Name: Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy. Ta technika bez Langendorffa umożliwia wydajne pozyskiwanie komórek sercowych z wysoką żywotnością dla badań kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują T. Yamamoto i Y. Mori za pomoc w eksperymentach morfologicznych. Prace te zostały wsparte grantem na badania naukowe (C) z Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (18K06871 dla M.O.K. i 17K08536 dla H.M.).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z Przewodnikiem do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych opublikowanym przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (publikacja NIH nr 85-23, poprawiona w 1996 roku) i zostały zatwierdzone przez instytucjonalną Komisję Rewizyjną Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Shiga (zatwierdzone nr 2019-3-7). Metody przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
1. Instrumenty i rozwiązania
UWAGA: Zarys procedury eksperymentalnej jest zilustrowany na schemacie przepływu (Rysunek uzupełniający 1). Pompa infuzyjna (lub pompa strzykawkowa) powinna być używana do perfuzji serca w kierunku prostym z przepływem jednokierunkowym. Nie zaleca się stosowania pompy perystaltycznej, która wytwarza przepływ pulsacyjny.
<ol>
	<li>Przed eksperymentem
	<ol>
		<li>Oznaczyć igłę do wstrzykiwań w miejscu oddalonym o około 3 mm od końcówki lakierem do paznokci. Po pozostawieniu do wyschnięcia na powietrzu przechowuj go w pojemniku w temperaturze pokojowej. Pożądany jest czerwony lub jasny kolor, aby potwierdzić głębokość wszczepienia do mięśnia sercowego podczas perfuzji.</li>
		<li>Spraw, aby serce stało, odcinając pokrywki z probówek na próbki o pojemności 1,5, 0,5 i 0,2 ml i przymocowując pokrywki do dna naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm za pomocą dwustronnej taśmy lub kleju. Mocowanie trzech pokrywek o różnych rozmiarach w jednym naczyniu umożliwia wybór odpowiedniej w zależności od wielkości serca myszy. Ten stojak na serce może być ponownie użyty po umyciu.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy, jak pokazano w Tabeli 1. Przechowywać roztwory podstawowe w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu eksperymentu 
	UWAGA: Bufor do izolacji komórek (CIB) zawiera (w mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 22 glukozy, 40 jednostek/ml insuliny i 25 HEPES (pH dostosowane do 7,4 z NaOH); a roztwór Tyrode zawiera (w mM) 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 5,5 glukozy i 5,0 HEPES (pH dostosowane do 7,4 z NaOH).
	<ol>
		<li>Przygotuj CIB. Podgrzej 160 ml wody destylowanej (DW) za pomocą kuchenki mikrofalowej do około 32 °C, a następnie dodaj 20 ml 10X CIB. Po dodaniu 0,79 g glukozy i 10 μl roztworu insuliny, dostosować pH za pomocą 1 M NaOH i doprowadzić do 200 ml za pomocą DW.</li>
		<li>Przygotować roztwór mieszaniny enzymów (mieszanina enzymów). Dodać 30 mg kolagenazy, 1,8 mg trypsyny, 1,8 mg proteazy i 90 μl 100 mM roztworu podstawowego CaCl2 do 30 ml CIB (końcowe stężenie Ca2+ wynosi 0,3 mM), wymieszać i trzymać na lodzie. U myszy w wieku <4 tygodni zmniejsz dawkę trypsyny i proteazy do 0,9 mg10. Przed użyciem podgrzać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Przygotować roztwór CIB-Ca2+-BSA. Dodać 30 mg BSA i 90 μl 100 mM roztworu podstawowego CaCl2 do 15 ml CIB (końcowe stężenie Ca2+ wynosi 1,2 mM), wymieszać, przefiltrować przez filtr 20 μm i trzymać na lodzie.</li>
		<li>Przygotuj rozwiązanie CIB-EGTA. Po sporządzeniu roztworów opisanych w krokach 1.2.2 i 1.2.3, dodać 400 mM roztworu podstawowego EGTA do pozostałego CIB w rozcieńczeniu 1:1000 (końcowe stężenie EGTA wynosi 0,4 mM) i wymieszać. Napełnij 35-milimetrową miskę hodowlaną i stojącą miskę sercową CIB-EGTA i trzymaj je na lodzie.
		<ol>
			<li>Wlać około 20 ml CIB-EGTA do szklanej zlewki o pojemności 30 ml i umieścić w niej plastikową pipetę transferową, trzymając ją na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj roztwór Tyrode. Dodaj 100 ml 10X Tyrode do 800 ml DW i podgrzej go w kuchence mikrofalowej do około 32 °C. Po dodaniu 0,99 g glukozy i 1,8 ml 1 M CaCl2 dostosować pH za pomocą 1 M NaOH i doprowadzić do 1000 ml za pomocą DW.</li>
		<li>Przygotować roztwór do ponownego zawieszania komórek. Dodać 30 mg BSA i 300 μl antybiotyków 50X do 15 ml roztworu Tyrode.</li>
		<li>Przygotować strzykawki. Napełnij strzykawkę o pojemności 20 ml połączoną z elastyczną rurką przedłużającą i oznaczoną igłą do wstrzykiwań za pomocą CIB-EGTA. Napełnij strzykawkę o pojemności 30 ml podgrzaną mieszanką enzymów. Oba należy trzymać w temperaturze 37 °C do momentu tuż przed użyciem.</li>
		<li>Przygotuj płytkę perfuzyjną. Rozgrzej matę grzejną pod mikroskopem stereoskopowym. Umieścić płytkę perfuzyjną (pokrywkę wielodołkowej płytki hodowlanej) na wstępnie podgrzanej macie grzewczej. Rozgrzej zacisk naczyniowy, umieszczając go w płytce perfuzyjnej do czasu użycia. Umieść naczynie hodowlane o średnicy 60 mm do pipetowania i sitko do komórek na wstępnie podgrzanej macie grzewczej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Antegrade perfuzja serca myszy
UWAGA: Plastikowa pipeta transferowa używana do ssania serca powinna być miękka i nie powinna być ostro zwężana w kierunku końcówki. Wybierz mały zacisk naczyniowy z ząbkowaniem. Zalecane instrumenty są wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Wycięcie serca myszy i zaciśnięcie aorty 
	UWAGA: Dorosłe myszy (>8 tygodni) powinny zostać poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu sodu (>300 mg/kg, wstrzyknięcie dootrzewnowe [i.p.]) z heparyną (8000 jednostek/kg).
	<ol>
		<li>Szybko wytnij serce myszy, ssąc.
