Name: Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj protokół mikroiniekcji jaj i hodowli Thermobia domestica w celu edycji genomu. Ta metoda umożliwia generowanie i utrzymywanie szczepów mutacyjnych w badaniach genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TO i TD były wspierane przez granty JSPS KAKENHI o numerach odpowiednio 19H02970 i 20H02999.

1. Utrzymanie kolonii laboratoryjnych
<ol>
	<li>Do utrzymania populacji dzikich i zmutowanych należy użyć dużego plastikowego pojemnika (460 mm x 360 mm x 170 mm) ze zwykłym sztucznym pokarmem dla ryb, wodą w plastikowych kubkach z otworem wentylacyjnym na górze, składanym papierem do ukrywania owadów i warstwową bawełną do składania jaj (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Trzymaj wszystkie kultury T. domestica w inkubatorach o temperaturze 37 °C i ustaw wilgotność względną (RH) wewnątrz każdego pojemnika na 60%–80%. 
	UWAGA: Ponieważ T. domestica absorbuje parę wodną z atmosfery11, bezpośrednie zaopatrzenie w wodę nie jest potrzebne. Odpowiednia wilgotność względna jest utrzymywana dzięki obecności pary wodnej z plastikowych kubków zawierających otwór wentylacyjny na górze lub z kubków bez pokrywki wewnątrz każdego pojemnika. Nie ma potrzeby nawilżania wnętrza całego inkubatora, w którym znajdują się kultury. Przybliżony czas trwania każdego etapu rozwojowego w warunkach opisanych w tym protokole jest pokazany na Rysunek 1. Prędkość rozwoju można regulować, zmieniając temperaturę i/lub klasę RH<sup="xref">12.</li>
	<li>Od czasu do czasu dodawaj jedzenie. Dodaj wodę, zanim wyschnie.</li>
	<li>Przenieś populacje do nowego czystego pojemnika co najmniej co 3 miesiące, biorąc pod uwagę, że dorosłe osobniki przestają składać jaja w brudnym środowisku i/lub gęstej populacji (patrz Dyskusja).</li>
</ol>
2. Pobieranie komórek jajowych i mikroiniekcja
<ol>
	<li>Projektowanie przewodnika RNA (gRNA)
	<ol>
		<li>Zaprojektuj sekwencję gRNA dla każdego wymaganego celu i porównaj sekwencje gRNA z zespołem genomu, aby sprawdzić możliwe miejsca rozpoznawania poza celem.</li>
		<li>Zsyntetyzuj i oczyść gRNA zgodnie z instrukcjami producenta8. 
		UWAGA: Na przykład, w przypadku celowania w biały gen transportera kasety wiążącego ATP, zaprojektowano sekwencję docelową 20 pz i zamówiono dwa zsyntetyzowane oligonukleotydy DNA 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGGGAC-3' i 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3'. Matrycę DNA przygotowano przez wyżarzanie tych dwóch oligonukleotydów, a następnie amplifikację PCR, a następnie gRNA jest następnie transkrybowane in vitro z matrycy za pomocą polimerazy RNA T7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj kolonie do zbierania jaj
	<ol>
		<li>Przenieś około 20 dorosłych samców i 20 samic do średniej wielkości pojemnika (200 mm x 150 mm x 90 mm) z jedzeniem, zapasem wody, złożonym papierem i małym kawałkiem warstwowej bawełny do składania jaj (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</li>
		<li>Stwórz kilka kolonii, aby uzyskać dużą liczbę zarodków w krótkim czasie, które zostaną wykorzystane do edycji genomu. 
