Name: Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj bezkomórkową metodę produkcji proteoliposomów do analizy funkcjonalnej białek błonowych. Protokół wykorzystuje pszeniczny system bezkomórkowy i liposomy, umożliwiając skuteczną syntezę białek oraz wspierając odkrywanie celów lekowych i rozwój przeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Projekt Platformy do Wspierania Odkrywania Leków i Badań w Naukach Przyrodniczych (Podstawa Wspierania Innowacyjnych Odkryć Leków i Badań Nauk Przyrodniczych (BINDS)) od AMED pod numerem grantu JP20am0101077. Prace te były również częściowo wspierane przez JSPS KAKENHI Grant Grant Number 20K05709.

1. Przygotowanie plazmidu ekspresji pEU
UWAGA: plazmid ekspresji pEU powinien zawierać kodon start, otwartą ramkę odczytu białka błony docelowej oraz kodon stop we fragmencie (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). W razie potrzeby dodaj sekwencje znaczników wykrywania/oczyszczania w odpowiednim miejscu. Do podklonowania ma zastosowanie zarówno trawienie enzymem restrykcyjnym, jak i klonowanie bezszwowe. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący bezproblemową metodę klonowania.
<ol>
	<li>Przygotuj wstaw fragment DNA.
	<ol>
		<li>Amplifikuj interesujący Cię gen metodą PCR przy użyciu matrycy cDNA, startera 1 i startera 2. Podkład 1 i starter 2 zawierają odpowiednio 15 punktów bazowych w celu bezproblemowego klonowania (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Nie należy dołączać sekwencji, które mają zostać przetworzone i usunięte z dojrzałego białka w komórkach (np. sekwencji sygnałowej). Przetwarzanie zsyntetyzowanego białka nie odbywa się w systemie bezkomórkowym pszenicy. Nie dodawaj sekwencji Kozaka. Wektor pEU-E01-MCS posiada wzmacniacz translacji E01.</li>
		<li>Dodaj 1/25 objętości enzymu restrykcyjnego DpnI do produktu PCR, aby usunąć matrycowe DNA plazmidu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Użyj zestawu do oczyszczania PCR, aby oczyścić produkt PCR i dostosować stężenie do 20–50 ng/μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Linearyzuj wektor pEU-E01-MCS.
	<ol>
		<li>Przeprowadź odwrotną reakcję PCR przy użyciu pEU-E01-MCS, startera 3 i startera 4.</li>
		<li>Dodać 1/25 objętości enzymu restrykcyjnego DpnI do produktu odwrotnego PCR. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Użyj zestawu do oczyszczania PCR, aby oczyścić produkt PCR zgodnie z zaleceniami producenta. Dostosuj stężenie do 20–50 ng/μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszaj 2 μl wstawienia fragmentu DNA, 2 μl wektora linearyzowanego i 4 μl 2x bezszwowej mieszaniny enzymów klonujących.</li>
	<li>Przekształć szczep Escherichia coli JM109 za pomocą produktu do bezproblemowego klonowania. Za pomocą rozsiewacza rozprowadzić zawiesinę bakteryjną na płytce agarowej LB-ampicyliny. 
	UWAGA: wektor pEU posiada marker oporności na ampicylinę.</li>
	<li>Potwierdź sekwencję plazmidu ekspresyjnego skonstruowanego przy użyciu startera 5 i startera 6 ze strony 5' i 3' MCS odpowiednio w plazmidzie pEU.</li>
	<li>Amplifikuj i oczyszczaj plazmidy ekspresyjne.
	<ol>
		<li>Hodować przekształcony plazmidowo szczep E. coli JM109 w 150 ml pożywki LB-ampicyliny w temperaturze 37 °C i 125 uderzeń na minutę, wstrząsając przez noc.</li>
		<li>Wyodrębnij i oczyść plazmidy za pomocą dostępnego w handlu zestawu midi do przygotowania plazmidu. Rozpuść plazmidy w 500 μl buforu TE. 
		UWAGA: Nie używaj mini zestawu przygotowawczego do ekstrakcji plazmidu. Nie zapewnia wystarczającej jakości i ilości plazmidu.</li>
		<li>Dodać 500 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1). Mieszać energicznie przez 5 minut i wirować przez 5 minut w temperaturze 17 800 x g i temperaturze pokojowej. Przenieś górny roztwór plazmidu do nowej probówki. 
		UWAGA: Nosić jednorazowe rękawiczki, aby chronić skórę przed fenolem i chloroformem. 
		UWAGA: W celu usunięcia zanieczyszczenia RNazą z zestawu do ekstrakcji plazmidu, należy oczyścić plazmidy za pomocą oczyszczania fenolowo-chloroformowego.</li>
		<li>Dodać 500 μl chloroformu, aby całkowicie usunąć fenol. Mieszać energicznie przez 5 minut i wirować przez 5 minut w temperaturze 17 800 x g i temperaturze pokojowej. Przenieś górny roztwór plazmidu do nowej probówki.</li>
		<li>Dodać 2,5 objętości etanolu i 1/8 objętości 7,5 M octanu amonu i przechowywać w temperaturze -30 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 17 800 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Przemyć granulat 500 μl 70% etanolu. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i pozostawić osad na 5 minut do wyschnięcia.</li>
		<li>Całkowicie rozpuścić plazmidy ekspresyjne w 100 μl ultraczystej wody. Zmierzyć stężenie plazmidów o absorbancji przy 260 nm. Dostosuj stężenie do 1 mg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transkrypcja in vitro
UWAGA: Używaj plastikowych rurek i końcówek wolnych od DNaz i nukleaz w krokach transkrypcji i translacji. Unikaj autoklawowania wyrobów z tworzyw sztucznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
<ol>
	<li>Zbieraj ultraczystą wodę w nowej plastikowej tubie. 
