Name: Bezlaserowe śladowanie białek rodników hydroksylowych w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej białek wyższego rzędu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę bezlaserowego śladowania białek rodnikami hydroksylowymi do analizy strukturalnej białek wyższego rzędu. Technika z wykorzystaniem dozymetrii rodnikowej w czasie rzeczywistym poprawia powtarzalność oznaczeń i przyspiesza badania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 i R44GM125420).

1. Instalacja kapilary
<ol>
	<li>Za pomocą przecinaka do krzemionki utnij kapilarę kwarcową o średnicy wewnętrznej (ID) 250 µm na długość 27 cali. Sprawdź, czy końce kapilary są czyste i cięte prosto.</li>
	<li>Utwórz dwa okna o długości około 15 mm poprzez wypalenie powłoki polimidowej. Licząc od „dolnego końca”, wykonaj pierwsze okno do fotolizy w odległości 90 mm od „dolnego końca”, a drugie okno dozymetru w odległości 225 mm od „dolnego końca”. 
	UWAGA: Po wypaleniu powłoki kapilara staje się bardzo krucha.</li>
	<li>Odkręć nakrętkę i tulejkę w porcie 5, a następnie wprowadź „dolny koniec” kapilary tuż za stożkowy koniec tulejki (Rycina 1A).</li>
	<li>W module do fotolizy zdejmij nasadkę celi do fotolizy, wyciągając ją prosto, a następnie usuń magnetyczną maskę metalową, która będzie utrzymywać kapilarę na miejscu. 
	OSTROŻNIE: Wewnątrz nasadki celi do fotolizy znajduje się zakrzywione lustro; nie wolno dopuścić do dotknięcia lustra przez jakikolwiek przedmiot.</li>
	<li>W module dozymetru otwórz celę dozymetryczną, naciskając zakładkę po lewej stronie i odchylając celę do짐etryczną w prawo. Zdejmij magnetyczne klipsy, które będą utrzymywać kapilarę na miejscu.</li>
	<li>Umieść kapilarę w rowku w podstawie celi do fotolizy. Wycentruj okno kapilary względem okna celi do fotolizy. Przytrzymując kapilarę jedną ręką, załóż maskę magnetyczną, aby unieruchomić kapilarę. Załóż nasadkę celi do fotolizy z powrotem na miejsce.</li>
	<li>Umieść kapilarę w rowku w podstawie celi dozymetrycznej. Wycentruj drugie okno kapilary względem małego otworu w centrum podstawy celi dozymetrycznej. Przytrzymując kapilarę jedną ręką, zamocuj dwa klipsy magnetyczne, aby unieruchomić kapilarę. Zamknij celę dozymetryczną, aż usłyszysz kliknięcie.</li>
	<li>Wsuń kapilarę przez radełkowaną nakrętkę na górze uchwytu kapilary w kolektor produktu (Rycina 1B). Wysuń kapilarę do poziomu tuż nad dno fiolki. 
	UWAGA: Ważne jest, aby kapilara sięgała dna fiolki, co zapewni jej zanurzenie w roztworze gaszącym podczas przeprowadzania eksperymentu.</li>
</ol>
2. Instalacja pętli wtryskowej
<ol>
	<li>Należy użyć rurek teflonowych o średnicy zewnętrznej 1/16” i średnicy wewnętrznej 0.015” (381 µm). Aby obliczyć długość rurki potrzebną do uzyskania pożądanej objętości, należy zastosować równanie 1. 
	<img alt="Wzór hydrodynamiki \(L=\frac{V}{π(\frac{d}{2})^2}\); równanie dotyczące dynamiki przepływu." src="/files/ftp_upload/61861/61861equ01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
	Gdzie L to długość rurki w milimetrach, V to pożądana objętość w mikrolitrach, a d to średnica wewnętrzna rurki w milimetrach. Dla objętości wtrysku 25 µL i średnicy wewnętrznej 381 µm długość rurki powinna wynosić około 219,3 mm. 
	UWAGA: Dla objętości mniejszych niż 20 µL należy użyć rurek PTFE o średnicy wewnętrznej 0.01”.</li>
	<li>Uciąć rurkę teflonową na wymaganą długość za pomocą obcinaka do rurek. Sprawdzić, czy końce rurki są przycięte czysto i prosto.</li>
	<li>Wsunąć jeden koniec nowej pętli wtryskowej przez jedną z nakrętek i nałożyć nową tulejkę na koniec rurki. Przytrzymać tulejkę i nakrętkę w odpowiedniej pozycji, a następnie wsunąć rurkę do portu 3 zaworu wtryskowego, aż dotknie dna zaworu. Mocno przytrzymać rurkę i dokręcić nakrętkę palcami. Za pomocą klucza dokręcić nakrętkę o kolejne ¼ obrotu. Wyjąć i sprawdzić montaż. 
	UWAGA: Jeśli tulejka nie jest stabilnie zamocowana, należy ją ponownie zainstalować i dokręcić o kolejne 1/8 obrotu. Powtórzyć czynność z drugim końcem pętli.</li>
	<li>Gdy oba końce będą posiadały nakrętkę i zamocowaną tulejkę, należy luźno przykręcić jeden koniec do portu 3, a drugi do portu 6 (Rysunek 1C). Po ustawieniu w odpowiedniej pozycji dokręcić obie strony palcami, a następnie o kolejne ¼ obrotu za pomocą klucza.</li>
</ol>
3. Inicjalizacja systemu fotolizy
<ol>
	<li>Włącz moduły fotolizy w następującej kolejności: (1) Moduł hydrauliki (Fluidics Module), (2) Moduł fotolizy (Photolysis Module), (3) Moduł dosymetrii (Dosimetry Module), (4) Kolektor produktu (Product Collector), a na koniec (5) komputer systemowy i uruchom oprogramowanie sterujące. 
	UWAGA: Moduł dosymetrii wymaga co najmniej pół godziny na rozgrzanie po zimnym starcie.</li>
	<li>Całkowicie zanurz rurkę z pozycji „Valve” pompy strzykawkowej (Rysunek 1D) w 10 mL buforu. Rurkę z pozycji „Waste” (Rysunek 1D) oraz rurkę z portu 2 portu strzykawkowego (Rysunek 1C) umieść w pustym pojemniku na odpady. 
