Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia wymuszonego rozpraszania Ramana to technologia obrazowania chemicznego, która umożliwia szybkie i ilościowe wykrywanie lipidów oraz umożliwia śledzenie lipidów u żywych zwierząt w sposób bezznacznikowy. Najważniejszą zaletą mikroskopii SRS w porównaniu z tradycyjnymi technikami wykrywania lipidów jest to, że nie zawiera znaczników, a zatem nie jest tak odporna na wybielanie fotograficzne, jak inne substancje fluorescencyjne i barwiące. Zastosowanie mikroskopii SRS w połączeniu z narzędziami genetycznymi i biochemicznymi dostępnymi dla organizmów modelowych, w szczególności Caenorhabditis elegans, zapewnia potężne ramy do badania prawidłowych regulatorów biologii lipidów i metabolizmu.

Aby wprowadzić wiązki laserowe do mikroskopu SRS, najpierw ustaw peryskop tak, aby podniósł wiązkę z wyjścia pikosekundowego źródła światła do portu wejściowego lasera na podczerwień w skanerze mikroskopu i otwórz oprogramowanie sterujące laserem, aby uruchomić lasery. Zmniejsz moc lasera pompy do 50 miliwatów i ustaw sygnał pompy na 750 nanometrów. Użyj ekspandera wiązki, aby dostosować średnicę wiązki tak, aby pasowała do tylnego otworu obiektywów mikroskopu.

Użyj dwóch luster przekaźnikowych, M1 i M2, aby skierować wiązkę laserową do peryskopu i ustawić skinienia peryskopu w środku zakresu strojenia. Wybierz początkową pozycję i kąt każdego zwierciadła tak, aby wiązka laserowa w przybliżeniu uderzała w środek lustra, aby wystrzelić wiązkę do mikroskopu i użyj pustego portu na wieżyczce obiektywu mikroskopu, aby wykonać wyrównanie kursu. Umieść sondę miernika mocy w porcie obiektywu, aby zmierzyć moc przepuszczanego światła i ustaw skaner mikroskopu na najwyższe powiększenie, 50X.

Zmierz moc przesyłanego światła za pomocą skupionej plamki wiązki laserowej i zoptymalizuj pokrętła luster M1 i M2 iteracyjnie, aby osiągnąć najwyższą transmitowaną moc lasera. Użyj narzędzia do wyrównywania, aby wykonać dokładne wyrównanie przepuszczanego światła, aby upewnić się, że światło przechodzi przez środek obiektywu i umieść nasadkę wyrównującą cel fluorescencji na pustym gnieździe obiektywu. Wyreguluj pokrętła pierwszego lusterka kierowniczego, M1, aby wyśrodkować plamkę wiązki laserowej i wprowadź rurkę przedłużającą z nasadką wyrównującą na drugim końcu do pustego gniazda obiektywu w celu monitorowania plamki wiązki laserowej.

Następnie dostrój pokrętła drugiego lusterka kierowniczego, M2, aby ponownie wyśrodkować punkt wiązki laserowej na drugim końcu rury przedłużającej. Aby skonfigurować moduł detekcji SRS, umieść kostkę rozdzielacza wiązki za kondensatorem, aby skierować transmitowany laser do modułu fotodiody. Aby skonfigurować połączenie elektroniczne, użyj wbudowanego modulatora elektrooptycznego o częstotliwości 20 megaherców wewnątrz pikosekundowego lasera dostrajanego do modulowania intensywności wiązki Stokesa i podawania sygnału wyjściowego fotodiody do wzmacniacza blokującego w celu demodulacji stymulowanej straty Ramana.

Następnie wprowadź wyjście wzmacniacza lock-in do skrzynki analogowej mikroskopu, aby przekonwertować elektryczny sygnał analogowy na sygnał cyfrowy. Aby zoptymalizować warunki obrazowania, dodaj pięć mikrolitrów kwasu oleinowego do komory szkiełka mikroskopowego mini i przykryj próbkę szkiełkiem nakrywkowym. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i użyj krawędzi podkładki, aby zlokalizować kroplę i ustawić na niej ostrość.

Dostosuj skraplacz do oświetlenia Kohler i użyj karty czujnika podczerwieni oraz przeglądarki podczerwieni, aby sprawdzić, czy ścieżka wiązki pompy jest nadal prawidłowa. Upewnij się, że stopień opóźnienia jest ustawiony na zero femtosekund i ustaw długość fali wiązki pompy na 795.8 nanometrów. Ustaw moc belki pompy na 50 miliwatów i ustaw wiązkę Stoke na 100 miliwatów.

Otwórz migawkę zarówno dla wiązek, jak i dla głównej migawki lasera. Zeskanuj próbkę i sprawdź obraz na ekranie komputera. Zmień tryb wyświetlania na wysoki, niski i dostosuj zakres, aby zobaczyć około 50% nasycenia.