	UWAGA: Nie używaj wody uzdatnionej DEPC, ponieważ resztki DEPC silnie hamują reakcję. Do transkrypcji i tłumaczenia używaj świeżo oczyszczonej ultraczystej wody.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcji transkrypcji, mieszając 115,2 μl ultraczystej wody, 40 μl buforu transkrypcyjnego LM, 20 μl mieszaniny NTP, 2,4 μl 80 U/μL inhibitora RNazy, 2,4 μl 80 U/μL polimerazy SP6 i 20 μl plazmidów ekspresyjnych pEU 1 mg / mL. Delikatnie wymieszaj odczynniki, odwracając je. Wykonaj szybki obrót.</li>
	<li>Inkubować reakcję transkrypcji w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj reakcję, odwracając i szybko odwiruj. Natychmiast należy go użyć do tłumaczenia, w przeciwnym razie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Potwierdź produkt transkrypcji za pomocą elektroforezy.
	<ol>
		<li>Wymieszać 100 ml 1x buforu TAE i 1 g agarozy. Podgrzej zawiesinę w kuchence mikrofalowej, aby przygotować 1% żel agarozowy TAE.</li>
		<li>Weź 1 μl reakcji transkrypcyjnej i wymieszaj z 3 μl wody i 4 μl 2x barwnika ładującego. 
		UWAGA: Denaturacja RNA nie jest wymagana.</li>
		<li>Załadować 4 μl mieszaniny i 2 μl markera drabinkowego DNA do żelu TAE z agarozy.</li>
		<li>Elektroforeza pod napięciem 100 V przez 20 min.</li>
		<li>Barwić żel w bromku etydyny przez 30 minut. Sprawdź wzór pasma drabinkowego mRNA za pomocą transiluminatora UV i obrazowania żelowego. 
		UWAGA: Gdy obserwuje się rozmazane pasmo mniejsze niż 500 pz, podejrzewa się degradację mRNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie materiałów do tłumaczenia
<ol>
	<li>Przygotuj bufor tłumaczenia.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 27 ml świeżo przygotowanej ultraczystej wody i 0,75 ml każdego 40-krotnego roztworu podstawowego dla S1, S2, S3 i S4 odpowiednio w probówce o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Moduluj ilość materiałów zgodnie z końcową wymaganą ilością 1x bufora translacyjnego. 
		UWAGA: Nie przechowuj ani nie zamrażaj ponownie nadmiaru bufora translacyjnego 1x po użyciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy kinazy kreatynowej . Limofilizowaną kinazę kreatynową rozpuścić w ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 20 mg/ml. Dozować roztwór w małych ilościach (po 10 do 50 μl każda) do 0,2 ml 8-paskowych probówek PCR. Zamrozić probówki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Nie zamrażaj ponownie roztworu kinazy kreatynowej po rozmrożeniu.</li>
	<li>Umyj kubki dializacyjne (o pojemności 0,1 ml) w celu usunięcia glicerolu z membrany dializy. 
	UWAGA: Istnieje kilka kubków do dializy o różnych rozmiarach. Małe kubki (0,1 ml) są używane odpowiednio do testów na małą skalę (sekcja 5.4), a duże kubki (2 ml) do produkcji na dużą skalę (sekcja 5.5). Można uniknąć etapu mycia membrany dializacyjnej w dużych kubkach.
	<ol>
		<li>Wlej 1 ml ultraczystej wody do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Włóż mały kubek do dializy (0,1 ml) do probówki. Dodaj 0,5 ml ultraczystej wody do filiżanki.</li>
		<li>Inkubować przez ponad 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie liposomów
UWAGA: Tutaj opisujemy dwa protokoły przygotowania liposomów. Jeden wykorzystuje gotowe do użycia liofilizowane liposomy (sekcja 4.1), podczas gdy drugi wytwarza liposomy poprzez uwodnienie cienkiego filmu lipidowego (sekcja 4.2).
<ol>
	<li>Przygotuj liposomy za pomocą liofilizowanych liposomów. 
	UWAGA: Łatwiejszym sposobem wytwarzania proteoliposomu jest użycie dostępnego w handlu liposomu asolektyny. Asolektyna to rodzaj naturalnego lipidu ekstrahowanego z soi.
	<ol>
		<li>Otworzyć fiolkę zawierającą 10 mg liofilizowanych liposomów asolektyny (patrz tabela materiałów) i dodać 200 μl buforu translacyjnego (sekcja 3.1) na dno fiolki. Zamknąć fiolkę i inkubować przez 10 minut.</li>
		<li>Energicznie wymieszać, umieszczając fiolkę na mieszalniku wirowym na 1 minutę.</li>
		<li>Umieścić fiolkę w probówce o pojemności 50 ml. Odwirować probówkę, odwirowując przy 500 x g przez 1 minutę.</li>
		<li>Za pomocą pipety przenieś zawiesinę liposomów asolektyny (50 mg lipidów/ml) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Natychmiast użyj liposomu do translacji, w przeciwnym razie zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj liposomy, nawilżając cienki film lipidowy.
