w celu przeciwdziałania ich wyzwaniom osmoregulacyjnym. U dorosłych komarów Aedes aegypti układ wydalniczy składa się z kanalików Malpighiego (MT) i jelita tylnego, z których ten ostatni składa się z jelita krętego przedniego i tylnej odbytnicy5. MT są odpowiedzialne za wytwarzanie moczu pierwotnego, zwykle bogatego w NaCl i/lub KCl. Mocz pierwotny jest następnie modyfikowany przez procesy wydzielnicze i reabsorpcyjne, gdy przemieszcza się w dół kanalika i wchodzi do jelita tylnego5. Końcowe odchody mogą być hiper- lub hiposmotyczne do hemolimfy, w zależności od warunków żywienia/środowiska, i są wzbogacone w toksyczne i azotowe odpady2.
MTs są idealne do badania wielu cech transportu płynu nabłonkowego i substancji rozpuszczonej, ponieważ realizują bardzo różnorodne funkcje transportowe i wydalnicze2,6. Poprzez regulację hormonalną2, MT działają poprzez wydzielanie jonów i innych substancji rozpuszczonych z krwi do kanalika lumen7, zapewniając gradient osmotyczny umożliwiający transport wody przez akwaporyny8,9, który wspólnie tworzy pierwotny mocz, zanim dotrze do reabsorpcji hindgut2. W ten sposób, zbierając wydzielany płyn z izolowanych MT, można w sposób ciągły monitorować transepiteliczny transport płynu i jonów. Pomiar szybkości wydzielania i składu moczu dostarcza informacji na temat mechanizmów odpowiedzialnych za transnabłonkowy transport jonów i płynów. Popularną metodą badania szybkości wydzielania płynów jest test Ramsaya, który został po raz pierwszy wprowadzony przez Ramsaya w 1953 roku10. W tej metodzie dystalny (zamknięty) koniec kanalika jest traktowany hormonem (lub innym badanym związkiem/lekiem), podczas gdy proksymalny (otwarty) koniec jest owinięty wokół szpilki w nasyconym wodą oleju parafinowym, który wydziela pierwotny mocz, gromadząc się w postaci kropli na końcu szpilki. Izolowane MT są w stanie przetrwać i funkcjonować przez długi czas (do 24 godzin) w zoptymalizowanych warunkach in vitro, co czyni je odpowiednimi i skutecznymi modelami do pomiaru wydzielania płynów. Owady mają otwarty układ krążenia, dlatego MT można łatwo rozciąć i usunąć, ponieważ zwykle swobodnie unoszą się w klasie hemolimf<sup="xref">6. Dodatkowo, z wyjątkiem mszyc - które nie mają MTs11 - liczba MT u danego gatunku owadów może się znacznie różnić od czterech do setek (pięć u komarów Aedes), co pozwala na wielokrotne pomiary jednego owada.
MTs u komarów Aedes, podobnie jak inne owady endopterygote, składają się z dwóch typów komórek tworzących prosty nabłonek2,12; duże główne komórki, które ułatwiają aktywny transport kationów (tj. Na+ i K+) do światła, oraz cienkie komórki gwiaździste, które pomagają w transepitelialnym wydzielaniu Cl-13. MT nie są unerwione2, a zamiast tego są regulowane przez kilka hormonów, w tym zarówno czynniki moczopędne, jak i antydiuretyczne, co pozwala na kontrolę transportu jonów (głównie Na+, K+ i Cl-) oraz osmotycznie zobowiązaną wodę2. W licznych badaniach analizowano regulację hormonalną MT Aedes, aby zrozumieć rolę czynników endokrynnych w transepitelium transportu14,15,16,17,18. Jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, protokoły w niniejszym dokumencie pokazują wpływ różnych czynników hormonalnych na wyizolowane MT od dorosłych samic komarów A. aegypti, w tym zarówno kontrolę moczopędną, jak i antydiuretyczną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Test Ramsaya służy do pokazania, w jaki sposób hormon antydiuretyczny, AedaeCAPA-1, hamuje wydzielanie płynów MT stymulowanych przez hormon moczopędny 31 (DH31) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
