Badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego
13 kwietnia 2022
Obecny protokół opisuje metody badania struktury i dynamiki dwóch modelowych białek, które odgrywają ważną rolę w zdrowiu człowieka. Technika ta łączy laboratoryjną charakterystykę biofizyczną ze spektroskopią echa spinowego neutronów, aby uzyskać dostęp do dynamiki w skalach czasu i długości istotnych dla ruchów międzydomenowych białek.
Poniższy protokół przedstawia, jak skonfigurować eksperyment Neutron Spin Echo w celu zmierzenia pośredniej funkcji rozpraszania i zbadania dynamiki białek w roztworze. Główną zaletą spektroskopii neutronowego echa spinowego jest jej zdolność do obserwacji rearanżacji domen i poddomen białkowych w skali czasowej od piko do nanosekundy; Jest to zakres spowolnionych ruchów w białkach w ich prawie naturalnym środowisku oraz w zatłoczonym roztworze białkowym. Neutron Spin Echo jest również wrażliwy na konfigurację izotopową, co pozwala na bardzo specyficzne i ukierunkowane badania z wykorzystaniem dopasowania kontrastu.
Wgląd w dynamikę domen białek jest główną częścią badań biofizycznych w trwającym trudnym zadaniu polegającym na przekazywaniu ruchów domen białek z ich biologiczną funkcjonalnością. Przedstawiony tutaj protokół można ogólnie zastosować do każdego pomiaru neutronowego echa spinowego wykonanego na spektrometrze SNS-NSE, niezależnie od wybranego próbki, jeśli pozostaje się w sferze materiałów miękkiej materii. Aby przygotować eksperyment, zacznij od wybrania grubości obciążenia próbki komórki w oparciu o stężenie próbki białka, temperaturę potrzebną do pomiaru i ilość dostępnego roztworu.
Wyczyść komórkę płynem do mycia naczyń bez fosforanów, wodą dejonizowaną i 70% dietanolem. Wysuszyć komórkę w piecu konwekcyjnym. Załaduj cztery mililitry roztworu białkowego do komórki i zamknij nakrętkami.
Użyj folii woskowej lub dowolnego szczeliwa, aby uszczelnić sample cells. Załadować cztery mililitry buforu dializacyjnego do identycznego pojemnika co próbka białka i zamknąć. Transportować próbki na linię wiązki.
Zamknij migawkę i wejdź do obszaru jaskini obudowy spektrometru. Zamontuj celę na próbkę na aluminiowym uchwycie próbki, dokręcając i płytki mocujące. Zamontuj próbkę grafitu i próbkę proszku tlenku glinu załadowaną do identycznego pojemnika co próbka białka.
Umieść ten sam uchwyt, delikatnie wsuwając go do puszki systemu wymuszania temperatury. Zamknij pokrywę systemu wymuszania temperatury i ustaw temperaturę na żądaną wartość, uzyskując dostęp do interaktywnego ekranu systemu wymuszania temperatury. Zamontuj kamerę neutronową w celu wyrównania próbek względem wiązki.
Aby zebrać dane ze spektroskopii neutronowego echa spinowego, wyrównaj próbkę w wiązce neutronów za pomocą kamery neutronowej i czterech niezależnych otworów próbki. Otwórz oprogramowanie do zbierania danych Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy i zbierz statystyki próbki, uruchamiając skany defrakcji dla żądanych kątów rozpraszania i długości fali. Skonfiguruj parametry pomiaru na podstawie statystyk zebranych dla każdej próbki, edytując makra pomiarowe dostarczone przez naukowca zajmującego się instrumentem asystującym.
Rozpocznij skanowanie, wpisując nazwę protokołu w wierszu poleceń i pobierając echa dla próbki. Zaloguj się do klastra Zdalnej Analizy Neutron Sciences za pomocą danych uwierzytelniających użytkownika ORNL i naciśnij przycisk uruchamiania sesji. W katalogu użytkownika otwórz okno terminala i wpisz polecenie konfiguracji oprogramowania.
Następnie wpisz polecenie środowiska. Utwórz folder do redukcji danych w katalogu domowym i skopiuj dostarczone skrypty i makra z katalogu współdzielonego. Edytuj, zmień nazwę i zapisz odpowiednio dostarczone makro redukcji.
