Name: Badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj spektroskopię neutronowego echa spinowego do badania dynamiki białek w roztworze. Ta metoda pozwala obserwować przestawianie się domen białkowych w skali czasowej piko- do nanosekund.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie wykorzystało zasoby Źródła Neutronów Spallation (BL-15, BL-6, laboratoria Biologii i Chemii), Biura DOE Zakładu Użytkowników Nauki zarządzanego przez Oak Ridge National Laboratory. W badaniach wykorzystano również zasoby reaktora MLZ-FRM2 w Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) oraz JCNS1 w Forschungszentrum Jülich GmbH w Niemczech. Autor dziękuje dr. Ralfowi Biehlowi i dr. Andreasowi Stadlerowi za pomoc w modelowaniu i wkład w badania nad białkami IgG i MBP, dr. Piotrowi A. Żołnierczukowi za wsparcie w redukcji danych NSE, dr Changwoo Do za wsparcie w pomiarach SANS oraz Rhondzie Moody i dr Kevinowi Weissowi za wsparcie laboratorium biochemicznego SNS.

Niniejsza praca charakteryzuje dwa białka: typowe ludzkie białko przeciwciała IgG oraz białko MBP, które jest wewnętrznie nieuporządkowane. Liofilizowana forma białek została pozyskana z dostawców komercyjnych (patrz Tabela materiałów).
1. Przygotowanie próbek białek
<ol>
	<li>Przygotować bufor 50 mM fosforanu sodu + 0,1 M NaCl, odważając i rozpuszczając odpowiednie odczynniki stałe w ciężkiej wodzie (D2O) (patrz Tabela materiałów). Jest to deuterowany rozpuszczalnik buforowy dla IgG.
	<ol>
		<li>Dostosować pH roztworu buforowego do wartości 6,6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor 20 mM fosforanu sodu + 6 M mocznika, odważając i rozpuszczając odpowiednie składniki stałe w ciężkiej wodzie (D2O). Jest to deuterowany rozpuszczalnik buforowy dla MBP.
	<ol>
		<li>Dostosować pH roztworu buforowego do wartości 4,7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltrować rozpuszczalniki buforowe za pomocą filtrów o rozmiarze porów 0,2 µm (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Odważyć i rozpuścić liofilizowane proszki oczyszczonego białka w deuterowanych rozpuszczalnikach dla odpowiednich białek (kroki 1.1.-1.2.) przy wysokim stężeniu białka (~50 mg/mL).</li>
	<li>Przenieść roztwór białka do koszyczków dializacyjnych z membranami dializacyjnymi o MWCO 3,5 K i dializować przeciwko przefiltrowanemu buforowi przez 24 h w temperaturze 10 °C dla MBP oraz 25 °C dla IgG (patrz Tabela materiałów), lekko wstrząsając probówkami w celu utworzenia gradientu dyfuzyjnego.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór białka za pomocą buforu do dializy do serii stężeń: 1, 2, 5, 10 i 50 mg/mL.</li>
	<li>Wyznaczyć dokładne stężenia przy użyciu spektrofotometru Nanodrop (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Wstępna charakterystyka próbek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
<ol>
	<li>Nanieś 80 µL każdego roztworu białka z serii stężeń przygotowanej powyżej (Krok 1.6.) do jednorazowej kuwety DLS (patrz Tabela materiałów) i wyznacz współczynniki dyfuzji, uśredniając wyniki z 10 pomiarów.</li>
	<li>Przedstaw współczynniki dyfuzji translacyjnej w funkcji stężenia białka i dokonaj ekstrapolacji do stężenia zero.</li>
	<li>Wprowadź każdy roztwór białka z serii stężeń do kapilar wirkozawiskozymetru (patrz Tabela materiałów) i zmierz lepkość dynamiczną.</li>
	<li>Przedstaw zmierzone wartości lepkości dynamicznej w funkcji stężenia białka i dokonaj ekstrapolacji do stężenia zero. 
	UWAGA: Ekstrapolacja dyfuzji DLS do stężenia zero pozwala uzyskać wartość dyfuzji translacyjnej dla pojedynczej cząsteczki białka. Ekstrapolacja lepkości dynamicznej do stężenia zero powinna dać wartość lepkości dynamicznej zmierzoną doświadczalnie dla roztworu buforu.</li>
</ol>
3. Pomiar rozpraszania pod małym kątem (neutronowego lub rentgenowskiego)
<ol>
	<li>Wykonaj pomiary małokątowego rozpraszania neutronów (SANS) i/lub małokątowego rozpraszania promieni rentgenowskich (SAXS) (patrz Tabela materiałów) dla czterech stężeń białka, najlepiej 2 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL i 50 mg/mL.</li>
	<li>Znormalizuj widma SANS i SAXS względem stężenia białka.</li>
	<li>Dopasuj czynnik kształtu białka P(Q) do widm SANS i SAXS, korzystając z oprogramowania Ensemble Optimization31 i/lub SasView32.</li>
	<li>Oblicz czynnik strukturalny S(Q, c), dzieląc sygnał SANS i SAXS przez P(Q) dla każdego stężenia. 
	UWAGA: Czytelnicy zainteresowani sposobami pomiaru i interpretacji danych rozpraszania małokątowego jako wsparcia dla pomiarów NSE są zachęcani do dokładnego zapoznania się z literaturą23,28,31,32,33.</li>
</ol>
4. Pomiar poziomu NSE
<ol>
	<li>Przygotuj eksperyment i zamontuj próbkę zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Wybierz grubość kuwety do ładowania próbki na podstawie stężenia roztworu białka, temperatury wymaganej do pomiaru oraz dostępnej ilości roztworu. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano przezroczyste kwarcowe pojemniki z górnym wlewem o wymiarach 40 mm x 30 mm x 4 mm.</li>
		<li>Wielokrotnie czyść kuwetę, naprzemiennie używając bezfosforowego detergentu do naczyń (patrz Tabela materiałów), wody dejonizowanej i 70% etanolu.</li>
		<li>Wysusz kuwetę w piecu konwekcyjnym; w przypadku kuwet kwarcowych nie przekraczaj temperatury 80 °C.</li>
		<li>Wprowadź 4 mL roztworu białka do kuwety i zamknij ją zakrętkami. Użyj folii woskowej lub innego uszczelniacza (patrz Tabela materiałów), aby uszczelnić kuwety z próbkami. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano 4,8 mL roztworu o stężeniu ~50 mg/mL, aby uzyskać wystarczającą intensywność rozpraszania.</li>