		<ol>
			<li>Szybko otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Przeciąć plastikową pipetę transferową, której końcówka jest w przybliżeniu tego samego rozmiaru lub nieco mniejsza niż odsłonięte serce (zwykle w miejscu około 1 cm od oznaczenia 0,5 ml w kierunku końcówki, ale zależy to od rozmiaru serca).</li>
			<li>Zassaj serce do pipety, podnieś pipetę, aby zrobić wystarczająco dużo miejsca na włożenie nożyczek, i wytnij serce zakrzywionymi nożyczkami od strony grzbietowej, unikając uszkodzenia przedsionków.</li>
			<li>Natychmiast przenieś wycięte serce do szklanej zlewki o pojemności 30 ml zawierającej schłodzony lodem CIB-EGTA, aby zatrzymać skurcz. Ta procedura trwa zwykle <1 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Czyszczenie okolic aorty
		<ol>
			<li>Przenieś serce do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego wypełnionego chłodzonym lodem CIB-EGTA i usuń płuca i inne widoczne tkanki, a następnie przenieś z grubsza oczyszczone serce do stojaka na serce wypełnionego schłodzonym CIB-EGTA i umieść je wierzchołkiem w dół.</li>
			<li>Pod mikroskopem stereoskopowym usuń tłuszcz i tkankę łączną, aby oczyścić okolice aorty. Jeśli długość przeciętej aorty jest zbyt długa, w tym tętnica ramienno-głowowa, lewa tętnica szyjna wspólna lub lewa tętnica podobojczykowa, odetnij aortę tuż pod tętnicą ramienno-głowową, aby ją skrócić, aby przejść do następnego kroku. Ta procedura trwa zwykle około 4 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zaciśnięcie aorty i umieszczenie zaciśniętego serca na płytce perfuzyjnej
		<ol>
			<li>Pod mikroskopem umieść serce w stojaku na serce. Operator powinien skierować się w stronę przedniej powierzchni serca, podnieść koniec aorty pęsetą i zacisnąć aortę w pobliżu przedsionków małym zaciskiem naczyniowym, delikatnie dociskając nieco aortę.</li>
			<li>Umieść zaciśnięte serce na płytce perfuzyjnej przednią stroną do góry, a następnie przykryj je kilkoma kroplami CIB-EGTA, aby nie wyschło. Ta procedura trwa zwykle <20 s.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja serca 
	UWAGA: Najpierw wykonaj perfuzję serca za pomocą CIB-EGTA, aby rozładować krew i zapobiec krzepnięciu.
	<ol>
		<li>Wprowadzić igłę do wstrzykiwań i rozpocząć perfuzję w celu uwolnienia krwi
		<ol>
			<li>Ustawić strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną wstępnie podgrzanym CIB-EGTA podłączoną do elastycznej rurki przedłużającej i oznaczonej igły do wstrzykiwań na pompie infuzyjnej. Uruchom pompę z małą prędkością 0,5 ml/min, aby ostrożnie napełnić igłę i rurkę CIB-EGTA i upewnić się, że nie dopuścić do przedostania się powietrza do rurki.</li>
			<li>Umieścić igłę do wstrzykiwań na płytce perfuzyjnej krótszym bokiem ukośnego kształtu z przodu. Przesuń igłę w kierunku wierzchołka serca, aż zacznie go dotykać, a następnie ostrożnie włóż igłę w pobliżu wierzchołka lewej komory do komory komorowej bez skręcania. Nie odłączać igły od płytki podczas wprowadzania igły.</li>
			<li>Obserwuj czerwony znak, aby oszacować głębokość wkłucia igły. Po zakończeniu wprowadzania igły krew wypływająca z tętnicy wieńcowej powinna zacząć być odprowadzana.</li>
			<li>Przymocować igłę do wstrzykiwacza na płytce za pomocą taśmy i zwiększyć prędkość pompy do 1 ml/min. Ta procedura trwa zwykle około 30 s. Jeśli perfuzja serca zakończy się powodzeniem, pod mikroskopem można zobaczyć przepływ CIB-EGTA w naczyniach włosowatych tuż pod nasierdziem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Perfuzja serca za pomocą enzymu mix 
		UWAGA: Podczas perfuzji enzymatycznej głębokość wkłutej igły można monitorować, sprawdzając czerwony znak na igle.
		<ol>
			<li>Po perfuzji 2-3 ml CIB-EGTA w celu całkowitego odprowadzenia krwi z tętnicy wieńcowej, zmień perfuzat na mieszankę enzymów. Nie dopuścić do przedostania się pęcherzyków powietrza do rurki. Sprawdzić przepływ mieszaniny enzymów i upewnić się, że igła do wstrzykiwań nie wysunęła się, sprawdzając położenie czerwonego znaku.</li>
			<li>Po perfuzji 1-2 ml należy zwiększyć prędkość pompy do 1,5 ml/min. Od czasu do czasu należy usunąć pipetą nagromadzony perfuzat zawierający krew, która wypłynęła z serca. 
			UWAGA: Z biegiem czasu ściana mięśnia sercowego stanie się w niektórych miejscach przezroczysta i będzie wydawać się cętkowana, co jest oznaką trawienia macierzy zewnątrzkomórkowej po udanej perfuzji. Innym objawem jest wznowienie bicia przedsionków spowodowane obecnością Ca2+ w mieszaninie enzymów.</li>
			<li>Przerwać perfuzję, gdy całkowita objętość perfundowanej mieszaniny enzymów wynosi 10 ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja pojedynczych komórek serca
<ol>
	<li>Dysocjacja komórek serca
	<ol>
		<li>Po perfuzji z mieszaniną enzymów przenieść 10 ml mieszanki enzymów pozostałej w strzykawce do naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm umieszczonego na macie grzewczej i dodać 20 mg BSA (0,2% BSA w mieszaninie enzymów). Upuszczony proszek BSA powinien natychmiast się rozpuścić, delikatnie obracając dłonią. Wyjąć igłę do wstrzykiwań i zacisk naczyniowy z serca.</li>
		<li>Oddzielić komory i przedsionki i przenieść je do mieszaniny enzymów uzupełnionej 0,2% BSA na macie grzewczej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja miocytów komorowych
	<ol>
		<li>Chwyć nasierdzie dwiema pęsetami i delikatnie rozerwij i pociągnij komory z boku na bok w mieszance enzymów uzupełnionej 0,2% BSA na małe kawałki. Rozprowadzić komórki, delikatnie pipetując (około 30 razy).</li>
		<li>Przefiltrować niestrawione resztki przez sitko siatkowe o wielkości 100 μm i przenieść filtrat do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w celu odwirowania przy 50 × g przez 3 minuty. Zawiesić granulowane kardiomiocyty we wstępnie podgrzanym roztworze CIB-Ca2+-BSA, inkubować go przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie odwirować w temperaturze 14 × g przez 3 minuty.</li>
		<li>Zawiesić końcowe wytrącone kardiomiocyty w roztworze do ponownego zawieszania komórek (skład podano w Tabeli 2) i utrzymywać go w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja miocytów przedsionkowych
	<ol>
		<li>Podczas końcowego wirowania frakcji miocytów komorowych w kroku 3.2 rozpocznij izolację miocytów przedsionkowych. Przenieść przedsionki, przechowywane jak w kroku 3.1, do wstępnie podgrzanego roztworu CIB-Ca2+-BSA, rozerwać go na kawałki i rozdzielić komórki, pipetując końcówką pipety o stężeniu 10 μl na macie grzewczej.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę komórek o stężeniu 14 × g przez 3 minuty i ponownie zawiesić granulowane komórki przedsionkowe roztworem do ponownego zawieszania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja i hodowla fibroblastów serca
	<ol>
		<li>Przenieść supernatant z pierwszego wirowania w kroku 3.2 do innej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 190 × g przez 5 minut. Przepłukać wytrącone komórki dwukrotnie przez odwirowanie w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, a następnie zawiesić komórki za pomocą DMEM uzupełnionego 10% albuminą bydlęcą płodu (FBS) i antybiotykami.</li>
		<li>Umieścić końcową frakcję komórkową w kolbie hodowlanej (25 cm2) i pozwolić komórkom przylegać do dna kolby w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5% CO2 . Po 90 minutach inkubacji wyrzuć nieprzyłączone komórki i dodaj świeżą pożywkę hodowlaną. Komórki powinny zbliżyć się do zbiegu po około 4 dniach, po czym należy je amplifikować przez trypsynizację i wysiać do nowych szalek hodowlanych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pobieranie białek z przedsionków i komór
<ol>
	<li>Po perfuzji oddzielić przedsionki i komory i homogenizować je w buforze do lizy w stosunku 10 mg masy tkanki do 100 μl buforu za pomocą małego młynka w probówce z próbką o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przechowywać homogenat w lodzie przez 40 minut, mieszając wirowo co 10 minut w celu ekstrakcji białek, a następnie odwirować probówkę o stężeniu 15000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Frakcję supernatantu przechowywać w temperaturze -80 °C jako próbkę białka.</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne izolowanych komórek serca
UWAGA: Konieczne jest unieruchomienie nieprzylegających kardiomiocytów do dna naczynia do obrazowania komórek za pomocą kleju biologicznego.