		UWAGA: Oczekuje się, że około 20–40 jaj zostanie zebranych z kolonii po 8 godzinach w temperaturze 37 °C. Zwykle potrzeba kilku dni, aby przeniesione dorosłe osobniki zaczęły składać jaja, prawdopodobnie z powodu adaptacji do nowego środowiska.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu wstrzyknięcia należy wymienić bawełnę znajdującą się wewnątrz pojemników na nową.</li>
	<li>Umieść taśmę dwustronną o wymiarach 76 mm x 5 mm na zwykłym szkiełku podstawowym o wymiarach 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Osiem godzin później zbierz jaja z warstwowej bawełny, oddzielając warstwy za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Wyrównaj jajka na taśmie dwustronnej za pomocą mokrego pędzla i zachowaj odległość 2 mm między jajkami. Wszystkie jaja powinny być ustawione tak, aby oś podłużna jaja była skierowana w stronę iniekcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Delikatnie dociśnij jaja pędzlem, aby zapewnić mocne trzymanie podczas wstrzykiwania. 
	UWAGA: W tym protokole grzyb rośnie szybko w uszkodzonych wstrzykniętych jajach w mokrych i ciepłych warunkach. Ważne jest, aby zachować odległość między jajami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu i ekspansji grzyba.</li>
	<li>Wymieszaj gRNA i białko Cas9 do końcowego stężenia odpowiednio 100 ng/μL i 500 ng/μL. Do rozcieńczenia użyj wody destylowanej. Inkubuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby pobudzić tworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego, a następnie trzymaj mieszaninę na lodzie. 
	UWAGA: Do roztworu do wstrzykiwań można dodać neutralną czerwień o końcowym stężeniu 1% w celu monitorowania wstrzykiwanej ilości.</li>
	<li>Załadować 2 μl roztworu gRNA/Cas9 do szklanej kapilary iniekcyjnej za pomocą mikroładowarki. Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że w roztworze nie ma pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby postukaj w igłę, aby usunąć bąbelki. 
	UWAGA: W tym eksperymencie używana jest gotowa igła do uzyskania cienkiej końcówki igły (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Zamiast tego można użyć domowej roboty igły o podobnym kształcie.</li>
	<li>Przymocować szklaną kapilarnę iniekcyjną, uprzednio załadowaną roztworem gRNA/Cas9, do uchwytu wyposażonego w manipulator i podłączyć uchwyt do elektronicznego mikrowtryskiwacza.</li>
	<li>Zoptymalizuj kształt końcówki igły, łamiąc ją lekko kleszkami, aby zapobiec zatykaniu się i uzyskać lepszą trwałość podczas serii wstrzyknięć (przykład odpowiedniej igły pokazano w Rysunek 3C). 
	UWAGA: Zaleca się wymianę igły, gdy jest zatkana. Możliwe jest kontynuowanie wstrzykiwania tą samą igłą, jeśli zostanie ona ponownie złamana kleszczami, ale szersza końcówka prowadzi do większego uszkodzenia jaj i obniża ich przeżywalność. Ponieważ jaja T. domestica są miękkie i kruche, utrzymanie cienkiej końcówki igły jest kluczem do uzyskania wysokiego wskaźnika przeżywalności po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Wprowadzić igłę w środku osi podłużnej jaja i wstrzyknąć niewielką ilość roztworu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3D–H w celu odniesienia do ilości wstrzyknięcia). Dostosuj konfigurację elektronicznego mikrowtryskiwacza podczas wstrzykiwania, w zależności od kształtu końcówki igły. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie stałego ciśnienia podczas wstrzykiwania, w przeciwnym razie lepka zawartość jaj może łatwo wpłynąć do szklanej igły i ją zatkać. Rozwiązaniem może być wstrzyknięcie z krótkim impulsem ciśnienia lub ze stałym ciśnieniem, w zależności od ilości wstrzykiwanej cieczy. Należy pamiętać, że gdy końcówka igły ma szeroki otwór, do jajka wstrzykuje się zbyt dużo roztworu, co powoduje śmiertelność (<silna klasa="xfig">Ryc. 3F–H). W takim przypadku utrzymuj stały przepływ płynu pod stałym ciśnieniem, a następnie włóż igłę do jajka i natychmiast ją wyciągnij. Jeśli spowoduje to zbyt duże przepełnienie lub jajko pęknie, zmień igłę.</li>
	<li>Przechowywać wstrzyknięte jaja w pojemniku o wielkości odpowiedniej do liczby wstrzykiwanych jaj (<20 jaj: małe naczynie; >20 jaj: pojemnik średniej wielkości) o wilgotności względnej 60–80% i temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Krycie
<ol>
	<li>Okresowo sprawdzaj wstrzyknięte jaja i wyrzucaj uszkodzone jaja kleszczami, aby uniknąć rozwoju grzybów (<silna klasa="xfig">Rysunek 3I,J). W przypadku, gdy na jajku rośnie zbyt dużo grzyba, oczyść powierzchnię jajka za pomocą 70% EtOH.</li>
	<li>Przed wykluciem (około 10 dni w temperaturze 37 °C po złożeniu jaj) zanurzyć szkiełko podstawowe z wstrzykniętymi jajami w talku w celu pokrycia powierzchni taśmy dwustronnej. Pozwoli to uniknąć układania wyklutych nimf. Przenieś szkiełka szklane malowane proszkowo do średniej wielkości pojemnika z jedzeniem, wodą i złożonym papierem do ukrywania owadów.</li>
	<li>Usuń szkiełka po wykluciu się nimf. Okresowo dostarczaj pokarm aż do osiągnięcia dorosłości. 
