Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Nasz protokół pomoże naukowcom zrozumieć fizjologiczne skutki trzech różnych metod przeszczepu szpiku kostnego i ich wpływ na wyniki eksperymentalne w warunkach hematopoezy klonalnej. Przeszczep szpiku kostnego z promieniowaniem całego ciała może negatywnie wpływać na narządy sercowo-naczyniowe i zmieniać patogenezę choroby. Dlatego nasze laboratorium opracowało dwie alternatywne metody, aby zminimalizować lub uniknąć możliwych skutków ubocznych.

Procedury zademonstrują Eunbee Park, doktorantka, i Megan Evans, doktorantka, obie z mojego laboratorium W celu ekranowania klatki piersiowej i brzucha umieść regulowaną tackę i promiennik rentgenowski w odpowiedniej odległości, aby uzyskać równomierne napromieniowanie. I umieść znieczulone myszy na płaskiej płytce led odwróconej do siebie w pozycji leżącej. Przymocuj łapy do płytki za pomocą taśmy i umieść osłonę led tak, aby dolny koniec wyrównał się z kością xiphisternum, a górny koniec ołowianej osłony znajdował się w pobliżu grasicy.

Po osłonięciu umieść myszy w promienniku i wystaw zwierzęta na działanie dwóch 5,5 szarych frakcji napromieniowania oddzielonych od siebie w odstępie od czterech do 24 godzin. Aby osłonić głowę, ostrożnie przyklej cztery łapy myszy do brzucha. Umieść mysz w stożkowym ograniczniku i wsuń ogranicznik w szczelinę w osłonie ołowianej, tak aby głowa i uszy myszy były całkowicie zakryte, pozostawiając resztę ciała myszy wystawioną na promieniowanie.

Po ekranowaniu umieść myszy w promienniku i wystaw zwierzęta na działanie 5,5 szarych frakcji promieniowania oddzielonych od siebie w odstępie od czterech do 24 godzin. Po każdym radioterapii umieść znieczulone myszy w klatce na podgrzewanej macie z monitorowaniem, aż do całkowitego wyzdrowienia. Aby wyizolować kości, zdezynfekuj skórę myszy dawcy 70% etanolem i wykonaj małe poprzeczne nacięcie skóry poniżej klatki piersiowej.

Trzymając mocno skórę po obu stronach nacięcia, rozerwij w przeciwnych kierunkach w kierunku głowy i stóp i oderwij skórę od wszystkich kończyn. Przetnij ramiona i stawy łokciowe i użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć przyczepione mięśnie i tkanki łączne z kości ramiennej. Ostrożnie zwichnij stawy między kością udową a biodrową.

I użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż głów kości udowej, aby odłączyć nogi. Przeciąć staw kolanowy, aby oddzielić kość udową i piszczelową. I użyj chusteczek laboratoryjnych, aby ostrożnie usunąć przyczepione mięśnie i tkanki łączne z kości.

Następnie przeciągnij kości myszy o tym samym genotypie do pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówek zawierających 20 mililitrów lodowatego sterylnego PBS na lodzie. Aby wyizolować komórki szpiku kostnego w szafce o drugiej klasie bezpieczeństwa biologicznego, użyj igły o rozmiarze 18, aby zrobić mały otwór na dnie sterylnej mikroprobówki o pojemności 500 mikrolitrów. I umieść probówkę w pojedynczej sterylnej 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej zawierającej 100 mikrolitrów lodowatego sterylnego PBS.

Po przygotowaniu wszystkich probówek należy wyjąć PBS z probówki zawierającej wyizolowane kości i przenieść kości na sterylne 100-milimetrowe naczynie do hodowli komórek. Użyj drobnych kleszczyków i małych nożyczek, aby ostrożnie usunąć nasadę z końców każdej kości i umieść do sześciu kości w każdej probówce o pojemności 500 mikrolitrów. Gdy wszystkie kości zostaną przecięte, wyekstrahuj komórki szpiku kostnego przez odwirowanie.

Jeśli cała zawartość szpiku została usunięta, kości powinny wydawać się białe i półprzezroczyste ze stosunkowo dużą czerwoną osadką na dnie 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. W przypadku przeszczepu komórek szpiku kostnego należy rozcieńczyć izolowane komórki szpiku kostnego w pożywce RPMI wolnej od surowicy i załadować 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do jednej strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 mililitra na mysz do wstrzyknięcia. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, powoli wstrzyknij całą objętość komórek do żyły tylnej oczodołu każdego znieczulonego biorcy.

Następnie umieść kroplę proparakainy na oku, aby złagodzić ból. I pozwól myszy odzyskać przytomność podczas monitorowania. Porównanie wpływu trzech metod kondycjonowania wstępnego BMT na wszczepienie komórek dawcy.

Frakcje komórek dawcy we krwi obwodowej i tkance serca analizowano za pomocą cytometrii przepływowej po upływie jednego miesiąca od BMT. W tej reprezentatywnej analizie, we krwi obwodowej myszy biorców, które otrzymały napromienianie całego ciała, monocyty, neutrofile i limfocyty B zostały w dużej mierze usunięte i zastąpione potomstwem komórek pochodzących ze szpiku kostnego dawcy. Ponadto populacje monocytów serca i neutrofili u biorców zostały prawie całkowicie zastąpione komórkami pochodzącymi od dawców.

W grupie częściowo osłoniętej napromienianiem, wymiana komórek odpornościowych serca pochodząca od dawcy była niewielka. Komórki szpiku kostnego myszy biorcy w osłoniętych obszarach prawdopodobnie przyczyniły się do niższego poziomu rekonstytucji krwi obwodowej w porównaniu z myszami, które otrzymały napromienianie całego ciała. W grupie bez kondycjonowania BMT, komórki pochodzące od dawcy były wykrywalne we krwi obwodowej i sercach myszy biorców po czterech tygodniach od BMT.

Ponadto komórki dawcze z niedoborem Tet2 stopniowo rozszerzały się z czasem. Dla porównania, myszy biorcy wszczepione komórkami dawcy typu dzikiego wykazywały minimalną ekspansję klonalną komórek dawcy. Optymalizacja tych modeli eksperymentalnych umożliwi bardziej rygorystyczne badania genów napędzających klonalną hematopoezę, które przyczyniają się do śmiertelności z różnych przyczyn, takich jak choroby sercowo-metaboliczne i nowotwory.

Mamy nadzieję, że nasze protokoły pozwolą naukowcom badać hematopoezę klonalną, aby zbadać, w jaki sposób przyczynia się ona do chorób sercowo-naczyniowych i innych stanów chorobowych.