	<ol>
		<li>Jeśli lipid jest sprzedawany w postaci proszku, rozpuścić go w chloroformie lub odpowiednim rozpuszczalniku organicznym do stężenia 10-100 mg/ml. 
		UWAGA: Cienki film lipidowy można przygotować przy użyciu oczyszczonych i/lub zsyntetyzowanych lipidów amfifilowych. Metoda oczyszczania asolektyny jest wcześniej opisana38. Funkcjonalnie zmodyfikowane lipidy, takie jak lipidy biotynylowane, lipidy fluorescencyjne i lipidy adiuwantowe, mogą być dodawane do lipidów podstawowych w celu wytworzenia funkcjonalnych liposomów.</li>
		<li>Przenieść roztwór lipidowy zawierający 50 mg lipidu(-ów) do kolby odparowującej.</li>
		<li>Za pomocą wyparki obrotowej odparować rozpuszczalnik i równomiernie rozprowadzić lipid na ściance dna kolby, tworząc cienką warstwę lipidu.</li>
		<li>Umieścić kolbę w eksykatorze próżniowym i pozostawić na noc pod podciśnieniem w celu całkowitego usunięcia rozpuszczalnika.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu translacyjnego do kolby odparowującej. Obrócić kolbę, aby rozprowadzić bufor na cienkim filmie lipidowym. Inkubuj przez 5 minut, aby nawodnić film.</li>
		<li>Sonizować kolbę za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego lub myjki ultradźwiękowej. Od czasu do czasu zmieniać kąt kolby, aby roztwór mógł dokładnie dotknąć folii. Upewnij się, że cienka warstwa lipidowa jest oderwana od spodu i całkowicie i jednorodnie zemulgowana. 
		UWAGA: Mikrografia elektronowa biotynylowanych lipidów zawierających liposomy jest pokazana na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę liposomów (50 mg lipidów/ml) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Jeśli nie ma być użyty natychmiast, zamroź liposomy w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Tłumaczenie in vitro
<ol>
	<li>Szybko rozmrozić ekstrakt z kiełków pszenicy, unosząc rurki na wodzie o temperaturze pokojowej przez kilka minut. Po rozmrożeniu natychmiast delikatnie wymieszaj, odwracając rurki, odwiruj i schładzaj na lodzie do użycia. 
	UWAGA: Po użyciu ekstrakt z kiełków pszenicy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wytrzymuje kilka cykli zamrażania/rozmrażania.</li>
	<li>Rozmrozić 20 mg/ml roztworu podstawowego kinazy kreatyny. Zmieszać 5 μl roztworu podstawowego i 45 μl buforu translacyjnego, aby przygotować 2 mg/ml roztworu roboczego kinazy kreatynowej 
	UWAGA: Ponowne zamrażanie kinazy kreatynowej nie jest zalecane.</li>
	<li>W razie potrzeby rozmrozić liposomy lub mRNA.</li>
	<li>Przeprowadź translację białek na małą skalę.
	<ol>
		<li>Usunąć wodę zarówno z probówki, jak i z kubka do dializy (0,1 ml), jak przygotowano w kroku 3.3.2.</li>
		<li>Wstrzyknąć odpowiednio 1 ml i 300 μl buforu translacyjnego do probówki i kubka do dializy. 
		UWAGA: W przypadku, gdy dno kubka do dializy nie sięga powierzchni buforu translacyjnego w probówce o pojemności 1,5 ml, należy wstrzyknąć do probówki dodatkowe 50–100 μl buforu.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcji translacji, mieszając 15,6 μl buforu translacyjnego, 2,4 μl 2 mg/ml kinazy kreatyny, 12 μl liposomów 50 mg/mL, 15 μl ekstraktu z kiełków pszenicy i 15 μl mRNA. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurki i odwiruj.</li>
		<li>Odessać 60 μl mieszaniny reakcyjnej translacji za pomocą pipety o pojemności 200 μl.</li>
		<li>Włożyć końcówkę pipety do spodniej powierzchni buforu translacyjnego w kubku dializacyjnym. Powoli i delikatnie odpipetować mieszaninę reakcyjną. Przykryj kubek do dializy pokrywką, aby zapobiec parowaniu. 
		UWAGA: Mieszanina reakcyjna opada naturalnie na dno kubka i tworzy dwuwarstwę. Nie naruszaj dwuwarstwy, mieszając lub potrząsając filiżanką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź tłumaczenie na dużą skalę (Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Wlać 22 ml buforu translacyjnego do probówki o pojemności 25 ml. Włóż duży kubek do dializy (2 ml) do probówki i dodaj 2 ml buforu translacyjnego do kubka.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcji translacji, mieszając 130 μl buforu translacyjnego, 20 μl kinazy kreatynowej 2 mg/mL, 100 μl liposomu 50 mg/ml, 125 μl ekstraktu z kiełków pszenicy i 125 μl mRNA. Delikatnie wymieszać, pipetując.</li>
		<li>Odessać całą mieszaninę reakcji translacji (500 μl) za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. Wstrzyknąć mieszaninę reakcji translacji do kubka dializacyjnego w taki sam sposób, jak opisano w kroku 5.4.5. Przykryj kubek do dializy pokrywką, aby zapobiec parowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować reakcje w temperaturze 15 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Dobrze wymieszać reakcję w kubku dializacyjnym przez pipetowanie. Przenieś surową zawiesinę proteoliposomu do nowej probówki. 
