Charakterystyka i przewidywanie funkcjonalne bakterii w tkankach jajnika
October 23rd, 2021
Przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne i sekwencjonowanie genu 16S rybosomalnego RNA (genu 16S rRNA) w celu odkrycia i rozróżnienia bakterii w nowotworowych i nienowotworowych tkankach jajnika in situ. Różnice składowe i funkcjonalne bakterii przewidywano za pomocą BugBase i Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).
Protokół ten ma na celu wykrycie bakterii w tkankach jajnika i przewidywanie ich funkcji. Barwienie immunohistochemiczne i sekwencjonowanie 16S rRNA zastosowano w celu odkrycia i rozróżnienia bakterii w nowotworowych i nienowotworowych tkankach jajnika in situ. Różnice kompensacyjne i funkcjonalne bakterii są przewidywane za pomocą BoP i komórkowo-genetycznego badania społeczności poprzez rekonstrukcję nieobserwowanych dni.
Nasz protokół ma na celu ekstrakcję bakterii z tkanek jajnika in situ. Może być również używany do odkrywania bakterii w wszelkiego rodzaju nowotworach. Głównymi zaletami naszego protokołu jest to, że jest łatwy i wygodny, że można go zrealizować w prawie każdym laboratorium.
Szybkie jest również uzyskanie wyników. Podczas praktyki w protokole ważne jest, aby wykluczyć wszelkie bakterie znajdujące się poza tkankami nowotworowymi. W związku z tym wszystkie procedury w tym protokole muszą być sterylne.
Podczas operacji należy rozdzielić wycięte jajniki na próbki tkanek o grubości około jednego centymetra za pomocą nowej sterylnej pęsety. Unikaj dotykania czegokolwiek innego podczas całej procedury. Po rozdzieleniu wyjąć próbkę do sterylnej probówki i umieścić ją w ciekłym azocie w celu transmisji.
Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Utrwal tkanki za pomocą formaliny, a następnie zanurz je w parafinie. Ten protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu.
Tkanki można przechowywać w temperaturze pokojowej w celu dłuższej konserwacji. W celu wykonania dalszych kroków należy pociąć próbki na pięć mikrometrycznych odcinków seryjnych. Następnie wysusz próbki.
Wykonaj deparafinę i ponowne nawodnienie próbek. Aby pobrać antygen, potrzebna jest 10-minutowa obróbka mikrofalowa w buforze EDTA. Zanurz próbki w PBS, który zawiera 0,3% wodoru.
Peroksydacja przez 20 minut, aby zatrzymać aktywność endogennej peroksydazy. Wykonać przeciwciało EMA w rdzeniu LPS, w stężeniu 1 na 300. I utrzymuj go przez jedną noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Aby odkryć bakterie, użyj zestawu substratów DAP, aby wykryć obecność HRP. Opierając się na instrukcjach producenta, użyj polimeru HRP, przeciwciała anty-królika. Użyj koncentratora stołowego, aby przeciwciała w pełni się połączyły.
Użyj PBS do eliminacji niepołączonych przeciwciał. Wykonaj barwienie chemiczne zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie spłucz próbki pod wodą. Wykonaj odwodnienie próbek.
Próbki garniturów przez podpisanie. I wprowadź jako próbkę za pomocą biblioteki obrazowania Pro Plus Prepare opartej na protokole producenta. Ćwicz wzór startera, który składa się z sekwencji specyficznych dla genu i sekwencji nukleotydowych zwisających adaptera Illumina.
Aby wzmocnić wskaźniki urodzeń dla regionu V4 bakteryjnych 16 na sekwencjach genów rRNA, amplifikuj matrycę z próbki wejściowej DNA za pomocą amplikonu PCR. Użyj kulek magnetycznych Mag-Bind RxNPure Plus, aby usunąć mieszaninę reakcyjną z produktu PCR. Wykonaj indeksowaną amplifikację PCR po raz drugi.
Użyj Agilent 2200 TapeStation, aby sprawdzić bibliotekę. Użyj systemu QuantiFluor dsDNA do ilościowego określenia biblioteki. Przy 600 cyklach standardowa komórka przepływowa v3 wytwarza około 100 000 sparowanych końców.
2 razy 300 podstawa 3. Biblioteki są zdenormalizowane, połączone w pulę i sekwencjonowane. Surowe dawki każdej próbki są filtrowane na podstawie jakości sekwencjonowania przez Trimmomatic.
Sekwencje podkładu i adaptera powinny zostać usunięte. Odczyty sekwencji, w których zarówno para, jak i jakość są mniejsze niż 25, powinny zostać skrócone. Przeanalizuj 16s rRNA za pomocą pakietu oprogramowania QIIME.