Mniejszy rozmiar owadów wymagał opracowania mikro metod pomiaru aktywności jonowej i stężeń w próbkach płynów lub w pobliżu powierzchni izolowanych tkanek, takich jak MT i jelita. Zaimplementowano różne metody, w tym użycie radioizotopów jonów19, co wymaga zbierania wydzielanych kropel płynu do pomiaru stężeń jonów20. Stymulowane kanaliki Aedes in vitro zazwyczaj wydzielają ~0,5 nL/min21, dlatego obsługa tak małych objętości może stanowić wyzwanie i potencjalnie powodować błąd przy przenoszeniu. W rezultacie, mikroelektrody jonoselektywne (ISME) są szeroko stosowane do pomiaru stężenia jonów w wydzielanych kropelkach MT in vitro. W tej metodzie elektroda referencyjna i ISME, wypełnione odpowiednim roztworem zasypkowym i jonoforem, są umieszczane w wydzielanej kropelce moczu w celu określenia stężenia jonów22. Zaadaptowany z Donini and associates23, ten obecny protokół wykorzystuje jonofor selektywny Na+ do pomiaru aktywności jonów w wydzielanych kropelkach ze stymulowanych MT u dorosłych komarów Aedes. Ponieważ mikroelektrody jonoselektywne mierzą aktywność jonów, dane te można wyrazić jako stężenia jonów przy założeniu, że roztwory kalibracyjne i próbki eksperymentalne mają ten sam współczynnik aktywności jonów21 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B,C).
Technika Skanowania Elektrod Jonoselektywnych (SIET) również wykorzystuje ISME do pomiaru gradientów stężenia jonów w niewymieszanej warstwie przylegającej do organów, tkanek lub komórek, które transportują jony. ISME mierzą gradienty napięcia, które można następnie wykorzystać do obliczenia gradientów stężenia jonów oraz kierunku i wielkości strumienia jonów w narządzie, tkance lub komórce20. W tej technice ISME jest zamontowany na trzyosiowym manipulatorze sterowanym przez skomputeryzowane silniki mikrokrokowe, dzięki czemu jego pozycja 3D jest kontrolowana do poziomu mikrometra20. Napięcia są mierzone w dwóch punktach w warstwie niezmieszanej przy użyciu protokołu próbkowania zaprogramowanego i kontrolowanego przez oprogramowanie komputerowe. Te dwa punkty są zwykle oddalone od siebie o odległość 20–100 μm, przy czym jeden punkt znajduje się w odległości 5–10 μm od powierzchni narządu, tkanki lub komórki, a drugi punkt w odległości 20–100 μm. Różnica w wielkości napięć między dwoma punktami jest obliczana w celu uzyskania gradientu napięcia24,25,26, który jest następnie używany do obliczenia gradientu stężenia, a następnie strumienia netto za pomocą prawa Ficka24,27. Metoda ta jest przydatna do oceny transportu określonych jonów przez różne regiony jelita owada i MT lub w określonych punktach czasowych po posiłku z krwi lub ekspozycji na leczenie. Na przykład, SIET może być wykorzystany do zrozumienia, w jaki sposób procesy absorpcyjne i wydzielnicze w układzie wydalniczym komarów są regulowane przez hormony28, a także różne zachowania żywieniowe i warunki hodowli25. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem SIET ujawniły miejsca zaangażowane w transport jonów wzdłuż brodawek odbytu i odbytnicy larw i dorosłych komarów24,28. Obecny protokół, opisany wcześniej przez Paluzziego i współpracowników26, mierzy strumień Na+ przez nabłonek poduszki odbytnicy dorosłej kobiety (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