		<li>Wprowadź 4 mL buforu do dializy do pojemnika identycznego z tym, w którym znajduje się próbka białka, a następnie uszczelnij go.</li>
		<li>Przetransportuj próbki do linii wiązki, zamknij migawkę i wejdź do obszaru grodzi spektrometru34.</li>
		<li>Zamontuj kuwetę z próbką w aluminiowym uchwycie, dokręcając śruby i płyty mocujące (Rysunek 2, panel lewy). 
		UWAGA: Można zamontować dwie kuwety jednocześnie, pod warunkiem że dla wszystkich próbek wymagany jest ten sam protokół pomiarowy.</li>
		<li>Zamontuj próbkę grafitową i/lub próbkę proszku Al2O3 umieszczoną w pojemniku identycznym jak próbka białka. Są to wzorce dostarczane przez wsparcie techniczne linii wiązki SNS-NSE.</li>
		<li>Umieść uchwyt z próbką, ostrożnie wsuwając go do obudowy systemu wymuszania temperatury (TFS, patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: TFS jest najczęściej używanym środowiskiem próbek w SNS-NSE i pompuje suche powietrze do kanistra z próbką w celu osiągnięcia pożądanej temperatury (Rysunek 2, panele środkowy i prawy).</li>
		<li>Zamknij pokrywę TFS i ustaw temperaturę na pożądaną wartość za pomocą interaktywnego ekranu TFS.</li>
		<li>Zamontuj kamerę neutronową (patrz Tabela materiałów) w celu wyrównania próbek względem wiązki.</li>
		<li>Oczyść obudowę instrumentu, odessaj powietrze, zamknij drzwi i otwórz migawkę wiązki. 
		UWAGA: Kuwety z próbkami są dostarczane przez wsparcie techniczne linii wiązki SNS-NSE. Informacje o dostępnych kuwetach oraz bibliotece środowisk próbek można znaleźć na stronie internetowej linii wiązki SNS-NSE7,35.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz dane NSE zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Wyrównaj próbkę w wiązce neutronów, korzystając z kamery neutronowej oraz czterech niezależnych apertur dla próbek.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do zbierania danych SNS-NSE36 i zbierz statystyki próbki, wykonując skany dyfrakcyjne dla pożądanych kątów rozpraszania i długości fali.</li>
		<li>Ustaw parametry pomiaru na podstawie statystyk zebranych dla każdej próbki, edytując makra pomiarowe dostarczone przez asystującego naukowca odpowiedzialnego za instrument (Instrument Scientist).</li>
		<li>Rozpocznij skanowanie, wpisując nazwę protokołu w wierszu poleceń, i zarejestruj echa dla próbki.</li>
		<li>Rozpocznij skanowanie i zarejestruj echa również dla referencji sprężystej oraz buforowanego rozpuszczalnika. Przeprowadzaj przerywane operacje migawki wiązki podczas wymiany próbek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Układ kamery neutronowej z uchwytami próbek z Al i TFS, okno wiązki do eksperymentów rozproszeniowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: System pomiarowy NSE. Panel lewy: próbki roztworu białka w pojemniku kwarcowym zamocowane za pomocą śrub i płytek na aluminiowym (Al) uchwycie próbek. Aluminiowy uchwyt próbek umożliwia jednoczesne zamocowanie dwóch próbek wewnątrz środowiska pomiarowego. Panel środkowy: próbka w systemie wymuszania temperatury (TFS) może być zamontowana na stopie do próbek; okno wiązki neutronów znajduje się po prawej stronie, natomiast po lewej stronie widoczna jest kamera neutronowa używana do centrowania. Panel prawy: umieszczanie uchwytu z dwiema próbkami w komorze pomiarowej z oknami krzemowymi (Si). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
5. Redukcja danych NSE
UWAGA: SNS-NSE jest wyposażony w dedykowane oprogramowanie o nazwie DrSpine (redukcja danych dla echa spinowego)37,38, dostępne w ramach ORNL Neutron Sciences Remote Analysis Cluster, a także w szybki przewodnik użytkownika i wbudowany system pomocy.
<ol>
	<li>Zaloguj się do Neutron Sciences Remote Analysis Cluster (patrz Tabela materiałów) przy użyciu danych uwierzytelniających użytkownika ORNL i naciśnij przycisk Launch Session.</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie do redukcji danych zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>W katalogu użytkownika otwórz okno terminala i wpisz: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.</li>
		<li>Następnie wpisz: drspine_create_env.sh.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz w katalogu domowym folder na redukcję danych i skopiuj dostarczone skrypty oraz makra z katalogu współdzielonego.</li>
	<li>Odpowiednio edytuj, zmień nazwę i zapisz dostarczone makro redukcyjne.</li>
	<li>Wprowadź polecenie drspine w wierszu poleceń i naciśnij enter, aby uruchomić środowisko redukcyjne oprogramowania.</li>
	<li>Wprowadź „nazwę makra redukcyjnego” edytowanego w kroku 5.4. w wierszu poleceń wewnątrz środowiska oprogramowania i naciśnij Enter.</li>
</ol>
6. Dopasowanie danych NSE
<ol>
	<li>Edytuj skrypt Pythona „stapler-drspine.py”, dostarczony przez pomagającego naukowca odpowiedzialnego za instrument, wpisując nazwy zredukowanych danych plikowych. 
	UWAGA: Skrypt Pythona jest bezpłatnie dostępny dla użytkowników instrumentu.</li>
	<li>Edytuj funkcję dopasowania z dostarczonej biblioteki.</li>
	<li>Wpisz nazwę edytowanego skryptu „stapler-drspine.py” w wierszu poleceń i naciśnij Enter, aby odczytać, dopasować i wykreślić zredukowane dane NSE. 
	UWAGA: Naukowiec odpowiedzialny za instrument dostarczy szablon makra do redukcji oraz skrypt Pythona „stapler-drspine.py”, który umożliwia odczyt i dopasowanie zredukowanych danych NSE. Końcowe zredukowane dane NSE są zapisane w formacie ASCII i mogą być odczytywane przez różne preferowane programy.</li>
</ol>

