Przygotowanie dorosłego osobnika Drosophila melanogaster do obrazowania całego mózgu podczas reakcji na zachowanie i bodźce
April 27th, 2021
Prezentujemy metodę specjalnie dostosowaną do obrazowania całego mózgu dorosłego Drosophila podczas zachowania i w odpowiedzi na bodźce. Głowa jest ustawiona tak, aby umożliwić optyczny dostęp do całego mózgu, podczas gdy mucha może poruszać nogami i czułkami, czubkiem trąbki, a oczy mogą odbierać bodźce czuciowe.
Nasz protokół umożliwia obrazowanie całego mózgu muchy podczas zachowania, co jest ważne dla zrozumienia, w jaki sposób neurony w różnych obszarach mózgu oddziałują na siebie, kształtując zachowanie. W przeciwieństwie do innych opublikowanych protokołów, ten został opracowany specjalnie w celu uzyskania dostępu do całego mózgu, podczas gdy mucha zachowuje się i wyczuwa za pomocą zapachu, smaku lub stymulacji wizualnej. Aby utworzyć szczelinę główną.
Po wydrukowaniu uchwytu za pomocą drukarki 3D umieść kawałek taśmy klejącej prostokątnie na płaskiej powierzchni pod mikroskopem stereoskopowym. I wytnij kawałek o wymiarach około pięciu milimetrów na jeden centymetr. Użyj dwóch skalpeli połączonych ze sobą równolegle, aby wyciąć następną szczelinę o wymiarach 400 na 400 mikrometrów pośrodku dłuższego boku taśmy i umieść taśmę po bardziej płaskiej stronie otworu na spodzie uchwytu.
Użyj kleszczy, aby popchnąć taśmę około 500 mikrometrów wokół otworu. I użyj czarnego lakieru do paznokci, aby zakryć górną część taśmy i uchwyt. Po pozostawieniu lakieru do paznokci do wyschnięcia przez co najmniej godzinę, użyj zwiniętej chusteczki do napełnienia rowka na głowę, około jednego mikrolitra tłuszczu.
Aby przygotować szczelinę na korpus, pokrój około dwucentymetrowy kawałek taśmy na dwie części i wytnij plastry o szerokości 1,5 milimetra. Następnie wytnij szczelinę na ramię i korpus o głębokości 0,3 milimetra i upewnij się, że taśma pasuje do uchwytu. Aby przymocować muchę do uchwytu, najpierw umieść płytki pojemnik z lodem pod mikroskopem preparacyjnym i umieść uchwyt do góry nogami na kawałku tkanki laboratoryjnej umieszczonej nad lodem.
Odessaj jedno- lub czterodniową samicę muszki owocowej z jej podłości i zdmuchnij muchę na niestopiony lód. Gdy mucha przestanie się poruszać, użyj kleszczyków firmy Dell, aby chwycić muchę u podstawy skrzydeł i wsuń muchę do uchwytu z szyjką w gnieździe. Oczy powinny być równomiernie ustawione po obu stronach szczeliny.
W razie potrzeby dodaj jeden mikrolitr smaru na czubek głowy, aby klej nie dotarł do tyłu głowy. Następnie przykryj ciało chusteczką i odrobiną lodu, aby mucha się nie poruszyła. Aby zabezpieczyć głowę, umieść ją pod kątem około 20 stopni od całkowicie tylnego widoku.
I użyj zwiniętej chusteczki, aby nałożyć klej UV wokół głowy, unikając zabrudzenia obszaru zainteresowania sensorycznego. W przypadku eksperymentów smakowych użyj kleszczy, aby wyciągnąć trąbkę i dodaj klej do podstawy trąbki, aby zapobiec ruchom. Jeśli nie jest planowany eksperyment smakowy, wepchnij i przyklej trąbkę do głowy.
Utwardź klej światłem UV przez pięć sekund i użyj zwiniętej chusteczki, aby dokładnie oczyścić obszary otaczające głowę, aby usunąć pozostały płynny klej, który mógłby przykleić się do nóg i drzwi, ziemi, obszarów czuciowych. Następnie użyj cienkiego paska taśmy lub chusteczki, aby w razie potrzeby przesunąć nogi do przodu. Aby ustawić korpus, wyjmij pojemnik na lód i obróć uchwyt.