Końcowy segment systemu wydalniczego komarów wymaga skoordynowanych ruchów mięśni, aby pomóc w mieszaniu jedzenia i wydzielaniu odpadów26. Niewchłanialne produkty trawienia z jelita środkowego, wraz z pierwotnym moczem wydzielanym przez MT, są przepuszczane przez zastawkę odźwiernika i dostarczane do jelita tylnego2. Spontaniczne skurcze jelita tylnego rozpoczynają się przy zastawce odźwiernika i występują w falach perystaltycznych, które są przekazywane przez jelito kręte poprzez skoordynowany skurcz mięśni okrężnych i podłużnych otaczających powierzchnię podstawy komórek nabłonka26. Wreszcie, mięśnie w odbytnicy pomagają napędzać i eliminować odpady przez kanał odbytu. Chociaż ruchliwość tylnego jelita owada jest miogeniczna, wymagając zewnątrzkomórkowego Ca2+ do wytworzenia spontanicznych skurczów, procesy te mogą być również regulowane neuronalnie26,29,30. Ta egzogenna regulacja przez układ nerwowy jest ważna po karmieniu, ponieważ zwierzę musi wydalić odpady z jelit i przywrócić równowagę hemolimfy31. W rezultacie, przeprowadzanie testów biologicznych in vitro w celu identyfikacji neuropeptydów miostymulujących lub miohamujących jest przydatne w ocenie, w jaki sposób neurochemikalia wpływają na ruchliwość jelita grubego. Obecny protokół, przeprowadzony przez Lajevardi i Paluzzi28, wykorzystuje nagrania wideo do zbadania motoryki jelita krętego w odpowiedzi na neuropeptydy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Podobnie, przetwornik siły lub konwerter impedancji może być również używany do obserwacji śladów skurczów za pomocą oprogramowania do akwizycji danych32,33. Jednak korzystanie z technologii wideo pozwala nam wizualnie ocenić narząd i dalej analizować przy użyciu podzbioru parametrów w celu określenia roli hormonów w motoryce jelita tylnego.
Korzystanie z tych technik może pomóc w scharakteryzowaniu czynników, które regulują i koordynują transport płynów i jonów wzdłuż układu wydalniczego wraz z ruchliwością jelita tylnego. Co ważne, potwierdza się funkcjonalny związek między reakcją moczopędną MT a ruchliwością jelita grubego, ponieważ stwierdzono, że hormony moczopędne, takie jak DH31 i 5HT, charakteryzujące się zdolnością do stymulowania wydzielania płynów przez MT, wykazują również działanie miotropowe wzdłuż jelita tylnego komara21,34,35. Odkrycia te podkreślają znaczenie ścisłej koordynacji między MT a jelitem tylnym podczas zdarzeń takich jak diureza poposiłkowa u owadów wymagających szybkiej eliminacji odpadów.
Tutaj opisano szczegółowe podejście do techniki testu Ramsaya do pomiaru szybkości wydzielania płynów u komara, A. aegypti, oraz użycie mikroelektrod selektywnych jonowo do określania stężeń Na+ w wydzielanym płynie MT, co w połączeniu pozwala na określenie szybkości transepitelowego transportu jonów. Dodatkowo, Technika Skanowania Elektrod Jonoselektywnych i testy skurczu jelita tylnego są opisane w celu pomiaru odpowiednio strumienia jonów i ruchliwości, co pomaga wyjaśnić regulację hormonalną jelita tylnego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 4).