<ol>
	<li>Adhezja izolowanych kardiomiocytów do naczynia hodowlanego ze szklanym dnem
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem izolacji komórek pokryj naczynie hodowlane ze szklanym dnem klejem biologicznym (np. Cell-Tak) zgodnie z instrukcją producenta, spłucz DW i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po ponownym zawieszeniu wyizolowanych kardiomiocytów w roztworze CIB-Ca2+-BSA, upuść zawiesinę komórkową na dno naczyń pokrytych klejem i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne
	<ol>
		<li>Umieść izolowane kardiomiocyty na naczyniu ze szklanym dnem pokrytym klejem biologicznym i utrzymuj je w temperaturze pokojowej przez 40 minut, aby komórki mogły przylegać do naczynia. Hodowla fibroblastów serca w naczyniach hodowlanych ze szkła dolnego.</li>
		<li>Przepłukać komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i utrwalić je 4% paraformaldehydem (PFA) przez 5 minut z potrząsaniem. Przemyć utrwalone komórki PBS przez 10 minut trzy razy i inkubować je w roztworze blokująco-przepuszczalnym przez 60 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.</li>
		<li>Badać komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokująco-przepuszczalnym przez 60 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki trzykrotnie PBS przez 10 minut, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po trzykrotnym przemyciu ich PBS przez 10 min, zabarwić jądra DAPI (rozcieńczenie 1:10000 w PBS). Analizuj sygnały fluorescencyjne za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Nagrania z zaciskiem krosowym całej komórki
<ol>
	<li>Wykonaj elektrody plastra ze szklanych kapilar za pomocą poziomego ściągacza mikroelektrod. Rezystancja elektrody wahała się od 2 do 4 MΩ po napełnieniu roztworem pipety bogatym w K+ (tabela 2). Przenieść podwielokrotność wyizolowanych kardiomiocytów do komory rejestracyjnej zamontowanej na stoliku mikroskopu odwróconego z dodatkiem tyrodu z szybkością 1 ml/min w temperaturze 36–37 °C.</li>
	<li>Rejestrować potencjały czynnościowe za pomocą perforowanej metody patch-clamp z roztworem pipet bogatym w K+ zawierającym 30 mg/ml amfoterycyny B, stosując impulsy prądu o czasie trwania 5-10 ms z częstotliwością 1 Hz przez elektrodę krosową.</li>
</ol>
7. Analizy Western blot
<ol>
	<li>W tym badaniu należy przeprowadzić analizę Western blot białek drobnocząsteczkowych, takich jak przedsionkowy peptyd natriuretyczny markera przedsionkowego (ANP).</li>
	<li>Rozpuścić próbkę białka w końcowym stężeniu buforu 1X Sample, 2% 2' merkaptoetanolu i denaturować białka przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Załadować 20 μg białka do każdego dołka i przeprowadzić elektroforezę w działającym buforze z 20 mA na żel przez 120 minut.</li>
	<li>Przenieść białko do membrany PVDF w buforze transferowym pod napięciem 10 V przez 40 minut. Przemyć przeniesioną membranę dwukrotnie TBST przez 5 minut, następnie zablokować 5 % odtłuszczonym mlekiem w TBST przez 60 minut w temperaturze pokojowej i sondować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozpuszczonym w TBST przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć membranę 5 razy TBST przez 7 minut i inkubować ją z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w TBST przez 120 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 5-krotnym umyciu membrany TBST przez 7 minut, zwizualizuj sygnały za pomocą testu chemiczno-luminescencyjnego i przeanalizuj je za pomocą analizatora luminoobrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+am+%C3%BCberlebenden+S%C3%A4ugethierherzen%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1898).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circulation Research. 26 (6), 679-687 (1970).</li>
<li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li>
<li>Joshi-Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+plasticity+in+long-term+cultures+of+adult+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional plasticity in long-term cultures of adult ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 65, 76-87 (2013).</li>
<li>Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+current+in+single+myocardial+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium current in single myocardial mouse cells.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).</li>
<li>Zhou, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%3A+methods+for+cellular+genetic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 429-436 (2000).</li>
<li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).</li>
<li>Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapidly+activating+sustained+K%2B+current+modulates+repolarization+and+excitation-contraction+coupling+in+adult+mouse+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle.</a> Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Sambrano, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+signalling+network+in+mouse+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes.</a> Nature. 420 (6916), 712-714 (2002).</li>
<li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bcl-2+overexpression+promotes+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6257-6262 (2002).</li>
<li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro%3A+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Developmental Dynamics. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cardiac+fibroblasts+in+post-myocardial+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The role of cardiac fibroblasts in post-myocardial heart tissue repair.</a> Experimental and Molecular Pathology. 101 (2), 231-240 (2016).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+self-beating+cardiomyocytes+in+adult+mouse+ventricles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel type of self-beating cardiomyocytes in adult mouse ventricles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 381 (3), 361-366 (2009).</li>
<li>Shan, D., Marchase, R. B., Chatham, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+TRPC3+increases+apoptosis+but+not+necrosis+in+response+to+ischemia-reperfusion+in+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Overexpression of TRPC3 increases apoptosis but not necrosis in response to ischemia-reperfusion in adult mouse cardiomyocytes.</a> American Journal of Physiology. 294 (3), 833-841 (2008).</li>
<li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+and+functional+role+of+the+rapidly+activating+delayed+rectifier+K%28%2B%29+current+in+left+and+right+atria+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Presence and functional role of the rapidly activating delayed rectifier K(+) current in left and right atria of adult mice.</a> European Journal of Pharmacology. 649 (1-3), 14-22 (2010).</li>
<li>Milgroom, A., Ralston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+skeletal+muscle+with+CLARITY+for+light+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging.</a> Cell Biology International. 40 (4), 478-483 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ serce jest bardzo podatne na niedokrwienie, czas potrzebny na wycięcie serca i zanurzenie go w lodowatym CIB-EGTA w celu zatrzymania skurczu powinien być jak najkrótszy (<1 min). Jest to pierwszy krytyczny krok tej metody. Drugi krytyczny krok dotyczy kierunku serca. Szczególna orientacja wyciętego serca w kroku 2.1.2 ułatwia dostrzeżenie i usunięcie tłuszczu i tkanki łącznej wokół aorty. Po oczyszczeniu okolic aorty umieść zaciśnięte serce przednią powierzchnią do góry na płytce perfuzyjnej. Ostatnim krytycznym etapem jest wprowadzenie igły do wstrzykiwań. Podczas przesuwania igły w kierunku serca, igła do wstrzykiwań nie powinna być odłączana od płytki perfuzyjnej, aby zachować stałą odległość od płytki. Pozycja przyczepu znajduje się w pobliżu wierzchołka lewej komory. Włóż igłę ostrożnie, nie skręcając, ponieważ takie skręcenie może powiększyć otwór. Głębokość wkłucia igły można oszacować, obserwując czerwony znak. Jeśli igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko, końcówka może przebić się przez przegrodę komorową i wejść do prawej komory lub przez zastawkę mitralną i wejść do lewego przedsionka. Po potwierdzeniu zaniku krwi z tętnicy wieńcowej igłę należy przymocować taśmą do płytki perfuzyjnej.