Zbierz sekwencje, aby utworzyć OTU z punktem odcięcia podobieństwa na poziomie 97%W przypadku OTU w każdej próbce należy obliczyć względną liczebność. Zastosuj klasyfikator bayesowski, który znajduje się w zestawie treningowym RDP, aby posortować wszystkie sekwencje. Przy danej OTU do OTU przypisuje się klasyfikację, która ma główną spójność sekwencji.
OTU są dostosowane do bazy danych Silva, na podstawie informacji o grupie próbki. Wykonaj analizę różnorodności alfa i współrzędnych głównych opartą na UniFrac. Aby przewidzieć powiązaną prezentację cech bakterii, użyj BugBase.
Przewidywanie składu funkcjonalnego metagenomu w PICRUSt. Korzystając z danych monitorujących i bazy danych zawierającej genomy referencyjne, analizuj różne funkcje w każdej grupie za pomocą oprogramowania STAMP. Użyj jednego oprogramowania statystycznego, aby obliczyć wynik.
Wskazanie istotności statystycznej powinno być ustawione na p mniejsze niż 0,05. Oblicz czynniki zakłócające, które obejmują wiek i parzystość, za pomocą testu t-Studenta. Oblicz stan menopauzy, historię nadciśnienia tętniczego i cukrzycy za pomocą testu Chi-kwadrat.
Oblicz liczbę taksonów bakterii jajnika za pomocą testu U Manna-Whitneya. Do badania włączono 16 pacjentek. BugBase wykorzystano do ćwiczenia analizy przewidywanych metagenomów.
Potencjalnie patogenetyczna i immunohistochemia jajników z wykorzystaniem przeciwciała przeciwbakteryjnego LPS. Rysunek ten pokazuje bogactwo i różnorodność bakterii w grupie nowotworowej i kontrolnej. Ujawnione przez sekwencjonowanie 16S rRNA.
Rysunki są indeksem obserwowanych gatunków. Indeks Chao1, indeks ACE, indeks Shannona, indeks równomierności, indeks Simpsona, odpowiednio. Na tym rysunku przedstawiono względną liczebność gromady i 12 najliczniejszych gatunków bakterii w próbkach jajników.
Rysunek A, B, C i D. Oznacza względną obfitość panelu w jajnikach pacjentek z grupy kontrolnej i grupy z rakiem jajnika. Względna liczebność dwunastu najliczniej występujących gatunków bakterii w jajnikach pacjentek z grupy kontrolnej i grupy z rakiem jajnika. Jest to najpowszechniejsze, zgrupowane przy użyciu PCoA i względnej obfitości Anoxynatronum sibiricum i Methanosarcina vacuolata.
Rysunek A przedstawia najczęściej spotykane obiekty, które zostały zgrupowane przy użyciu PCoA. PC1 i PC2 są wykreślane na osi x i y. Czerwony blok jest równy próbce z grupy raka jajnika.
Niebieskie kółko jest równe próbce w grupie kontrolnej. Próbki z grupy raka jajnika można oddzielić od innych próbek z grupy kontrolnej. Rysunek B przedstawia najpowszechniejsze obiekty, które zostały zgrupowane przy użyciu PCoA.
PC1 i PC2 są wykreślane na osiach x i y. Czerwony blok jest równy próbce z grupy raka jajnika. Niebieskie pełne koło jest równe próbce pobranej od pacjentki z mięśniakiem macicy.
A niebieskie puste koło jest równe próbce pacjentki z adenomiozą macicy. Rysunek C przedstawia względną liczebność Anoxynatronum sibiricum. Rysunek D to Methanosarcina vacuolata.
Rysunek ten przedstawia analizę BugBase przewidywanej metagenomiki. Potencjalnie patogenetyczny i tolerancyjny fenotyp stresu oksydacyjnego jajników w grupie nowotworowej był silniejszy niż w grupie kontrolnej. Liczba ta znacząco różni się od przestrzeni ścieżki KEGG między grupą nowotworową a grupą kontrolną za pomocą analizy PICRUSt.
Kiedy otrzymamy nasze próbki, potrzebna jest para nowych sterylnych pęset. Zwróć uwagę na potencjalne zanieczyszczenie próbek. Że bakterie poza miejscowymi tkankami nowotworowymi mogą znacznie wpływać na rozdzielczość.
