Name: Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj trzy metody przeszczepu szpiku kostnego u myszy do badania hematopoezy klonalnej, w tym napromieniowanie całego ciała, osłonowe i bez kondycjonowania. Protokoły te minimalizują działania niepożądane i poprawiają wyniki eksperymentalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty US National Institutes of Health dla K. Walsha (HL131006, HL138014, and HL132564), dla S. Sano (HL152174), grant American Heart Association dla M. A. Evansa (20POST35210098) oraz grant Japan Heart Foundation dla H. Ogawy.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Wirginijskim.
1. Przed wstępnym warunkowaniem
<ol>
	<li>Około 24 h przed napromienianiem należy zapewnić myszom biorcom wodę z dodatkiem antybiotyków (5 mM sulfametoksazolu, 0.86 mM trimetoprimu). Jest to niezbędne w celu zapobiegania infekcjom, ponieważ układ odpornościowy zostanie stłumiony po napromienianiu; suplementację tę należy kontynuować przez 2 tygodnie po zabiegu. Na tym etapie należy dodatkowo podawać myszom żel odżywczo-nawadniający, aby zachęcić je do jedzenia oraz zapobiec utracie masy ciała i odwodnieniu po napromienianiu.</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu MRI przedstawiający rozmieszczenie szczura, osłonę głowy oraz pomiary odległości dla zapewnienia precyzji obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61875/61875fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Zdjęcia przedstawiające różne układy do kondycjonowania wstępnego.(A) Układ do napromieniowania całego ciała w klatce typu pie-cage z użyciem promieni gamma (Ceź-137): Wiązka promieniowania pada z tyłu irradiatora w kierunku osi y (promieniowanie poziome). (B) Układ do napromieniowania całego ciała myszy w klatce z użyciem promieni X: Klatka z myszą jest umieszczona w komorze refleksyjnej. Wiązka promieniowania pada z góry irradiatora w kształcie stożka (promieniowanie pionowe). Odległość od źródła promieniowania do klatki wynosi 530 mm. (C) Regulowana taca w irradiatorze promieni X: Układ ten jest stosowany do napromieniowania z częściowym osłanianiem przy użyciu promieni X. Wiązka promieniowania pada z góry irradiatora w kształcie stożka (promieniowanie pionowe). Odległość od źródła promieniowania do tacy wynosi 373 mm, a promień wynosi 250 mm. (D) Osłanianie klatki piersiowej: Zznieczulone myszy są umieszczane na tacy. Myszy są ułożone naprzeciw siebie w pozycji grzbietnej z całkowicie wyprostowanymi kończynami. Dolna krawędź osłony ołowianej jest wyrównana z wyrostkiem mieczowatym, a górna z grasicą. (E) Osłanianie jamy brzusznej: Zznieczulone myszy są rozmieszczone tak samo jak w układzie do osłaniania klatki piersiowej, przy czym dolna krawędź osłony ołowianej jest wyrównana z odbytem, a górna znajduje się poniżej przepony. (F) Układ do napromieniowania z osłoną głowy z użyciem promieni gamma (Ceź-137): Przednie łapy znieczulonej myszy są przytaśmowane, a mysz jest umieszczona w stożkowym stabilizatorze. Czarna osłona ołowiana (zaznaczona) zakrywa głowę i uszy myszy. Wiązka promieniowania pada z tyłu irradiatora w kierunku osi Y (promieniowanie poziome). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61875/61875fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
2. Przygotowanie myszy biorców (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Całociałowe napromienianie
	<ol>
		<li>Umieść myszy biorców w klatce typu „pie-cage” z jednolitymi przegrodami lub w klatce dla myszy w komorze refleksyjnej w obliczonym promieniu, aby otrzymały taką samą dawkę napromieniania; zaleca się jednak maksymalnie 8 myszy na klatkę „pie-cage” i 5 myszy na zwykłą klatkę, aby zapewnić jednorodne napromienianie (Rysunek 1A,B).</li>
		<li>Aby uzyskać całkowitą mieloablację, należy zapewnić, aby myszy biorcy otrzymały całkowitą dawkę promieniowania 11 Gy w dwóch frakcjach po 5.5 Gy, oddzielonych odstępem 4–24 h. 
		UWAGA: Chociaż optymalne przyjęcie przeszczepu można uzyskać stosując 4 h odstępu między frakcjami, można go wydłużyć do 24 h, co może być pomocne w przypadku braku personelu i/lub niedostępności irradiatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napromienianie z częściowym osłanianiem
	<ol>
		<li>Zanurz myszy biorców w znieczuleniu poprzez dożylne wstrzyknięcie ketaminy (80–100 mg/kg) i ksylazyny (5–10 mg/kg). Unieruchomienie myszy jest kluczowe dla zapewnienia jednorodnego napromieniania i skutecznej ochrony narządów docelowych podczas procesu osłaniania.</li>
		<li>W przypadku osłaniania klatki piersiowej i jamy brzusznej skieruj wiązkę promieniowania irradiatora rentgenowskiego pionowo względem myszy (Rysunek 1C).
		<ol>
			<li>Umieść znieczulone myszy na płaskiej płycie, centrując źródło promieniowania od góry. Ustaw myszy w pozycji grzbietnej, przeciwlegle do siebie, z całkowicie wyprostowanymi kończynami przednimi i tylnymi (Rysunek 1D,E). 
			UWAGA: Wykorzystywana w tym eksperymencie instalacja irradiatora rentgenowskiego pozwala na umieszczenie dwóch myszy jednocześnie w promieniu efektywnym, który zapewnia jednorodne napromienianie. Chociaż promień efektywny oblicza się na podstawie odległości między źródłem promieniowania a taca, liczba zwierząt, które mogą być napromieniane jednocześnie, zależy od konkretnego irradiatora.</li>
			<li>Przymocuj łapy myszy do płyty za pomocą taśmy, aby zapewnić ich unieruchomienie podczas procedury napromieniania. Umieść osłony ołowiane tak, aby zakrywały obszary wymagające ochrony.</li>
			<li>Aby osłonić klatkę piersiową, przygotuj osłonę ołowianą, mierząc odległość od wyrostka mieczowatego myszy do grasicy i obliczając grubość, która zapewni wystarczającą ochronę przed źródłem promieniowania. Umieść osłonę ołowianą tak, aby jej dolna krawędź pokrywała się z wyrostkiem mieczowatym. Górna krawędź bariery ołowianej powinna znajdować się w pobliżu grasicy (Rysunek 1D).</li>