	UWAGA: Należy użyć buforu, w którym zawieszone będzie białko. Zalecanym buforem jest 10 mM NaPO4.</li>
	<li>Na karuzeli kolektora produktu umieść probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL w pozycjach oznaczonych jako H oraz 6.</li>
	<li>W przypadku zastosowania kapilary o średnicy wewnętrznej (ID) 250 µm, ustaw prędkość przepływu załadunku na 500 µL/min, prędkość przepływu przetwarzania na 7,5 µL/min oraz prędkość przepływu odpadów na 500 µL/min.</li>
	<li>Oblicz opóźnienie błysku (flash delay), czas produktu (product time) i czas odpadów (waste time) dla trybu półautomatycznego (Semi-Automatic Mode), korzystając z równania 2. 
	<img alt="Równanie prędkości przepływu cieczy; formuła: \( t = \frac{s \pi (d/2)^2}{f} \); schemat fizyczny." src="/files/ftp_upload/61861/61861equ02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> 
	Gdzie t to czas w minutach, s to odległość kapilary w milimetrach, d to średnica wewnętrzna kapilary w milimetrach, a f to prędkość przepływu w µL/min.
	<ol>
		<li>W przypadku opóźnienia błysku odległość mierzona jest od „dolnego końca” kapilary do pierwszego okna i powinna wynosić około 90 mm. Przy zastosowaniu kapilary o średnicy wewnętrznej 250 µm i prędkości przepływu przetwarzania 7,5 µL/min próbka dotrze do okna fotolizy w około 35 sekundach. Aby umożliwić wystąpienie dwóch błysków przy częstotliwości 1 Hz przed dotarciem próbek, ustaw opóźnienie błysku na 33 sekundy.</li>
		<li>W przypadku czasu produktu wprowadź czas, jaki zajmie przepływ wstrzykniętego roztworu z zaworu wstrzykiwania do końca kapilary. Dla kapilary o długości 27” i średnicy wewnętrznej 250 µm ustaw czas produktu na 4,5 minuty.</li>
		<li>W przypadku czasu odpadów wprowadź czas potrzebny na zebranie całkowitej objętości wstrzykniętego roztworu. W tym momencie kolektor produktu przesunie się z pozycji produktu do fiolki na odpady. Dla objętości wstrzyknięcia 25 µL i prędkości przepływu 7,5 µL/min ustaw czas odpadów na 7,8 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepłucz pętlę wstrzykiwania pięciokrotnie, wstrzykując 25 µL wody klasy HPLC do portu wstrzykiwania przy ustawionym zaworze wstrzykiwania w pozycji załadunku (load).</li>
	<li>Ręcznie przekręć zawór wstrzykiwania do pozycji „inject position”, aby przepłukać resztę systemu. Wybierz Process (Out) w oprogramowaniu sterującym, aby rozpocząć przepływ wody. Podczas przepływu podnieś kapilarę kolektora produktu, wybierając Up w sekcji kolektora produktu, tak aby widzieć koniec kapilary. Przepuszczaj wodę przez kapilarę, aż utworzy się kropla. 
	UWAGA: Jeśli kropla się nie utworzy, sprawdź zawór wstrzykiwacza pod kątem nieszczelności. W przypadku wycieku poluzuj nakrętkę, ponownie osadź kapilarę i dokręć.</li>
</ol>
4. Wyznaczenie rzeczywistej wydajności ▪OH w celu przetestowania efektów usuwania rodników przez bufor.
<ol>
	<li>W oprogramowaniu sterującym uruchom przepływ, wybierając Process (Out). W karcie ustawień ustaw napięcie błysku na 0 V. W karcie Manual Control, w sekcji danych dozymetrycznych, wybierz Start Data + AutoZero.</li>
	<li>Wybierz pozycję dla fiolki z produktem (H) i fiolki na odpady (6).</li>
	<li>Wybierz Ready, ręcznie przekręć zawór wtryskowy w dół do pozycji załadunku i wstrzyknij 25 µL 1 mM adeniny z 100 mM H2O2 do portu wtryskowego. Po wstrzyknięciu ręcznie przekręć zawór wtryskowy w górę do pozycji wtrysku. 
	UWAGA: Powoduje to automatyczne uruchomienie przepływu w systemie, włączenie źródła plazmy i rozpoczęcie pozyskiwania danych dozymetrycznych.</li>
	<li>Zwiększaj napięcie, przechodząc do karty ustawień i zmieniając napięcie błysku. Powtórz kroki 4.2 i 4.3, stosując napięcia 500 V, 750 V, 1000 V i 1250 V. Odczyt absorbancji adeniny przy każdym napięciu wykonaj w trzech powtórzeniach.</li>
	<li>Wybierz kartę obliczeń, aby wyznaczyć średnią absorbancję każdej próbki. Najpierw kliknij Select, a następnie ręcznie zaznacz początek i koniec piku absorbancji. W dostępnym polu wpisz opis próbki. Powtórz czynność dla wszystkich pozyskanych danych. 
	UWAGA: Mogą tworzyć się pęcherzyki powietrza, powodując skoki w odczytach dozymetru. Wybierając dane do wyznaczenia średniej absorbancji, pomiń obszary z pęcherzykami.</li>
	<li>Skopiuj i wklej dane do programu Excel, aby obliczyć średnią zmianę absorbancji adeniny dla każdego napięcia, określając w ten sposób efektywną wydajność ▪OH.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.6, jeśli stosowane są wiele warunków próbkowych (różne bufory/dodatki), aby znormalizować efektywną wydajność ▪OH dla każdego warunku.</li>
</ol>
5. Modyfikacja białka w celu wykrycia zmian w strukturze wysokiego rzędu.
<ol>
	<li>Wymieszać adeninę o stężeniu 4 mM z białkiem o stężeniu 20 µM w stosunku jeden do jednego, aby otrzymać roztwór zawierający 2 mM adeniny i 10 µM białka.</li>
	<li>Przygotować roztwór gaszący, stosując katalazę w stężeniu 0,3 mg/mL w celu rozkładu nadmiaru nadtlenku wodoru oraz amid metioniny w stężeniu 35 mM w celu zneutralizowania pozostałych rodników. Odmierzyć 25 µL roztworu gaszącego do mikroprowetki o pojemności 200 µL, tak aby zmieszać go z równą objętością produktu znakowanego.</li>
