Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Protokół łączy w sobie moc generowania typów ludzkich komórek sercowo-naczyniowych przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych i wszechstronną technikę generowania sferoid bijących serca w czasie krótszym niż 72 godziny. Te sferoidy serca mogą być wykorzystywane do modelowania chorób i testowania leków. Jedną z głównych zalet tej łatwej techniki jest to, że można wygenerować prawie 1000 bijących sferoid serca na standardowej 12-dołkowej płytce.

A co najważniejsze, każdy sferoid serca może być badany pod kątem jego funkcji skurczowej za pomocą techniki opartej na obrazowaniu. Po stopieniu agarozy w kuchence mikrofalowej umieść ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pozwól jej ostygnąć przez trzy minuty. Odpipetować 700 mikrolitrów stopionej agarozy i dodać ją do silikonowej mikroformy o wymiarach dziewięć na dziewięć, uważając, aby nie powstawać pęcherzyków.

Ostrożnie umieść formę na zimnym bloku lodu, aby przyspieszyć czas trwania agarozy. Gdy agaroza stanie się półprzezroczysta, ostrożnie zegnij krawędzie mikroformy, aby zgubić replikę agarozy i delikatnie oderwij replikę ze wszystkich stron, aby odłączyć ją od silikonowej mikroformy. Przenieś tackę na mikrotkanki agarozy zawierającą 81 okrągłych wgłębień na sterylną płytkę 12-dołkową, a następnie dodaj dwa mililitry PBS do tacki na mikrotkanki agarozy i sprawdź ją pod mikroskopem pod kątem uwięzionych pęcherzyków lub studzienek o nieregularnych kształtach.

Zanurz tackę agarozy w dwóch mililitrach 70% etanolu na noc, a następnie poddaj ją działaniu promieniowania UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego na godzinę. Usuń 70% etanol i umyj dwa razy wodą destylowaną i raz dwoma mililitrami PBS. Po zliczeniu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów, fibroblastów serca i komórek śródbłonka pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych po trypsynizacji i neutralizacji, umieść zawiesiny komórek na lodzie.

W nowej probówce wymieszaj indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych, fibroblasty serca i komórki śródbłonka. Następnie wyjmij PBS ze studzienki i komory wysiewu komórek, nie dotykając wgłębień, i dodaj kroplami 200 mikrolitrów zawiesiny komórek. Pozwól komórkom osiąść w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez dwie godziny.

Dodaj pożywkę do produkcji mikrotkanek otaczającą formę agarozy, aby pokryć powierzchnię komory wewnętrznej. Po 24 godzinach obserwuj, czy w okrągłych wgłębieniach znajdują się samoorganizujące się i kompaktowe sferoidy. Zmieniaj podłoże co dwa dni, aby utrzymać sferoidy.

Zazwyczaj po 48 godzinach można zaobserwować spontaniczne bicie sferoid. Hodowlę poszczególnych typów komórek należy przeprowadzić oddzielnie na pożywce o macierzy błony podstawnej lub na szkiełkach komorowych pokrytych żelatyną. Delikatnie wypłucz mikrotkanki serca z okrągłych wgłębień i zbierz je w 15-mililitrowej probówce kronikowej.

Odessać pożywkę i przepłukać komórki lub mikrotkanki jednym mililitrem PBS. Następnie utrwalić komórki lub mikrotkanki za pomocą buforu utrwalającego zawierającego 4,2% PFA i inkubować w temperaturze pokojowej. Odessać PFA i inkubować komórki lub mikrotkanki z jednym mililitrem roztworu przepuszczalnego.

Następnie odessać roztwór i spłukać dwoma do trzech mililitrów PBS. Dodać 500 do 1000 mikrolitrów roztworu blokującego do komórek i inkubować przez co najmniej godzinę w przypadku szkiełek w komorze i przez trzy do czterech godzin w przypadku mikrotkanek. Próbki należy inkubować ze sprzężonymi przeciwciałami w roztworze blokującym przez godzinę w przypadku szkiełek w komorze i przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w przypadku mikrotkanek serca.