			<li>Aby osłonić jamę brzuszną, przygotuj osłonę ołowianą, mierząc odległość od odbytu myszy do przepony i obliczając grubość, która zapewni wystarczającą ochronę przed źródłem promieniowania. Umieść osłonę ołowianą tak, aby jej dolna krawędź pokrywała się z odbytem. Górna krawędź osłony ołowianej powinna znajdować się poniżej przepony (Rysunek 1E). 
			UWAGA: Ujednolicenie rozmieszczenia osłony ołowianej pomiędzy kohortami może zmniejszyć zmienność wynikającą z wielkości myszy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku osłaniania głowy skieruj wiązkę promieniowania irradiatora cezowego poziomo względem myszy.
		<ol>
			<li>Ostrożnie przymocuj taśmą przednie łapy znieczulonej myszy do brzucha. Zapewnia to otrzymanie pełnej dawki promieniowania przez kończyny przednie i zapobiega ich zakryciu przez osłonę.</li>
			<li>Aby osłonić głowę, umieść mysz w stożkowym unieruchamiaczu, który pasuje do osłony ołowianej. Po umieszczeniu myszy w stożkowym unieruchamiaczu, wsuń go w szczelinę w osłonie ołowianej (Rysunek 1F). Osłona ołowiana powinna całkowicie zakrywać głowę i uszy myszy (~3.2 cm), pozostawiając resztę ciała myszy odsłoniętą do napromieniania. Pozycję unieruchamiacza wewnątrz osłony można dostosować do zwierząt o różnej wielkości, przesuwając go głębiej do wewnątrz lub na zewnątrz osłony.</li>
			<li>Umieść myszy w irradiatorze, prostopadle do źródła promieniowania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li> Poddaj myszy działaniu dwóch frakcji promieniowania po 5.5 Gy (całkowita dawka 11 Gy) oddzielonych odstępem 4–24 h.</li>
		<li>Po każdej frakcji napromieniania umieść klatki ze znieczulonymi myszami na matach grzewczych lub pod czerwonymi lampami grzewczymi, aby zapobiec hipotermii i wspomóc wybudzanie z znieczulenia. 
		UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie przegrzać znieczulonej myszy podczas korzystania z lampy, ponieważ zwierzę nie może uciec przed ciepłem. Jak opisano powyżej, rozmieszczenie zwierząt i grubość osłony ołowianej mogą różnić się między badaniami w zależności od specyficznych cech irradiatora (typ promieniowania/kierunek wiązki itp.). Badacze będą musieli odpowiednio dostosować swoje eksperymenty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja kości
UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby myszy donora i biorcy były w podobnym wieku, mieszczących się w przedziale 8–12 tygodni. W celu zminimalizowania heterogeniczności (nawet przy użyciu myszy o tym samym genotypie) zaleca się wykorzystanie co najmniej 3 myszy jako donorów (zamiast jednego donora). Z sześciu kości (dwóch kości udowych, dwóch piszczelowych i dwóch ramiennych) jednej myszy można uzyskać około 40 milionów niefrakcjonowanych komórek szpiku kostnego. Przeszczepienie 5 milionów komórek szpiku kostnego do każdej myszy biorcy zazwyczaj zapewnia prawidłowe przyjęcie przeszczepu.
<ol>
	<li>Uśmierć myszy dawców poprzez zwichnięcie szyi bez znieczulenia (preferowana metoda w celu uniknięcia kontaminacji chemicznej komórek), a następnie umieść każdą mysz na chłonnym podkładzie.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę, używając sprayu z 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj niewielkie cięcie poprzeczne skóry poniżej klatki piersiowej i mocno chwyć skórę po obu stronach nacięcia, rozrywając ją w przeciwnych kierunkach w stronę głowy i stóp. Odwarstw skórę ze wszystkich kończyn.</li>
	<li>Przetnij tkanki w obrębie barków i stawów łokciowych, a następnie usuń przylegające mięśnie i tkanki łączną za pomocą chusteczki Kimwipe, aby odsłonić kości ramienne.</li>
	<li>Ostrożnie zwichnij stawy biodrowe między kością udową a miednicą. Używając tępych nożyczek, przetnij tkanki wzdłuż głowy kości udowej i oddziel nogi. Przetnij w obrębie stawu kolanowego, aby rozdzielić kość udową od piszczelowej, a następnie ostrożnie usuń przylegające mięśnie i tkanki łączną za pomocą chusteczki Kimwipe, aby pobrać kość udową i piszczelową. 
	UWAGA: Na tym etapie należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie uszkodzić nasad kości. Kości złamane należy odrzucić ze względu na utratę sterylności. Oprócz kości udowych, piszczelowych i ramiennych można zebrać również kości miednicy oraz kręgi. W celu pobrania komórek szpiku z kręgów można użyć moździerza i tłuczka do rozkruszenia kości na mniejsze fragmenty.</li>
	<li>Umieść wyizolowane kości od myszy o tym samym genotypie w odpowiednich probówkach stożkowych o pojemności 50 mL zawierających 20 mL lodowatego, sterylnego PBS i przechowuj je w lodzie do czasu dalszego użycia. Zwróć szczególną uwagę na to, aby umieścić kości w probówkach odpowiadających właściwym genotypom.</li>
	<li>Powtórz powyższe kroki dla każdego zwierzęcia dawcy, zmieniając rękawiczki pomiędzy każdą myszą. Nożyczki i inne narzędzia należy również oczyszczać 70% etanolem po każdym zwierzęciu.</li>
</ol>
4. Izolacja komórek szpiku kostnego
UWAGA: Poniższe kroki należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II.
<ol>
	<li>Przygotowanie zestawów probówek: Za pomocą igły 18 G wykonaj mały otwór w dnie sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 mL i umieść ją w sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL, która zawiera na dnie 100 μL lodowatego, sterylnego PBS. 
	UWAGA: Ponieważ w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 mL zmieści się tylko sześć kości, zaleca się przygotowanie wystarczającej liczby zestawów probówek, aby przetworzyć wszystkie kości jednocześnie.</li>
	<li>Odsącz PBS i przenieś wyizolowane kości na sterylną szalkę hodowlaną o średnicy 100 mm. Trzymając każdą kość za pomocą precyzyjnej pęsety, ostrożnie odetnij nasady z obu końców, używając małych nożyczek wysterylizowanych w autoklawie. Umieść odcięte kości w przygotowanych zestawach probówek.</li>
	<li>Wiruj probówki z prędkością 10,000 x g przez 35 s w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po wirowaniu potwierdź, że szpik kostny został pomyślnie usunięty z kości. Kości powinny być białe i półprzezroczyste, a na dnie probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL powinien znajdować się stosunkowo duży czerwony osad (pellet). Usuń probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 mL. 