	<li>Rozcieńczyć H2O2 do stężenia 200 mM i przechowywać w lodzie.</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym (Control Software), w zakładce ustawień, rozpocząć pomiar napięcia błysku od 0 V, aby określić poziom utleniania tła.</li>
	<li>W zakładce sterowania ręcznego wybrać Start Data + AutoZero, następnie Process (Out), potem Ready, a na koniec przestawić zawór wtryskowy do pozycji załadunku (load).</li>
	<li>Umieścić roztwór gaszący w pozycji 1 na karuzeli zbierania produktów. W oprogramowaniu sterującym systemem (System Control Software) zmienić fiolkę produktu na 1.</li>
	<li>Bezpośrednio przed wtryskiem wymieszać 12,5 µL mieszaniny adeniny i białka z 12,5 µL H2O2, aby uzyskać stężenie końcowe 1 mM adeniny, 5 µM białka i 100 mM H2O2. Delikatnie wymieszać za pomocą pipety, krótko odwirować i wstrzyknąć 25 µL przez port wtryskowy w ciągu 10 sekund od wymieszania.</li>
	<li>Przestawić zawór wtryskowy do pozycji wtrysku (inject) i odczekać do czasu przetworzenia próbki.</li>
	<li>Powtórzyć akwizycję dla napięć 500 V, 750 V, 1000 V i 1250 V. Każdy pomiar napięcia wykonać w trzech powtórzeniach.</li>
	<li>Obliczyć średnią absorbancję zgodnie z opisem w kroku 4.5. Skopiować i wkleić wszystkie dane do programu Excel.</li>
</ol>
6. Wyłączenie systemu
<ol>
	<li>Po pobraniu wszystkich próbek, wypłucz port strzykawki i pętlę próbkową, ustawiając zawór wtryskowy w pozycji załadunku (load) i wstrzykując 25 µL wody do HPLC pięć razy.</li>
	<li>Przekręć zawór wtryskowy do pozycji wtrysku (inject), aby wypłukać resztę systemu wodą do HPLC.</li>
	<li>Zatrzymaj przepływ, zamknij oprogramowanie sterujące systemem i wyłącz moduły, zaczynając od kolektora produktów, modułu dozownika, modułu fotolizy, a na koniec modułu hydrauliki.</li>
</ol>
7. Przygotowanie próbek oraz chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas
<ol>
	<li>Zdenaturuj białko, inkubując próbki w temperaturze 80 °C przez 20 min w obecności 50 mM Tris i 1 mM CaCl2. Ochłodź próbki do temperatury pokojowej i dodaj trypsynę w stosunku 1:20 do białka. Traw białko przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem próbek. Następnego dnia przerwij trawienie trypsyną, podgrzewając próbki do 95 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Wykryj peptydy przy użyciu systemu LC-MS/MS o wysokiej rozdzielczości połączonego z systemem UPLC.</li>
	<li>Nałóż próbkę najpierw na kolumnę pułapkową (300 µm ID X 5 mm, wielkość porów 100 Å, wielkość cząstek 5 µm) i przemyj przy przepływie 5,0 µL/mL przez 3 min wodą zawierającą 2% rozpuszczalnika B (acetonitryl i 0,1% kwasu mrówkowego).</li>
	<li>Rozdziel peptydy na nanokolumnie C18 (0,75 mm x 150 mm, wielkość cząstek 2 µm, wielkość porów 100 Å) przy szybkości przepływu 300 nL/min z gradientem między rozpuszczalnikiem A (woda zawierająca 0,1% kwasu mrówkowego) a rozpuszczalnikiem B. Gradient elucji peptydów składa się z liniowego wzrostu od 2 do 35% B w ciągu 22 min, wzrostu do 95% B w ciągu 5 min i utrzymania tej wartości przez 3 min w celu przemycia kolumny, a następnie powrotu do 2% B w ciągu 3 min i utrzymania tej wartości przez 9 min w celu ponownej ekwilibracji kolumny.</li>
	<li>Zbierz dane w trybie jonów dodatnich. Ustaw napięcie rozpylania na 2400 V oraz temperaturę rurki transferowej jonów na 300 °C.</li>
	<li>Wykonaj pełne skanowanie MS w zakresie 250-2000 m/z, a następnie osiem kolejnych skanowań MS/MS zależnych od danych (data-dependent) dla ośmiu najliczniejszych jonów peptydowych. Do fragmentacji peptydów zastosuj dysocjację indukowaną zderzeniem przy 35% energii znormalizowanej.</li>
	<li>Zidentyfikuj wszystkie wykryte niemodyfikowane peptydy z analizy MS/MS, używając dostępnego oprogramowania do analizy białek w oparciu o odpowiedni plik FASTA zawierający sekwencję białka i stosowny enzym proteolityczny.</li>
	<li>Wyszukaj i skwantyfikuj zmodyfikowane peptydy za pomocą oprogramowania HRPF Data Processing Software. Stopień utlenienia każdego zidentyfikowanego peptydu oblicza się, dzieląc sumaryczną powierzchnię piku chromatograficznego zmodyfikowanego peptydu przez całkowitą powierzchnię piku chromatograficznego tego peptydu w formie zmodyfikowanej i niemodyfikowanej, korzystając z równania 3. 
	P = [I(pojedynczo utleniony) X 1 + I (podwójnie utleniony) X 2 + I(potrójnie utleniony) X 3 + .../[Iunoxidized + I(pojedynczo utleniony) + I(podwójnie utleniony) + I(potrójnie utleniony) ...] 
	gdzie P oznacza średnią liczbę zdarzeń utleniania na cząsteczkę peptydu, a I reprezentuje powierzchnię piku peptydu nieutlenionego (Iunoxidized) oraz peptydu z n zdarzeniami utleniania.</li>
</ol>
8. W celu przeprowadzenia badania różnicowego powtórz kroki 5-7 dla drugiego wariantu warunków.
UWAGA: Aby potwierdzić powtarzalność, zaleca się wykonanie dwóch powtórzeń biologicznych oprócz powtórzeń technicznych w trzech próbkach dla każdego warunku.