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955456</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalki Petriego</td><td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td><td>C351008</td><td></td></tr><tr><td>Probówki kapilarne ze szkła borokrzemianowego (OD 1 mm, ID 0,58 mm, długość 100 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>używane do elektrod</td></tr> <tr><td>referencyjnych ISMERurki kapilarne z włókna kapilarnego ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 2 mm, średnica wewnętrzna 1,12 mm, długość 102 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B200F-4</td><td>używana do elektrod referencyjnych SIET</td></tr><tr><td>Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego bez włókien (OD 1,5 mm, ID 1,12 mm, długość 100 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150-4</td><td>używane do elektrod ISME i SIET podkładka</td></tr><tr><td>CO2 Diamed</td><td></td><td>GEN59-114</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dimetylotrimetylosililoaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41716</td><td></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Niestandardowa</td><td></td><td>Może być wytwarzana przez lokalny warsztat mechaniczny</td></tr><tr><td>Chlorek żelaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze (Dumont # 5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-748A</td><td></td></tr><tr><td>Uwodniony olej mineralny</td><td>Fisher Scientific</td><td>8042-47-5</td><td>Konkretna marka nie jest ważna</td></tr><tr><td>INFINITY1-2CB kamera wideo</td><td>Luminera</td><td>INFINITY1-2CB</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatory (leworęczne i praworęczne)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>MMJL i MMJR</td><td>Konkretna marka nie jest ważna, o ile wysokiej jakości manipulator</td></tr><tr><td>Olej mineralny, Light</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-4</td><td></td></tr><tr><td>Kołki Minutien (stal nierdzewna 0,1 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Nietwardniejąca modelina</td><td>Sargent Art</td><td></td><td>Specyficzna marka nie jest ważna</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny Olympus (DLA SIET)</td><td>Niestandardowy system</td><td></td> <td>Olympus</td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta Pasteura (transferowa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna roztwór (0,1 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-005-M</td><td>84 kDa</td></tr><tr><td>Polichlorek winylu (PVC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81395</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053-09</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila medium</td><td>System SIET</td><td></td> Sigma-Aldrich S0146 <td></td></tr><tr><td></td><td>Odpowiedni</td><td>niestandardowy system</td> elektroniczny <td>Szczegóły dostępne pod adresem: http://www.applicableelectronics.com/overview</td></tr><tr><td>Srebrny drut</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl jonoforu sodu II A</td><td>Fluka</td><td>99357</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe polistyrenowe naczynia Petriego (hodowla)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012921</td><td>Każdy rozmiar będzie odpowiedni, ale szalki 60 mm są dobre zarówno do sekcji, jak i test</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z mikrometrem ocznym</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 Flaming Brown Ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>FGPN7</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Chemical Company</td><td>NC9285739</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowane mieszadło z płytą grzejną VWR - aluminiowe</td><td>VWR</td><td>9578</td><td>Konkretna marka nie jest ważna</td></tr></tbody></table>