	UWAGA: Jeśli podczas inspekcji wizualnej nie stwierdzono obecności szpiku na dnie probówki 1.5 mL, należy ponownie odciąć fragment kości i powtórzyć krok 4.3.</li>
	<li>Resuspenduj szpik kostny w 1 mL lodowatego PBS, a następnie przenieś zawiesinę komórkową tego samego genotypu do dopasowanej probówki stożkowej o pojemności 50 mL.</li>
	<li>Dysocjuj komórki, przepuszczając je 10 razy przez igłę 18 G za pomocą strzykawki 10 mL.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesiny pojedynczych komórek przez sitko komórkowe 70 μm. Dodaj dodatkowy lodowaty PBS do uzyskania objętości końcowej 10 mL i resuspenduj komórki, delikatnie używając pipetora.</li>
	<li>Wiruj z prędkością 310 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odsącz nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 10 mL bezzserwatkowego medium RPMI. Odstaw 30 μL tego materiału do zliczenia komórek.</li>
	<li>Oznacz stężenie komórek za pomocą licznika komórek i oblicz objętość zawiesiny komórkowej wymaganą do transplantacji. W przypadku BMT 100% wymagane jest 5 x 106 komórek szpiku kostnego dla każdej myszy biorcy. 
	UWAGA: W przypadku konkurencyjnego BMT przygotuj łącznie 5 x 106 komórek szpiku kostnego składających się z mieszaniny komórek donora (np. CD45.2+) i komórek konkurenta (np. CD45.1+). Zdecydowanie zaleca się przygotowanie nadmiarowych komórek szpiku kostnego. Na przykład, jeśli w grupie eksperymentalnej znajduje się 10 myszy biorców, zazwyczaj przygotowujemy komórki dla 12 myszy biorców.</li>
	<li>Przenieś obliczoną objętość zawiesiny komórkowej do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Wiruj z prędkością 310 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odsącz nadsącz i resuspenduj komórki, używając obliczonej ilości bezzserwatkowego medium RPMI, aby uzyskać odpowiednią gęstość i objętość komórek. Zazwyczaj optymalną objętością do iniekcji zaocznej (retro-orbitalnej) jest 200 μL.</li>
</ol>
5. Transplantacja komórek szpiku kostnego do napromieniowanych myszy
<ol>
	<li>Zanurz myszy biorców w narkozie, stosując 5% isofluranu.</li>
	<li>Podczas gdy myszy są w narkozie, powoli wstrzyknąć 200 μL komórek szpiku kostnego do żyły zakątka ocznego, używając igły 28–30 G i strzykawki insulinowej.
	<ol>
		<li>Alternatywnie można przeprowadzić podanie komórek dawcy poprzez wstrzyknięcie dożylne do żyły ogonowej oraz wstrzyknięcie domięśniowe do jamistej kości udowej, przy maksymalnej objętości odpowiednio 0,2 mL i 25 μL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wstrzyknięciu komórek nanieść kroplę kropli do oczu zawierających proparakainę na powierzchnię oka w celu uśmierzenia bólu. Następnie można pozwolić zwierzęciu odzyskać przytomność.</li>
</ol>
6. Transplantacja komórek szpiku kostnego do myszy niepoddanych kondycjonowaniu
<ol>
	<li>Zanurz myszy biorców w znieczuleniu poprzez inhalację 5% izofluranu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 5 x 106 niefrakcjonowane komórki szpiku kostnego od osobników o dowolnym genotypie do nienapromieniowanych myszy biorców drogą retroorbitalną, przy użyciu strzykawki insulinowej z igłą 28–30 G.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 6.1 i 6.2 przez 3 kolejne dni, tak aby myszy biorcy otrzymały łącznie 1,5 x 107 komórki szpiku kostnego 
	UWAGA: Ponieważ adopcyjne BMT bez procedury warunkowania wymaga przeszczepiania szpiku kostnego przez 3 kolejne dni, należy starać się naprzemiennie aplikować iniekcje do obu oczu.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy podać do dotkniętego oka kroplę kropli do oczu zawierających proparakainę.</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+disease%2C+aging%2C+and+clonal+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li>
<li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li>
<li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li>
<li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25(2019).</li>
<li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li>
<li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li>
<li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li>
<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204(2020).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1%CE%B2%2FNLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li>
<li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li>
<li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li>
<li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li>
<li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens%3A+working+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li>
<li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li>
<li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079(2016).</li>
<li>Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease%3A+the+liver-heart+axis-literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202(2019).</li>
<li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li>
<li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li>
<li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li>
<li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li>
<li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li>
<li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li>
<li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W badaniach hematopoezy klonalnej opisaliśmy trzy metody BMT: BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem z częściowym ekranowaniem oraz rzadziej stosowaną metodę BMT, która nie obejmuje kondycjonowania wstępnego (adoptywne BMT). Metody te zostały wykorzystane do oceny wpływu hematopoezy klonalnej na choroby sercowo-naczyniowe. Badacze mogą odpowiednio modyfikować te metody, aby dopasować je do konkretnego celu swojego badania.
Modele hematopoezy klonalnej H...

