Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe
22 września 2020
Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.
Wszystkie białka błonowe są ważnymi celami w odkrywaniu leków. Produkcja białek błonowych na największą skalę pozostaje wąskim gardłem w prowadzeniu badań biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych białek błonowych. Metoda ta może być stosowana do efektywnej syntezy białek błonowych in vitro oraz do przygotowania oczyszczonych proteoliposomów w krótkim czasie z wysokim wskaźnikiem sukcesu.
Po dodaniu odpowiednich odczynników, w tym bezkomórkowego plazmidu ekspresyjnego w celu wytworzenia mieszaniny reakcji transkrypcji, wymieszaj zawartość probówki przez delikatne odwrócenie lub stuknięcie i wykonaj szybkie wirowanie w mikrowirówce. Po odwirowaniu inkubować mieszaninę reakcji transkrypcji przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie mieszać i wirować w dół. Aby przygotować bufor translacyjny, należy rozcieńczyć roztwór podstawowy świeżą ultraczystą wodą.
W przypadku translacji na małą skalę należy użyć kubków dializacyjnych o pojemności 100 mikrolitrów umytych ultraczystą wodą, aby usunąć glicerol z membrany dializy. Dodaj jeden mililitr ultraczystej wody do nowej 1,5-mililitrowej probówki i włóż do niej mały kubek do dializy. Następnie dodaj 500 mikrolitrów ultraczystej wody do filiżanki na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Aby przygotować liposomy, przenieś roztwór lipidów zawierający 50 miligramów lipidów do kolby odparowującej. Umieścić kolbę w wyparce obrotowej w celu odparowania rozpuszczalnika. Gdy na powierzchni dna kolby wytworzy się cienka, równomiernie rozłożona warstwa lipidu, należy przenieść kolbę do eksykatora próżniowego pod podciśnieniem przez noc w celu całkowitego usunięcia rozpuszczalnika.
Następnego ranka wyjąć kolby z eksykatora i sprawdzić cienką warstwę lipidów. Dodać jeden mililitr buforu translacyjnego do kolby i obrócić kolbę, aby rozprowadzić bufor na cienkiej warstwie lipidowej. Po pięciu minutach należy poddać sonikę kolbie, od czasu do czasu zmieniając kąt, aby umożliwić roztworowi kontakt z całą powierzchnią filmu lipidowego.
Zatrzymaj sonikację, gdy lipid zostanie całkowicie usunięty z kolby, a zawiesina liposomowa stanie się jednolita. Następnie przenieś zawiesinę liposomów do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Przed wykonaniem translacji białek in vitro należy umieścić tubkę ekstraktu z kiełków pszenicy w temperaturze minus 80 stopni na wodzie o temperaturze pokojowej przez kilka minut, aby szybko rozmrozić materiał.
Po rozmrożeniu ekstraktu natychmiast wymieszaj zawartość tubki przez delikatne odwrócenie. Następnie odkręć w dół i umieść rurkę na lodzie. Dodaj ekstrakt z kiełków pszenicy, mRNA i liposomy, aby wytworzyć mieszaninę reakcji translacji.
Wymieszaj zawartość probówki przez delikatne odwrócenie lub stuknięcie i wykonaj szybkie wirowanie w mikrowirówce. Aby przeprowadzić translację białek in vitro na małą skalę, usuń wodę z kubka i rurki do dializy na małą skalę i dodaj jeden mililitr buforu translacyjnego do probówki i 300 mikrolitrów do kubka. Weź 60 mikrolitrów mieszaniny reakcji translacji.
Włożyć końcówkę pipety do buforu translacyjnego w kubku dializacyjnym. Następnie wstrzykuj mieszaninę powoli i delikatnie. Mieszanina reakcyjna o większej gęstości spontanicznie opada na dno kubka i tworzy warstwę.
Przykryj kubek pokrywką, aby zapobiec parowaniu. Aby przeprowadzić translację na dużą skalę, dodaj 22 mililitry buforu translacyjnego do 25-mililitrowej probówki i umieść w niej dwumililitrowy kubek do dializy. Dodać dwa mililitry buforu translacyjnego do kubka dializacyjnego.