<ol><li>Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFitter%2C+J+%22Neutron+Scattering+in+Biology%3A+Techniques+and+Applications%22">Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications</a>. , New York. (2006).</li>
<li>Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+spin-echo+and+TOF+reveals+protein+dynamics+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Physical+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).</li>
<li>Inoue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+domain+fluctuations+on+50-ns+timescale+enable+catalytic+activity+in+phosphoglycerate+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Large domain fluctuations on 50-ns timescale enable catalytic activity in phosphoglycerate kinase.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2309-2317 (2010).</li>
<li>Callaway, D. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+activation+of+nanoscale+dynamics+in+a+disordered+protein+alters+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Controllable activation of nanoscale dynamics in a disordered protein alters binding kinetics.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (7), 987-998 (2017).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Biehl, R., Changwoo, D., Richter, D., Stadler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+internal+friction+by+osmolyte+interaction+in+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Reduced internal friction by osmolyte interaction in intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (1), 292-296 (2020).</li>
<li>Monkenbusch, M., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+neutron+spectroscopy-a+tool+for+the+investigation+of+dynamics+of+polymers+and+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Physique%22%5BJournal%5D)">High resolution neutron spectroscopy-a tool for the investigation of dynamics of polymers and soft matter.</a> Comptes Rendus Physique. , (2007).</li>
<li>Richter, D., Monkenbusch, M., Schwahn, D. Neutron Scattering. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRichter%2C+D+%22Polymer+Science%3A+A+Comprehensive+Reference%2C+10+Volume+Set%22">Polymer Science: A Comprehensive Reference, 10 Volume Set</a>. , (2012).</li>
<li>Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+CC+%22Single+Crystal+Neutron+Diffraction+From+Molecular+Materials%22">Single Crystal Neutron Diffraction From Molecular Materials</a>. , World Scientific. Singapore. (2000).</li>
<li>Marshall, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarshall%2C+W+%22Theory+of+thermal+neutron+scattering%22">Theory of thermal neutron scattering</a>. , Oxford University Press. (1971).</li>
<li>Roger Pynn Introduction & Neutron Scattering &#34;Theory&#34. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf">https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf</a> (2004).</li>
<li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+scattering+in+polymer+physics%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+B%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Neutron scattering in polymer physics.</a> Physica B: Condensed Matter. 276-278, 22-29 (2000).</li>
<li>Harroun, T. A., Wignall, G. D., Katsaras, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+scattering+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neutron+Scattering+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutron scattering for biology.</a> Neutron Scattering in Biology. , (2006).</li>
<li>SNS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/sna">https://neutrons.ornl.gov/sna</a> (2020).</li>
<li>HFIR. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/hfir">https://neutrons.ornl.gov/hfir</a> (2020).</li>
<li>CNCS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/cncs">https://neutrons.ornl.gov/cncs</a> (2020).</li>
<li>Perticaroli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+hydration+water+in+protein+%28green+fluorescent+protein%29+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Description of hydration water in protein (green fluorescent protein) solution.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (3), 1098-1105 (2017).</li>
<li>Perticaroli, S., Nickels, J. D., Ehlers, G., Sokolov, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigidity%2C+secondary+structure%2C+and+the+universality+of+the+boson+peak+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rigidity, secondary structure, and the universality of the boson peak in proteins.</a> Biophysical Journal. 106 (12), 2667-2674 (2014).</li>
<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+flexibility+change+in+cytochrome+p450cam+substrate+binding+determined+by+neutron+scattering%2C+NMR%2C+and+molecular+dynamics+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coupled flexibility change in cytochrome p450cam substrate binding determined by neutron scattering, NMR, and molecular dynamics simulation.</a> Biophysical Journal. 103 (10), 2167-2176 (2012).</li>
<li>Mamontov, E., Zamponi, M., Hammons, S., Keener, W. S., Hagen, M., Herwig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BASIS%3A+A+new+backscattering+spectrometer+at+the+SNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neutron+News%22%5BJournal%5D)">BASIS: A new backscattering spectrometer at the SNS.</a> Neutron News. 19 (3), 22-24 (2008).</li>
<li>Mamontov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+diffusion+processes+measured+in+living+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microscopic diffusion processes measured in living planarians.</a> Scientific Reports. 9, 8708(2018).</li>
<li>Alpert, Y., Cser, L., Faragó, B., Franěk, F., Mezei, F., Ostanevich, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+flexibility+in+pig+immunoglobulin+G+studied+by+neutron+spin-echo+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Segmental flexibility in pig immunoglobulin G studied by neutron spin-echo technique.</a> Biopolymers. 24 (9), 1769-1784 (1985).</li>
<li>Bu, Z., Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D., Callaway, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+protein+domain+motion+in+Taq+polymerase+revealed+by+neutron+spin-echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (49), 17646-17651 (2005).</li>
<li>Biehl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+correlated+interdomain+motion+in+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Direct observation of correlated interdomain motion in alcohol dehydrogenase.</a> Physical Review Letters. 101, 138102(2008).</li>
<li>Farago, B., Li, J., Cornilescu, G., Callaway, D. J. E., Bu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+nanoscale+allosteric+protein+domain+motion+revealed+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activation of nanoscale allosteric protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 99 (10), 3473-3482 (2010).</li>
<li>Bu, Z., Callaway, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+propagation+of+long-range+allosteric+signals+by+nanoscale+protein+domain+motion+revealed+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamic propagation of long-range allosteric signals by nanoscale protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 100 (3), 223(2011).</li>
<li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+a+compact+state+of+a+multidomain+protein%2C+the+mercuric+ion+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of a compact state of a multidomain protein, the mercuric ion reductase.</a> Biophysical Journal. 107 (2), 393-400 (2014).</li>
<li>Longeville, S., Stingaciu, L. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+diffusion+and+the+dynamics+of+oxygen+capture+by+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin diffusion and the dynamics of oxygen capture by red blood cells.</a> Scientific Reports. 7, 10448(2017).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+antibody+fragment+motion%3A+Flexible+linkers+act+as+entropic+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring.</a> Scientific Reports. 6, 22148(2016).</li>
<li>Hahn, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+induction+due+to+free+larmor+precession%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Nuclear induction due to free larmor precession.</a> Physical Review. 77, 297(1950).</li>
<li>Hahn, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+echoes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Spin echoes.</a> Physical Review. 80, 580(1950).</li>
<li>Svergun, D. I., Koch, M. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+scattering+studies+of+biological+macromolecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution.</a> Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735-1782 (2003).</li>
<li>Sasview. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sasview.org">https://www.sasview.org</a> (2020).</li>
<li>Zhao, J. K., Gao, C. Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extended+Q-range+small-angle+neutron+scattering+diffractometer+at+the+SNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The extended Q-range small-angle neutron scattering diffractometer at the SNS.</a> Journal of Applied Crystallography. 43, 5 PART 1 1068-1077 (2010).</li>
<li>Ohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-resolution+neutron+spin-echo+spectrometer+for+the+SNS+with+%CF%84+%E2%89%A5+1+%C2%B5s%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+B%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">The high-resolution neutron spin-echo spectrometer for the SNS with τ ≥ 1 µs.</a> Physica B: Condensed Matter. 350, 147-150 (2004).</li>
<li>SNS-NSE web page. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/nse">https://neutrons.ornl.gov/nse</a> (2022).</li>
<li>Ohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spin-echo+spectrometer+at+the+Spallation+Neutron+Source+%28SNS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Instruments+and+Methods+in+Physics+Research%2C+Section+A%3A+Accelerators%2C+Spectrometers%2C+Detectors+and+Associated+Equipment%22%5BJournal%5D)">The spin-echo spectrometer at the Spallation Neutron Source (SNS).</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 696, 85-99 (2012).</li>
<li>Zolnierczuk, P. A., Holderer, O., Pasini, S., Kozielewski, T., Stingaciu, L. R., Monkenbusch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+data+extraction+from+neutron+time-of-flight+spin-echo+raw+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Efficient data extraction from neutron time-of-flight spin-echo raw data.</a> Journal of Applied Crystallography. 52 (5), 1022-1034 (2019).</li>
<li>Dr Spine hub. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine">https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine</a> (2022).</li>
<li>Stadler, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+nanosecond+dynamics+in+the+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), (2014).</li>
<li>FZJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs">https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs</a> (2022).</li>
<li>KWS2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://miz-garching.de/kws-2">https://miz-garching.de/kws-2</a> (2022).</li>
<li>Moorhouse, M., Barry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+databank%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+Biocomputing+and+Perl%22%5BJournal%5D)">The protein databank.</a> Bioinformatics Biocomputing and Perl. , (2005).</li>
<li>Tria, G., Mertens, H. D. T., Kachala, M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+ensemble+modelling+of+flexible+macromolecules+using+X-ray+solution+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering.</a> IUCrJ. 2 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Holderer, O., Monkenbusch, M., Schätzler, R., Kleines, H., Westerhausen, W., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JCNS+neutron+spin-echo+spectrometer+J-NSE+at+the+FRM+II%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II.</a> Measurement Science and Technology. 90 (4), 043107(2008).</li>
<li>Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+internal+protein+dynamics+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Exploring internal protein dynamics by neutron spin echo spectroscopy.</a> Soft Matter. 7 (4), 1299-1307 (2011).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+antibody+fragment+motion%3A+Flexible+linkers+act+as+entropic+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring.</a> Scientific Reports. 6, 22148(2016).</li>
<li>Stadler, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+nanosecond+dynamics+in+the+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6987-6994 (2014).</li>
<li>Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+internal+protein+dynamics+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Slow internal protein dynamics in solution.</a> Journal of Physics: Condensed Matter. 26 (50), 503103(2014).</li>
<li>Hinsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+modeling+toolkit%3A+A+new+approach+to+molecular+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular modeling toolkit: A new approach to molecular simulations.</a> Journal of Computational Chemistry. 21 (2), 79-85 (2000).</li>
<li>Uhlenbeck, G. E., Ornstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+theory+of+the+Brownian+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">On the theory of the Brownian motion.</a> Physical Review. 36 (5), 823(1930).</li>
<li>Wang, M. C., Uhlenbeck, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+theory+of+the+Brownian+motion+II%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">On the theory of the Brownian motion II.</a> Reviews of Modern Physics. 17, 323(1945).</li>
<li>Callaway, D. J. E., Bu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+domain+motion+and+long-range+allostery+in+signaling+proteins-a+view+from+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein domain motion and long-range allostery in signaling proteins-a view from neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Reviews. 7 (2), 165-174 (2015).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+scattering+function+for+macromolecules+in+solution+probed+by+neutron+spin+echo%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Intermediate scattering function for macromolecules in solution probed by neutron spin echo.</a> Physical Review E. 95, 020501(2017).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-time+dynamics+of+proteins+in+solutions+studied+by+neutron+spin+echo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Short-time dynamics of proteins in solutions studied by neutron spin echo.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 42, 147-156 (2019).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów finansowych i konfliktu interesów. Treść manuskryptu oparta jest na wykładzie wygłoszonym przez autora w ramach HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School w latach 2019-2021.