<ol><li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li>
<li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe%3A+a+regulatory+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Generics+and+Biosimilars+Initiative+Journal%22%5BJournal%5D)">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li>
<li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Society%22%5BJournal%5D)">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li>
<li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data%3A+starting+a+new+dialogue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li>
<li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding%3A+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li>
<li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li>
<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li>
<li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+%28FPOP%29+for+Higher+Order+Structure+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li>
<li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22American+Association+of+Pharmaceutical+Scientists+Journal%22%5BJournal%5D)">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li>
<li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li>
<li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li>
<li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+targeting+the+%CE%B2-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li>
<li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136(2018).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes%2C+Order+of+Binding%2C+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins%3A+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li>
<li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li>
<li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins%28FPOP%29%3A+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li>
<li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li>
<li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li>
<li>Linde. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Linde+Specialty+Gases+of+North+America%22">Linde Specialty Gases of North America</a>. , (2009).</li>
<li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li>
<li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+%28FPOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li>
<li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar%5BTitle%5D)+AND+%22American+Association+of+Pharmaceutical+Scientists+Journal%22%5BJournal%5D)">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87(2019).</li>
<li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498(2020).</li>
<li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li>
<li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li>
<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis%3A+Fundamentals+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355(2020).</li>
<li>Ultraviolet Absorption Spectrum of Hydrogen Peroxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum">http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum</a> (2016).</li>
<li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody%2FInterleukin-23+Interaction+with+Hydrogen%2FDeuterium+Exchange%2C+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry%2C+and+Alanine+Shave+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes%2C+Order+of+Binding%2C+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li>
<li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li>
<li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li>
<li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+paramyxovirus+fusion+%28F%29+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li>
<li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris%28hydroxymethyl%29aminomethane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li>
<li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li>
<li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li>
</ol>