badanie aktywności neuropeptydów i innych regulatorów układu wydalniczego u dorosłego komara

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Badania nad fizjologią owadów, szczególnie u tych gatunków, które są wektorami patogenów wywołujących choroby u ludzi i innych kręgowców, stanowią podstawę do opracowania nowych strategii zwalczania szkodników. W tym miejscu opisano szereg metod, które są rutynowo stosowane do określania funkcjonalnych ról neuropeptydów i innych czynników neuronalnych (tj. amin biogennych) w układzie wydalniczym komara, Aedes aegypti. Kanaliki Malpighiego (MT), odpowiedzialne za pierwotne tworzenie moczu, mogą funkcjonować przez wiele godzin po usunięciu z komara, co pozwala na pomiary wydzielania płynów po leczeniu hormonalnym. W związku z tym test Ramsaya jest przydatną techniką pomiaru szybkości wydzielania z izolowanych MT. Mikroelektrody jonoselektywne (ISME) mogą być sekwencyjnie używane do pomiaru stężeń jonów (tj. Na+ i K+) w wydzielanym płynie. Test ten pozwala na pomiar kilku MT w danym momencie, określając działanie różnych hormonów i leków. Technika skanowania elektrod jonoselektywnych wykorzystuje ISME do pomiaru napięcia reprezentatywnego dla aktywności jonowej w niewymieszanej warstwie przylegającej do powierzchni narządów transportujących jony w celu określenia transepitelicznego transportu jonów w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Metodę tę można wykorzystać do zrozumienia roli hormonów i innych regulatorów we wchłanianiu lub wydzielaniu jonów w nabłonku. Testy skurczu jelita grubego są również przydatnym narzędziem do charakteryzowania mioaktywnych neuropeptydów, które mogą zwiększać lub zmniejszać zdolność tego narządu do usuwania nadmiaru płynów i odpadów. Łącznie metody te zapewniają wgląd w to, w jaki sposób układ wydalniczy jest regulowany u dorosłych komarów. Jest to ważne, ponieważ koordynacja funkcjonalna narządów wydalniczych ma kluczowe znaczenie w pokonywaniu wyzwań, takich jak stres związany z wysuszeniem po eklozji i przed znalezieniem odpowiedniego żywiciela kręgowców w celu uzyskania posiłku z krwi.