Usuń wodę wokół muchy i działaj szybko, zanim mucha wyzdrowieje ze znieczulenia, umieść taśmę szczelinową na ciele nad otworem i delikatnie popchnij ciało muchy w dół, uważając, aby nie rozciągnąć nadmiernie szyi. Zakryj pozostałe duże otwory taśmą i dodaj około jednego mikrolitra tłuszczu z tyłu głowy, aby zapobiec przywieraniu kleju w tym miejscu. Użyj zwiniętej chusteczki do pomalowania kleju UV wokół klatki piersiowej oraz na taśmie i klatce piersiowej, a następnie utwardź klej światłem UV przez około pięć sekund.
Ostrożnie usuń tłuszcz i nieutwardzony klej chusteczką laboratoryjną i dodaj około jednego mililitra soli fizjologicznej na czubek głowy. Użyj kleszczy, aby odsunąć na bok wszelkie pęcherzyki powietrza i sprawdź, czy nie ma wycieków, umieszczając szkiełko nakrywkowe na soli fizjologicznej i obracając uchwyt, aby sprawdzić, czy na przedniej stronie nie ma soli fizjologicznej. Jeśli zaobserwuje się sól fizjologiczną, usuń sól fizjologiczną i zamocuj otwór większą ilością kleju lub smaru.
Aby wypreparować głowę, wybierz największe powiększenie i użyj zaostrzonych, bardzo cienkich kleszczy, aby wykonać dwa nacięcia u podstawy środkowego ciemnego trójkąta naskórka po obu stronach szyi. Wytnij wokół ciemnego trójkąta i usuń tę część naskórka. Mięsień 16 i przełyk powinny być widoczne przez ten otwór i poruszać się rytmicznie.
Użyj bardzo cienkich kleszczy, aby ostrożnie uszczypnąć górną część tego obszaru, aby przeciąć mięsień 16 bez nakłuwania przełyku. Jeśli rytmiczny ruch ustaje, mięsień 16 prawdopodobnie został usunięty. Kiedy mięsień zostanie wycięty, zaczynając od przyśrodkowej krawędzi obszaru ciemnego trójkąta, użyj kleszczy jak nożyczek, aby ostrożnie przeciąć i usunąć pozostały naskórek na małe kawałki.
Następnie użyj kleszczy, aby chwycić i powoli i systematycznie odciągać jeden worek powietrzny na raz. W tym filmie sonda wapniowa została wyrażona we wszystkich neuronach tych dwóch mózgów muszek owocowych. I pojawił się podmuch zapachu.
W tym eksperymencie ekspresja czujnika wapnia była ograniczona do neuronów dopaminergicznych i serotoninergicznych. Zwróć uwagę na ścisłą korelację między silną synchroniczną aktywnością mózgu a zachowaniem muchówek podczas chodzenia, co ilustruje, w jaki sposób cały mózg może być obserwowany podczas określonego zachowania. Korzystając z analizy składowych głównych i analizy składowych niezależnych, można wyodrębnić różne obszary funkcjonalne podświetlone różnymi kolorami.
Kształt i lokalizacja obszarów funkcjonalnych pozwala na odwzorowanie regionów na szablonach anatomicznych. Aby zidentyfikować regiony mózgu, a w niektórych przypadkach typy neuronów. Po dopasowaniu do odpowiedniego szablonu anatomicznego wartości fluorescencji można uśrednić w określonych anatomicznych obszarach mózgu w celu analizy ilościowej.
Na przykład w tej analizie możemy zaobserwować, że wszystkie regiony są bardziej aktywne podczas chodzenia niż podczas pielęgnacji. Uzbrój się w cierpliwość. Nauczenie się tej techniki sekcji serca jest trudne.
W moim laboratorium ludzie potrzebują średnio trzech do czterech miesięcy, zanim opanują to i otrzymają pierwsze przydatne przygotowania. Postępując zgodnie z tym protokołem, możemy rejestrować aktywność mózgu na dużą skalę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Szczególnie wskazane są szybkie metody, takie jak mikroskopia w polu świetlnym.
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodę obrazowania, aby wizualizować cały mózg dorosłych Drosophila podczas zachowań i reakcji na bodźce sensoryczne. Technika ta pozwala zarówno na dostęp optyczny, jak i ruch muchy, ułatwiając obserwację interakcji neuronowych podczas czynności takich jak chodzenie i reagowanie na zapachy.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia zachowań
- Techniki obrazowania
Tło
- Rozumienie interakcji neuronowych podczas zachowań jest kluczowym czynnikiem do odszyfrowywania, jak obszary mózgu kształtują zachowania.