	UWAGA: Do zebrania proteoliposomu z translacji na małą skalę zalecana jest probówka o płaskim dnie o pojemności 1,5 ml. Po odwirowaniu liposomy tworzą zwarty i łatwo widoczny osad w dolnym rogu probówki.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie proteoliposomów
<ol>
	<li>Odwirować probówkę zawierającą surową zawiesinę proteoliposomów o sile 17 800 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant. Zawiesić osad proteoliposomu w PBS (mała skala: 1 ml, duża skala: 10 ml) przez pipetowanie.</li>
	<li>Powtórz wirowanie i mycie proteoliposomów przez kolejne dwa kręgi.</li>
	<li>Po umyciu dodać niewielką ilość PBS i dobrze zawiesić osad proteoliposomu przez pipetowanie. Zmierzyć objętość zawiesiny za pomocą mikropipety. Dodaj PBS, aby dostosować objętość do 60 μl (mała skala) lub 500 μl (duża skala). Przenieść zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przenieś 10 μl zawiesiny proteoliposomów do nowej probówki do PCR dla SDS-PAGE. Resztę próbek należy podzielić na mniejsze porcje do wykorzystania w razie potrzeby. Zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
7. SDS-PAGE i barwienie CBB
<ol>
	<li>Dodać 70 μl wody i 40 μl 3x buforu do próbek SDS-PAGE do 10 μl zawiesiny proteoliposomów. 
	UWAGA: Nie gotuj próbki SDS-PAGE, ponieważ białka błonowe agregują się i prawie nie przenikają do żelu akrylowego podczas elektroforezy. Do buforu próbki SDS-PAGE należy również dodać wystarczającą ilość środka redukującego (np. 2-merkaptoetanol o stężeniu końcowym 3%), aby zapobiec utlenianiu.</li>
	<li>Umieść żel SDS-PAGE o gradiacji 5%–20% w komorze elektroforetycznej. Załaduj 3 μl, 6 μl, 12 μl próbek proteoliposomów, 2 μl markera wielkości białka, a także standardową serię BSA.</li>
	<li>Elektroforeza przy 52 mA, 400 V przez 30 min.</li>
	<li>Odbarwić żel barwnikiem CBB przez 1 godzinę. Odbarwić w gorącej wodzie i zeskanować obraz żelu.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), określ ilościowo intensywność pasma białka błonowego na każdym pasie. Oszacuj ilość zsyntetyzowanych białek błonowych za pomocą standardowych serii BSA.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół zapewnia metodę wytwarzania białek błonowych z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Ten protokół jest prosty, wysoce powtarzalny i łatwy do skalowania w górę. Ma również potencjał do skrócenia czasu i kosztów eksperymentów, które zużywają dużą ilość białek błonowych. Metoda dializy dwuwarstwowej zwiększa wydajność od 4 do 10 razy w porównaniu z metodą dwuwarstwową lub metodą dializy (ryc. 2B)45. W skrajnym przypadku wydajność kanału jonowego i transport...

Białka błonowe są jednym z najważniejszych celów leków w diagnostyce i terapii. Rzeczywiście, połowa małych związków leczniczych to białka błonowe, takie jak receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) i kanały jonowe1. Przez lata naukowcy pracowali nad badaniami biochemicznymi, biofizycznymi i strukturalnymi białek błonowych, aby wyjaśnić ich strukturę i funkcję2,3. Aktywnie prowadzone są również prace nad przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko białkom błonowym w celu przyspieszenia badań funkcjonalnych i strukturalnych oraz opracowania zastosowań terapeutycznych i diagnostycznych4,5,6,7,8,9. Wszystkie te badania wymagają dużej ilości wysokiej jakości białek błonowych10. Na przykład do rozwoju przeciwciał potrzeba kilku miligramów oczyszczonych białek błonowych o naturalnej konformacji. Do krystalografii rentgenowskiej wymagana jest znacznie większa ilość wysoko oczyszczonych białek błonowych. Jednak masowa produkcja białek błonowych pozostaje wąskim gardłem w badaniach nad białkami błonowymi11. Białka błonowe mają skomplikowane struktury z jedną lub kilkoma helisami transbłonowymi i odgrywają ważną rolę w homeostazie komórek. Heterologiczna nadekspresja białek błonowych prowadzi do wielu przeszkód, takich jak agregacja białek błonowych, które gromadzą się w wysokich stężeniach lokalnych lub zakłócenia szlaków sygnałów komórkowych. Nawet jeśli odciąg zakończy się sukcesem, kolejne etapy przygotowania próbki również napotykają trudności. Na przykład przygotowanie proteoliposomu wymaga wysokich umiejętności i doświadczenia zawodowego w zakresie solubilizacji, oczyszczania i stabilizacji białek błonowych, a także kosztuje dużo wysiłku i czasu12,13.