Klonalna hematopoeza (CH) to stan, który często obserwuje się u osób starszych i występuje w wyniku rozszerzonego klonu hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) z mutacją genetyczną1. Sugeruje się, że w wieku 50 lat większość osób nabędzie średnio pięć mutacji egzonicznych w każdej klasie HSPC2, ale większość z tych mutacji spowoduje niewielkie lub żadne konsekwencje fenotypowe dla danej osoby. Jeśli jednak przez przypadek jedna z tych mutacji daje przewagę konkurencyjną HSPC – na przykład poprzez promowanie jego proliferacji, samoodnawiania, przetrwania lub jakiejś kombinacji tych zjawisk – może to prowadzić do preferencyjnej ekspansji zmutowanego klonu w stosunku do innych HSPC. W rezultacie mutacja będzie się coraz bardziej rozprzestrzeniać w układzie krwiotwórczym, ponieważ zmutowany HSPC daje początek dojrzałym komórkom krwi, prowadząc do odrębnej populacji zmutowanych komórek we krwi obwodowej. Podczas gdy mutacje w dziesiątkach różnych genów kandydujących są związane ze zdarzeniami klonalnymi w układzie krwiotwórczym, wśród nich mutacje w metylotransferazie DNA 3 alfa (DNMT3A) i translokacji dziesięciu jedenastu 2 (TET2) są najbardziej rozpowszechnione3. Kilka badań epidemiologicznych wykazało, że osoby, które są nosicielami tych mutacji genetycznych, mają znacznie wyższe ryzyko chorób sercowo-naczyniowych (CVD), udaru mózgu i śmiertelności z jakiejkolwiek przyczyny3,4,5,6,7. Chociaż badania te wykazały, że istnieje związek między CH a zwiększoną częstością występowania chorób sercowo-naczyniowych i udaru mózgu, nie wiemy, czy związek ten jest przyczynowy, czy też jest wspólnym epifenomenem związanym z procesem starzenia. Aby lepiej zrozumieć ten związek, potrzebne są odpowiednie modele zwierzęce, które prawidłowo odwzorowują ludzką kondycję CH.
Kilka modeli zwierzęcych CH zostało stworzonych przez naszą grupę i inne przy użyciu danio pręgowanych, myszy i naczelnych innych niż ludzie8,9,10,11,12,13,14. Modele te często wykorzystują metody rekonstytucji układu krwiotwórczego poprzez przeszczepienie komórek zmodyfikowanych genetycznie, czasami przy użyciu rekombinacji Cre-lox lub systemu CRISPR. Podejście to pozwala na analizę specyficznej mutacji genu w komórkach krwiotwórczych w celu oceny, w jaki sposób przyczynia się ona do rozwoju choroby. Ponadto modele te często wykorzystują komórki kongeniczne lub reporterowe do odróżnienia działania komórek zmutowanych od komórek normalnych lub typu dzikiego. W wielu przypadkach do pomyślnego wszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych dawcy wymagany jest schemat kondycjonowania wstępnego.
Obecnie, przeszczep szpiku kostnego myszom biorcom można podzielić na dwie główne kategorie: 1) kondycjonowanie mieloablacyjne i 2) przeszczep bezwarunkowy. Kondycjonowanie mieloablacyjne można osiągnąć za pomocą jednej z dwóch metod, a mianowicie napromieniania całego ciała (TBI) lub chemioterapii15. TBI przeprowadza się poprzez poddanie biorcy śmiertelnej dawce promieniowania gamma lub rentgenowskiego, generując pęknięcia DNA lub wiązania krzyżowe w szybko dzielących się komórkach, czyniąc je nieodwracalnymi16. Busulfanan i cyklofosfamid to dwa powszechnie stosowane leki chemioterapeutyczne, które zaburzają niszę krwiotwórczą i podobnie powodują uszkodzenie DNA szybko dzielących się komórek. Wynikiem netto wstępnego kondycjonowania mieloablacyjnego jest apoptoza komórek krwiotwórczych, która niszczy układ krwiotwórczy biorcy. Strategia ta nie tylko pozwala na pomyślne wszczepienie HSPC dawcy, ale może również zapobiec odrzuceniu przeszczepu poprzez tłumienie układu odpornościowego biorcy. Jednak wstępne kondycjonowanie mieloablacyjne ma poważne skutki uboczne, takie jak uszkodzenie tkanek i narządów oraz ich rezydujących komórek odpornościowych, a także zniszczenie natywnej niszy szpiku kostnego17. W związku z tym zaproponowano alternatywne metody przezwyciężenia tych niepożądanych skutków ubocznych, szczególnie w odniesieniu do uszkodzenia narządów będących przedmiotem zainteresowania. Metody te obejmują ekranowane napromienianie myszy biorców i adoptywne BMT na myszy niekondycjonowane9,17. Osłona klatki piersiowej, jamy brzusznej, głowy lub innych obszarów przed napromieniowaniem poprzez umieszczenie ołowianej bariery chroni tkanki będące przedmiotem zainteresowania przed szkodliwymi skutkami napromieniowania i utrzymuje ich rezydującą populację komórek odpornościowych. Z drugiej strony, adoptywne BMT HSPC dla myszy niekondycjonowanych ma dodatkową zaletę, ponieważ zachowuje rodzimą niszę krwiotwórczą. W tym manuskrypcie opisujemy protokoły i wyniki wszczepienia HSPC po kilku schematach przeszczepu u myszy, w szczególności po dostarczeniu HSPC myszom TBI, myszom częściowo osłoniętym przed napromienianiem oraz myszom niekondycjonowanym. Ogólnym celem jest pomoc naukowcom w zrozumieniu różnych efektów fizjologicznych każdej metody, a także ich wpływu na wyniki eksperymentalne w warunkach CH i chorób sercowo-naczyniowych.

