Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy
19 maja 2021
Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.
Opracowaliśmy prostą, niezawierającą Langendorffa metodę izolowania pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki pakowania antegrade. Ta metoda pozwala na izolację komórek serca od młodych do starszych myszy. Perfuzja wsteczna oparta na Langendorffie została uznana za złoty standard izolowania miocytów serca u różnych zwierząt doświadczalnych.
Jednak kaniulacja LTA jest technicznie trudna u myszy ze względu na ich niewielkie rozmiary. W przypadku pobrania serca myszy, po potwierdzeniu eutanazji i ogoleniu brzucha, szybko otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce i użyj plastikowej pipety transferowej z końcówką przyciętą w przybliżeniu do rozmiaru serca, aby zassać serce do pipety. Podnieś pipetę, aby zrobić wystarczająco dużo miejsca na włożenie zakrzywionych nożyczek i użyj nożyczek do wycięcia serca od strony grzbietowej, uważając, aby nie uszkodzić przedsionków.
Natychmiast umieść serce w 30-mililitrowej szklanej zlewce zawierającej lodowaty CIB-EGTA na około jedną minutę. Kiedy skurcze ustaną, umieść serce w 35-mililitrowym naczyniu hodowlanym zawierającym lodowaty CIB-EGTA i usuń płuco i inną widoczną tkankę. Umieść z grubsza oczyszczone serce na stojaku sercowym wypełnionym schłodzonym wierzchołkiem do dołu CIB-EGTA i umieść stojak pod mikroskopem stereoskopowym.
Usuń tłuszcz i tkankę łączną z okolic aorty. Jeśli długość przeciętej aorty jest zbyt długa, przytnij aortę tuż pod tętnicą ramienno-głowową i ustaw serce tak, aby przednia powierzchnia była skierowana do przodu. Użyj pęsety, aby podnieść koniec aorty i użyj małego zacisku naczyniowego, aby zacisnąć aortę w pobliżu przedsionków, delikatnie naciskając na przedsionki.
Następnie umieść zaciśnięte serce na płytce perfuzyjnej przednią stroną skierowaną do góry i nawodnij serce kilkoma kroplami CIB-EGTA. W przypadku perfuzji skierowanej do przodu należy załadować 20-mililitrową strzykawkę zawierającą wstępnie podgrzany CIB-EGTA, podłączoną do elastycznej rurki przedłużającej i oznaczoną igłą do wstrzykiwań, na pompę infuzyjną i uruchomić pompę z natężeniem przepływu 0,5 mililitra na minutę. Po napełnieniu igły i pompki umieścić igłę do wstrzykiwań na płytce perfuzyjnej krótszym bokiem ukośnego kształtu z przodu i przesuwać igłę tak, aż dotknie wierzchołka serca.
Ostrożnie wprowadzić igłę w pobliżu wierzchołka lewej komory do komory komory, nie skręcając ani nie odłączając igły od płytki, obserwując znak, aby oszacować głębokość wprowadzenia igły. Po zakończeniu wprowadzania igły krew powinna zacząć wypływać z tętnicy wieńcowej. Za pomocą taśmy przymocuj igłę do płytki i zwiększ prędkość pompy do jednego mililitra na minutę.
Jeśli perfuzja serca zakończy się powodzeniem, przepływ buforu w naczyniach włosowatych powinien być widoczny tuż pod nasierdziem. Po dwóch do trzech mililitrach perfuzji CIB-EGTA zastąp bufor perfuzyjny mieszanką enzymów. Po perfuzji od jednego do dwóch mililitrów zwiększ prędkość pompy do 1,5 mililitra na minutę.
W razie potrzeby użyj pipety, aby usunąć nagromadzony perfuzat zawierający krew wypływający z serca i zatrzymaj perfuzję, gdy całkowita objętość perfundowanego enzymu osiągnie 10 mililitrów. Pod koniec perfuzji przenieś 10 mililitrów mieszanki enzymów ze strzykawki do 60-milimetrowego naczynia hodowlanego na macie grzewczej i dodaj 20 miligramów BSA do naczynia. Delikatnie obracać naczyniem, aby rozpuścić proszek i wyjąć igłę do wstrzykiwań oraz zacisk z serca.
Usuń komory i przedsionki z serca i umieść tkanki w mieszance enzymów uzupełnionej BSA. Aby wyizolować miocyty komorowe, użyj dwóch par pęset, aby chwycić nasierdzie i delikatnie pociągnij komory na małe kawałki. Gdy wszystkie fragmenty komór zostaną wytworzone, rozproszyj komórki około 30 razy za pomocą delikatnego pipetowania i przefiltruj niestrawione zanieczyszczenia przez sitko do komórek o siatce 100 mikronów do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.
Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad kardiomiocytów we wstępnie podgrzanym CIB uzupełnionym wapniem i BSA i inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić wytrącone kardiomiocyty w odpowiedniej objętości roztworu do ponownego zawieszania komórek w celu ich utrzymania w temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Aby wyizolować miocyty przedsionków, przenieś przedsionki do pojemnika z podgrzanym CIB uzupełnionym wapniem i BSA i rozerwij przedsionki na kawałki, jak pokazano.
Użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów ustawionej na 10 mikrolitrów, aby rozbić tkanki przez pipetowanie i zebrać zdysocjowane komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić komórkę przedsionkową w odpowiedniej objętości roztworu do ponownego zawieszania komórek. Na tym obrazie można zaobserwować świeżo wyizolowane miocyty komorowe.
Ta procedura izolacji powoduje uzyskanie od 70 do 80% plonu spoczynkowych miocytów komorowych w kształcie pręcików od ośmiu do 10 tygodni myszy w ciągu około pięciu godzin od izolacji. Stosunek świeżo wyizolowanych żywotnych komórek jest niższy u myszy w wieku powyżej dwóch lat. Potencjały czynnościowe rejestrowane w miocytach komorowych i przedsionkowych są podobne do tych mierzonych w komórkach uzyskanych metodą Langendorffa.