Spektroskopia NSE zapewnia unikalny i szczegółowy obraz dynamiki białek, którego inne techniki spektroskopowe nie są w stanie uzyskać. Pomiary w rozszerzonej skali czasowej dostarczają obserwacji zarówno translacyjnej, jak i rotacyjnej dyfuzji białek, jak to przedstawiono tutaj. Dynamika segmentowa i inne oscylacje wewnętrzne ujawniają się jako silny rozpad funkcji rozpraszania koherentnego S(Q, t) w krótkiej skali czasowej i są dobrze oddzielone od ogólnych procesów relaksacji dyfuzyjnej. Głównymi ograniczeniam...

Badanie dynamiki materii miękkiej za pomocą neutronów 
Badanie właściwości dynamicznych białek i peptydów stanowi istotną część badań biofizycznych, a obecnie istnieje wiele dobrze opracowanych metod pozwalających na dostęp do szerokiego zakresu krajobrazów energetycznych1. Powiązanie ujawnionej eksperymentalnie dynamiki białek z ich funkcją biologiczną jest znacznie trudniejszym zadaniem, wymagającym złożonych modeli matematycznych i komputerowych symulacji dynamiki. Znaczenie spektroskopii neutronowej w analizie ruchów białek zostało podkreślone w kilku uznanych i powszechnie cytowanych badaniach1,2,3,4,5. Przed zgłębieniem zróżnicowanego krajobrazu energetycznego wewnętrznej dynamiki białek niezbędny jest krótki przegląd procesów dynamicznych w materii miękkiej oraz sposobów, w jakie neutrony mogą być wykorzystane do ich analizy.
Wrażliwość neutronów na konfigurację izotopową oraz rodzaj oddziaływań, jakie wykazują z materią miękką, sprawia, że rozpraszanie neutronów jest jedną z najbardziej wszechstronnych technik badawczych6. Neutrony mogą uzyskiwać dostęp do szerokiego spektrum skal długości korelacji i czasów korelacji, od wzbudzeń jądrowych i drgań atomowych po ruchy kolektywne i wolne procesy relaksacyjne, takie jak rotacje izotropowe i ruchy dyfuzyjne. Podczas badania transferu energii rozproszonych neutronów można wyróżnić trzy główne oddziaływania: rozpraszanie sprężyste, w którym nie dochodzi do wymiany energii między neutronem padającym a cząstką w próbce; rozpraszanie niesprężyste, charakteryzujące się znaczną, mierzalną wymianą energii między neutronem a cząstką; oraz szczególny przypadek rozpraszania quasi-sprężystego, które oznacza bardzo mały transfer energii w porównaniu z energią neutronu padającego1,7. Oddziaływania te dostarczają precyzyjnych informacji o badanym materiale i stanowią podstawę teoretyczną dla szerokiej gamy technik rozpraszania neutronów.
W rozpraszaniu sprężystym detektor rejestruje kierunki neutronów w postaci wzoru dyfrakcyjnego, który pokazuje położenie atomów próbki względem siebie. Uzyskiwane są informacje o korelacjach położeń atomowych (tj. zintegrowana intensywność S(Q) w odniesieniu do przeniesienia pędu Q, która dotyczy wyłącznie informacji strukturalnych). Zasada ta stanowi podstawę dyfrakcji neutronów8.
Złożoność pojawia się, gdy transfer energii przestaje wynosić zero ze względu na wzbudzenia i fluktuacje wewnętrzne w materiale próbki. Stanowi to podstawę spektroskopii neutronowej, w której rozproszone neutrony są badane w funkcji zarówno transferu energii E , jak i transferu pędu Q. W ten sposób uzyskuje się informacje dynamiczne i strukturalne. Spektroskopia neutronowa mierzy tę samą całkowitą intensywność S(Q) dla transferu energii (tj. zmiany prędkości neutronów wynikającej z rozpraszania na próbce, S(Q,ω) = S(Q, E), co określa się również mianem dynamicznego czynnika strukturalnego)9.
Do obliczeń rozpraszania w materiale bardziej odpowiednie jest zastosowanie funkcji korelacji par7,10. W przypadku dyfrakcji statyczna funkcja korelacji par G(r) określa prawdopodobieństwo znalezienia środka cząstki w określonej odległości r od środka innej cząstki. Spektroskopia uogólnia statyczną funkcję korelacji par i wprowadza do równania rozpraszania energię/częstotliwość/czas. Funkcja korelacji par G(r) staje się funkcją czasu G(r, t), którą można rozłożyć na odrębną funkcję korelacji par atomowych GD(r, t) oraz funkcję autokorelacji GS(r, t). Opisują one dwa rodzaje korelacji: ruchy atomów skorelowane parami, które warunkują rozpraszanie spójne, oraz autokorelację, która warunkuje rozpraszanie niespójne10.
Rozpraszanie koherentne jest rozpraszaniem od „średniej” i zależy od względnej fazy rozproszonych fal. W reżimie rozpraszania pod małym kątem rozproszone fale neutronowe z różnych centrów rozpraszania (różnych atomów) interferują konstruktywnie (mają podobne fazy), a zbiorowy ruch atomów jest obserwowany z silnym wzmocnieniem intensywności. Rozpraszanie koherentne w zasadzie opisuje rozpraszanie pojedynczego neutronu na wszystkich jądrach w próbce10.
Gdy między rozproszonymi falami neutronowymi z różnych ośrodków nie zachodzi interferencja konstruktywna, śledzi się w czasie pojedynczy atom i obserwuje autokorelację między pozycją atomu w czasie t = 0 a tym samym atomem w czasie t. W związku z tym informacje o względnych pozycjach atomów zostają utracone, a uwaga skupia się wyłącznie na fluktuacjach lokalnych. Rozpraszanie wynikające z fluktuacji lokalnych determinuje rozpraszanie niekoherentne. Rozpraszanie niekoherentne jest izotropowe, przyczynia się do sygnału tła i pogarsza stosunek sygnału do szumu10,11.
Łącząc wszystkie powyższe informacje, wyróżniamy cztery główne procesy rozpraszania neutronów10: (1) sprężyste koherentne (mierzy korelacje pozycji atomowych), (2) niesprężyste koherentne (mierzy kolektywne ruchy atomów), (3) sprężyste niespójne (przyczynia się do tła, redukuje intensywność rozpraszania poprzez czynnik Debye’a-Wallera (DWF) i mierzy sprężysty niespójny czynnik strukturalny (EISF), opisujący geometrię ruchów dyfuzyjnych w ograniczonej geometrii) oraz (4) niesprężyste niespójne (mierzy dynamikę pojedynczych atomów i autokorelację).