Zastosowanie DH31 w odniesieniu do niestymulowanych MT prowadzi do znacznego zwiększenia szybkości wydzielania płynu, co potwierdza jego rolę jako hormonu diuretycznego u komarów z rodzaju Aedes (Rycyna 1A). W przypadku traktowania cewek AedaeCAPA-1, w MT stymulowanych DH31 obserwuje się spadek szybkości wydzielania. Rycina 1B przedstawia wykorzystanie elektrod jonoselektywnych do pomiaru stężeń Na+ w wydzielony...

Ten protokół przedstawia metodologie testu Ramsaya, mikroelektrody selektywne jonowo, technikę skanowania elektrod jonoselektywnych (SIET) oraz testy skurczowe in vitro, stosowane do badania układu wydalniczego dorosłych komarów, składającego się z kanalików Malpighiego i jelita tylnego, do wspólnego pomiaru szybkości wydzielania jonów i płynów, aktywności skurczowej i transepitelowego transportu jonów.

Badanie aktywności neuropeptydów i innych regulatorów układu wydalniczego u dorosłego komara

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Protokół ten opisuje techniki, które mogą być wykorzystane przez fizjologów małych zwierząt w celu wyjaśnienia roli neuropeptydów i innych czynników hormonalnych regulujących pracę układu trawiennego i/lub wydalniczego. Techniki te pozwalają na pomiary próbek biologicznych o rozmiarach mikro, które w innym przypadku nie byłyby możliwe przy użyciu technik zaprojektowanych specjalnie dla większych modeli zwierzęcych, w tym na przykład gryzoni i teleusów. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji endokrynologicznej jelit, w tym transportu nabłonka, a także mięśni gładkich związanych z przewodem pokarmowym u owadów i gatunków innych niż owady o podobnej wielkości.Zabiegi na jajowodach nerkowych zademonstruje Farwa Sajadi, doktorantka z mojego laboratorium. Dodatkowo, były doktorant z mojego laboratorium, Aryan Lajevardi, będzie demonstrował protokoły skoncentrowane na jelicie tylnym. Zacznij od przygotowania naczyń z testami Ramsaya i skurczu do eksperymentów.Użyj pipety i napełnij studzienki do 20 mikrolitrów roztworu. W przypadku niestymulowanych kontroli napełnij studzienki 20 mikrolitrami pożywki Schneidera z solą fizjologiczną Aedes. Po napełnieniu wszystkich studzienek wlej uwodniony olej mineralny do naczynia testowego, aż studzienki i szpilki Minutien zostaną zanurzone.Po zanurzeniu kanalika w studzience podnieś bliższy koniec kanalika za pomocą kleszczy, usuń go z kropli kąpieli i owiń koniec wokół szpilki. Owiń kanalik wokół szpilki dwukrotnie, utrzymując długość kanalika pozostałą w kropli kąpieli zgodną z innymi kanalikami. Aby wykonać selektywną mikroelektrodę sodową, użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby wypełnić elektrodę 100-milimolowym chlorkiem sodu.Upewnij się, że roztwór zasypki napełnia się, aż końcówka elektrody. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, delikatnie przesuń mikroelektrodę lub usuń roztwór i napełnij ponownie. Zanurz końcówkę pipety o pojemności 10 mikrolitrów w selektywnym roztworze jonoforu sodu.Ustaw elektrodę prostopadle do pipety, a następnie umieść palec w rękawiczce na spodzie końcówki, aby wytworzyć ciśnienie i usunąć niewielką kroplę jonoforu. Ostrożnie przyłóż kroplę jonoforu do końcówki mikroelektrody, uważając, aby jej nie złamać. Napełnij małą zlewkę do połowy 100-milimolowym chlorkiem sodu i umieść trochę plasteliny w środku na górze zlewki.Po pobraniu jonoforu umieścić końcówkę elektrody na ściance zlewki, pozwalając końcówkom zanurzyć się w chlorku sodu. Przechowywać ISME w zlewce do czasu, aż będzie gotowy do użycia. Aby wykonać elektrodę referencyjną ISME, należy wypełnić elektrodę 500 milimolowym chlorkiem potasu i przechowywać ją w zlewce.Pokryj końcówki elektrod roztworem około 3,5% polichlorku winylu, rozpuszczonego w tetrahydrofuranie, aby uniknąć przemieszczenia jonoforu po zanurzeniu w oleju parafinowym. Aby skalibrować elektrodę sodową, umieść 10 mikrolitrów kropelek chlorku sodu o standardowych stężeniach na krawędzi szalki Ramseya z inkubowanymi kanalikami Malpighiego. Umieść standardowe kropelki w odległości dwóch centymetrów od siebie, a wyższe stężenie na górze.Włóż zarówno elektrodę referencyjną, jak i elektrodę jonoselektywną na druty srebra chlorkowego i przymocuj je bezpiecznie za pomocą uchwytów elektrod, które są przymocowane do mikromanipulatorów. Skieruj obie elektrody w kierunku 200-milimolowej kropli chlorku sodu za pomocą mikromanipulatorów, upewniając się, że końcówki elektryczne nie dotykają dna naczynia. Włącz elektrometr, aby rozpocząć nagrywanie i poczekaj, aż odczyt się ustabilizuje.Nagraj odczyt i przejdź do następnego standardu. Po wykonaniu pomiarów szybkości wydzielania