Dłuższa długość aorty utrudnia zaciśnięcie aorty we właściwej pozycji. Jeśli zacisk jest zbyt daleko od przedsionków, serce może się obracać po infuzji perfuzyjnej. Aby temu zapobiec, odetnij aortę tuż pod tętnicą ramienno-głowową, aby skrócić aortę przed zaciśnięciem.
Jeśli krew nie zacznie wypływać po perfuzji z początkową prędkością 0,5 ml/min, zwiększ prędkość do 1 ml/min. Jeśli to nie pomoże, igła do wstrzykiwań może być umieszczona nieprawidłowo, na przykład w prawej komorze, przegrodzie międzykomorowej lub lewej ścianie mięśnia sercowego. W takim przypadku należy natychmiast wyjąć igłę i spróbować ponownie włożyć ją w pobliżu wierzchołka lewej komory. Przy kilkukrotnym wkłuciu igły strawione komórki mogą wypłynąć z otwartych otworów. Należy pamiętać, że zwykle nie wpływa to poważnie na izolację komórek.
Operatorzy mogą monitorować cały proces perfuzji serca do przodu za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby obserwować zmiany koloru i przezroczystości oraz wznowienie bicia przedsionków wraz z trawieniem. Łącznie 10 ml mieszanki enzymatycznej powinno być maksimum wymagane, nawet dla starego serca. W młodszych sercach (w wieku 5-7 tygodni) zmniejszamy objętość do 9 ml, co jest podobne do podejścia polegającego na wstecznej perfuzji z tą samą mieszanką enzymów.
Supernatant w końcowym wirowaniu zawiera szczątki, krwinki i nie-miocyty, podczas gdy osad zawiera głównie kardiomiocyty i zanieczyszczające nie-miocyty, takie jak fibroblasty i komórki śródbłonka. Aby oczyścić kardiomiocyty, potrzebne są dalsze kroki. Ogólnie rzecz biorąc, osad powinien być ponownie zawieszony w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowej i wstępnie posiany przez 2 godziny w temperaturze 37°C na naczyniu do hodowli komórek tkankowych, a następnie delikatnie usunąć kardiomiocyty przez pipetowanie i wstępne powlekanie do hodowli.
Mieszanina enzymów zawiera niskie stężenie Ca2+ (0,3 mM). Dlatego inkubujemy strawione komórki w CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2+) przed ostatecznym ponownym zawieszeniem roztworem do rezawieszania komórek (1,8 mM Ca2+), a stopniowy wzrost Ca2 + pozwala uniknąć uszkodzenia komórek7. Dopóki izolowane kardiomiocyty są nienaruszone (komórki w stanie spoczynku bez skurczu), ta procedura adaptacji Ca2 + nie wpływa na żywotność komórek u myszy. Ponieważ uszkodzone komórki obumierają podczas tej inkubacji, w konsekwencji otrzymujemy zdrową grupę komórek. Podobnie, wyizolowane nienaruszone miocyty przedsionkowe (komórki w stanie spoczynku bez nieregularnego skurczu) mogą być przechowywane w tym samym roztworze do ponownego zawieszania komórek. Jednak miocyty przedsionkowe są zwykle bardziej delikatne do przechowywania w porównaniu z miocytami komorowymi.
W laboratorium ta metoda izolacji jest prawie zawsze skuteczna, chyba że wprowadzenie igły do lewej komory nie powiedzie się. Udało nam się również wyizolować komórki z przerośniętego serca przygotowane przez chirurgiczne poprzeczne zwężenie aorty. Jednak u starszych myszy, które często mają małe zawały mięśnia sercowego, perfuzja ustaje, w niektórych miejscach ustaje perfuzja, co skutkuje niepełnym trawieniem, a tym samym niską wydajnością (ryc. 1C), podobną do metody wstecznej opartej na Langendorffie. W takich przypadkach zniekształcony kształt serca można zaobserwować nawet na początku perfuzji.
Ta metoda perfuzji antegrade jest przydatna do izolowania komórek serca od myszy w różnym wieku, ale nie od większych zwierząt, takich jak króliki i świnki morskie. Możliwe jest zastosowanie tej metody u noworodków lub młodych szczurów przed odsadzeniem.
Jedną z zalet tej metody perfuzji wstecznej jest to, że zmniejsza ona przeszkody techniczne związane ze stosowaniem metody perfuzji wstecznej opartej na Langendorffie dla małych serc myszy. Czas potrzebny do perfuzji wynosi około 7 minut przy 10 ml enzymów, ten krótki okres trawienia zwiększa żywotność komórek. Ponadto umożliwia przeprowadzenie perfuzji przez krążenie wieńcowe serca, nawet po strawieniu zastawek aortalnych. Izolacja miocytów przedsionkowych zwykle wymaga wstecznej perfuzji Langendorffa i dalszej inkubacji z enzymami17. To podejście perfuzji wstecznej może jednak głęboko perfuzjować tkankę enzymem w celu wyizolowania miocytów przedsionkowych.
W eksperymentach z udziałem wielu myszy aparat Langendorffa powinien zostać oczyszczony przed perfuzją następnego serca. Jednak w obecnej metodzie antegrade, o ile pożądana liczba zestawów narzędzi (np. strzykawek, igieł i płytek perfuzyjnych) jest wcześniej przygotowana, perfuzja może być wykonywana w sposób ciągły.
Poniżej przedstawiamy podstawową metodologię perfuzji wstecznej serca myszy przy użyciu tych samych roztworów, co metoda perfuzji wstecznej opartej na Langendorffie bez dodatkowych substancji chemicznych. Skład perfuzatu można zmienić, aby dostosować go do celu eksperymentu, na przykład używając detergentu zawierającego EGTA zamiast enzymów, aby uzyskać bezkomórkowe serce18.