<table><tbody><tr><td>Mikrowirówka 0,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-121</td><td>zapasy ogólne</td></tr><tr><td>Mikrowirówka 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>zapasy ogólne 1/2 cc STRZYKAWKA INSULINOWA O NISKIEJ DAWCE</td><td>EXELINT</td><td>26028</td> zaopatrzenie <td>ogólne</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy absolutny (200 prfof)</td><td>Fisher chemical</td><td>200559</td><td>zaopatrzenie ogólne</td></tr><tr><td>BD 1 ml Tuberkulina Strzykawki 25G 5/8 cala Igła</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>Igła BD PrecisionGlide 18G (1,22 mm X 25 mm)</td><td>Becton Dickinson</td><td>395195</td><td>ogólna dostawa</td></tr><tr><td>Grzejnik cezowy-137 J</td><td>. L. Shepherd&nbsp;</td><td>Sprzęt Mark IV</td><td></td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td>zaopatrzenie ogólne</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych Falcon 100 mm</td> TC <td>Nauki przyrodnicze</td><td>353003</td><td>zaopatrzenie ogólne</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>Sterylne sitka komórkowe Fisherbrand, 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>Hartowane drobne nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>Roztwór izotezji (izofluranu)</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>roztwór</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Zoetis</td><td>043-304</td><td>wtrysk</td></tr><tr><td>Wycieraczki Kimwipes Delicate Task</td><td>Kimtech Science</td><td>KCC34155</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Solution</td></tr><tr><td>RadDisk &ndash; Dysk natchnienia gryzoni</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M zaopatrzenie</td><td>ogólne</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Sulfametoksazol i trimetoprim</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td>iniekcja</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td>iniekcja</td></tr><tr><td>promiennik rentgenowski</td><td>Źródło Rad Sprzęt</td><td>RS-2000</td><td></td></tr></tbody></table>

procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Klonalna hematopoeza jest powszechnym stanem związanym z wiekiem, który wynika z nagromadzenia mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC). Mutacje w genach sterujących, które nadają sprawność komórkową, mogą prowadzić do rozwoju rozszerzających się klonów HSPC, które w coraz większym stopniu powodują powstawanie leukocytów potomnych zawierających mutację somatyczną. Ponieważ hematopoeza klonalna jest związana z chorobami serca, udarem mózgu i śmiertelnością, opracowanie systemów eksperymentalnych, które modelują te procesy, jest kluczem do zrozumienia mechanizmów, które leżą u podstaw tego nowego czynnika ryzyka. Procedury przeszczepu szpiku kostnego obejmujące kondycjonowanie mieloablacyjne u myszy, takie jak napromienianie całego ciała (TBI), są powszechnie stosowane do badania roli komórek odpornościowych w chorobach sercowo-naczyniowych. Jednak jednoczesne uszkodzenie niszy szpiku kostnego i innych miejsc zainteresowania, takich jak serce i mózg, jest nieuniknione w przypadku tych procedur. W związku z tym nasze laboratorium opracowało dwie alternatywne metody minimalizacji lub uniknięcia możliwych skutków ubocznych spowodowanych przez TBI: 1) przeszczep szpiku kostnego z osłoną przed napromienianiem oraz 2) adoptywne BMT dla myszy niekondycjonowanych. W narządach osłoniętych lokalne środowisko jest zachowane, co pozwala na analizę hematopoezy klonalnej, podczas gdy funkcja rezydentnych komórek odpornościowych jest niezakłócona. W przeciwieństwie do tego, adoptywne BMT dla myszy niekondycjonowanych ma dodatkową zaletę, że zachowane są zarówno lokalne środowiska narządów, jak i nisza krwiotwórcze. W tym miejscu porównujemy trzy różne podejścia do rekonstytucji komórek krwiotwórczych i omawiamy ich mocne i słabe strony w badaniach hematopoezy klonalnej w chorobach sercowo-naczyniowych.