- Poprzednie metody obrazowania nie pozwalały efektywnie na dostęp do całego mózgu podczas aktywnego zachowania organizmu.
- To badanie innowuje poprzez stworzenie uchwytu głowy, który umożliwia ruch podczas obrazowania.
- Sensory wapnia pomagają wizualizować aktywność neuronów w reakcji na bodźce.
Cel badania
- Opracowanie kompleksowego protokołu obrazowania dla mózgu Drosophila podczas zachowania.
- Obserwowanie synchronicznej aktywności neuronów związanych z określonymi zachowaniami, takimi jak chodzenie i reakcja sensoryczna.
- Zrozumienie korelacji między aktywnością mózgu a określonymi działaniami w żywym organizmie.
Stosowane metody
- Metoda wykorzystuje mikroskopy fluorescencyjne do rejestracji aktywności mózgu na dużą skalę.
- Drosophila melanogaster jest używana jako model biologiczny, koncentrując się na dorosłych muszkach owocowych.
- Stworzono niestandardowe uchwyty głowy i ciała dla nieruchomości podczas obrazowania.
- Kluczowe kroki obejmują staranne anatomiczne sekcjonowanie i zastosowanie kleju UV do stabilizacji.
- Technika polega na prezentowaniu różnych bodźców sensorycznych, umożliwiając obserwację reakcji neuronowych.
Główne wyniki
- Obrazy ujawniają silną korelację między aktywnością neuronową a zachowaniem chodu much.
- Funkcjonalne regiony mózgu są identyfikowane i mapowane na szablony anatomiczne.
- Badanie wykazuje wyższy poziom aktywności w pewnych regionach mózgu podczas chodzenia w porównaniu z czyszczeniem.
- Metody takie jak analiza głównych składowych dalece wyjaśniają funkcjonalność regionów mózgu.
Wnioski
- To badanie pokazuje nowy sposób badania dynamiki neuronowej podczas zachowań u Drosophila.
- Metoda zwiększa zrozumienie przetwarzania sensorycznego i działania w czasie rzeczywistym.
- Uzyskane wnioski mogą przyczynić się do szerszej wiedzy na temat mechanizmów neuronowych i reakcji behawioralnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables whole-brain imaging in behaving Drosophila, providing a scalable model for de-risking target validation in early discovery. By linking neural circuit activity to behavior and stimulus response, it supports mechanistic insight for phenotypic screening and assay development pipelines. The approach enhances predictive confidence in target engagement and pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating whole-brain activity with specific behaviors such as walking or grooming.
- Operational Value: Supports functional target validation through real-time observation of neuronal responses to sensory stimuli like odor, taste, or visual cues.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by mapping functional brain regions to anatomical templates for target engagement analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling quantitative fluorescence readouts of neuronal activity during behavior.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through stabilized head fixation and minimal behavioral perturbation.
- Scalability: Supports platform reuse for compound evaluation in disease-relevant systems requiring behavioral readouts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase neural activity measurements to preclinical validation via brain-wide functional mapping.
- Biomarker Alignment: Enables identification of neuron-type-specific activity patterns (e.g., dopaminergic, serotonergic) for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by linking target modulation to measurable changes in brain-wide activity during behavior.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating neuronal activity patterns with specific behaviors and sensory responses.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative fluorescence measurements in behaving organisms.
- Analytics: Utilizes principal and independent component analysis to extract functional brain regions for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via anatomical mapping of functional regions to established brain templates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal target validation across multiple sensory modalities and behavioral paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of neuronal dynamics during behavior.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via optimized head fixation, dissection, and stabilization protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target-pathway-behavior relationships.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative brain-wide activity changes in response to target modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, microsurgery, and fluorescence imaging for successful head dissection and preparation.
- Depends on 3D-printed holders, UV glue, saline perfusion, and fluorescence microscopy infrastructure for consistent results.
- Necessitates cross-team standardization in sample preparation, stimulus delivery, and image analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations across model systems due to species-specific anatomy and behavioral repertoires.
- Limited by the steep learning curve, with mastery requiring three to four months of practice as reported in source material.