Generalnie, pierwszym krokiem izolacji pojedynczej komórki z wypreparowanej tkanki jest rozdrobnienie tkanki na małe kawałki, a następnie trawienie tkanki łącznej i macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą enzymów. Kardiomiocytów nie można jednak wyizolować taką metodą siekania, ponieważ wzbogacenie w składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym włókna kolagenu i elastyny, sprawia, że mięsień sercowy jest zbyt trudny do zmielenia, a kardiomiocyty są bardzo wrażliwe na niedotlenienie i inne zmiany w mikrośrodowisku. W związku z tym, korzystając z systemu perfuzji wstecznej opartego na Langendorffie1, opracowano metodę trawienia macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą enzymów w celu wyizolowania poszczególnych kardiomiocytów z serca2,3,4.
W modelach mysich, wsteczna perfuzja serca z enzymami oparta na Langendorffie jest również używana do izolacji poszczególnych kardiomiocytów5,6,7,8. Jednak kaniulacja małej i cienkiej aorty myszy i jej montaż na aparacie Langendorffa w celu przeprowadzenia perfuzji wstecznej wymaga dużego stopnia umiejętności, ponieważ średnica Aorta w sercu osoby dorosłej ma około 1,2 mm. Co więcej, przeprowadzenie wielu eksperymentów wymaga czasu, ponieważ aparat Langendorffa powinien zostać oczyszczony przed perfuzją następnego serca.
Jako alternatywa dla wstecznej perfuzji, opracowano nową metodę izolowania kardiomiocytów z serca dorosłej myszy bez aparatu Langendorffa. Ta epokowa metoda opierała się na antegrade perfuzji tętnic wieńcowych9. Ostatnio ulepszyliśmy każdy krok tego protokołu antegrade, taki jak zaciskanie aorty, wprowadzanie igły i kontrola temperatury, a także monitorowaliśmy wszystkie procedury perfuzji za pomocą mikroskopu10. Niniejszym informujemy szczegółowo o udoskonaleniu tej metody perfuzji antegrade w celu skrócenia czasu izolacji i udostępniamy dodatkowe wideo. W tej metodzie perfuzja serca trwa około 7 minut przy 10 ml enzymów, a ten krótki okres trawienia zwiększa żywotność komórek. Jest to prosta metoda izolowania pojedynczych komórek serca w wysokiej jakości bez konieczności dodawania substancji chemicznych, takich jak monoksymus 2,3-butanodionu (BDM)6,11 lub taurine5,8. Wierzymy, że ta metoda obniży próg umiejętności tej techniki i zwiększy użyteczność kardiomiocytów myszy w badaniach podstawowych.

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>przeciwciała anty-mysie IgG Alexa Fluor 488</td>, USA <td>A11001</td><td>Przeciwciało wtórne znakowane fluorescencyjnie. (Rozcieńczenie 1:400 do barwienia immunologicznego)</td></tr><tr><td>Anty-&alfa-aktynina (ACTN)</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A7811</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne (klon EA-53). (Rozcieńczenie 1:400 do barwienia immunologicznego)</td></tr><tr><td>Przeciwprzedsionkowy peptyd natriuretyczny (ANP)</td><td>Merck-Millipore, USA</td><td>AB5490-I</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika (rozcieńczenie 1:2000 dla plam zachodnich)</td></tr><tr><td>Dehydrogenaza antyglicerydowałowa 3-fosforanowa (GAPDH)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, USA</td><td>2118</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne (rozcieńczenie 1:10000 dla plam zachodnich)</td></tr><tr><td>Aktyna przeciw mięśniom gładkim (SMA)</td><td>Dako, Dania</td><td>M0851</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne (klon 1A4) (1:400 do barwienia immunologicznego)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze IgG</td><td>Amersham, GE Healthcare, USA</td><td>NA934</td><td>Przeciwciało drugorzędowe (rozcieńczenie 1:10000 dla plam zachodnich)</td></tr><tr><td>Sól disodowa ATP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Materiał biologiczny do adhezji komórek lub tkanek</td></tr><tr><td>Chemi-Lumi One Super&nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, Japonia</td><td>02230-14</td><td>Odczynnik chemiluminescencyjny stosowany do western bloting.</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 2</td><td>Worthington Biochemicals, USA</td><td>LS004176</td><td>Wybierz aktywność, która na pewno będzie większa niż 300 jednostek/mg.</td></tr><tr><td>Complete Mini</td><td>Roche, Niemcy</td><td>11836153001</td><td>Mieszanina kilku inhibitorów proteazy.</td></tr><tr><td>4'6'diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Nacalai Tesque, Japonia</td><td>11034-56</td><td>Stosowany do nieprzepuszczalnego dla komórek barwienia jądrowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Nacalai Tesque, Japonia</td><td>08458-45</td>, w tym rurka przedłużająca <td>4,5 g / l gluozy</td></tr><tr><td></td><td>Top, Japonia</td><td>X1-50</td><td>Połącz ze strzykawką i igłą do iniekcji w celu perfuzji przedstopniowej.&nbsp;</td></tr><tr><td>EPC-8 wzmacniacz patch-clamp</td><td>HEKA, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>Narishige Scientific Instrument Lab., Japonia</td><td></td><td>średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,9 mm</td></tr><tr><td>Sól litowa GTP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>Poziomy ściągacz mikroelektrod&nbsp;</td><td>Niemcy)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mata grzejna</td><td>Natsume Seisakusho, Japonia</td><td>KN-475-3-40</td><td>Sprzęt do podgrzewania płytki perfuzyjnej.</td></tr><tr><td>Pompa infuzyjna</td><td>TERUMO, Japonia</td><td>TE-311</td><td>Pompa infuzyjna strzykawkowa do perfuzji antegrade.</td></tr><tr><td>Igła Injeciton (rozmiar 27)</td><td>TERUMO, Japonia</td><td>NN-2719S</td><td>Igła do wprowadzania do lewej komory.</td></tr><tr><td>Insulina (z trzustki bydlęcej)</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>I5500</td><td>Rozpuścić w 0,1 M HCl.</td></tr><tr><td>Mini młynek akumulatorowy</td><td>Funakoshi, Japonia</td><td>cG-4A</td><td>Mały młynek do homogenizacji tkanek w probówce o pojemności 1,5 ml.