Procesy dynamiczne w biologii, do których dostęp mają neutrony, obejmują szeroki zakres: od tłumienia niskoczęstotliwościowych wibracji atomowych i molekularnych, oddziaływań cząsteczek rozpuszczalnika z biopowierzchniami oraz procesów dyfuzyjnych w warstwie hydratacyjnej makrocząsteczek i w ograniczonej geometrii, po krótkozasięgowe ruchy dyfuzyjne translacyjne, rotacyjne i tumbled (kołyszące), a także ruchy domen białkowych i ruchy allosteryczne1. Szeroka różnorodność metod neutronowych i instrumentów służących do pomiaru dynamiki białek opiera się na sposobie achromatyzacji wiązki neutronów padających lub wychodzących oraz na sposobie analizy energii neutronów rozproszonych. Dzięki zastosowaniu spektrometrów trójosiowych, metod czasu przelotu (time-of-flight), rozpraszania wstecznego oraz spin-echo, można badać procesy dynamiczne o charakterystycznych czasach od 1 x 10-14 s do 1 x 10-6 s (od femtosekund do mikrosekund)12.
Oak Ridge National Laboratory, dysponujące dwoma renomowanymi źródłami neutronów: Spallation Neutron Source (SNS)13 oraz High Isotope Flux Reactor (HFIR)14, posiada jeden z najlepszych zestawów spektrometrów do badania dynamiki biomateriałów. Niektóre z najbardziej wymownych przykładów obejmują wykorzystanie spektrometru z siekaczem neutronów zimnych (CNCS) w SNS15 do badania dynamicznych zaburzeń wody hydratacyjnej wokół zielonego białka fluorescencyjnego w roztworze16 lub subpikosekundowych wibracji kolektywnych kilku białek17. Powracającym problemem w badaniach nieelastycznego rozpraszania neutronów jest fakt, że niektóre procesy biologiczne zachodzą zbyt wolno, aby można je było zaobserwować. Bez zastosowania ekstremalnych konfiguracji, które prowadzą do ogromnej utraty natężenia strumienia neutronów, spektrometry czasu przelotu są ograniczone do rozdzielczości energetycznej 10 µeV, co odpowiada maksymalnej skali czasowej ~200 ps10,11. Jest to niewystarczające do obserwacji ruchów w dużej skali w białkach. Dlatego często potrzebne są instrumenty o wyższej rozdzielczości energetycznej, takie jak spektrometry wstecznego rozpraszania. Połączenie technik czasu przelotu i wstecznego rozpraszania okazało się skuteczne w badaniu zmian dynamiki wewnętrznej cytochromu P450cam (CYP101), enzymu katalizującego hydroksylację kamfory18.
Dyfuzyjność mikroskopowa zmierzona za pomocą spektrometru wstecznego rozpraszania w SNS-BASIS19 była zaskakująco dobrze określona i mogła zostać podzielona na dyfuzyjność wody (wody hydratacyjnej, cytoplazmatycznej i wolnej) oraz dyfuzyjność składników komórkowych u płazińców planariów, które były pierwszymi żywymi zwierzętami badanymi metodą rozpraszania neutronów20. Rozpraszanie wsteczne jest wysokorozdzielczą techniką spektroskopową, jednak jest ograniczone do zakresu kilku µeV = kilku nanosekund, podczas gdy powolna dynamika w biomateriałach przejawia się również jako czas przeżycia korelacji między pozycjami atomów lub orientacjami spinów (np. procesy relaksacyjne, które zazwyczaj zachodzą w zakresie czasu od dziesięciu do setek nanosekund).
Spektroskopia neutronowego echa spinowego (NSE) jest jedyną techniką rozpraszania neutronów pozwalającą na osiągnięcie tak wysokiej rozdzielczości. W przeciwieństwie do innych technik neutronowych, NSE nie wymaga achromatyzacji wiązki, ponieważ wykorzystuje kwantowo-mechaniczną fazę neutronów, którą stanowią ich momenty magnetyczne. Manipulowanie momentami magnetycznymi umożliwia zastosowanie szerokiego rozkładu długości fal wiązki neutronów, podczas gdy technika ta wykazuje czułość na bardzo niewielkie zmiany prędkości neutronów rzędu 1 x 10-4. NSE została z sukcesem wykorzystana do badania powolnej dynamiki wielu białek w roztworach. Wśród tych wielu pionierskich badań należy wymienić badanie elastyczności segmentowej immunoglobuliny świni21; sprzężonych ruchów domen w polimerazie Taq22; ruchów domen w tetramerze dehydrogenazy alkoholowej drożdży23; zmiany konformacji kinazy fosfoglicerynianowej po związaniu substratu3; aktywacji ruchów domen oraz dynamicznej propagacji sygnałów allosterycznych w białku regulatorowego kofaktora 1 wymiany Na+/H+ (NHERF1)4,24,25; dynamiki stanu zwartego reduktazy jonów rtęci26; oraz dyfuzji hemoglobiny w erytrocytach27. Dwa nowsze badania nad dynamiką białek wykazały elastyczność ludzkiego przeciwciała Immunoglobuliny G (IgG) jako sprężyny entropowej28 oraz charakterystykę wkładu rozpuszczalnika w dynamikę wewnętrznie nieuporządkowanego podstawowego białka mieliny (MBP)5.
Niniejszy artykuł wyjaśnia podstawowe zasady NSE, przedstawia kilka zalecanych metod przygotowawczych do szczegółowego badania dynamiki białek, a także opisuje metodologię i protokół eksperymentalny pozyskiwania danych NSE przy użyciu spektrometru NSE w SNS, SNS-NSE. Protokół charakteryzuje dwa białka: IgG, typowe ludzkie białko przeciwciał, oraz białko wewnętrznie nieuporządkowane MBP. Krótko omówiono implikacje biofizyczne, znaczenie badawcze przykładów oraz ograniczenia tej techniki.
Spektroskopia NSE, metoda pomiarów dynamiki wolnej 
NSE jest techniką polaryzacyjną wykorzystującą czas przelotu neutronów do pomiaru wymiany energii (utraty polaryzacji) wynikającej z oddziaływań kwazielastycznych między neutronami a atomami w próbce. U podstaw spektroskopii NSE leżą dwie podstawowe zasady: (1) zdolność spinu neutronu do precesji w polu magnetycznym z częstotliwością proporcjonalną do natężenia pola magnetycznego <img alt="Wektor pola magnetycznego, \(\vec{B}\), równanie; schemat; fizyka, analiza pola wektorowego." src="/files/ftp_upload/61862/61862eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">, a mianowicie częstotliwość Larmora29, oraz (b) echo spinowe lub echo Hanna, reprezentujące manipulację i refokusowanie sygnału polaryzacji podczas stosowania serii impulsów częstotliwości radiowej30.