Z drugiej strony, w ostatnich dziesięcioleciach pojawiły się zaawansowane technologie do produkcji białek bez użycia żywych komórek14,15,16,17,18. Technologia bezkomórkowej syntezy białek odtwarza reakcję translacji w probówce. Ponieważ nie ma żadnych ograniczeń, które ma komórkowy system ekspresji, systemy bezkomórkowe mają potencjał do syntezy różnych białek, które są trudne do ekspresji lub wykazują toksyczność w komórkach. Oczyszczony ekstrakt komórkowy lub odtworzona maszyneria translacyjna jest mieszana z matrycowymi mRNA, aminokwasami i źródłami energii, a rekombinowane białka są syntetyzowane w krótkim czasie. Jeśli chodzi o syntezę białek błonowych, niektóre rodzaje rusztowań złożonych z lipidów lub amfifilów, takie jak liposomy, dwucele, nanodyski lub kopolimery, są dodawane do reakcji bezkomórkowej19,20,21,22,23,24. Zsyntetyzowane białka błonowe oddziałują z rusztowaniami i mogą być stabilizowane w wodzie. Bezkomórkowe syntetyzowane białka błonowe są szeroko stosowane w badaniach funkcjonalnych i produkcji przeciwciał25,26,27,28,29,30,31.
W tym protokole opisujemy efektywną metodę produkcji proteoliposomów bez komórek przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. System syntezy białek bez komórek pszenicy to potężny system translacji in vitro wykorzystujący ekstrakt z kiełków pszenicy15,32,33. Zarodki pszenicy zawierają dużą ilość maszynerii translacyjnej i niewiele inhibitorów translacji. Maszyneria translacyjna w pszenicy, należącej do eukariontów, jest odpowiednia do translacji białek eukariotycznych, a na jej wydajność translacji prawie nie ma wpływu użycie kodonu matrycowego mRNA. Korzystając z systemu bezkomórkowego pszenicy, zsyntetyzowaliśmy różne białka, w tym kinazy białkowe34,35, ligazy ubikwityny36, czynniki transkrypcyjne37 oraz białka błonowe o wysokich wskaźnikach sukcesu. Do produkcji białka błonowego dodajemy liposom pęcherzyków lipidowych do mieszaniny translacyjnej jako rusztowanie19,38. Domeny hydrofobowe białka błonowego oddziałują z dwuwarstwą lipidową i są spontanicznie integrowane z liposomem. Wirowanie w gradiencie gęstości służy do ścisłego oddzielenia proteoliposomów od endogennych białek pszenicy, mimo że zwykłe odwirowanie mieszaniny reakcji translacji jest wystarczające do prostego oczyszczenia proteoliposomu20. Wiele rodzajów integralnych białek błonowych zostało zsyntetyzowanych przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i stosowanych w różnych badaniach i rozwoju25,38,39,40,41,42,43,44. Ponadto opracowaliśmy "metodę dializy dwuwarstwowej" dla produkcji na dużą skalę45,46. W tej metodzie urządzenie do dializy typu kubełkowego jest zanurzone w buforze podającym substrat, a w kubku tworzą się dwie warstwy mieszaniny reakcji translacji i buforu podającego substrat, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 1. Ciągłe dostarczanie substratów i usuwanie produktu ubocznego może być skutecznie prowadzone zarówno na górze, jak i na dole mieszaniny reakcyjnej przez długi czas, co prowadzi do doskonałej skuteczności translacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A i <silna klasa="xfig">Rysunek 2B)45.

<table><tbody><tr><td>&czasy; 3 Bufor</td><td></td><td></td> do próbek SDS-PAGE <td>Zawierający 10% 2-merkaptoetanol</td></tr><tr><td>5-20% gradientowy żel SDS-PAGE</td><td>ATTO</td><td>E-D520L</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczony etanol ultraczystą wodą.</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Takara Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Nakalai tesque</td><td>02406-95</td><td>Ponieważ ten odczynnik rozpływa się, po otwarciu rozpuść go w wodzie i przechowuj w temperaturze -30& stopni C.</td></tr><tr><td>Ampicillin Sodium</td><td>Nakalai tesque</td><td>02739-74</td><td></td></tr><tr><td>Liposom asolektyny, liofilizowany</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-PLE-ASL</td><td>Fiolka zawiera 10 mg liofilizowanych liposomów.</td></tr><tr><td>Norma</td><td></td><td></td> BSA <td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 i mikro; L i razy; 1 SDS-PAGE bufor do próbek</td></tr><tr><td>CBB barwienie żelem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>klon cDNA będący przedmiotem zainteresowania</td><td></td><td></td><td>Plazmid zawierający klon cDNA lub syntetyczny fragment DNA</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Nakalai tesque</td><td>08402-84</td><td></td></tr><tr><td>Chłodzony inkubator</td><td></td><td></td><td>Zakres temperatury od 0 do 40 &deg; C lub szerszy.</td></tr><tr><td>Kinaza kreatynowa</td><td>Roche Diagnostics</td><td>04524977190</td><td></td></tr><tr><td>kubek do dializy (0,1 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>Slide-A-Lyzer MINI urządzenie do dializy, 10K MWCO, 0,1 ml</td></tr><tr><td>kubek dializacyjny (2 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88404</td><td>Slide-A-Lyzer MINI urządzenie do dializy, 10K MWCO, 2 ml</td></tr><tr><td>marker drabinkowy DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>GeneLiner 1 kb DNA Drabinka</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD1703</td><td>FastDigest DpnI</td></tr><tr><td>Szczep E. coli JM109</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora do elektroforezy</td><td>ATTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99,5%)</td><td>Nakalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Bromek</td><td></td><td></td><td></td>etydyny</tr><tr><td>Kolba do odparowywania, 100 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>żelowy Skaner</td><td></td><td></td> żelowy <td>Jako substytut używamy skanera dokumentów i immunizatora LED.</td></tr><tr><td>Rosół</td><td></td><td></td><td></td>LB</tr><tr><td>Interesujące lipidy</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>NTP mix</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-TSC-NTP</td><td>Mieszanina ATP, GTP, CTP, UTP, po 25 mM każda</td></tr><tr><td>Probówka 25 ml bez nukleaz</td><td>IWAKI</td><td>362-025-MYP</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z tworzywa sztucznego bez nukrówek</td><td>Watson bio labs</td><td></td><td>Nie sterylizować w autoklawie. Używaj ich oddzielnie od innych eksperymentów.