E.E.C., J.S.S. i S.R.W. ujawniają znaczne udziały finansowe w GenNext Technologies, Inc., firmie na wczesnym etapie rozwoju, która dąży do komercjalizacji technologii analizy struktury białek wyższego rzędu. Udostępnione reprezentatywne dane zostały zweryfikowane przez S.K.M., który nie znajduje się w finansowym konflikcie interesów.

Istnieje kilka krytycznych kroków, aby zapewnić prawidłowe znakowanie białek podczas każdego eksperymentu HRPF. Po pierwsze, dobiera się odpowiednie natężenie przepływu i szybkość błysku źródła, aby upewnić się, że każdy bolus próbki jest napromieniany jeden raz. Gwarantuje to, że białko jest wystawione na działanie pojedynczego bolusa nowo powstałego ▪OH. Gdy białko zostanie utalone, struktura białka wyższego rzędu może zostać zmieniona. Aby mieć pewność, że natywna struktura białka jest badana, każda cząstec...

Konformacja białka i związana z nią struktura wyższego rzędu (HOS) są głównymi determinantami prawidłowej funkcji biologicznej i nieprawidłowego zachowania1. To samo dotyczy biofarmaceutyków, których struktura i aktywność funkcjonalna jest zależna od różnych aspektów ich produkcji i środowiska. Zmiany biofarmaceutyczne w HOS zostały powiązane z niepożądanymi reakcjami na leki (ADR) przypisywanymi niepożądanym farmakologiom i odpowiedzi immunologicznej pacjenta2,3. Pojawienie się ADR zwróciło uwagę przemysłu biofarmaceutycznego na kluczową rolę, jaką białko HOS odgrywa w bezpieczeństwie i skuteczności bioterapeutyków, a także ustaliło zapotrzebowanie na nową i ulepszoną analitykę HOS4.
Ślad białka rodnika hydroksylowego (HRPF) jest obiecującą techniką śledzenia zmian w białkowym HOS. HRPF polega na nieodwracalnym znakowaniu zewnętrznej powierzchni białka ▪OH, a następnie analizie spektrometrii mas (MS) w celu zidentyfikowania dostępnej dla rozpuszczalnika powierzchni białka5,6,7. HRPF został z powodzeniem wykorzystany do wykrywania defektów białka HOS i jego funkcji8,9, scharakteryzować HOS przeciwciał monoklonalnych (mAb)10,11,12,13, określ wiązanie Kd liganda14, i wiele więcej15,16,17,18,19. Powszechną metodą generowania ▪OH dla HRPF jest szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP), które wykorzystuje wysokoenergetyczne, szybkie lasery UV do wytwarzania ▪OH z fotolizyH2O2. W większości przypadków FPOP używa drogich laserów excimerowych wykorzystujących niebezpieczny gaz (KrF), który wymaga znacznych zabezpieczeń, aby uniknąć urazów dróg oddechowych i oczu20. Aby uniknąć zagrożeń związanych z wdychaniem, inni używali czterokrotnie zwiększonych laserów z granatu neodymowo-itrowo-aluminiowego (Nd:YAG) o poczwórnej częstotliwości21, które eliminują użycie toksycznych gazów, ale nadal są kosztowne, wymagają znacznej wiedzy operacyjnej i wymagają rozległej kontroli światła rozproszonego w celu ochrony użytkowników przed obrażeniami oczu.
Chociaż za pomocą HRPF można uzyskać wiele informacji, nie osiągnięto powszechnego zastosowania w biofarmacji. Dwie bariery dla ograniczonego przyjęcia HRPF to: 1) stosowanie niebezpiecznych i drogich laserów, które wymagają znacznych środków ostrożności20; oraz 2) nieodtwarzalność HRPF spowodowana wymiataniem ▪tła OH, które ogranicza badania porównawcze22. Aby zastąpić użycie lasera, opracowano szybkostrzelną, wysokoenergetyczną plazmową jednostkę do fotolizy, aby bezpiecznie wykonywać FPOP w łatwy sposób. Aby poprawić niepowtarzalność eksperymentów HRPF, zaimplementowano dozymetrię rodnikową w czasie rzeczywistym.
Praktyka HRPF została ograniczona przez nieodtwarzalność przypisaną oczyszczaniu ▪tła OH22. Chociaż ▪OH są doskonałymi sondami topografii białek, reagują również z wieloma składnikami znajdującymi się w preparatach, co sprawia, że konieczne jest zmierzenie efektywnego stężenia rodnika dostępnego do utlenienia białka docelowego. Różnice w przygotowaniu buforu, stężeniu nadtlenku wodoru, właściwościach ligandów lub fotolizie mogą powodować różnice w utlenianiu między grupami kontrolnymi i eksperymentalnymi, które powodują niejednoznaczność w badaniach różnicowych HOS. Dodanie dozymetrii rodnikowej w czasie rzeczywistym umożliwia dostosowanie efektu ▪obciążenia OH, a tym samym zwiększa pewność i powtarzalność podczas eksperymentu HRPF. Zastosowanie dozymetrii radykalnej w FPOP zostało opisane gdzie indziej23,24,25, a dokładniej omówiono je w niedawnej publikacji26. W tym miejscu opisujemy zastosowanie nowatorskiego systemu fotolizy błyskawicznej i dozymetrii w czasie rzeczywistym do znakowania apo-mioglobiny koni (aMb), porównując poziomy utleniania peptydów w eksperymencie FPOP z poziomami uzyskanymi przy użyciu lasera excimerowego.