płynu, ostrożnie przenieś elektrody referencyjne i jonoselektywne do wydzielanej kropli za pomocą mikromanipulatorów. Włącz nagrywanie i poczekaj, aż odczyt się ustabilizuje, a następnie nagrywaj.Włącz IPA-2 Ion/Polarographic Amplifier, mikroskop świetlny i komputery. Umieść mikroelektrodę selektywną sodową na uchwycie składającym się z drutu z chlorku srebra i podłącz ją do żeńskiego gniazda złącza. Wyjąć z zlewki jedną elektrodę odniesienia z chlorkiem potasu, umieszczając jeden palec na jednym końcu i przechylając szklaną kapilarnę w kierunku tego palca, aby zapobiec wypadnięciu agaru.Ostrożnie umieść jeden koniec w uchwycie, upewniając się, że nie tworzą się bąbelki. Jeśli pojawi się pęcherzyk, wyjmij elektrodę odniesienia, napełnij uchwyt trzema molowymi roztworami chlorku potasu i powtórz czynność. Umieść uchwyt elektrody w gnieździe złącza żeńskiego.Po kalibracji należy przeprowadzić sekcję narządu. Umieścić naczynie z poli-L-lizyny z wypreparowaną próbką na stoliku mikroskopu i włożyć końcówkę elektrody referencyjnej do soli fizjologicznej. Zanurz końcówkę mikroelektrody jonoselektywnej w soli fizjologicznej, uważając, aby nie złamać końcówki.Użyj pokręteł regulacji ręcznej, aby wyregulować położenie mikroelektrody podczas patrzenia pod mikroskop świetlny. Dostosuj pionowe położenie mikroelektrody tak, aby jej końcówka znajdowała się w tej samej płaszczyźnie co narząd lub tkanka, a następnie obróć przełącznik silnika, aby włączyć. Za pomocą strzałek komputera przesuń mikroelektrodę poziomo do pozycji oddalonej o trzy milimetry od tkanki, aby zmierzyć nagrania tła.Gdy wszystko będzie gotowe, rozpocznij nagrywanie, naciskając F5, uzyskaj pięć pomiarów aktywności w tle. Przesuń końcówkę mikroelektrody blisko tkanki, uważając, aby nie przebić narządu. Zmniejsz czułość na uderzenie, aby umieścić końcówkę mikroelektrody dwa mikrometry bezpośrednio w prawo, prostopadle do tkanki.Uzyskaj trzy zapisy w miejscu wzdłuż poduszki doodbytniczej, aby zidentyfikować miejsce największej aktywności jonów, a następnie uzyskaj podstawowe pomiary soli fizjologicznej w miejscu wykazującym największą aktywność. Aby zarejestrować skurcze jelita tylnego, napełnij jedną z studzienek w naczyniu znaną objętością soli fizjologicznej Aedes. Po sekcji ostrożnie przenieś wypreparowane jelito tylne przyczepione do jelita środkowego do dołka w innym naczyniu, uważając, aby nie uszczypnąć jelita krętego.Zanurz jelito w soli fizjologicznej wewnątrz studzienki i umieść szpilki Minutien w jelicie środkowym i odbytnicy. Jelito kręte nie powinno być napięte i należy obserwować spontaniczne skurcze rozpoczynające się w zastawce odźwiernika w przedniej części jelita krętego. Podłącz kamerę wideo do mikroskopu stereoskopowego.Następnie umieść naczynie zawierające wypreparowany narząd pod mikroskopem i nagrywaj wideo przez dwie minuty. Zastosowanie DH31 przeciwko niestymulowanym kanalikom Malpighiego powoduje znaczny wzrost szybkości wydzielania płynów, co potwierdza jego rolę jako hormonu moczopędnego u komarów Aedes. Gdy kanaliki są traktowane AedaeCAPA-1, obserwuje się zmniejszenie szybkości wydzielania w kanalikach Malpighiego stymulowanych DH31.Do pomiaru stężenia sodu w wydzielanych kropelkach użyto elektrod jonoselektywnych. Leczenie DH31 MT nie miało wpływu na stężenie sodu w wydzielanej kropli. Jednak po zastosowaniu AedaeCAPA-1 stężenie sodu w wydzielanym płynie uległo znacznemu zwiększeniu.Dodatkowo, w porównaniu z niestymulowanymi kontrolami, DH31 doprowadził do znacznie większego tempa transportu sodu, podczas gdy AedaeCAPA-1 zniósł ten wzrost kanalików stymulowanych DH31. SIET wykorzystano do oceny zmian w transporcie sodu wzdłuż nabłonka poduszki odbytnicy u dorosłych samic komarów. Analog leukokininy użyto do zbadania zmian we wchłanianiu sodu, co spowodowało czterokrotne zmniejszenie wchłaniania sodu w porównaniu z kontrolą soli fizjologicznej.Aby ocenić rolę neuropeptydu pyrokininy2 w motoryce jelita krętego, użyto analogu Rhodnius prolixus, który, jak wykazano wcześniej, aktywuje receptor PK2 A.aegypti wzbogacony w jelicie krętym komara. W stosunku do poziomów wyjściowych PK2 znacząco hamuje skurcze jelita krętego. Podczas wykonywania testu Ramsaya z kanalikami Malpighiego i pomiaru szybkości wydzielania jonów lub płynów, konieczne jest, aby kanaliki nie zostały uszkodzone podczas sekcji lub podczas przenoszenia do naczynia testowego.Po teście Ramsaya, specyficzne transportery błonowe mogą być celowane farmakologicznie lub molekularnie przy użyciu technik odwrotnej genetyki, aby określić ich specyficzny wkład w transepiteliczny transport substancji rozpuszczonych w nabłonku prostym.