Umyj szkiełka komory trzykrotnie 500 mikrolitrami 0,1% Tween 20, z pięciominutowymi przerwami między każdym praniem, a następnie wykonaj końcowe płukanie za pomocą PBS. Umyj mikrotkanki serca pięć razy dwoma mililitrami 0,1% Tween 20, z zachowaniem 20-minutowego czasu między każdym myciem. Następnie wykonaj ostatnie pranie przez dodatkowe 20 minut.

Inkubuj komórki lub mikrotkanki za pomocą DAPI przed mikroskopią konfokalną, a następnie ostrożnie przenieś mikrotkanki serca do 35-milimetrowego szklanego naczynia z dnem i dodaj PBS, aby zanurzyć mikrotkankę. Wypłucz mikrotkanki z okrągłych wgłębień za pomocą pożywki za pomocą szerokiej lub jednomililitrowej końcówki pipety do 15-mililitrowej probówki chronicznej i pozwól im się osadzić. Następnie odessać pożywkę i spłukać jednym mililitrem PBS.

Dodać 200 do 300 mikrolitrów buforu do trawienia enzymatycznego i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie delikatnie mieszaj mikrotkanki przez minutę i powtórz inkubację. Po inkubacji energicznie wymieszaj mikrotkanki zwykłą jednomililitrową końcówką pipety, aby strawić je na pojedyncze komórki.

Uzyskać mętną zawiesinę komórek i natychmiast zneutralizować zawiesinę komórek za pomocą pięciu mililitrów pożywki zawierającej 5% FBS. Przecedź zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów i policz całkowitą liczbę komórek. Odwirować zawiesinę jednokomórkową o temperaturze 300 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze wiążącym aneksynę z Aneksyną V FITC i jodkiem propidyny lub barwnikiem wykluczającym martwe komórki TO-PRO-3 i inkubować przez 10 minut na lodzie. Po inkubacji dodać 300 mikrolitrów buforu wiążącego aneksynę do zawiesiny komórek i przenieść ją do probówki FACS z okrągłym dnem w celu analizy cytometrii przepływowej. Oczyszczone indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty serca pochodzącymi z komórek macierzystych uwidoczniono za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.

Czystość różnych typów komórek określono za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej. Troponina T została użyta jako marker dla kardiomiocytów i osiągnięto ponad 90% czystość. Cząsteczka adhezyjna komórek śródbłonka płytek krwi CD31 i wimentyna zostały użyte jako markery komórek śródbłonka i fibroblastów serca i wykazały czystość odpowiednio ponad 98 i 96%.

Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że kardiomiocyty były najcięższe i zajmowały środek mikrotkanek, podczas gdy komórki śródbłonka były przeplatane w mikrotkankach, a fibroblasty serca zajmowały głównie obrzeża. Trawienie mikrotkanek przy użyciu tego tempa i Liberazy TL spowodowało uzyskanie wysoce żywotnych proporcji komórek z mniejszą liczbą komórek apoptotycznych po dwóch tygodniach hodowli. Jednogodzinna ekspozycja mikrotkanek serca na wysokie stężenie doksorubicyny indukowała kardiotoksyczność zależną od dawki.

Kurczliwość mikrotkanek i ruch wektorów wygenerowały pseudomapę cieplną, która ilustrowała średni profil skurczu w całej mikrotkance. Ruch skurczu mikrotkanek serca generował dodatnie szczyty, które mierzono jako prędkość skurczu, prędkość relaksacji i szybkość dudnienia, która została obliczona jako czas między dwoma cyklami skurczu. Kurczliwość mikrotkanek serca była stała przez cztery tygodnie w hodowli.

Ogrzewanie komórek jest jednym z najważniejszych etapów w tym konkretnym protokole, w którym należy zadbać o ostrożne dozowanie zawiesiny komórek kroplami do układu agarozowego w celu równomiernego rozprowadzenia w mikrodołkach i zapobieżenia przepełnieniu. Korzystając ze zoptymalizowanego protokołu promieniowania tych mikrotkanek, można poddać je technologiom sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takim jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki lub sekwencja ATAC pojedynczej komórki, aby zrozumieć wzorce ekspresji genów specyficzne dla komórki, wynikające z różnych warunków leczenia.