</td></tr><tr><td>Końcówki bez nudzi</td><td>Watson bio labs</td><td></td><td>Nie sterylizować w autoklawie. Używaj ich oddzielnie od innych eksperymentów.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania</td><td></td> buforu <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>PBS</td></tr> MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Żel i PCR Clean-up <tr><td>wektor pEU-E01-MCS</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-11</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1)</td><td>Nippon Gene</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Midi do przygotowania plazmidu</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740410</td><td>NucleoBond Xtra Midi</td></tr><tr><td>Podkład 1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Niestandardowa synteza oligo</td><td>5'-CCAAGATATCACTAGnnnn Starter specyficzny dla genu, do przodu. Wielkie litery pokazują sekwencję nakładania się, która ma zostać dodana w celu bezproblemowego klonowania. Małe litery nnnn&hellip;. (20-30 pz) pokazuje sekwencję specyficzną dla genu.</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Niestandardowa synteza oligo</td><td>5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnn-3' Starter specyficzny dla genu, odwrócony. Wielkie litery pokazują sekwencję nakładania się, która ma zostać dodana w celu bezproblemowego klonowania. Małe litery nnnn&hellip;. (20-30 pz) pokazuje sekwencję specyficzną dla genu.</td></tr><tr><td>Primer 3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom oligo synthesis</td><td>5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3' Forward starter do linearyzacji wektorowej. Podkreślenie działa jako nakładanie się w bezproblemowym klonowaniu.</td></tr><tr><td>Primer 4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom oligo synthesis</td><td>5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3' Odwrócony starter do linearyzacji wektorowej. Podkreślenie działa jako nakładanie się w bezproblemowym klonowaniu.</td></tr><tr><td>Podkład 5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Niestandardowa synteza oligo</td><td>5'-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3' Starter sekwencjonujący, forward</td></tr><tr><td>Primer 6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom synteza oligo</td><td>5'- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3' Starter sekwencjonowania, odwrócony</td></tr><tr><td>Marker wielkości białka</td><td>Bio-Rad</td><td>1610394</td><td>Precision Plus Protein Standard</td></tr><tr><td>Bezszwowa mieszanina enzymów klonujących</td><td>parownik</td><td></td><td></td> obrotowy New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix Dostępne są również inne odczynniki do klonowania bezszwowego.</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA SP6 i Inhibitor RNazy</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-TSC-ENZ</td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy</td><td></td><td></td><td></td>podwodnej</tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td>TAE</tr><tr><td>Bufor transkrypcyjny LM</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-TSC-5TB-LM</td><td></td></tr><tr><td>Bufor translacyjny</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-SUB-SGC</td><td>SUB-AMIX SGC (&czasy; 40) roztwór podstawowy (S1, S2, S3, S4). Przygotowanie i czasy; 1 bufor translacyjny przed użyciem przez zmieszanie bulionu S1, S2, S3, S4 i ultraczystej wody.</td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td>ultraczysta</td><td>Zalecamy przygotowanie wody ultraczystej przy użyciu systemu produkcji wody ultraczystej za każdym razem, gdy przeprowadzasz eksperyment. Nie sterylizować w autoklawie. Przygotowaliśmy wodę ultraczystą przy użyciu systemu Milli-Q Reference i Elix10. Jako substytut można użyć dostępnej na rynku wody wolnej od nukleaz (nie wody uzdatnionej DEPC). Zadbaj o zanieczyszczenie po otwarciu butelki.</td></tr><tr>Jako substytut może być stosowany <td>homogenizator ultradźwiękowy</td><td>Branson</td><td>SONIFIER model 450D-Advanced</td><td>Myjka ultradźwiękowa.</td></tr><tr><td>Oświetlacz</td><td></td><td></td><td></td>UV</tr><tr><td>Eksykator</td><td></td><td></td><td></td>próżniowy</tr><tr><td>Ekstrakt z kiełków pszenicy</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-WGE-7240</td><td>WEPRO7240</td></tr></tbody></table>

bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Białka błonowe odgrywają istotną rolę w różnych procesach komórkowych i pełnią ważne funkcje. Białka błonowe są ważne z medycznego punktu widzenia w odkrywaniu leków, ponieważ są celem ponad połowy wszystkich leków. Przeszkodą w prowadzeniu badań biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych białek błonowych, a także w rozwoju przeciwciał była trudność w wytwarzaniu dużych ilości wysokiej jakości białka błonowego o prawidłowej konformacji i aktywności. W tym miejscu opisujemy "metodę dializy dwuwarstwowej" wykorzystującą system wolny od komórek zarodków pszenicy, liposomy i kubki do dializy w celu wydajnej syntezy białek błonowych i przygotowania oczyszczonych proteoliposomów w krótkim czasie z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Białka błonowe mogą być wytwarzane nawet w kilku miligramach, takie jak GPCR, kanały jonowe, transportery i tetraspaniny. Ta bezkomórkowa metoda przyczynia się do skrócenia czasu, kosztów i wysiłku związanego z przygotowaniem wysokiej jakości proteoliposomów oraz zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Stosując niniejszy protokół, częściowo oczyszczone proteoliposomy można uzyskać w krótkim czasie. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 2A. Dwadzieścia pięć GPCR klas A, B i C zostało pomyślnie zsyntetyzowanych przy użyciu metody dializy dwuwarstwowej (w małej skali) i częściowo oczyszczonych poprzez wirowanie i przemywanie buforem. Chociaż ilość zsyntetyzowanych białek różni się w zależności od rodzaju białka, przy użyciu dużych woreczków dializacyjnych zazwyczaj można zsyntetyzow...

Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Wszystkie białka błonowe są ważnymi celami w odkrywaniu leków. Produkcja białek błonowych na największą skalę pozostaje wąskim gardłem w prowadzeniu badań biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych białek błonowych. Metoda ta może być stosowana do efektywnej syntezy białek błonowych in vitro oraz do przygotowania oczyszczonych proteoliposomów w krótkim czasie z wysokim wskaźnikiem sukcesu.Po dodaniu odpowiednich odczynników, w tym bezkomórkowego plazmidu ekspresyjnego w celu wytworzenia mieszaniny reakcji transkrypcji, wymieszaj zawartość probówki przez delikatne odwrócenie lub stuknięcie i wykonaj szybkie wirowanie w mikrowirówce. Po odwirowaniu inkubować mieszaninę reakcji transkrypcji przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie mieszać i wirować w dół. Aby przygotować bufor translacyjny, należy rozcieńczyć roztwór podstawowy świeżą ultraczystą wodą.W przypadku translacji na małą skalę należy użyć kubków dializacyjnych o pojemności 100 mikrolitrów umytych ultraczystą wodą, aby usunąć glicerol z membrany dializy. Dodaj jeden mililitr ultraczystej wody do nowej 1,5-mililitrowej probówki i włóż do niej mały kubek do dializy. Następnie dodaj 500 mikrolitrów ultraczystej wody do filiżanki na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.Aby przygotować liposomy, przenieś roztwór lipidów zawierający 50 miligramów lipidów do kolby odparowującej. Umieścić kolbę w wyparce obrotowej w celu odparowania rozpuszczalnika. Gdy na powierzchni dna kolby wytworzy się cienka, równomiernie rozłożona warstwa lipidu, należy przenieść kolbę do eksykatora próżniowego pod podciśnieniem przez noc w celu całkowitego usunięcia rozpuszczalnika.Następnego ranka wyjąć kolby z eksykatora i sprawdzić cienką warstwę lipidów. Dodać jeden mililitr buforu translacyjnego do kolby i obrócić kolbę, aby rozprowadzić bufor na cienkiej warstwie lipidowej. Po pięciu minutach należy poddać sonikę kolbie, od czasu do czasu zmieniając kąt, aby umożliwić roztworowi kontakt z całą powierzchnią filmu lipidowego.Zatrzymaj sonikację, gdy lipid zostanie całkowicie usunięty z kolby, a zawiesina liposomowa stanie się jednolita. Następnie przenieś zawiesinę liposomów do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Przed wykonaniem translacji białek in vitro należy umieścić tubkę ekstraktu z kiełków pszenicy w temperaturze minus 80 stopni na wodzie o temperaturze pokojowej przez kilka minut, aby szybko rozmrozić materiał.Po rozmrożeniu ekstraktu natychmiast wymieszaj zawartość tubki przez delikatne odwrócenie. Następnie odkręć w dół i umieść rurkę na lodzie. Dodaj ekstrakt z kiełków pszenicy, mRNA i liposomy, aby wytworzyć mieszaninę reakcji translacji.Wymieszaj zawartość probówki przez delikatne odwrócenie lub stuknięcie i wykonaj szybkie wirowanie w mikrowirówce. Aby przeprowadzić translację białek in vitro na małą skalę, usuń wodę z kubka i rurki do dializy na małą skalę i dodaj jeden mililitr buforu translacyjnego do probówki i 300 mikrolitrów do kubka. Weź 60 mikrolitrów mieszaniny reakcji translacji.Włożyć końcówkę pipety do buforu translacyjnego w kubku dializacyjnym. Następnie wstrzykuj mieszaninę powoli i delikatnie. Mieszanina reakcyjna o większej gęstości spontanicznie opada na dno kubka i tworzy warstwę.Przykryj kubek pokrywką, aby zapobiec parowaniu. Aby przeprowadzić translację na dużą skalę, dodaj 22 mililitry buforu translacyjnego do 25-mililitrowej probówki i umieść w niej dwumililitrowy kubek do dializy. Dodać dwa mililitry buforu translacyjnego do kubka dializacyjnego.Weź 500 mikrolitrów mieszaniny reakcji translacji, powoli i delikatnie wstrzyknij mieszaninę do buforu translacyjnego w kubku. Inkubować reakcje przez 24 godziny w temperaturze 15 stopni Celsjusza. Następnego dnia dokładnie wymieszaj reakcję w kubku dializacyjnym przez pipetowanie i przenieś surowe zawiesiny proteoliposomów do nowych probówek.Aby oczyścić proteoliposomy, należy osadzać proteoliposom w surowych zawiesinach przez centrowanie. Następnie przemyj proteoliposom przez trzykrotne ponowne zawieszenie w odpowiedniej objętości lodowatego buforu PBS. Po umyciu dokładnie ponownie zawiesić granulki proteoliposomów w małej objętości PBS i zmierzyć objętość