	UWAGA: Osiągnięcie dorosłości po wykluciu zajmuje osobnikom około 2,0–2,5 miesiąca (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Stadium dorosłe ocenia się na podstawie dobrze rozwiniętego pokładełka u samic (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).</li>
	<li>Aby skopulować osobniki, przenieś tyle dorosłych samic, ile potrzeba, z kolonii laboratoryjnej do średniej wielkości pojemnika i wysiaduj je przez co najmniej 14 dni w temperaturze 37 °C, aby upewnić się, że są dziewicze. 
	UWAGA: Nie jest konieczne zbieranie dziewiczych samic z kolonii laboratoryjnej, ponieważ dorosłe T. domestica mają powtarzający się cykl linienia i krycia zwany "cyklem reprodukcyjnym i linienia", podczas którego samice wyrzucają plemniki przy każdym linieniu i ponownie łączą się w pary w następnym cyklu zapłodnienia13.</li>
	<li>Przenieś dorosłego samca lub samicę G0, który rozwinął się z wstrzykniętego jaja i dorosłego osobnika (osobników) typu dzikiego, do małego plastikowego naczynia (Ø 100 mm x 40 mm) z jedzeniem, złożonym papierem i małym kawałkiem bawełny do składania jaj G1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C'; naczynie godowe). Trzymaj naczynia do łączenia w większym pojemniku z wilgotnością względną 60%–80% (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: W naczyniu można umieścić wiele dorosłych osobników typu dzikiego, aby zwiększyć szansę na udane krycie, chociaż wysokie wskaźniki sukcesu osiągnięto w przypadku parowania jeden do jednego.</li>
</ol>
4. Genotypowanie
<ol>
	<li>Zaprojektuj pary starterów PCR dla każdego gRNA, aby amplifikować produkt o stężeniu 100–200 pz, który zawiera miejsce docelowe gRNA. Zetrzyj każdą sekwencję startera z zespołem genomu, aby sprawdzić jego specyficzność (przykład pokazano dla celowania w biały gen w <silna klasa = "xfig" > Rysunek 4A).</li>
	<li>Sprawdź transformację linii zarodkowej dorosłych G0.
	<ol>
		<li>Pięć dni po złożeniu jaj należy zebrać pojedyncze jaja G1 z każdej dorosłej pary G0 do probówek o pojemności 0,2 ml (jedno jajko na probówkę; zebrane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania). Oddziel warstwy bawełny, aby zebrać jaja. 
		UWAGA: Zaleca się genotypowanie co najmniej 12 nimf G1 z każdej pary godowej w celu oceny powodzenia transmisji w linii zarodkowej (patrz Reprezentatywne wyniki).</li>
		<li>Dodać 15 μl 0,25 mg/ml roztworu proteinazy K (rozpuszczonego w buforze Tris-EDTA) do każdej probówki, krótko homogenizować próbki wykałaczkami i inkubować w temperaturze 55 °C przez 3 do 16 godzin.</li>
		<li>Dezaktywować proteinazę K, umieszczając próbki w temperaturze 95 °C na 10 minut.</li>
		<li>Dodaj 90 μl wody destylowanej do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Użyć 2 μl supernatantu w 10 μl mieszaniny reakcyjnej PCR zawierającej startery zaprojektowane w kroku 4.1. 