Aby porównać wpływ trzech metod BMT/warunkowania wstępnego na przyjmowanie się komórek dawcy, za pomocą cytometrii przepływowej przeanalizowano frakcje komórek dawcy we krwi obwodowej i tkance serca w 1. miesiącu po BMT. Izolowane komórki barwiono na specyficzne markery leukocytarne w celu zidentyfikowania różnych podgrup leukocytów. W badaniach tych typy dzikie (typ dziki (WT) Komórki szpiku kostnego dawcy C57BL/6 (CD45.2) podano do typ dziki B6.SJL-PtprcaPrpc...

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Nasz protokół pomoże naukowcom zrozumieć fizjologiczne skutki trzech różnych metod przeszczepu szpiku kostnego i ich wpływ na wyniki eksperymentalne w warunkach hematopoezy klonalnej. Przeszczep szpiku kostnego z promieniowaniem całego ciała może negatywnie wpływać na narządy sercowo-naczyniowe i zmieniać patogenezę choroby. Dlatego nasze laboratorium opracowało dwie alternatywne metody, aby zminimalizować lub uniknąć możliwych skutków ubocznych.Procedury zademonstrują Eunbee Park, doktorantka, i Megan Evans, doktorantka, obie z mojego laboratorium W celu ekranowania klatki piersiowej i brzucha umieść regulowaną tackę i promiennik rentgenowski w odpowiedniej odległości, aby uzyskać równomierne napromieniowanie. I umieść znieczulone myszy na płaskiej płytce led odwróconej do siebie w pozycji leżącej. Przymocuj łapy do płytki za pomocą taśmy i umieść osłonę led tak, aby dolny koniec wyrównał się z kością xiphisternum, a górny koniec ołowianej osłony znajdował się w pobliżu grasicy.Po osłonięciu umieść myszy w promienniku i wystaw zwierzęta na działanie dwóch 5,5 szarych frakcji napromieniowania oddzielonych od siebie w odstępie od czterech do 24 godzin. Aby osłonić głowę, ostrożnie przyklej cztery łapy myszy do brzucha. Umieść mysz w stożkowym ograniczniku i wsuń ogranicznik w szczelinę w osłonie ołowianej, tak aby głowa i uszy myszy były całkowicie zakryte, pozostawiając resztę ciała myszy wystawioną na promieniowanie.Po ekranowaniu umieść myszy w promienniku i wystaw zwierzęta na działanie 5,5 szarych frakcji promieniowania oddzielonych od siebie w odstępie od czterech do 24 godzin. Po każdym radioterapii umieść znieczulone myszy w klatce na podgrzewanej macie z monitorowaniem, aż do całkowitego wyzdrowienia. Aby wyizolować kości, zdezynfekuj skórę myszy dawcy 70% etanolem i wykonaj małe poprzeczne nacięcie skóry poniżej klatki piersiowej.Trzymając mocno skórę po obu stronach nacięcia, rozerwij w przeciwnych kierunkach w kierunku głowy i stóp i oderwij skórę od wszystkich kończyn. Przetnij ramiona i stawy łokciowe i użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć przyczepione mięśnie i tkanki łączne z kości ramiennej. Ostrożnie zwichnij stawy między kością udową a biodrową.I użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż głów kości udowej, aby odłączyć nogi. Przeciąć staw kolanowy, aby oddzielić kość udową i piszczelową. I użyj chusteczek laboratoryjnych, aby ostrożnie usunąć przyczepione mięśnie i tkanki łączne z kości.Następnie przeciągnij kości myszy o tym samym genotypie do pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówek zawierających 20 mililitrów lodowatego sterylnego PBS na lodzie. Aby wyizolować komórki szpiku kostnego w szafce o drugiej klasie bezpieczeństwa biologicznego, użyj igły o rozmiarze 18, aby zrobić mały otwór na dnie sterylnej mikroprobówki o pojemności 500 mikrolitrów. I umieść probówkę w pojedynczej sterylnej 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej zawierającej 100 mikrolitrów lodowatego sterylnego PBS.Po przygotowaniu wszystkich probówek należy wyjąć PBS z probówki zawierającej wyizolowane kości i przenieść kości na sterylne 100-milimetrowe naczynie do hodowli komórek. Użyj drobnych kleszczyków i małych nożyczek, aby ostrożnie usunąć nasadę z końców każdej kości i umieść do sześciu kości w każdej probówce o pojemności 500 mikrolitrów. Gdy wszystkie kości zostaną przecięte, wyekstrahuj komórki szpiku kostnego przez odwirowanie.Jeśli cała zawartość szpiku została usunięta, kości powinny wydawać się białe i półprzezroczyste ze stosunkowo dużą czerwoną osadką na dnie 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. W przypadku przeszczepu komórek szpiku kostnego należy rozcieńczyć izolowane komórki szpiku kostnego w pożywce RPMI wolnej od surowicy i załadować 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do jednej strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 mililitra na mysz do wstrzyknięcia. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, powoli wstrzyknij całą objętość komórek do żyły tylnej oczodołu każdego znieczulonego biorcy.Następnie umieść kroplę proparakainy na oku, aby złagodzić ból. I pozwól myszy odzyskać przytomność podczas monitorowania. Porównanie wpływu trzech metod kondycjonowania wstępnego BMT na wszczepienie komórek dawcy.Frakcje komórek dawcy we krwi obwodowej i tkance serca analizowano za pomocą cytometrii przepływowej po upływie jednego miesiąca od BMT. W tej reprezentatywnej analizie, we krwi obwodowej myszy biorców, które otrzymały napromienianie całego ciała, monocyty, neutrofile i limfocyty B zostały w dużej mierze usunięte i zastąpione potomstwem komórek pochodzących ze szpiku kostnego dawcy. Ponadto populacje monocytów serca i neutrofili u biorców zostały prawie całkowicie zastąpione komórkami pochodzącymi od dawców.W grupie częściowo osłoniętej napromienianiem, wymiana komórek odpornościowych serca pochodząca od dawcy była niewielka. Komórki szpiku kostnego myszy biorcy w osłoniętych obszarach prawdopodobnie przyczyniły się do niższego poziomu rekonstytucji krwi obwodowej w porównaniu z myszami, które otrzymały napromienianie całego ciała. W grupie bez kondycjonowania BMT, komórki pochodzące od dawcy były wykrywalne we krwi obwodowej i sercach myszy biorców po czterech tygodniach od BMT.Ponadto komórki dawcze z niedoborem Tet2 stopniowo rozszerzały się z czasem. Dla porównania, myszy biorcy wszczepione komórkami dawcy typu dzikiego wykazywały minimalną ekspansję klonalną komórek dawcy. Optymalizacja tych modeli eksperymentalnych umożliwi bardziej rygorystyczne badania genów napędzających klonalną hematopoezę, które przyczyniają się do śmiertelności z różnych przyczyn, takich jak choroby sercowo-metaboliczne i nowotwory.Mamy nadzieję, że nasze protokoły pozwolą naukowcom badać hematopoezę klonalną, aby zbadać, w jaki sposób przyczynia się ona do chorób sercowo-naczyniowych i innych stanów chorobowych.