</td></tr><tr><td>4%-Paraformaldehydowy roztwór buforowy fosforanu (4% PFA)</td><td>Nacalai Tesque, Japonia</td><td>09154-85</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G potasu</td><td>Nacalai Tesque, Japonia</td><td>26239-84</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Nacalai Tesque, Japonia</td><td>26807-21</td><td></td></tr><tr><td>10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (pH 7,4) (10X PBS)</td><td>Nacalai Tesque, Japonia</td><td>27575-31</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa płytka do hodowli wielodołkowej</td><td>Falcon, Stany Zjednoczone</td><td>353226</td><td>Użyj pokrywki wielodołkowej płytki hodowlanej jako płytki perfuzyjnej.</td></tr><tr><td>Plastikowa strzykawka (20 ml)</td><td>TERUMO, Japonia</td><td>SS-20ES</td><td>Służy do infuzji CIB-EGTA.</td></tr><tr><td>Plastikowa strzykawka (30 ml)</td><td>TERUMO, Japonia</td><td>SS-30ES</td><td>Służy do infuzji Enzyme-mix</td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta transferowa</td><td>Sarstedt, Niemcy</td><td>86.1171</td><td>Odetnij końcówkę tuż przed zassaniem serca myszy do pipety.</td></tr><tr><td>Membrana z polifluorku winylidenu (PVDF)</td><td>Merck-Millipore, USA</td><td>IPVH00010</td><td>Błona Immobilin-P (błona transferowa do blottingu białek)</td></tr><tr><td>Proteaza</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P5147</td><td>Mieszanina trzech lub więcej proteaz, w tym zewnątrzkomórkowej proteazy seryny.</td></tr><tr><td>4X Roztwór buforowy próbki</td><td>Fuji Film, Japonia</td><td>198-13282</td><td>Zawiera 0,25 M Tris-HCl (pH 6,8), 8 w/v% SDS, 40 w/v% Gliceroland 0,02 w/v% BPB</td></tr><tr><td>SDS żel poliakrylamidowy&nbsp; (15 proc.)</td><td>Fuji Film, Japonia</td><td>193-14991</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Nacalai Tesque, Japonia</td><td>32237-14</td><td></td></tr><tr><td>10X roztwór buforowy Tris-Glycine (10X TG)</td><td>Nacalai Tesque, Japonia</td><td>09422-81</td><td>Zawiera 0,25 M-tris i 1,92 M-glicyny, (pH 8,3)&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T8003</td><td>Trypsyna z bydła typu 1.&nbsp;</td></tr><tr><td>Klamra naczyniowa</td><td>Karl Hammacher GmbH, Niemcy</td><td>HSE 004-35</td><td>Mały prosty zacisk naczyniowy służący do zaciskania aorty.</td></tr><tr><td>Wszystkie inne odczynniki</td><td>Nacalai Tesque, Japonia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

W podstawowych badaniach z wykorzystaniem serca myszy, wyizolowanie żywotnych pojedynczych kardiomiocytów jest kluczowym krokiem technicznym do pokonania. Tradycyjnie, izolowanie kardiomiocytów od królików, świnek morskich lub szczurów przeprowadzano poprzez wsteczną perfuzję serca za pomocą enzymów za pomocą aparatu Langendorffa. Jednak wymagany jest wysoki stopień umiejętności, gdy ta metoda jest używana z małym sercem myszy. Niedawno doniesiono o metodzie perfuzji antegrade, która nie wykorzystuje aparatu Langendorffa, do izolacji kardiomiocytów myszy. Niniejszym przedstawiamy kompletny protokół poprawy perfuzji wstecznej wyciętego serca w celu wyizolowania pojedynczych komórek serca od dorosłych myszy (w wieku 8 - 108 tygodni). Perfuzję antegrade przeprowadza się przez wstrzyknięcie perfuzatu w pobliżu wierzchołka lewej komory wyciętego serca, którego aorta została zaciśnięta, za pomocą pompy infuzyjnej. Wszystkie zabiegi przeprowadzane są na wstępnie ogrzanej macie grzewczej pod mikroskopem, co pozwala na monitorowanie procesów iniekcji i perfuzji. Wyniki sugerują, że miocyty komorowe i przedsionkowe oraz fibroblasty mogą być dobrze izolowane od jednej dorosłej myszy jednocześnie.

Zasada tej metody jest prosta: perfuzat przepływa z lewej komory, zastawka aortalna jest otwierana, a perfuzat biegnie do tętnicy wieńcowej w tym samym kierunku co przepływ krwi, ponieważ aorta jest zamykana przez zaciskanie, co umożliwia głęboką perfuzję mięśnia sercowego w celu strawienia macierzy zewnątrzkomórkowej.
Miocyty komorowe świeżo wyizolowane obecną metodą są pokazane w Rysunek 1A. <silna klasa="xfig">Rysunek 1B pokazuje powiększone obrazy miocytów komorowych i przedsionkowych. Ta procedura izolacji zaowocowała wysoką wydajnością (70% -80%) spokojnych miocytów komorowych w kształcie pręcików od dorosłych myszy (8-10 tygodni), które były dostępne w ciągu około 5 godzin po izolacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), podobny odstęp czasu do tego przy użyciu tradycyjnej procedury opartej na Langendorffie 7. Jednak stosunek świeżo wyizolowanych żywotnych komórek był niższy u starszych myszy w wieku &gt;2 lat (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Całkowita liczba miocytów komorowych uzyskanych na dorosłe serce przy użyciu tego protokołu wynosiła około 3 x 106 komórek, co było podobne do wcześniej podanej wartości7,12. Potencjały czynnościowe zarejestrowane w miocytach komorowych i przedsionkowych (<silna klasa="xfig">Ryc. 1D) były podobne do tych w komórkach uzyskanych metodą opartą na Langendorffie<klasa sup="xref">10. Analiza barwienia immunologicznego potwierdziła, że sarkomeryczna struktura miocytów komorowych była dobrze zorganizowana z wyraźnie widoczną błoną komórkową (<silna klasa="xfig">Figura 2A). Poszczególne kardiomiocyty wyizolowane tą metodą mogą być bezpośrednio wykorzystane w eksperymentach, takich jak analiza elektrofizjologiczna10 lub eksperyment barwienia immunologicznego.</silna></klasa></silna></silna></silna></silna>
W przestrzeniach śródmiąższowych występują fibroblasty serca. Wystarczające trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje izolację tych komórek. Wyizolowane fibroblasty serca namnażają się w warunkach hodowli i mogą być kilkakrotnie pasażowane lub przechowywane w ciekłym azocie w odpowiednim roztworze zbiornika komórkowego. Rysunek 2B pokazuje, że większość hodowanych fibroblastów serca przekształciła się w miofibroblasty podczas subhodowli, co potwierdza zwiększona ekspresja aktyny α mięśni gładkich13,14. Za pomocą obecnej metody można również wyizolować komórki progenitorowe serca i wyhodować je w odpowiedniej pożywce hodowlanej, która zaczyna bić automatycznie10,15.