		UWAGA: Zaleca się stosowanie polimerazy DNA zoptymalizowanej pod kątem prymitywnych matryc, aby osiągnąć wystarczającą amplifikację PCR.</li>
		<li>Aby przeanalizować produkty PCR, wykonaj test mobilności heterodupleksowej (HMA) za pomocą systemu elektroforezy mikroprocesorowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B; patrz Ohde i in., 2018)8. 
		UWAGA: Mutacje można ocenić za pomocą dwóch alternatywnych metod: (1) HMA ze standardowymi polimerami żelowymi, takimi jak 8% poliakrylamid14; (2) trawienie produktów PCR endonukleazą T7, a następnie elektroforeza w żelu agarozowym<klasa sup = "xref">15.</li>
		<li>Zachowaj tylko nimfy G1 powstałe z dorosłych G0, które zawierają mutacje w swojej linii zarodkowej i odrzuć pozostałe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indywidualne genotypowanie nimf/dorosłych osobników G1
	<ol>
		<li>Wyizolować nimfy G1 na 24-dołkowych płytkach za pomocą aspiratora lub pędzla. Umieść płytki 24-dołkowe w większym pojemniku (np. średniej wielkości pojemniku używanym w tym protokole) z dopływem wody, jak opisano powyżej, aby utrzymać wilgotność względną na poziomie 60%–80% (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Utrzymuj zapasy sztucznego regularnego pokarmu dla ryb (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D'). 
		UWAGA: Chociaż ten krok można wykonać w dowolnym momencie nimfalnego i dorosłego stadium, zaleca się wykonanie go po osiągnięciu dorosłości i tuż przed parowaniem (>2,5 miesiąca po wstrzyknięciu; <silna klasa="xfig">Rysunek 1B) Ponieważ łatwiej jest utrzymać firebrats w dużym pojemniku. Wymagana jest indywidualna hodowla w celu śledzenia genotypu każdej nimfy G1 na następujących etapach. Nimfy G1 od tego samego dorosłego G0 mogą mieć różne mutacje.</li>
		<li>Uszczypnij i wyciągnij cerci i włókno ogonowe od nimfy/dorosłego osobnika za pomocą kleszczy i zbierz je do probówki o pojemności 0,2 ml zawierającej 50 μl EtOH (zebrane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania). 
		UWAGA: Próbki tkanek są zbierane w EtOH, ponieważ zapobiega to utracie tych małych próbek z powodu elektryczności statycznej. Jeśli trzeba zatrzymać ruch owadów, znieczulenie nimfy/dorosłego osobnika na lodzie podczas pobierania próbek tkanek. Ponieważ T. domestica nie może przetrwać po długotrwałym chłodzeniu na lodzie, nie znieczulaj ich dłużej niż minutę i natychmiast przenieś je z powrotem do temperatury pokojowej. Ablacja cerci i włókna ogonowego nie powoduje wzrostu śmiertelności.</li>
		<li>Umieścić probówki z próbkami z otwartymi pokrywkami na bloku termicznym na 15 minut w temperaturze 70 °C w celu odparowania EtOH.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.2.2–4.2.5 dla genotypowania.</li>
		<li>Prześlij produkty PCR, w których zaobserwowano zmutowany wzór prążka, do standardowej usługi sekwencjonowania Sangera.</li>
		<li>Zachowaj nimfy/dorosłe osobniki G1 z pożądanymi mutacjami i odrzuć pozostałe (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 4C, aby uzyskać reprezentatywny wynik sekwencjonowania).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krzyżuj dorosłe osobniki zawierające pożądane mutacje w naczyniu godowym i uzyskaj kolejne pokolenia, aby stworzyć homozygotyczny zmutowany szczep.</li>
</ol>

<ol><li>Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019">http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019</a> (2019).</li>
<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+expression+pattern+of+labial%2C+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li>
<li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+%28Zygentoma%2C+Lepismatidae%29%3A+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+and+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li>
<li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes%2C+Clock+and+cycle%2C+in+the+firebrat+Thermobia+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li>
<li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica%3A+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Biotechnology+and+Sericology%22%5BJournal%5D)">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li>
<li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna%2C+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Biotechnology+and+Sericology%22%5BJournal%5D)">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica%3A+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Structure+and+Development%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li>