bone-marrow-transplantation-procedures-mice-to-study-clonal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje indukcję choroby jelitowej przeszczep przeciwko gospodarzowi, GvHD, u śmiertelnie napromieniowanej myszy biorcy przy użyciu allogenicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i indukujących GvHD alloreaktywnych limfocytów T indukujących śledzionę. Protokół ten pomaga w ustaleniu modelu ciężkiej ostrej choroby jelitowej GvHD, aby zrozumieć mechanizm choroby i opracować innowacyjne opcje terapeutyczne.

Indukcja choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w modelach mysich za pomocą allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego i komórek śledziony

Ten protokół opisuje procedurę seryjnego pobierania próbek szpiku kostnego kości udowej (BM) bez konieczności poświęcania myszy. Procedura ta ułatwia badania podłużne składu BM myszy w czasie i zapewnia szeregowy dostęp do komórek w BM do badań ex vivo i transplantacji.

Aspiracja szpiku kostnego kości udowej u żywych myszy

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Opisujemy protokół, w którym kondycjonowanie busulfanu pozwala na zastąpienie szpiku kostnego myszy biorcy komórkami szpiku kostnego od myszy dawców, które powszechnie wyrażają zielone białko fluorescencyjne, przy braku napromieniowania. Technika ta jest przydatna do badania akumulacji komórek szpiku kostnego w ośrodkowym układzie nerwowym.

Busulfanu jako środek mielosupresyjny do generowania stabilnego chimeryzmu szpiku kostnego na wysokim poziomie u myszy

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania konkurencyjnych eksperymentów z przeszczepem szpiku kostnego myszy w celu zbadania funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych bez wcześniejszego oczyszczania komórek macierzystych przez sortowanie komórek.

Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

Ten manuskrypt zawiera opis metodologii użytej do ustanowienia modeli myszy transdukcyjno-transplantacyjnych. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat błędów technicznych, których należy unikać podczas wykonywania przeszczepów szpiku kostnego. Należy uzyskać jasne zrozumienie znaczenia wysokiego miana wirusa, transfekcji/transdukcji i napromieniania.

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Poznaj trzy metody przeszczepu szpiku kostnego u myszy do badania hematopoezy klonalnej, w tym napromieniowanie całego ciała, osłonowe i bez kondycjonowania. Protokoły te minimalizują działania niepożądane i poprawiają wyniki eksperymentalne.

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Przeglądaj więcej filmów