Preferowane jest ustawienie grupy kontrolnej na każdym kroku. W celu zmniejszenia skutków potencjalnego zanieczyszczenia.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół został zaprojektowany do wykrywania i rozróżniania bakterii w nowotworowych i nienowotworowych tkankach jajnika in situ. Zastosowano barwienie immunohistochemiczne i sekwencjonowanie 16S rRNA w celu przewidzenia różnic kompozycyjnych i funkcjonalnych bakterii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Onkologia
- Immunologia
Tło
- Zrozumienie składu bakteryjnego w tkankach jajnika może zapewnić wgląd w biologię raka.
- Barwienie immunohistochemiczne umożliwia wizualizację bakterii w próbkach tkankowych.
- Sekwencjonowanie 16S rRNA jest potężnym narzędziem do identyfikacji gatunków bakterii.
- Narzędzia predykcyjne, takie jak BugBase i PICRUSt, mogą wywnioskować funkcje bakterii na podstawie ich informacji genetycznych.
Cel badania
- Wyodrębnienie i identyfikacja bakterii z tkanek jajnika.
- Porównanie populacji bakteryjnych w tkankach nowotworowych i nienowotworowych.
- Przewidywanie funkcyjnych ról zidentyfikowanych bakterii.
Zastosowane metody
- Barwienie immunohistochemiczne do wizualizowania tkanek.
- Sekwencjonowanie genu 16S rRNA do identyfikacji bakterii.
- BugBase do przewidywania składu bakteryjnego.
- PICRUSt do przewidywania funkcyjnych różnic między bakteriami.
Główne wyniki
- Identyfikacja odrębnych populacji bakteryjnych w nowotworowych i nienowotworowych tkankach jajnika.
- Przewidywania funkcyjne wskazują na różnice w zdolnościach metabolicznych między dwoma typami tkanek.
- Protokół jest przystosowany do zastosowania z różnymi typami guzów.
Wnioski
- To badanie dostarcza ram dla zrozumienia roli bakterii w raku jajnika.
- Metody są dostępne i mogą być wdrożone w większości laboratoriów.
- Dalsze badania mogą zgłębić konsekwencje tych społeczności bakteryjnych w progresji raka.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding microbial presence in ovarian tissues addresses a growing need to de-risk cancer target hypotheses by revealing microenvironmental factors that may influence tumor biology. This protocol enables biopharma R&D to assess bacterial contributions to oncogenic pathways, supporting mechanistic insight in early discovery. By providing a standardized method to detect and functionally predict tissue-associated microbes, it aids in prioritizing targets with stronger translational confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates tumor microenvironment hypotheses by identifying bacteria differentially abundant in cancerous versus non-cancerous ovarian tissues.
- Operational Value: Uses immunohistochemistry and 16S rRNA sequencing to spatially resolve and quantify bacterial presence in situ.
- Predictive Value: Employs BugBase and PICRUSt to infer functional phenotypes, such as pathogenicity and oxidative stress tolerance, linked to cancer phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable 16S rRNA sequencing outputs suitable for comparative microbial profiling across sample groups.
- Reproducibility: Incorporates contamination controls and sterile tissue handling to ensure reliable detection of true tissue-associated signals.
- Scalability: Compatible with high-throughput sequencing and bioinformatics pipelines for broader application across tumor types.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Detects microbial signatures in human ovarian cancer tissues, supporting relevance to human pathophysiology.
- Translational Continuity: Enables longitudinal tracking of microbial shifts from normal to malignant states, informing biomarker discovery.
- Mechanistic De-risking: Predicts functional microbial contributions (e.g., metabolic pathways) that may modulate tumor progression or therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation to preclinical validation, particularly in immuno-oncology and microenvironment-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing whether specific bacteria are enriched in tumor tissues and associated with cancer phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microbial profiling data that can be integrated with multi-omics datasets for target prioritization.
- Analytics: Provides functional predictions via BugBase and PICRUSt, enabling comparison of metabolic and phenotypic potentials between groups.
- Translational Research: Connects microbial detection to cancer biology through differential abundance and functional inference in patient-derived tissues.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other solid tumors, allowing cross-cancer microbiome studies using a standardized workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking microbial presence to functional phenotypes in cancer-relevant pathways.
- Operational Value: Employs accessible techniques (IHC, 16S sequencing, bioinformatics) feasible in most research laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying microbial confounders or modulators of tumor biology early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target selection by accounting for microenvironmental variables that may affect drug efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, molecular biology, and bioinformatics for sequencing and functional prediction.
- Necessitates sterile tissue handling, PCR equipment, sequencing platforms, and tools like QIIME, Trimmomatic, and STAMP.
- Demands standardized protocols across sites to minimize contamination and ensure comparability of microbial data.
- Must account for host tissue variability and low biomass challenges when applying to other organ systems.
- Limited by detection sensitivity in low-abundance communities and dependence on reference databases for functional inference.