<li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+insects%3A+Applications%2C+best+practices+and+biosafety+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li>
<li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li>
<li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+balance+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+%28Packard%29.+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li>
<li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+ecology+of+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+%28Packard%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Monographs%22%5BJournal%5D)">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNijhout%2C+HF+%22Insect+Hormones%22">Insect Hormones</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+detection%2C+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li>
<li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li>
<li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+notes+upon+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+Packard%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+New+York+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby pomyślnie wygenerować pożądanego mutanta T. domestica z CRISPR/Cas9, najpierw ważne jest zebranie wystarczającej liczby zarodków w odpowiednim stadium do wstrzyknięcia. Aby uzyskać stałą zbieralność wystarczającej liczby jaj T. domestica , kluczem jest wybór odpowiedniego rozmiaru pojemnika, aby mieć mniejszą gęstość populacji, ponieważ pomogłoby to w pomyślnym zakończeniu serii złożonych zachowań godowych, które powtarzają się po każdym dorosłym linieniu13. Dorosły samiec <e...

Thermobia domestica należy do jednego z najbardziej podstawowych rzędów owadów, Zygentoma, który zachowuje rodowy ametaboliczny i bezskrzydły cykl życiowy. Tak podstawowa pozycja filogenetyczna i cechy przodków sprawiają, że gatunek ten jest atrakcyjnym modelem do badania mechanizmów leżących u podstaw sukcesu owadów na Ziemi, które obejmują ponad 70% opisanych gatunków zwierząt1. T. domestica od dawna jest wykorzystywana głównie do badania cech przodków fizjologii owadów ze względu na jego odpowiednie cechy jako modelu laboratoryjnego, takie jak stosunkowo krótki cykl życia (2,5–3,0 miesięcy od zarodka do dorosłego osobnika reprodukcyjnego; <silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i łatwa hodowla. W ciągu ostatnich trzech dekad jego zastosowanie zostało rozszerzone o badanie cech przodków różnych cech, takich jak budowa ciała, różnicowanie neuronalne i rytmy okołodobowe2,3,4.
Zastosowanie zaawansowanych narzędzi genetycznych u T. domestica mogłoby jeszcze bardziej przyspieszyć takie działania w szerokim obszarze badawczym. Pomyślne knockdown genu za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) u embrionów, nimf i dorosłych został zgłoszony w T. domestica4,5,6. Wydajność ogólnoustrojowego RNAi jest nadal wysoce zależna od gatunku - na przykład jest ogólnie wysoka u Coleoptera, podczas gdy jest niska w rzędzie lepidoptera7. Skuteczność i czas trwania knockdown RNAi u T. domestica nie zostały jeszcze ocenione. Oprócz RNAi, wcześniej informowaliśmy o udanym nokaucie genu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u T. domestica8. System CRISPR/Cas jest szeroko stosowany do edycji genomu u owadów, w szczególności do celowanego nokautu genów. Jego zastosowanie można rozszerzyć do innych zastosowań, takich jak test reporterowy genów, śledzenie linii komórkowych i manipulowanie aktywnością transkrypcyjną poprzez wbijanie egzogennych konstruktów po ustanowieniu protokołu dostarczania komponentów systemu CRISPR/Cas do jąder9. W połączeniu z opublikowanym genomem assembly10, szerokie zastosowanie i dalszy rozwój edycji genomu T. domestica opartej na CRISPR/Cas ułatwiłoby badania koncentrujące się na mechanizmach ewolucyjnych stojących za wyjątkowym sukcesem adaptacyjnym owadów. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodka i krycia dorosłych T. domestica w celu wygenerowania zmutowanego szczepu przy użyciu CRISPR/Cas9. Biorąc pod uwagę tę nowatorską metodę, omawiamy znaczenie uwzględnienia unikalnej biologii nietradycyjnych gatunków modelowych dla pomyślnego zastosowania tych technik.