<table><tbody><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>wystarczy dowolna marka</td></tr><tr><td>50 & mikro; L SGE Strzykawki gazoszczelne</td><td>Fisher Scientific</td><td>SG-00723</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 nanokolumna (0,75 mm X 150 mm, 2 &mikro; m)</td> <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), klasa LC/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>Apomyoglobina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne wycieraczki do zadań</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>wystarczy dowolny 30% nadtlenek wodoru</td></tr><tr><td>Amid metioniny</td><td>Chem-Impex</td><td>03109</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spektrometr masowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spektrometr</td> <td>masowymożna użyć innych instrumentów o wysokiej rozdzielczości (np. Q exactive Orbitrap lub Orbitrap Fusion)</td></tr><tr><td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro Cleave Stone, 1" x 1" x 1/32"</td><td>Molex</td><td>1068680064</td><td>dowolny obcinak do rurek kapilarnych jest wystarczający</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>Water, LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

bezlaserowe śladowanie białek rodników hydroksylowych w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej białek wyższego rzędu

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Ślad białka rodnika hydroksylowego (HRPF) to nowa i obiecująca technika analizy strukturalnej wyższego rzędu, która dostarcza informacji o zmianach w strukturze białka, interakcjach białko-białko lub oddziaływaniach białko-ligand. HRPF wykorzystuje rodniki hydroksylowe (▪OH) do nieodwracalnego znakowania powierzchni białka dostępnej dla rozpuszczalnika. Nieodłączna złożoność, koszty i niebezpieczny charakter wykonywania HRPF znacznie ograniczyły szerokie zastosowanie w biofarmacji. Czynniki te obejmują: 1) stosowanie skomplikowanych, niebezpiecznych i drogich laserów, które wymagają znacznych środków ostrożności; oraz 2) nieodtwarzalność HRPF spowodowana wymiataniem ▪OH w tle, co ogranicza badania porównawcze. Niniejsza publikacja zawiera protokół działania bezlaserowego systemu HRPF. Ten bezlaserowy system HRPF wykorzystuje technologię błyskawicznego utleniania plazmowego źródła światła o wysokiej energii i wysokim ciśnieniu z dozymetrią rodnikową in-line. Plazmowe źródło światła jest bezpieczniejsze, łatwiejsze w użyciu i bardziej wydajne w generowaniu rodników hydroksylowych niż laserowe systemy HRPF, a dozymetr rodnikowy in-line zwiększa odtwarzalność badań. W połączeniu z bezlaserowym systemem HRPF rozwiązuje i przezwycięża wspomniane niedociągnięcia i ograniczenia technik laserowych.

Źródło plazmy wysokociśnieniowej połączone z dosymetrią w czasie rzeczywistym pozwala na lepszą kontrolę wydajności ▪OH, co umożliwia dokładniejszą obserwację zmian w strukturze białek wyższego rzędu. Dodatek adeniny pozwala na stworzenie skutecznego dosymetru rodników działającego w czasie rzeczywistym. Po utlenieniu adenina traci absorbancję w UV przy 265 nm (Rysunek 2A). Zmiana absorbancji adeniny jest bezpośrednio powiązana z koncentracją rodników dostępnych dla HRPF, co zapew...

Ten protokół przedstawia metodę wykorzystania wbudowanej dozymetrii rodnikowej i plazmowego źródła światła do przeprowadzenia błyskawicznego śladu białkowego utleniania. Metoda ta zastępuje niebezpieczny laser UV w celu uproszczenia i poprawy odtwarzalności szybkich badań utleniania fotochemicznego białek.

Bezlaserowe śladowanie białek rodników hydroksylowych w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej białek wyższego rzędu