Wpisz drspine"w wierszu poleceń i naciśnij Enter, aby uruchomić środowisko redukcji oprogramowania. Wpisz nazwę makra redukcji w wierszu polecenia w środowisku oprogramowania i naciśnij Enter. Edytuj skrypt języka Python dostarczony przez Assisting Instrument Scientist z nazwami zredukowanych danych pliku.
Edytuj funkcję, aby pasowała, z podanej biblioteki. Wpisz nazwę edytowanego skryptu w wierszu polecenia, a następnie naciśnij Enter, aby odczytać, dopasować i wykreślić zredukowane dane NSE. Funkcja rozpraszania pośredniego mierzona przez NSE dla białek IgG i MBP wykazuje wyraźne odchylenie od prostego procesu relaksacji przypominającego dyfuzję w krótkiej czteroletniej skali czasowej, wskazując na dostępność wewnętrznej dynamiki białek przez NSE i potrzebę bardziej złożonego modelu do opisania obserwowanych procesów dynamicznych.
Wyniki obliczeń pośredniej funkcji rozpraszania dopasowanych przez modelowanie atomowe obu białek przy użyciu modeli opracowanych przez Autora były w pełni zgodne z danymi eksperymentalnymi NSE. Wyniki dowiodły, że wolniejszą dynamikę obserwowaną w dłuższych okresach futrzastych można przypisać ogólnym procesom dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej, podczas gdy dynamikę obserwowaną w krótkich skalach czasowych można przypisać dynamice domen białkowych. Jedną z ważnych rzeczy, o których należy pamiętać, jest potrzeba dobrze przygotowanych i czystych próbek do pomiarów NSE.
Dobra próbka dla Spin Echo ma współczynnik odwrócenia wyższy niż trzy, który jest stosunkiem między koherentnym i niekoherentnym rozpraszaniem próbki. Również podczas przygotowywania próbki i ładowania jej do kuwet NSE, roztwór próbki powinien być przechowywany w bezpiecznym miejscu i wolny od wszelkich chemicznych lub biologicznych zanieczyszczeń krzyżowych. Ze względów bezpieczeństwa próby wejścia do obudowy spektrometru powinny być podejmowane dopiero po zamknięciu żaluzji i przewidziano dodatkowe pół godziny czasu na schłodzenie radiacyjne komory.
Rozpraszanie neutronów pod małym kątem jest zalecane do oceny kształtu i struktury białek w stężonym roztworze. Można to zrobić przed lub równolegle z eksperymentem NSE. Dodatkowe metody, takie jak dynamiczne rozpraszanie światła i pomiary lepkości, dostarczają informacji na temat dyfuzji translacyjnej i interakcji hydrodynamicznej w stężonym roztworze białkowym, a także są zalecane.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje konfigurację eksperymentu Neutron Spin Echo w celu badania dynamiki białek w roztworze. Podkreśla on zdolność tej techniki do obserwacji przemieszczeń domen białkowych w skalach czasowych od pikosekund do nanosekund, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich funkcji biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka
- Dynamika białek
- Spektroskopia neutronowego echa spinowego
Wstęp
- Dynamika białek jest kluczowa dla zrozumienia ich funkcjonalności.
- Neutronowe echo spinowe jest czułe na konfiguracje izotopowe.
- Technika ta umożliwia ukierunkowane badania z wykorzystaniem dopasowania kontrastu.
- Krytyczne jest badanie ruchów białek w środowiskach zbliżonych do naturalnych.
Cel badania
- Pomiar funkcji rozpraszania pośredniego białek.
- Badanie dynamiki domen i poddomen białkowych.
- Uzyskanie wiedzy na temat związku między ruchami białek a ich funkcjonalnością biologiczną.
Zastosowane metody
- Konfiguracja eksperymentów neutronowego echa spinowego (NSE).
- Pomiar dynamiki białek w roztworze.
- Dobór grubości kuwety z próbką w zależności od stężenia białka.
- Kontrola temperatury podczas pomiarów.
Główne wyniki
- Wykazano zdolność do obserwacji powolnych ruchów białek.
- Dostarczono ram metodologicznych do badania różnych materiałów miękkich.
- Podkreślono znaczenie przygotowania próbek w eksperymentach.