Homogenizacja mocnego mięśnia sercowego nie jest łatwa, szczególnie dla tkanki serca starszych myszy, która posiada dużą ilość włókien zewnątrzkomórkowych. Po perfuzji antegrade białko z przedsionków i komór może być łatwo homogenizowane w buforze do lizy z lekką siłą w celu ekstrakcji białek. Analiza Western blot wykazała specyficzną ekspresję ANP w przedsionkach, ale nie w komorach u dorosłych (20 tygodni) i starszych (108 tygodni) myszy (<silna klasa="xfig">Ryc. 3).</silna>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig1.jpg"> 
Rysunek 1. Izolowane kardiomiocyty od myszy. A. Miocyty komorowe świeżo izolowane z perfuzją wsteczną, z obrazami uzyskanymi w małym powiększeniu. Po końcowym płukaniu kardiomiocyty zawieszono ponownie w 2 ml roztworu do ponownego zawieszania komórek, z czego 100 μl wrzucono na naczynie hodowlane ze szklanym dnem i oczekiwano na osiadanie komórek. Bar, 100 μm. B. Powiększone obrazy izolowanych miocytów komorowych (górnych) i miocytów przedsionkowych (dolnych). Bar, 100 μm. C. Wyizolowane komórki zawieszono w roztworze do rezawieszania komórek i przechowywano w temperaturze 37°C przez pożądany okres, a liczbę żywych miocytów komorowych policzono w 10-15 polach pod mikroskopem. Zaokrąglone komórki uznano za nieodwracalnie uszkodzone lub martwe16. Zielone, niebieskie i czerwone symbole uzyskano od 3 myszy w wieku 8-10 tygodni, a czarne symbole pochodziły od 106-tygodniowej myszy. Żółty symbol oznacza średnią każdej grupy. D. Reprezentatywne potencjały czynnościowe zarejestrowane z miocytów komorowych (czarnych) i przedsionkowych (czerwonych) 8-10 myszy. Dane uzyskano z komórek po około 3 godzinach od izolacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig2.jpg"> 
Rysunek 2. Barwienie immunologiczne α-aktyniny w izolowanych mysich miocytach komorowych i aktyny α mięśni gładkich w hodowanych fibroblastach serca myszy. A. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa barwienia immunologicznego na α-aktyninę (zielona), barwienie DAPI jąder (niebieska) i obraz DIC miocytów komorowych wyizolowanych z serca myszy z perfuzją wsteczną. Bar, 50 μm. B. Barwienie immunologiczne dla aktyny α mięśni gładkich (zielony), barwienie DAPI jąder (niebieski) i obraz DIC fibroblastów serca wyizolowanych z serca myszy z perfuzją wsteczną. Fibroblasty serca hodowano przez cztery dni. Bar, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig3.jpg"> 
Rysunek 3. Analizy Western blot ANP w przedsionkach i komorach. Analizy Western blot dla markera przedsionkowego przedsionkowego peptydu natriuretycznego (ANP) w przedsionkach (A) i komorach (V) przygotowanych z serca dorosłych (20 tygodni) i starszych (108 tygodni). ANP jest obecny w przedsionkach, ale nieobecny w komorach. Użyj dehydrogenazy 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego (GAPDH) jako białka kontrolnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwory podstawowe do izolowania komórek serca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">10X CIB (500 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zawartość NaCl</td>
			<td>37,99 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kci</td>
			<td>2,01 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>2,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>0,23 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPESY </td>
			<td>29,79 gramów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>Napełnij do 500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">100 mM CaCl2 zapasy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 </td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">400 mM roztworu podstawowego EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (EGTA)</td>
			<td>400 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwór insuliny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulina</td>
			<td>1 jednostka/ml w 0,1 M HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">50X Roztwór podstawowy antybiotyków (20 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicylina</td>
			<td>100 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycyny</td>
			<td>100 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czerwień fenolowa</td>
			<td>1,5 grama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>20 ml i sterylizować z filtrowaniem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">10X roztwór Tyrode (1000 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zawartość NaCl</td>
			<td>81,82 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kcl</td>
			<td>4,03 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>0,47 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPESY </td>
			<td>11,92 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td> powiedział:
			<td>0,8 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>Napełnij do 1000 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Zapas roztworu do barwienia immunologicznego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Akcje DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (interfejs DAPI)</td>
			<td>2 mg/ml w metanolu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwory podstawowe dla Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"> bufor HEPES (100 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zawartość NaCl</td>
			<td>0,88 grama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mM EGTA</td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPESY </td>
			<td>0,24 grama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mln NaOH</td>
			<td>dostosować pH do 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>Napełnij do 500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Koktajl inhibitorów proteazy </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kompletny mini</td>
			<td>1 tabletka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>0,4 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Opis roztworów podstawowych. Roztwory podstawowe przechowywać w temperaturze 4 °C. Koktajl inhibitorów proteazy z podwielokrotnościami do przechowywania w temperaturze -20 °C.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Rozwiązania do izolowania komórek serca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">CIB (200 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-krotny CIB</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór insuliny</td>
			<td>0,01 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glukoza</td>
			<td>0,79 grama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mln NaOH</td>
			<td>pH dostosuj do 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>Napełnij do 200 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwór do mieszania enzymów (30 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza typu 2</td>
			<td>30 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsyna</td>
			<td>1,8 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteazy</td>
			<td>1,8 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM roztwór podstawowy CaCl2</td>
			<td>0,09 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cib</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">CIB-Ca2+-BSA (15 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsa</td>
			<td>30 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM roztwór podstawowy CaCl2</td>
			<td>0,18 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cib</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">CIB-EGTA (150 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mM roztwór podstawowy EGTA</td>
			<td>0,150 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cib</td>
			<td>150 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwór tylody (1000 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X roztwór podstawowy Tyrode</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glukoza </td>
			<td>0,99 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>1,8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mln NaOH</td>
			<td>pH dostosuj do 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>Napełnij do 1000 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwór do ponownego zawieszania komórek (15 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsa</td>
			<td>30 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X roztwór podstawowy antybiotyków</td>
			<td>0,3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozwiązanie Tyrode</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwory do barwienia immunologicznego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwór przylegający do komórek (0,3 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komórka-Tak</td>
			<td>0,01 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,1 M NaHCO3 (pH 8,0)</td>
			<td>0,285 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,1 mln NaOH</td>
			<td>0,005 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Blokujący roztwór permeabilizatyny (10 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surowica bydlęca płodu</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton X-100</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 razy więcej kanałów na sekundę</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>7 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">K+ bogaty roztwór pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparaginian potasu</td>
			<td>70 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kcl</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sól disodowa ATP</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sól litowa GTP</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (EGTA)</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPESY</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koh</td>
			<td>pH dostosuj do 7,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Rozwiązania dla Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor do lizy (1 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor HEPES</td>
			<td>0,86 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet-P40</td> powiedział:
			<td>0,1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koktajl inhibitorów proteazy</td>
			<td>0,04 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Uruchomiony bufor (1000 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TG (0,25 m tris i 1,92 m glicyna)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sds</td>
			<td>1 gramów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>900 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor transferowy (1000 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TG</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metanol</td>
			<td>200 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>700 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor do bibuły (TBST) (1000 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mln NaCl</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M Tris-HCl (pH 7,5)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Animacja 20</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dw</td>
			<td>965 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Opis roztworów roboczych do izolacji komórek serca, barwienia immunologicznego i Western blot. Przygotuj wszystkie roztwory robocze tuż przed eksperymentami.
Rysunek uzupełniający 1. Zarys izolacji komórek. Schemat przepływu izolacji miocytów komorowych i przedsionkowych oraz fibroblastów serca z jednego serca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/SupplementaryFig1R.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...