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Bezlaserowe śladowanie białek rodników hydroksylowych znacznie ułatwia identyfikację miejsc interakcji białek i regionów potwierdzających zmian, przyspieszając badania nad agregacją, strukturą i stabilnością białek. Dzięki wbudowanej dozymetrii rodnikowej użytkownicy mogą dostosować efektywne obciążenie rodnikami hydroksylowymi w czasie rzeczywistym, a dzięki dozymetrii rodnikowej w czasie rzeczywistym można zaoszczędzić czas eksperymentalny i cenną próbkę, jednocześnie poprawiając odtwarzalność etykietowania. Na początek rozetnij kapilę krzemionkową o średnicy wewnętrznej 250 mikrometrów na 27 cali za pomocą kamienia do rozszczepiania krzemionki, sprawdzając końce kapilary pod kątem czystego i prostego cięcia.Utwórz dwa okna o długości około 15 milimetrów. Od dolnego końca kapilary wypal powłokę poliimidową 90 milimetrów w górę, aby utworzyć okno fotolizy i 225 milimetrów w celu okienka dozymetru. Włóż dolny koniec kapilary tuż za stożkowy koniec nakrętki i skuwki.Dodaj kapilarnę do portu piątego, dokręcając kluczem tuż za pomocą palca. Zdejmij nasadkę ogniwa fotolizy modułu fotolizy, wyciągając ją prosto, a następnie zdejmij magnetycznie zamontowaną metalową maskę, która utrzyma kapilarnę na miejscu. Otwórz komórkę dozymetru, naciskając wypustkę po lewej stronie i otwórz komórkę dozymetru w prawo.Usuń magnetycznie zamontowane klipsy, które utrzymają kapilarę na miejscu. Następnie umieść kapilę w rowkowanym kanale u podstawy komórki fotolizy i wyśrodkuj okno kapilarne z okienkiem komórki fotolizy. Przytrzymaj kapilarnę na miejscu i dodaj maskę magnetyczną.Umieść nasadkę fotolizy z powrotem na swoim miejscu. Umieść kapilę w rowkowanym kanale u podstawy celi dozymetrycznej i wyśrodkuj drugie okienko kapilarne na małym otworze w środku celi dozymetru. Trzymając kapilarnę na miejscu jedną ręką, umieść dwa klipsy magnetyczne na miejscu, aby utrzymać kapilarnę na miejscu.Zamknij komórkę dozymetru, aż zamknie się z kliknięcia. Na koniec wprowadzić kapilar przez radełkowane pokrętło na szczycie podnośnika kapilarnego kolektora produktu, przedłużając kapilar tuż nad dnem fiolki. Przytnij żądaną długość rurki teflonowej za pomocą noża i sprawdź, czy końce są czyste, proste cięcie.Włóż jeden koniec nowej pętli wtryskowej przez jedną z nakrętek i umieść nową tuleję na końcu rurki. Przytrzymaj nakrętkę i tuleję na miejscu, wkładając rurkę do szóstego portu zaworu wtryskowego, aż osiągnie dno. Dokręć nakrętkę kluczem, a następnie upewnij się, że nakrętka i tuleja są dobrze zamocowane.Gdy oba końce mają nakrętkę i zamocowaną tuleję, luźno przykręć jeden koniec do portu trzeciego, a drugi koniec do portu szóstego. Po ustawieniu się na miejscu dokręć obie strony, aby mocno dotknąć palcami, a następnie ćwierć obrotu obok palca za pomocą klucza. Włącz bezlaserowy system HRPF, uruchamiając moduł fluidyki, a następnie moduł fotolizy, moduł dozymetru, kolektor produktu i komputer systemowy.Uruchom oprogramowanie systemowe. Całkowicie zanurz rurkę w 10 mililitrach buforu z pozycji zaworu na pompie strzykawkowej. Skieruj rurkę z pozycji odpływu, a rurkę z portu drugiego na porcie strzykawki do pustego pojemnika w celu zebrania odpadów.Umieść 1.5 mililitrowe probówki wirówkowe w miejscu oznaczonym HN6 na karuzeli kolektora produktu. Przepłukać pętlę wtryskową pięć razy, wstrzykując 25 mikrolitrów wody klasy HPLC z zaworem ustawionym w pozycji obciążenia. Ręcznie przekręć zawór wtryskowy, aby przepłukać resztę układu.Wybierz opcję Process (Proces) w oprogramowaniu sterującym, aby rozpocząć przepływ wody, aż utworzy się kropla. Przygotować roztwór zawierający dwie milimolowe adeniny i 10 mikromolowe białko. Następnie przygotuj roztwór hartowniczy, używając 0,3 miligrama na mililitr katalazy i 35-milimolowego amidu metianiny.Podaniec 25 mikrolitrów roztworu hartującego do mikroprobówki o pojemności 200 mikrolitrów. Rozcieńczyć nadtlenek wodoru do 200 milimolów, trzymając go na lodzie. Uruchom napięcie lampy błyskowej przy zerowym napięciu w oprogramowaniu sterującym.Ta kontrola zerowego napięcia określi wszelkie utlenienie tła na białku będącym przedmiotem zainteresowania. Wybierz pozycję Uruchom automatyczne zerowanie danych, a następnie pozycję Proces, a następnie pozycję Gotowe. Na koniec przekręć zawór wtryskowy w dół do pozycji obciążenia.Umieść roztwór hartujący w pierwszym miejscu na karuzeli kolektora produktu, a następnie zmień fiolkę z produktem na jedną w oprogramowaniu sterującym systemem. Bezpośrednio przed wstrzyknięciem należy zmieszać 12,5 mikrolitra mieszaniny adeniny i białka z 12,5 mikrolitrami nadtlenku wodoru. Pipetuj mieszaninę w górę i w dół, aby wymieszać, a następnie szybko ją odwiruj.Wstrzyknąć 25 mikrolitrów tego roztworu za pomocą portu iniekcyjnego w ciągu 10 sekund od wymieszania. Ustawić zawór wtryskowy w pozycji wtrysku i poczekać, aż próbka będzie przetwarzana. Zwiększ napięcie błysku do 750 V w oprogramowaniu sterującym i powtórz kroki etykietowania.Następnie należy zapisać absorbancję każdej próbki. Najpierw kliknij przycisk Wybierz, a następnie ręcznie wybierz początek i koniec absorpcji piku. W dostępnym miejscu wpisz opis próbki.Powtórz tę czynność dla wszystkich pozyskanych danych. Skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnią zmianę absorbancji adeniny dla każdego napięcia. Po pobraniu wszystkich próbek przepłukać port strzykawki i pętlę próbki, ustawiając zawór wtryskowy w pozycji obciążenia i pięciokrotnie wstrzyknąć 25 mikrolitrów wody HPLC.Przekręć zawór wtryskowy do pozycji wtrysku, aby przepłukać resztę układu wodą z HPLC. Po przepłukaniu zatrzymaj przepływ, wyjdź z oprogramowania sterującego systemem i wyłącz moduły, zaczynając od kolektora produktu, modułu dozymetru, modułu fotolizy, a na końcu modułu fluidyki. Po utlenieniu adenina stosowana do dozymetrii zmniejsza absorbancję UV przy 265 nanometrach.Bufor 2 zawiera wymiatacz rodników, który zmniejsza zmianę absorbancji adeniny w porównaniu z buforem 1. Apomioglobinę modyfikowano w obecności nadtlenku wodoru i adeniny przy czterech rosnących napięciach lampy plazmowej. Wykryto sześć peptydów, z liniowym wzrostem utleniania w odniesieniu do zmiany absorbancji adeniny przy 265 nanometrach.Te sześć utlenionych peptydów jest znakowanych na strukturze krystalicznej mioglobiny. Stopień utlenienia wykryty za pomocą wysokociśnieniowej lampy plazmowej jest znacznie wyższy niż w przypadku metody laserowej. Wzrost ten wynika z szerokiego spektrum emisji UV wysokociśnieniowej lampy plazmowej.Wytwarzając szerokie spektrum promieniowania UV, wysokociśnieniowa lampa plazmowa lepiej nakłada się na domenę absorpcji nadtlenku wodoru, co skutkuje bardziej wydajną produkcją rodników hydroksylowych poprzez fotolizę nadtlenku wodoru, w porównaniu z laserem ekscymerowym Kr F i laserem Nd YAG. Wysokociśnieniowa lampa plazmowa znacznie zwiększa produkcję rodników hydroksylowych w stopniu wykraczającym poza to, co zwykle obserwuje się przy użyciu lasera ekscymerowego Kr F. Użycie 100-milimolowego nadtlenku może spowodować wysoki poziom utlenienia tła.Jeśli układ białkowy jest podatny na utlenianie wywołane nadtlenkiem, zmniejsz stężenie do zaledwie 10 milimolów. Nieodwracalna etykieta HRPF pozwala na dalszą obsługę próbek, w tym długie trawienie proteazy, można dodać tandemowy znacznik masy do multipleksowania i przeprowadzić chromatografię 2D, wszystko to poprawia wykrywanie peptydów i koordynację informacji strukturalnych.