Podstawy procesu NSE można podsumować w kilku prostych krokach6,11, korzystając z Rysunku 1. (1) Wiązka neutronów wytworzona przez źródło (pozycja 1) jest polaryzowana (pozycja 2), prowadzona i transportowana (pozycja 3), a następnie dociera do wejścia spektrometru NSE, gdzie zostaje obrócona o 90° przez pierwszy flipper pi-połowa (pozycja 4). (2) Spolaryzowana wiązka (np. magnetyczne momenty neutronów) staje się prostopadła do linii pola magnetycznego pierwszego magnesu (pierwsza strefa precesji, pozycja 5) i zaczyna precesować. (3) Na końcu magnesu spiny neutronów akumulują określony kąt precesji proporcjonalny do natężenia pola magnetycznego i czasu przelotu spędzonego wewnątrz (zasadniczo odwrotnie proporcjonalny do prędkości neutronów). Poszczególne prędkości neutronów są zakodowane w ich kącie precesji na końcu pierwszej strefy precesji. (4) Blisko pozycji próbki, flipper pi (pozycja 6) odwraca orientację spinu o 180°, zmieniając znak kąta precesji. (5) Neutrony oddziałują z cząsteczkami próbki (pozycja 7) i ulegają rozproszeniu. (6) Rozproszone neutrony wchodzą do drugiej strefy precesji (pozycja 8) i w niej precesują, ale mają odwróconą orientację. (7) Kolejny flipper pi-połowa (pozycja 9) służy do obrócenia orientacji spinu z prostopadłej na poziomą. Powstrzyma to precesję, przekształcając kąt precesji φ w polaryzację proporcjonalną do cos(φ). (8) Analizator (pozycja 10) wybiera neutrony na podstawie jednej orientacji. Jeśli oddziaływanie z próbką jest sprężyste, prędkość neutronu nie ulegnie zmianie. Neutrony spędzą identyczną ilość czasu przelatując przez pierwszą i drugą strefę precesji, a zakumulowane kąty precesji zostaną w pełni odzyskane. Pełna polaryzacja zostaje przywrócona na detektorze (pozycja 11) jako echo pierwotnej polaryzacji (tj. echo spinowe). (9) Jednak w NSE rozproszenie jest quasi-sprężyste, zatem niewielka wymiana energii między neutronami a cząsteczkami próbki prowadzi do różnych prędkości neutronów po rozproszeniu przez próbkę. Ze względu na różne prędkości, neutrony spędzą dodatkowy czas przelatując przez drugą strefę precesji i nie odzyskają prawidłowo swojego kąta precesji. Na detektorze odzyskiwana jest polaryzacja częściowa, a utrata polaryzacji wynikająca z relaksacji spinowej jest proporcjonalna do cosinusowej transformaty Fouriera funkcji spektralnej S(Q, ω), czyli pośredniej funkcji rozproszenia F(Q, t). (10) Parametr czasu funkcji F(Q, t) jest proporcjonalny do natężenia magnetycznego pola precesji. Skanowanie utraty polaryzacji jako funkcji natężenia pola magnetycznego daje zatem funkcję relaksacji, która zależy od procesów dynamicznych zachodzących w próbce.
<img alt="Schemat akceleratora cząstek, pokazujący układ synchrotronu dla eksperymentów fizyki wysokich energii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Fotografia spektrometru NSE w SNS (SNS-NSE) oraz schemat drogi przelotu neutronów z najważniejszymi komponentami funkcjonalnymi. Od prawej do lewej: 1 = źródło neutronów; 2 = system choppers-bender-polarizer-secondary shutter; 3 = prowadnice transportu wiązki; 4 = flipper pi/2 dla pierwszego obrotu spinu o 90°; 5 = pierwsza strefa precesji; 6 = flipper pi dla obrotu spinu o 180°; 7 = obszar próbki i otoczenie próbki (tutaj pokazano piec kriogeniczny); 8 = druga strefa precesji; 9 = flipper pi/2 dla drugiego obrotu spinu o 90°; 10 = analizator; 11 = detektor. (Należy zauważyć, że części elementu 3, a także 2 i 1, znajdują się za niebieską ścianą wewnątrz osłony; w przypadku NSE opartych na reaktorze choppery są zastąpione selektorem prędkości). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Bydlęcy roztwór białkowy MBP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1891</td><td>liofilizowany proszek odtworzony w&nbsp; D2O</td></tr><tr><td>D2O - ciężka woda</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Produkt nr 151882</td><td>płynna</td></tr><tr><td>woda dionizowana</td><td>w domu</td> <td>-</td> <td>do mycia / czyszczenia komórek</td></tr><tr><td>DLS instrument</td><td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&uuml; </td><td></td><td>Dynamiczny przyrząd do rozpraszania światła</td></tr><tr><td>Elastyczne wzorce rozpraszania</td><td>SNS-NSE, ORNL-Al</td><td></td><td>2O3&nbsp; oraz Proszki grafitowe</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>65350-M</td><td>70% etanol do czyszczenia komórek</td></tr><tr><td>Roztwór białka IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4506</td><td>liofilizowany proszek rozpuszczony w&nbsp; D2O</td></tr><tr><td>KWS-2 stacja przyrządów</td><td>JCNS w MLZ,&nbsp; Garching, Niemcy</td> <td>-</td> <td>instrument neutronowy o małym kącie</td></tr><tr><td>Płyn do mycia naczyń Liquinox</td> <td>Alconox-bezfosforanowy płynny środek do czyszczenia szkła laboratoryjnego</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr produktuS9390</td><td>sól siedmiowodna fosforanu disodowego</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr produktu S9888</td><td>sól chlorku sodu</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr produktu S9638</td><td>sól monohydratu fosforanu sodu</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Nanodrop Thermo</td><td>Scientific Numer katalogowy:&nbsp; Spektrofotometr ND-2000</td><td>NanoDrop 2000/2000c Kamera</td></tr><tr><td>do wyrównywania neutronów</td><td>NeutronOptics, Grenoble</td><td>NOG210222</td><td>Kamera 100 x 100 mm z czujnikiem CMOS Sony IMX249</td></tr><tr><td>Parafilm M - wosk parafilm</td><td>Bemis</td><td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td><td>uniwersalna folia laboratoryjna w dozowniku kartonowym</td></tr><tr><td>Phoenix-J-NSE Spektrometr</td><td>JCNS outstation w MLZ,&nbsp; Garching,</td> <td>Niemcy-spektrometr neutronowy</td><td></td></tr> <tr><td>SasView</td><td>https://www.sasview.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SAXSpace, instrument Anton Paar</td><td>FZ-J&uuml; </td><td></td><td>Przyrząd rentgenowski LICH o małym kącie</td></tr><tr><td>Membrany dializacyjne Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>88400-88405</td><td>Slide-A-Lyzer mini urządzenia do dializy probówki 3,5 K MWCO</td></tr><tr><td>SNS Zdalna analiza klastra</td><td>Neutron Science (sns.gov)</td><td>https://analysis.sns.gov</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr SNS-NSE</td><td>ORNL, Oak Ridge, TN,</td> USA-spektrometr <td></td><td></td></tr><tr><td>neutronowySterylne filtry strzykawkowe</td><td>VWR</td><td>N.A. PN:28145-501</td><td>0,2 &micro; m filtry wielkości porów</td></tr><tr><td>System wymuszania temperatury (TFS)</td><td>SP Numer części naukowej</td><td>100004055</td><td>sprzęt do środowiska próbki</td></tr><tr><td>Mocznik -d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr produktu 176087</td><td>deuterowana lepkościomierz soli mocznikowej</td></tr><tr><td></td><td>FZ-J&uuml; </td><td>Lepkościomierz z kulką opadającą</td> <td>lisza</td></tr></tbody></table>

badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Aktywność i funkcjonalność większości białek ludzkiego ciała jest związana ze zmianami konfiguracyjnymi całych subdomen w strukturze krystalicznej białka. Struktury krystaliczne stanowią podstawę wszelkich obliczeń, które opisują strukturę lub dynamikę białka, w większości przypadków z silnymi ograniczeniami geometrycznymi. Jednak te ograniczenia wynikające ze struktury krystalicznej nie występują w roztworze. Struktura białek w roztworze może różnić się od kryształu ze względu na przegrupowania pętli lub subdomen w skali czasowej piko do nanosekundy (tj. reżimu czasowego wewnętrznej dynamiki białek). Niniejsza praca opisuje, w jaki sposób można uzyskać dostęp do zwolnionych ruchów w skali czasu kilkudziesięciu nanosekund za pomocą rozpraszania neutronów. W szczególności dynamiczna charakterystyka dwóch głównych białek ludzkich, wewnętrznie nieuporządkowanego białka, które nie ma dobrze zdefiniowanej struktury drugorzędowej i klasycznego białka przeciwciała, jest rozwiązywana za pomocą spektroskopii echa spinowego neutronów (NSE) w połączeniu z szerokim zakresem metod charakterystyki laboratoryjnej. Dalsze informacje na temat dynamiki białek uzyskano przy użyciu modelowania matematycznego w celu opisania eksperymentalnych danych neutronowych i określenia krzyżowania się między połączonymi ruchami dyfuzyjnymi i wewnętrznymi białek. Wyodrębnienie wewnętrznego dynamicznego wkładu w funkcję rozpraszania pośredniego uzyskanego z NSE, w tym skali czasowej różnych ruchów, pozwala na dalsze wgląd w właściwości mechaniczne pojedynczych białek i miękkość białek w ich prawie naturalnym środowisku w zatłoczonym roztworze białkowym.