Opracowaliśmy prostą, niezawierającą Langendorffa metodę izolowania pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki pakowania antegrade. Ta metoda pozwala na izolację komórek serca od młodych do starszych myszy. Perfuzja wsteczna oparta na Langendorffie została uznana za złoty standard izolowania miocytów serca u różnych zwierząt doświadczalnych.Jednak kaniulacja LTA jest technicznie trudna u myszy ze względu na ich niewielkie rozmiary. W przypadku pobrania serca myszy, po potwierdzeniu eutanazji i ogoleniu brzucha, szybko otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce i użyj plastikowej pipety transferowej z końcówką przyciętą w przybliżeniu do rozmiaru serca, aby zassać serce do pipety. Podnieś pipetę, aby zrobić wystarczająco dużo miejsca na włożenie zakrzywionych nożyczek i użyj nożyczek do wycięcia serca od strony grzbietowej, uważając, aby nie uszkodzić przedsionków.Natychmiast umieść serce w 30-mililitrowej szklanej zlewce zawierającej lodowaty CIB-EGTA na około jedną minutę. Kiedy skurcze ustaną, umieść serce w 35-mililitrowym naczyniu hodowlanym zawierającym lodowaty CIB-EGTA i usuń płuco i inną widoczną tkankę. Umieść z grubsza oczyszczone serce na stojaku sercowym wypełnionym schłodzonym wierzchołkiem do dołu CIB-EGTA i umieść stojak pod mikroskopem stereoskopowym.Usuń tłuszcz i tkankę łączną z okolic aorty. Jeśli długość przeciętej aorty jest zbyt długa, przytnij aortę tuż pod tętnicą ramienno-głowową i ustaw serce tak, aby przednia powierzchnia była skierowana do przodu. Użyj pęsety, aby podnieść koniec aorty i użyj małego zacisku naczyniowego, aby zacisnąć aortę w pobliżu przedsionków, delikatnie naciskając na przedsionki.Następnie umieść zaciśnięte serce na płytce perfuzyjnej przednią stroną skierowaną do góry i nawodnij serce kilkoma kroplami CIB-EGTA. W przypadku perfuzji skierowanej do przodu należy załadować 20-mililitrową strzykawkę zawierającą wstępnie podgrzany CIB-EGTA, podłączoną do elastycznej rurki przedłużającej i oznaczoną igłą do wstrzykiwań, na pompę infuzyjną i uruchomić pompę z natężeniem przepływu 0,5 mililitra na minutę. Po napełnieniu igły i pompki umieścić igłę do wstrzykiwań na płytce perfuzyjnej krótszym bokiem ukośnego kształtu z przodu i przesuwać igłę tak, aż dotknie wierzchołka serca.Ostrożnie wprowadzić igłę w pobliżu wierzchołka lewej komory do komory komory, nie skręcając ani nie odłączając igły od płytki, obserwując znak, aby oszacować głębokość wprowadzenia igły. Po zakończeniu wprowadzania igły krew powinna zacząć wypływać z tętnicy wieńcowej. Za pomocą taśmy przymocuj igłę do płytki i zwiększ prędkość pompy do jednego mililitra na minutę.Jeśli perfuzja serca zakończy się powodzeniem, przepływ buforu w naczyniach włosowatych powinien być widoczny tuż pod nasierdziem. Po dwóch do trzech mililitrach perfuzji CIB-EGTA zastąp bufor perfuzyjny mieszanką enzymów. Po perfuzji od jednego do dwóch mililitrów zwiększ prędkość pompy do 1,5 mililitra na minutę.W razie potrzeby użyj pipety, aby usunąć nagromadzony perfuzat zawierający krew wypływający z serca i zatrzymaj perfuzję, gdy całkowita objętość perfundowanego enzymu osiągnie 10 mililitrów. Pod koniec perfuzji przenieś 10 mililitrów mieszanki enzymów ze strzykawki do 60-milimetrowego naczynia hodowlanego na macie grzewczej i dodaj 20 miligramów BSA do naczynia. Delikatnie obracać naczyniem, aby rozpuścić proszek i wyjąć igłę do wstrzykiwań oraz zacisk z serca.Usuń komory i przedsionki z serca i umieść tkanki w mieszance enzymów uzupełnionej BSA. Aby wyizolować miocyty komorowe, użyj dwóch par pęset, aby chwycić nasierdzie i delikatnie pociągnij komory na małe kawałki. Gdy wszystkie fragmenty komór zostaną wytworzone, rozproszyj komórki około 30 razy za pomocą delikatnego pipetowania i przefiltruj niestrawione zanieczyszczenia przez sitko do komórek o siatce 100 mikronów do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad kardiomiocytów we wstępnie podgrzanym CIB uzupełnionym wapniem i BSA i inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić wytrącone kardiomiocyty w odpowiedniej objętości roztworu do ponownego zawieszania komórek w celu ich utrzymania w temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Aby wyizolować miocyty przedsionków, przenieś przedsionki do pojemnika z podgrzanym CIB uzupełnionym wapniem i BSA i rozerwij przedsionki na kawałki, jak pokazano.Użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów ustawionej na 10 mikrolitrów, aby rozbić tkanki przez pipetowanie i zebrać zdysocjowane komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić komórkę przedsionkową w odpowiedniej objętości roztworu do ponownego zawieszania komórek. Na tym obrazie można zaobserwować świeżo wyizolowane miocyty komorowe.Ta procedura izolacji powoduje uzyskanie od 70 do 80% plonu spoczynkowych miocytów komorowych w kształcie pręcików od ośmiu do 10 tygodni myszy w ciągu około pięciu godzin od izolacji. Stosunek świeżo wyizolowanych żywotnych komórek jest niższy u myszy w wieku powyżej dwóch lat. Potencjały czynnościowe rejestrowane w miocytach komorowych i przedsionkowych są podobne do tych mierzonych w komórkach uzyskanych metodą Langendorffa.Analiza barwienia immunologicznego może być wykorzystana do oceny organizacji struktury sarkomerowej miocytów komorowych i przemiany fibroblastów serca w miofibroblasty po subhodowli. Analiza Western blot jest zalecana w celu określenia specyficznej ekspresji interesujących białek w przedsionkach i komorach po przetworzeniu. Po perfuzji z enzymami białka z przedsionków i komór mogą być łatwo homogenizowane w buforze do lizy z lekką siłą do ekstrakcji białek.Ważne jest, aby kontrolować kierunek i głębokość wprowadzania igły. Podczas wprowadzania igły do lewej komory należy uważać, aby nie przebić przegrody komorowej ani nie przebić zastawki. Skład perfuzatu można zmienić w zależności od celu eksperymentu.Na przykład, detergent uzupełniony przez EGTA może być użyty do wykonania bezkomórkowego rusztowania serca.

an-antegrade-perfusion-method-for-cardiomyocyte-isolation-from-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje technikę perfuzji skierowanej do przodu izolowanego serca myszy, podczas której perfuzat jest wstrzykiwany przez lewą komorę, a ostatecznie przenika cały mięsień sercowy. Metoda ta może być wykorzystana do izolowania kardiomiocytów od modeli mysich i generowania pozbawionych komórek serc do dalszych zastosowań.

Model perfuzji antegrade: technika ex vivo perfuzji izolowanego serca myszy

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Zoptymalizowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania mysich perycytów serca do podstawowych badań i badania ich potencjału biologicznego i terapeutycznego.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji, transfekcji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy i szczurów.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Wiele tkanek roślinnych, w tym łyko i drewno sosny taeda (Pinus taeda L.), zawiera wysokie stężenia związków fenolowych i polisacharydów, które utrudniają oczyszczanie RNA. Niniejsza prezentacja omawia techniki zbioru tkanek hodowanych w warunkach polowych oraz izolacji RNA o jakości wystarczającej do analiz mikromacierzy i innych analiz genomowych.

Ulepszona metoda izolacji RNA z sosny taeda (P. taeda L.) i innych gatunków iglaków

Poznaj metodę perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy. Ta technika bez Langendorffa umożliwia wydajne pozyskiwanie komórek sercowych z wysoką żywotnością dla badań kardiologicznych.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Przeglądaj więcej filmów