zawiesiny za pomocą mikropipety.Następnie dodaj PBS, aby dostosować głośność zawieszenia. Przenieś każdą zawiesinę do nowej mikrotuby. Aby skonfigurować analizę strony SDS, dodaj 70 mikrolitrów wody i 40 mikrolitrów trzykrotnie stężonego buforu próbki strony SDS do 10 mikrolitrów każdej zawiesiny proteoliposomowej.Ustaw żel stronicowy SDS o gradiencie od 5 do 20% w komorze do elektroforezy. Załaduj żel dwoma mikrolitrami markera wielkości białka, trzema, sześcioma i 12 mikrolitrami każdej próbki proteoliposomu oraz 10 mikrolitrami wzorców albuminy surowicy bydlęcej. Po załadowaniu próbek uruchom elektroforezę, a następnie zabarwij żel barwnikiem Coomassie Brilliant Blue.Na koniec odbarwij żel w gorącej wodzie, delikatnie potrząsając i zeskanuj obraz żelu. Korzystając z tego protokołu, jak pokazano, różne białka błonowe z trzema lub więcej helisami transbłonowymi można łatwo wytworzyć jako proteoliposomy w krótkim czasie. W tej metodzie dializy dwuwarstwowej ciągłe dostarczanie substratów i usuwanie produktu ubocznego może być skutecznie prowadzone zarówno na górze, jak i na dole mieszaniny reakcyjnej przez długi czas, co prowadzi do doskonałej skuteczności translacji.Metoda dializy dwuwarstwowej powoduje od 4 do 10-krotnego wzrostu wydajności w porównaniu z zastosowaniem samej metody dializy dwuwarstwowej lub dializy. Zebranie zsyntetyzowanych proteoliposomów przez centryfikację i ich częściowe oczyszczenie buforem płuczącym znacznie skraca proces oczyszczania białek błonowych. Ten bezkomórkowy system jest łatwy w obsłudze i wysoce skalowalny.Może być również używany do produkcji białek pamięci, które są trudne do ekspresji innymi metodami. Metoda ta jest niezwykle pomocna w badaniach i eksperymentach, które wykorzystują lub celują w białka błonowe, takie jak białko błonowe, produkcja przeciwciał, SPR, Elisa i AlphaScreen.

cell-free-production-proteoliposomes-for-functional-analysis-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Tutaj prezentujemy dwa ultraszybkie protokoły do rekonstytucji białek błonowych w fuzogenne proteoliposomy oraz fuzji takich proteoliposomów z docelowymi dwuwarstwami lipidowymi w celu bezdetergentowego dostarczania tych białek błonowych do dwuwarstwy pofuzyjnej. Połączenie tych podejść umożliwia szybki i łatwy w obsłudze montaż złożonych, wieloskładnikowych systemów membranowych.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Liposomy zawierające amfifile jednołańcuchowe, szczególnie kwasy tłuszczowe, wykazują odmienne właściwości w porównaniu do tych zawierających diacylofosfolipidy ze względu na unikalne właściwości chemiczne amfifilów jednołańcuchowych. Tutaj opisujemy techniki przygotowania, oczyszczania i stosowania liposomów składających się z części lub całości tych amfifilów.

Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

Opisano przygotowanie antygenowych nanocząsteczek liposomalnych i ich zastosowanie w stymulowaniu aktywacji komórek B in vitro i in vivo. Spójne i silne odpowiedzi przeciwciał doprowadziły do opracowania nowego modelu alergii na orzeszki ziemne. Protokół generowania liposomów antygenowych można rozszerzyć na różne antygeny i modele immunizacji.

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Kotranslacyjna insercja do wstępnie uformowanych nanodysków umożliwia badanie bezkomórkowych syntetyzowanych białek błonowych w określonych środowiskach lipidowych bez kontaktu z detergentami. Protokół ten opisuje przygotowanie podstawowych komponentów systemu oraz parametry krytyczne dla poprawy wydajności odciągania i jakości próbki.

Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

Ten protokół opisuje użycie komercyjnych, bezkomórkowych zestawów do ekspresji białek do produkcji białek błonowych opartych na nanodyskach, które mogą być używane jako antygeny w szczepionkach podjednostkowych.

Bezkomórkowa produkcja skalowana i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Poznaj bezkomórkową metodę produkcji proteoliposomów do analizy funkcjonalnej białek błonowych. Protokół wykorzystuje pszeniczny system bezkomórkowy i liposomy, umożliwiając skuteczną syntezę białek oraz wspierając odkrywanie celów lekowych i rozwój przeciwciał.

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Przeglądaj więcej filmów