Sprawdź, czy nasycenie jest wyśrodkowane na obrazie, ostrożnie regulując lusterka kierownicze wewnątrz pikosekundowego systemu laserowego dostrajanego w celu zoptymalizowanego nakładania się pompy i Stokesa, aby zmaksymalizować intensywność obrazu i wyśrodkować szczytową intensywność w razie potrzeby. Przed każdą sesją obrazowania dodaj 100 mikrolitrów ciepłej 2% agarozy do czystego szkiełka umieszczonego między szkiełkami nośnymi z dwiema warstwami taśmy laboratoryjnej i szybko umieść drugi szkiełko na pierwszym szkiełku. Delikatnie dociśnij, aby utworzyć cienką, równą podkładkę agarozową i pozwól agarozie ostygnąć.

Aby zamontować robaki do obrazowania, umieść od czterech do pięciu mikrolitrów kropli środka znieczulającego na 10 do 20 robaków na szkiełku nakrywkowym i użyj mikroskopu preparacyjnego, aby wybrać robaki do obrazowania, umieszczając robaki na kropli znieczulenia podczas ich zbierania. Po zebraniu wszystkich robaków przykryj robaki szklanym szkiełkiem z podkładką agarozową. W celu obrazowania zamontuj próbkę ślimaka z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę soczewki obiektywu i skieruj źródło światła w jasnym polu na okular, aby zlokalizować ślimaki.

Ustaw ostrość ślimaków i odpowiednio dostosuj położenie skraplacza. Dostosuj moc lasera, ustawiając moc lasera pompy na 200 miliwatów, a moc podczerwieni na 400 miliwatów. Ustaw wzmacniacz lock-in do demodulacji sygnału SRS robaka.

Rozpocznij skanowanie pierwszego robaka z dużą szybkością skanowania, dostosowując precyzyjną ostrość, aby znaleźć obszar zainteresowania. Gdy sygnał zostanie zoptymalizowany, przełącz się na wolniejszą szybkość skanowania i wyższą rozdzielczość pikseli, aby uzyskać obraz SRS i zapisać obraz w formacie umożliwiającym wysoką rozdzielczość. Po zobrazowaniu wszystkich próbek przełącz źródło lasera w tryb czuwania i wyłącz wszystkie powiązane urządzenia.

Aby przeanalizować obrazy, otwórz pliki w ImageJ i wybierz opcję Analizuj i ustaw pomiary, aby wybrać właściwości do analizy. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby obrysować obszar jelita robaka, który ma zostać określony ilościowo, a następnie ponownie kliknij przycisk Analizuj i zmierz. Pomiary pojawią się w oknie wyników.

Po opisaniu wszystkich robaków skopiuj i wklej pomiary dla każdego z robaków w danym genotypie do arkusza kalkulacyjnego. Jako wartość pomiaru tła należy wybrać obszar w pobliżu robaka, który nie ma żadnego sygnału SRS i odjąć średnią wartość szarości tła od pomiaru dla każdego pojedynczego robaka, aby obliczyć średnią i odchylenie standardowe średnich wartości szarości odjętych tła od wszystkich robaków w danym genotypie lub grupie testowej. Wartości te można następnie znormalizować do średniej z grupy kontrolnej.

W tej reprezentatywnej analizie poziomy lipidów jelitowych u zsynchronizowanych z wiekiem robaków typu dzikiego i mutantów daf-2 pozbawionych receptora insuliny określono ilościowo w wieku dorosłym. Zgodnie z oczekiwaniami u robaków typu dzikiego obserwuje się spadek poziomu lipidów, rozpoczynający się pierwszego dnia i trwający do dziewiątego dnia dorosłości. Poziomy lipidów w mutantach daf-2 rosną jednak do piątego dnia życia, w którym to momencie pozostają stałe i są około 2,5 do trzech razy wyższe niż w przypadku typu dzikiego.

Inaktywacja Daf-16 hamuje wzrost poziomu lipidów mutantów daf-2. Ekspresja izoformy daf-16a lub daf-16b w podwójnych mutantach daf-2, daf-16 nie przywraca poziomu lipidów. Ekspresja izoformy daf-16d/f/h jest jednak wystarczająca do przywrócenia poziomów lipidów w podwójnych mutantach daf-2, daf-16 do poziomów obserwowanych w pojedynczych mutantach daf-2.

Wyniki te wskazują, że izoforma daf-16d/f/h specyficznie moduluje metabolizm lipidów u zmutowanych robaków daf-2. Ważne jest, aby używać tej samej mocy lasera dla pompy i wiązek Stokesa podczas całej sesji obrazowania oraz uwzględnić grupę kontrolną w każdym sześcio- i czterokrotnym spójnym oznaczaniu ilościowym. Oprócz ilościowego określania magazynowania lipidów, mikroskopia SRS może być połączona z bioortogonalnymi znacznikami, takimi jak deuter, i wdrożona w celu wizualizacji dynamiki włączania, syntezy i degradacji lipidów.

Mikroskopia SRS umożliwia multipleksowanie i może być stosowana do obrazowania wielu biomolekuł w różnych przedziałach subkomórkowych. Tak zwana hiperspektralna mikroskopia SRS ma wielką przyszłość w badaniu dynamiki metabolicznej.