laser-free-hydroxyl-radical-protein-footprinting-to-perform-higher

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje sposób ilościowego oznaczania zależnego od Mg(II) tworzenia trzeciorzędowej struktury RNA za pomocą dwóch metod footprintingu z użyciem rodników hydroksylowych.

Monitorowanie zmian równowagi w strukturze RNA za pomocą „peroksydacyjnego” i „oksydacyjnego” mapowania śladów rodników hydroksylowych

Dokładny pomiar masy stanowi ważny krok podczas badania białek. Do takiego oznaczania można wykorzystać spektrometrię mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), a jej kluczową zaletą jest tolerancja na sole, detergenty i zanieczyszczenia. Poniżej przedstawiono przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek in vivo (IV-FPOP) to technika śladu białek rodników hydroksylowych, która pozwala na mapowanie struktury białek w ich naturalnym środowisku. Protokół ten opisuje montaż i konfigurację mikroprzepływowego systemu przepływu IV-FPOP.

Ślad białka rodnika hydroksylowego in vivo do badania interakcji białkowych w Caenorhabditis elegans

Tutaj charakteryzujemy strukturę białek i miejsca interakcji w żywych komórkach za pomocą techniki śladu białkowego, zwanej szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Charakterystyka białek komórkowych za pomocą szybkiego fotochemicznego utleniania białek w komórce

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek to nowa technika strukturalnej charakterystyki białek. Różne dodatki rozpuszczalnikowe i ligandy mają różne właściwości wymiatania rodników hydroksylowych. Aby porównać strukturę białka w różnych warunkach, wymagana jest kompensacja w czasie rzeczywistym rodników hydroksylowych powstających w reakcji w celu normalizacji warunków reakcji.

Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek

Opisano eksperymentalne procedury znakowania kowalencyjnego na bazie dietylopirowęglanów z detekcją spektrometryczną mas. Wodorowęglan dietylu jest po prostu mieszany z białkiem lub kompleksem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania, co prowadzi do modyfikacji reszt aminokwasowych dostępnych w rozpuszczalniku. Zmodyfikowane pozostałości można zidentyfikować po mineralizacji proteolitycznej i analizie metodą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas.

Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Nowa platforma statyczna służy do charakteryzowania struktury białek i miejsc interakcji w natywnym środowisku komórkowym, wykorzystując technikę śladu białkowego zwaną szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Inkubator platformowy z ruchomym stolikiem XY: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach

Poznaj metodę bezlaserowego śladowania białek rodnikami hydroksylowymi do analizy strukturalnej białek wyższego rzędu. Technika z wykorzystaniem dozymetrii rodnikowej w czasie rzeczywistym poprawia powtarzalność oznaczeń i przyspiesza badania.

Bezlaserowe śladowanie białek rodników hydroksylowych w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej białek wyższego rzędu

Przeglądaj więcej filmów