Weź 500 mikrolitrów mieszaniny reakcji translacji, powoli i delikatnie wstrzyknij mieszaninę do buforu translacyjnego w kubku. Inkubować reakcje przez 24 godziny w temperaturze 15 stopni Celsjusza. Następnego dnia dokładnie wymieszaj reakcję w kubku dializacyjnym przez pipetowanie i przenieś surowe zawiesiny proteoliposomów do nowych probówek.
Aby oczyścić proteoliposomy, należy osadzać proteoliposom w surowych zawiesinach przez centrowanie. Następnie przemyj proteoliposom przez trzykrotne ponowne zawieszenie w odpowiedniej objętości lodowatego buforu PBS. Po umyciu dokładnie ponownie zawiesić granulki proteoliposomów w małej objętości PBS i zmierzyć objętość zawiesiny za pomocą mikropipety.
Następnie dodaj PBS, aby dostosować głośność zawieszenia. Przenieś każdą zawiesinę do nowej mikrotuby. Aby skonfigurować analizę strony SDS, dodaj 70 mikrolitrów wody i 40 mikrolitrów trzykrotnie stężonego buforu próbki strony SDS do 10 mikrolitrów każdej zawiesiny proteoliposomowej.
Ustaw żel stronicowy SDS o gradiencie od 5 do 20% w komorze do elektroforezy. Załaduj żel dwoma mikrolitrami markera wielkości białka, trzema, sześcioma i 12 mikrolitrami każdej próbki proteoliposomu oraz 10 mikrolitrami wzorców albuminy surowicy bydlęcej. Po załadowaniu próbek uruchom elektroforezę, a następnie zabarwij żel barwnikiem Coomassie Brilliant Blue.
Na koniec odbarwij żel w gorącej wodzie, delikatnie potrząsając i zeskanuj obraz żelu. Korzystając z tego protokołu, jak pokazano, różne białka błonowe z trzema lub więcej helisami transbłonowymi można łatwo wytworzyć jako proteoliposomy w krótkim czasie. W tej metodzie dializy dwuwarstwowej ciągłe dostarczanie substratów i usuwanie produktu ubocznego może być skutecznie prowadzone zarówno na górze, jak i na dole mieszaniny reakcyjnej przez długi czas, co prowadzi do doskonałej skuteczności translacji.
Metoda dializy dwuwarstwowej powoduje od 4 do 10-krotnego wzrostu wydajności w porównaniu z zastosowaniem samej metody dializy dwuwarstwowej lub dializy. Zebranie zsyntetyzowanych proteoliposomów przez centryfikację i ich częściowe oczyszczenie buforem płuczącym znacznie skraca proces oczyszczania białek błonowych. Ten bezkomórkowy system jest łatwy w obsłudze i wysoce skalowalny.
Może być również używany do produkcji białek pamięci, które są trudne do ekspresji innymi metodami. Metoda ta jest niezwykle pomocna w badaniach i eksperymentach, które wykorzystują lub celują w białka błonowe, takie jak białko błonowe, produkcja przeciwciał, SPR, Elisa i AlphaScreen.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wydajną metodę bezkomórkową produkcji wysokiej jakości proteoliposomów z wykorzystaniem bezkomórkowego systemu ekspresyjnego pszenicy oraz liposomów. Metoda ta ułatwia analizę funkcjonalną białek błonowych oraz wspiera screening celów terapeutycznych i opracowywanie przeciwciał.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biochemia
- Odkrywanie leków
Wstęp
- Białka błonowe stanowią kluczowe cele w procesie odkrywania leków.
- Produkcja białek błonowych na dużą skalę jest istotnym wąskim gardłem.
- Metoda ta pozwala na syntezę białek błonowych in vitro.
- Umożliwia ona efektywne przygotowanie oczyszczonych proteoliposomów.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody syntezy białek błonowych.
- Ułatwienie analizy funkcji białek błonowych.
- Wsparcie opracowywania nowych celów terapeutycznych i przeciwciał.