studying-activity-neuropeptides-other-regulators-excretory-system

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym wywiadzie George Dimopoulos skupia się na mechanizmach fizjologicznych wykorzystywanych przez komary do zwalczania infekcji wywoływanych przez Plasmodium falciparum oraz wirusa dengi. Wyjaśniono, w jaki sposób identyfikuje się u komarów kluczowe geny refrakcyjne, czyli geny nadające odporność na patogeny wektora, oraz jak tę wiedzę można wykorzystać do stworzenia transgenicznych komarów, które nie są w stanie przenosić pasożyta malarii ani wirusa dengi.

Tworzenie lepszego komara: Identyfikacja genów umożliwiających odporność na malarię i gorączkę dengi u komarów A. gambiae i A. aegypti

Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące selekcji klonalnych linii komórkowych oraz testu bioluminescencji wapniowej w celu analizy relacji struktura-aktywność syntetycznych neuropeptydów stawonogów względem ich pokrewnych receptorów GPCR. Test ten może być wykorzystany do deorfanizacji receptorów oraz badań relacji struktura-aktywność na potrzeby projektowania analogów syntetycznych oraz odkrywania peptydów i potencjalnych leków.

Analiza funkcjonalna receptorów sprzężonych z białkiem G u komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) z wykorzystaniem testu bioluminescencji wapniowej

W niniejszym protokole łączymy wyciszanie genów za pomocą RNAi z testem diurezy in vivo, aby zbadać wpływ wyciszenia wybranych genów na wydalanie płynów przez komary.

Wyciszenie genów za pomocą RNAi oraz test diurezy in vivo u dorosłych samic komarów Aedes aegypti

Korzystając z dwóch metod do oszacowania ekspresji genów w głównych wyrostkach smakowych Aedes aegypti, zidentyfikowaliśmy zestaw genów przypuszczalnie leżących u podstaw reakcji neuronalnych na gorzkie i odpychające związki, zgodnie z badaniem elektrofizjologicznym.

Zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie RNA wyrostków smakowych komara Aedes aegypti wywołującego żółtą febrę

Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.

Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje krok po kroku protokół udanych i nisko stosowanych elektroantennogramów u kilku rodzajów komarów, w tym zarówno u samic, jak i u samców.

Przewodnik krok po kroku po elektroantennografii komarów

Dorosły gruczoł ślinowy komara (SG) jest niezbędny do przenoszenia wszystkich patogenów przenoszonych przez komary na ich ludzkich gospodarzy, w tym wirusów i pasożytów. Film ten pokazuje skuteczną izolację SG od stadium larwalnego (L4) komarów Anopheles gambiae i przygotowanie SG L4 do dalszej analizy.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju Anopheles gambiae

Opisano procedury badania zachowań komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach za pomocą elektropenetracji AC-DC.

Elektropenetrografia AC-DC do badania zachowań sondujących i połykanych komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach

Społeczności mikrobiologiczne u komarów są bardzo obiecujące dla strategii biokontroli wektorów. Większość symbiontów nie nadaje się do hodowli, co wymaga analiz metagenomicznych. Opisujemy metodę preparacji samic komarów i oddzielania jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych, zapobiegając zanieczyszczeniu krzyżowemu, ułatwiając badania mikrobiomu na poziomie narządów i zwiększając zrozumienie roli mikroorganizmów w biologii komarów.

Rozwarstwienie jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów w celu analizy mikrobiomu na poziomie narządów

Poznaj metody badania aktywności neuropeptydów w układzie wydalniczym komara Aedes za pomocą testu Ramsaya i techniki SIET. Protokół umożliwia pomiar sekrecji płynów i transportu jonów w cewkach Malpighiego oraz jelicie tylnym.

Badanie aktywności neuropeptydów i innych regulatorów układu wydalniczego u dorosłego komara

Przeglądaj więcej filmów