Białko IgG z ludzkiej surowicy oraz białka MBP z wołowiny zrekonstytuowano w wysokich stężeniach (~50 mg/mL) w buforach na bazie D2O. Ze względu na rozpuszczenie białek w wysokich stężeniach, otrzymane roztwory były roztworami białek w warunkach zagęszczenia (crowding). Dynamika badana za pomocą NSE jest podatna na wpływ zagęszczonego środowiska, w którym znajdują się białka (oddziaływania czynnika strukturalnego i efekty hydrodynamiczne)5,28,</su...

Obecny protokół opisuje metody badania struktury i dynamiki dwóch modelowych białek, które odgrywają ważną rolę w zdrowiu człowieka. Technika ta łączy laboratoryjną charakterystykę biofizyczną ze spektroskopią echa spinowego neutronów, aby uzyskać dostęp do dynamiki w skalach czasu i długości istotnych dla ruchów międzydomenowych białek.

Badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

Poniższy protokół przedstawia, jak skonfigurować eksperyment Neutron Spin Echo w celu zmierzenia pośredniej funkcji rozpraszania i zbadania dynamiki białek w roztworze. Główną zaletą spektroskopii neutronowego echa spinowego jest jej zdolność do obserwacji rearanżacji domen i poddomen białkowych w skali czasowej od piko do nanosekundy; Jest to zakres spowolnionych ruchów w białkach w ich prawie naturalnym środowisku oraz w zatłoczonym roztworze białkowym. Neutron Spin Echo jest również wrażliwy na konfigurację izotopową, co pozwala na bardzo specyficzne i ukierunkowane badania z wykorzystaniem dopasowania kontrastu.Wgląd w dynamikę domen białek jest główną częścią badań biofizycznych w trwającym trudnym zadaniu polegającym na przekazywaniu ruchów domen białek z ich biologiczną funkcjonalnością. Przedstawiony tutaj protokół można ogólnie zastosować do każdego pomiaru neutronowego echa spinowego wykonanego na spektrometrze SNS-NSE, niezależnie od wybranego próbki, jeśli pozostaje się w sferze materiałów miękkiej materii. Aby przygotować eksperyment, zacznij od wybrania grubości obciążenia próbki komórki w oparciu o stężenie próbki białka, temperaturę potrzebną do pomiaru i ilość dostępnego roztworu.Wyczyść komórkę płynem do mycia naczyń bez fosforanów, wodą dejonizowaną i 70% dietanolem. Wysuszyć komórkę w piecu konwekcyjnym. Załaduj cztery mililitry roztworu białkowego do komórki i zamknij nakrętkami.Użyj folii woskowej lub dowolnego szczeliwa, aby uszczelnić sample cells. Załadować cztery mililitry buforu dializacyjnego do identycznego pojemnika co próbka białka i zamknąć. Transportować próbki na linię wiązki.Zamknij migawkę i wejdź do obszaru jaskini obudowy spektrometru. Zamontuj celę na próbkę na aluminiowym uchwycie próbki, dokręcając i płytki mocujące. Zamontuj próbkę grafitu i próbkę proszku tlenku glinu załadowaną do identycznego pojemnika co próbka białka.Umieść ten sam uchwyt, delikatnie wsuwając go do puszki systemu wymuszania temperatury. Zamknij pokrywę systemu wymuszania temperatury i ustaw temperaturę na żądaną wartość, uzyskując dostęp do interaktywnego ekranu systemu wymuszania temperatury. Zamontuj kamerę neutronową w celu wyrównania próbek względem wiązki.Aby zebrać dane ze spektroskopii neutronowego echa spinowego, wyrównaj próbkę w wiązce neutronów za pomocą kamery neutronowej i czterech niezależnych otworów próbki. Otwórz oprogramowanie do zbierania danych Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy i zbierz statystyki próbki, uruchamiając skany defrakcji dla żądanych kątów rozpraszania i długości fali. Skonfiguruj parametry pomiaru na podstawie statystyk zebranych dla każdej próbki, edytując makra pomiarowe dostarczone przez naukowca zajmującego się instrumentem asystującym.Rozpocznij skanowanie, wpisując nazwę protokołu w wierszu poleceń i pobierając echa dla próbki. Zaloguj się do klastra Zdalnej Analizy Neutron Sciences za pomocą danych uwierzytelniających użytkownika ORNL i naciśnij przycisk uruchamiania sesji. W katalogu użytkownika otwórz okno terminala i wpisz polecenie konfiguracji oprogramowania.Następnie wpisz polecenie środowiska. Utwórz folder do redukcji danych w katalogu domowym i skopiuj dostarczone skrypty i makra z katalogu współdzielonego. Edytuj, zmień nazwę i zapisz odpowiednio dostarczone makro redukcji.Wpisz drspine"w wierszu poleceń i naciśnij Enter, aby uruchomić środowisko redukcji oprogramowania. Wpisz nazwę makra redukcji w wierszu polecenia w środowisku oprogramowania i naciśnij Enter. Edytuj skrypt języka Python dostarczony przez Assisting Instrument Scientist z nazwami zredukowanych danych pliku.Edytuj funkcję, aby pasowała, z podanej biblioteki. Wpisz nazwę edytowanego skryptu w wierszu polecenia, a następnie naciśnij Enter, aby odczytać, dopasować i wykreślić zredukowane dane NSE. Funkcja rozpraszania pośredniego mierzona przez NSE dla białek IgG i MBP wykazuje wyraźne odchylenie od prostego procesu relaksacji przypominającego dyfuzję w krótkiej czteroletniej skali czasowej, wskazując na dostępność wewnętrznej dynamiki białek przez NSE i potrzebę bardziej złożonego modelu do opisania obserwowanych procesów dynamicznych.Wyniki obliczeń pośredniej funkcji rozpraszania dopasowanych przez modelowanie atomowe obu białek przy użyciu modeli opracowanych przez Autora były w pełni zgodne z danymi eksperymentalnymi NSE. Wyniki dowiodły, że wolniejszą dynamikę obserwowaną w dłuższych okresach futrzastych można przypisać ogólnym procesom dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej, podczas gdy dynamikę obserwowaną w krótkich skalach czasowych można przypisać dynamice domen białkowych. Jedną z ważnych rzeczy, o których należy pamiętać, jest potrzeba dobrze przygotowanych i czystych próbek do pomiarów NSE.Dobra próbka dla Spin Echo ma współczynnik odwrócenia wyższy niż trzy, który jest stosunkiem między koherentnym i niekoherentnym rozpraszaniem próbki. Również podczas przygotowywania próbki i ładowania jej do kuwet NSE, roztwór próbki powinien być przechowywany w bezpiecznym miejscu i wolny od wszelkich chemicznych lub biologicznych zanieczyszczeń krzyżowych. Ze względów bezpieczeństwa próby wejścia do obudowy spektrometru powinny być podejmowane dopiero po zamknięciu żaluzji i przewidziano dodatkowe pół godziny czasu na schłodzenie radiacyjne komory.Rozpraszanie neutronów pod małym kątem jest zalecane do oceny kształtu i struktury białek w stężonym roztworze. Można to zrobić przed lub równolegle z eksperymentem NSE. Dodatkowe metody, takie jak dynamiczne rozpraszanie światła i pomiary lepkości, dostarczają informacji na temat dyfuzji translacyjnej i interakcji hydrodynamicznej w stężonym roztworze białkowym, a także są zalecane.

study-of-protein-dynamics-via-neutron-spin-echo-spectroscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Tutaj znajduje się szczegółowy opis protokołu wdrożonego w laboratorium do akwizycji i analizy profili dyspersji relaksacyjnej 15N za pomocą spektroskopii NMR roztworu.

15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

Ten artykuł opisuje protokoły przygotowania próbek, redukcji danych i analizy danych w badaniach neutronowego echa spinowego (NSE) błon lipidowych. Rozsądne znakowanie lipidów deuterem umożliwia dostęp do różnych dynamik błon w mezoskopowych skalach długości i czasu, w których zachodzą ważne procesy biologiczne.

Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Opisano system echoskopowej welocymetrii obrazowej cząstek (EPIV), który umożliwia pozyskiwanie dwuwymiarowych pól prędkości w płynach nieprzezroczystych optycznie lub przez geometrie nieprzezroczyste optycznie, oraz przedstawiono pomiary walidacyjne w przepływie w rurze.

Echo Particle Image Velocimetry

Ogólnym celem tej metody jest określenie niskoenergetycznej struktury elektronowej ciał stałych w ultra niskich temperaturach za pomocą kątowo-rozdzielczej spektroskopii fotoemisyjnej z promieniowaniem synchrotronowym.

Kątowo-rozdzielcza spektroskopia fotoemisyjna w bardzo niskich temperaturach

Pamięć echa gradientowego to protokół do przechowywania optycznych stanów kwantowych światła w zespołach atomowych. Pamięć kwantowa jest kluczowym elementem wzmacniacza kwantowego, który może rozszerzyć zakres kwantowej dystrybucji klucza. Przedstawiamy działanie schematu w przypadku implementacji w 3-poziomowym zespole atomowym.

Pamięć kwantowa echa gradientowego w ciepłej parze atomowej

Komórka ścinająca jest przeznaczona do pomiarów rozpraszania neutronów pod małym kątem w płaszczyźnie gradientu prędkości-prędkości ścinania i służy do charakteryzowania złożonych płynów. Pomiary przestrzennie rozdzielcze w kierunku gradientu prędkości są możliwe do badania materiałów z pasmami ścinania. Zastosowania obejmują badania dyspersji koloidalnych, roztworów polimerowych i struktur samoorganizujących się.

Pomiar mikrostruktury materiału pod przepływem za pomocą rozpraszania neutronów w 1-2 płaszczyznach przepływu i małym kącie

Poczyniono postępy w wykorzystaniu rozpraszania częstości występowania echa spinowego (SERGIS) jako techniki rozpraszania neutronów do badania skal długości w próbkach o nieregularnym charakterze. Krystality estru metylowego kwasu [6,6]-fenylo-C61-masłowego przebadano techniką SERGIS, a wyniki potwierdzono mikroskopią sił optycznych i atomowych.

Wykorzystanie neutronowego echa spinowego do rozwiązania problemu rozpraszania padania w celu zbadania organicznych materiałów ogniw słonecznych

Poznaj spektroskopię neutronowego echa spinowego do badania dynamiki białek w roztworze. Ta metoda pozwala obserwować przestawianie się domen białkowych w skali czasowej piko- do nanosekund.

Badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego

Przeglądaj więcej filmów