Zastosowane metody
- Do wytworzenia mieszaniny reakcyjnej do transkrypcji dodaje się plazmid do ekspresji bezkomórkowej.
- Mieszaninę delikatnie odwraca się lub opukuje, a następnie wiruje w mikrowirówce.
- Inkubację mieszaniny reakcyjnej do transkrypcji przeprowadza się w temperaturze 37 °C przez sześć godzin.
- Bufor do translacji przygotowuje się poprzez rozcieńczenie roztworu stokowego wodą ultrapure.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na otrzymanie wysokiej jakości proteoliposomów.
- Wykazuje ona wysoką skuteczność w syntezie białek błonowych.
- Umożliwia przeprowadzenie analizy funkcjonalnej białek błonowych.
- Wspiera badanie celów terapeutycznych leków oraz opracowywanie przeciwciał.
Wnioski
- Ta metoda bezkomórkowa jest wydajna w produkcji białek błonowych.
- Rozwiązuje ona problem wąskiego gardła w badaniach nad białkami błonowymi.
- Protokół ten można dostosować do różnych zastosowań związanych z białkami błonowymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna produkcja funkcjonalnych białek błonowych pozostaje krytycznym wąskim gardłem w początkowych etapach procesu odkrywania leków i opracowywania przeciwciał. Bezkomórkowy system dializy dwuwarstwowej umożliwia szybką, skalowalną syntezę wysokiej jakości proteoliposomów, co bezpośrednio wspiera procesy walidacji celów i przepływy pracy podczas screeningu. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną i przyspiesza rozwój portfolio celów terapeutycznych w obrębie białek błonowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rzetelną analizę funkcjonalną białek błonowych będących celami terapeutycznymi.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez otrzymywanie białek o prawidłowej konformacji i aktywności.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie wyboru celów oraz podejmowania decyzji o selekcji projektów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane proteoliposomy do dalszych testów funkcjonalnych i platform przesiewowych.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację testów dla białek błonowych.
- Umożliwia skalowalną produkcję na potrzeby wysokoprzepustowych badań przesiewowych i generowania przeciwciał.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej w przypadku terapeutyków opartych na białkach błonowych.
- Wspiera translacyjne strategie biomarkerowe poprzez umożliwienie analizy funkcjonalnej celów istotnych klinicznie.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzeń w późnych fazach badań wynikających z niewystarczającej jakości lub wydajności białka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda produkcji proteoliposomów bezkomórkowych integruje etapy walidacji celu, opracowywania testów oraz identyfikacji związków wiodących w procesie odkrywania leków celujących w białka błonowe.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków funkcji białek błonowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki z proteoliposomów do niezawodnej oceny związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe analizy SDS-PAGE i testy funkcjonalne w celu porównania wydajności i aktywności białek.
- Badania translacyjne: Stanowi pomost od walidacji in vitro do rozwoju modeli przedklinicznych dla celów błonowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, adaptacyjną platformę dla różnych celów białkowych błon w ramach wielu programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad białkami błonowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i usprawnia produkcję białek błonowych przy wysokiej powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz poprawia efektywność kapitałową w portfelach wczesnej fazy.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów terapeutycznych opartych na białkach błonowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie ekspresji bezkomórkowej oraz pracy z białkami błonowymi.
- Wymaga dostępu do systemów ekstraktu z zarodków pszenicy, narzędzi do przygotowywania liposomów oraz infrastruktury analitycznej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalnej jakości i wydajności proteoliposomów.
- Metoda jest dostosowalna do różnych klas białek błonowych, w tym GPCR i kanałów jonowych.
- Skalowalność i przepustowość mogą być ograniczone przez dostępność odczynników oraz możliwości oczyszczania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
In Vitro Transcription
1:12
Translation Material Preparation
1:54
Liposome Preparation
3:07
In Vitro Translation
5:14
Proteoliposome Purification
5:56
Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and Coomassie Brilliant Blue (CBB) Staining
6:57
Results: Representative Proteoliposome Production by Bilayer-Dialysis
8:01
Conclusion