Analiza barwienia immunologicznego może być wykorzystana do oceny organizacji struktury sarkomerowej miocytów komorowych i przemiany fibroblastów serca w miofibroblasty po subhodowli. Analiza Western blot jest zalecana w celu określenia specyficznej ekspresji interesujących białek w przedsionkach i komorach po przetworzeniu. Po perfuzji z enzymami białka z przedsionków i komór mogą być łatwo homogenizowane w buforze do lizy z lekką siłą do ekstrakcji białek.
Ważne jest, aby kontrolować kierunek i głębokość wprowadzania igły. Podczas wprowadzania igły do lewej komory należy uważać, aby nie przebić przegrody komorowej ani nie przebić zastawki. Skład perfuzatu można zmienić w zależności od celu eksperymentu.
Na przykład, detergent uzupełniony przez EGTA może być użyty do wykonania bezkomórkowego rusztowania serca.
Przegląd
Niniejsze badanie podejmuje problem izolacji pojedynczych komórek serca myszy, co ma kluczowe znaczenie dla badań kardiologicznych. Autorzy opracowali metodę bez użycia aparatu Langendorffa, wykorzystując perfuzję antegradną do efektywnej izolacji komórek od myszy w różnym wieku, co znacznie ułatwiło dostęp do konkretnych typów komórek serca.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Izolacja komórek serca
- Biologia serca myszy
- Techniki hodowli komórkowej
Wstęp
- Tradycyjne metody Langendorffa w przypadku myszy napotykają trudności techniczne wynikające z ich rozmiaru.
- Izolacja komórek jest kluczowa dla zrozumienia funkcji i patologii serca.
- Opracowanie dostępnych metod przynosi korzyści szerokiemu spektrum badań kardiologicznych.
Zastosowane metody
- Technika perfuzji antegradnej
- System modelu mysiego
- Zastosowanie specyficznych buforów i enzymów do dysocjacji komórek
Główne wyniki
- Efektywna izolacja miocytów komorowych i przedsionkowych z wysoką żywotnością komórek (wydajność 70-80%).
- Potencjały czynnościowe komórek podobne do tych uzyskanych metodą Langendorffa.
- Szczegółowe kroki proceduralne dla optymalnej ekstrakcji komórek.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia uproszczoną i skuteczną metodę izolacji komórek serca z serca myszy.
- Zastosowane podejście ma istotne znaczenie dla rozwoju metodologii badań kardiologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna izolacja żywych kardiomiocytów z serc myszy jest kluczowym elementem umożliwiającym wczesne odkrycia oraz badania mechanistyczne w badaniach nad lekami sercowo-naczyniowymi. Metoda perfuzji antegradnej eliminuje bariery techniczne związane z perfuzją retrogradną opartą na modelu Langendorffa, rozszerzając dostęp do wysokiej jakości komórek serca w szerszym zakresie wieku myszy. Możliwość ta wspiera rzetelną walidację celów oraz testy funkcjonalne, co bezpośrednio wpływa na pewność prognostyczną w procesach badawczo-rozwojowych w dziedzinie kardiologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez specyficznych dla serca z wykorzystaniem świeżo wyizolowanych miocytów komór komór i przedsionków.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez dostarczanie komórek o wysokiej żywotności do testów funkcjonalnych i molekularnych.
- Ułatwia badania mechanistyczne nad typami komórek serca, zwiększając pewność predykcyjną w wyborze celu terapeutycznego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną izolację kardiomiocytów i fibroblastów do dalszego opracowywania testów.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych wydajności komórkowych odpowiednich do analiz elektrofizjologicznych i ekspresji białek.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów komórek serca do screeningu związków i odczytów funkcjonalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami kardiologicznymi istotnymi dla przebiegu chorób, umożliwiając izolację komórek z myszy od młodocianych po starsze.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki stałej jakości i żywotności komórek.
- Wspiera translacyjne badania biomarkerów dzięki kompatybilności z analizami immunobarwienia i Western blot.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda perfuzji antegradnej integruje się z kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, dostarczając wiarygodnego źródła pierwotnych komórek serca do testowania hipotez, opracowywania testów analitycznych oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia rzetelne testowanie hipotez zerowych oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych z wykorzystaniem świeżo wyizolowanych kardiomiocytów.
- Przesiewanie: Pozwala na uzyskanie powtarzalnych, ilościowych preparatów komórkowych do standaryzacji testów i oceny związków chemicznych.
- Analityka: Wspiera ilościowe odczyty, takie jak pomiary potencjału czynnościowego i profilowanie ekspresji białek.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do modeli chorobowych i walidację biomarkerów dzięki wysokiej jakości izolacji komórek.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia skalowalny, zstandaryzowany protokół możliwy do adaptacji w różnych zespołach badawczych i systemach modelowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów kardiologicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów izolacji komórek serca.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach w portfelach kardio-naczyniowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów odkrywczych w kardiologii.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie mikrochirurgicznej dysekcji i perfuzji pod mikroskopem stereoskopowym.
- Wymaga dostępu do pomp infuzyjnych, mat grzewczych oraz infrastruktury analitycznej do dalszych badań.
- Wymaga standaryzacji parametrów perfuzji i protokołów obchodzenia się z komórkami pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zastosowania u myszy w różnym wieku, jednak wydajność i żywotność komórek mogą być niższe u starszych zwierząt.
- Dla zachowania powtarzalności niezbędna jest staranna kontrola głębokości wprowadzenia igły oraz składu perfuzatu.