- Wykazano skuteczność metody Neutron Spin Echo w badaniach biofizycznych.
Wnioski
- Neutron Spin Echo jest potężnym narzędziem do badania dynamiki białek.
- Protokół można dostosować do różnych próbek białek.
- Uzyskane informacje mogą pogłębić zrozumienie funkcjonalności białek.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spektroskopia echa spinowego neutronów umożliwia badaniom i rozwojowi w sektorze biofarmaceutycznym analizę dynamiki domen białkowych w skalach czasowych od pikosekund do nanosekund w warunkach roztworów zbliżonych do naturalnych, wypełniając tym samym krytyczną lukę między statycznymi strukturami krystalicznymi a funkcjonalnym zachowaniem białek. Możliwość ta wspiera walidację celu, dostarczając mechanistycznych wglądów w elastyczność białek i zmiany konformacyjne leżące u podstaw aktywności biologicznej, co pozwala na testowanie hipotez we wczesnych etapach i ograniczanie ryzyka. Metoda ta dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych na temat wewnętrznych ruchów białek, zwiększając pewność predykcyjną w identyfikacji związków wiodących oraz wyborze modeli przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez charakterystykę reorganizacji domen białkowych związanych z mechanizmami funkcjonalnymi.
- Wartość operacyjna: Umożliwia walidację funkcjonalną celu poprzez bezpośrednią obserwację dynamiki poddomen w roztworze.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez wyjaśnienie mechanistycznych podstaw aktywności białek i zmniejszenie niejednoznaczności w zakresie oddziaływania na cel.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez określenie dynamicznych linii bazowych zachowania białek.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację i powtarzalność testów dzięki ilościowym pomiarom pośredniej funkcji rozpraszania.
- Gotowość do przesiewania: Dostarcza skalowalne, kompatybilne z platformą wyniki umożliwiające niezawodne przesiewanie związków w środowiskach roztworów o dużym zagęszczeniu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dynamikę fazy odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie systemów istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Koncentruje się na predykcyjnej redukcji ryzyka poprzez izolowanie wewnętrznej dynamiki białek od ogólnych procesów dyfuzji.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ustalenie zależności między strukturą, dynamiką a funkcją w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnej fazy odkrywania (Early Discovery), przez identyfikację wiodących związków (Lead Identification), aż po badania przedkliniczne, dostarczając dynamicznych odczytów fenotypowych, które uzupełniają analizy strukturalne i funkcjonalne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez rozstrzyganie ruchów domen białkowych w istotnych funkcjonalnie skalach czasowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki zstandaryzowanym, ilościowym wynikom umożliwiającym porównania między różnymi warunkami.
- Analityka: Dostarcza pośrednią funkcję rozpraszania oraz dopasowane parametry modelu, które kwantyfikują ruchy wewnętrzne w stosunku do ruchów dyfuzyjnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez charakteryzację dynamiki w stężonych roztworach białek naśladujących środowiska komórkowe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako reużywalna metoda dynamicznego fenotypowania dla wielu celów białkowych i modalności.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: pewność predykcyjna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w funkcji białek.
- Wartość operacyjna: standaryzacja, powtarzalność i skalowalność pomiarów dynamicznych w układach białkowych.
- Wartość strategiczna: lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zmniejszone biologiczne ryzyko na późnych etapach dzięki wczesnemu wglądowi w mechanizmy.
- Wpływ na portfolio: priorytetyzacja skorygowana o ryzyko i decyzje dotyczące rozwoju oparte na dynamicznym profilowaniu fenotypowym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w dziedzinie biofizyki, rozpraszania neutronów oraz przygotowania próbek białek.
- Zależność od dostępu do spektrometrów Neutron Spin Echo oraz infrastruktury wspomagającej redukcję danych.
- Konieczność standaryzacji protokołów przygotowania próbek, uszczelniania i kontroli zanieczyszczeń pomiędzy zespołami.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne dotyczące różnych stężeń białek, warunków buforowych i zakresów temperatur.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potrzeba wysokiego współczynnika odwrócenia flip ratio (>3), protokoły bezpieczeństwa radiacyjnego oraz techniki komplementarne, takie jak SANS, w celu uzyskania kontekstu strukturalnego.