<table><tbody><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &micro; g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Antystatyczny środek czyszczący</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>do usuwania elektryczności statycznej z płytki 24-dołkowej</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Duży pojemnik</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Mikroiniektor elektroniczny</td></tr><tr><td>Femtotip II, kapilara iniekcyjna</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Kapilara szklana wtryskowa</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Średniej wielkości</td></tr><tr><td>inkubator</td> kontenerowy <td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>do 37 stopni; C inkubacja. Nie ma potrzeby nawilżania wnętrza inkubatora.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>Enzym PCR do genotypowania. Zoptymalizowany pod kątem wzmocnienia z prymitywnych szablonów.</td></tr><tr><td>Podstawka magnetyczna</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>do trzymania mikromanipulatora</td></tr><tr><td></td><td>Mikroładowarka Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>SZX12</td><td>do mikroiniekcji. Do mikroiniekcji wystarczy ponad 35-krotne powiększenie</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>System elektroforezy mikroprocesorów</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Taśma dwustronna do umieszczania jaj na szkiełku</td></tr><tr><td>Pędzel (włosie końskie)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do kultur roślinnych</td><td>SPL Nauki Przyrodnicze</td><td>310100</td><td>Miska godowa i zapasy wody do dużych i średnich pojemników</td></tr><tr><td>Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR Liofilizat z Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop SZX 12</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>Do mikroiniekcji wystarczy powiększenie ponad 35-krotne</td></tr><tr><td>Talk</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Złote</td><td>spektrum wzrostu Marki</td><td></td><td>Sztuczny regularny pokarm dla ryb</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u firebrat thermobia domestica

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Ognisty Thermobia domestica to ametaboliczny, bezskrzydły gatunek, który nadaje się do badania mechanizmów rozwojowych owadów, które doprowadziły do ich udanej ewolucji na Ziemi. Zastosowanie narzędzi genetycznych, takich jak edycja genomu, jest kluczem do zrozumienia zmian genetycznych, które są odpowiedzialne za przejścia ewolucyjne w podejściu Evo-Devo. W tym artykule opisujemy nasz obecny protokół generowania i utrzymywania zmutowanych szczepów T. domestica. Opisujemy metodę iniekcji na sucho, jako alternatywę dla zgłaszanej metody iniekcji na mokro, która pozwala nam uzyskać stabilnie wysokie wskaźniki przeżywalności w zarodkach, którym wstrzyknięto implanty. Raportujemy również zoptymalizowane ustawienie środowiska, aby kojarzyć dorosłe osobniki i uzyskiwać kolejne pokolenia z wysoką wydajnością. Nasza metoda podkreśla znaczenie uwzględnienia unikalnej biologii każdego gatunku dla pomyślnego zastosowania metod edycji genomu do nietradycyjnych organizmów modelowych. Przewidujemy, że te protokoły edycji genomu pomogą we wdrożeniu T. domestica jako modelu laboratoryjnego i jeszcze bardziej przyspieszą rozwój i zastosowanie użytecznych narzędzi genetycznych u tego gatunku.

W naszych doświadczeniach za pomocą jednej kapilary iniekcyjnej z odpowiednio przygotowaną końcówką można skutecznie wstrzyknąć materiał do około 100 jaj (Ryc. 3C). Iniekcja kompleksu rybonukleoproteiny gRNA/Cas9 do embrionów w ciągu pierwszych 8 h po zniesieniu jaj prowadzi do powstania insercji i delecji (indels) w miejscu docelowym gRNA. Powoduje to mutacje bialleliczne w niektórych komórkach pokolenia wstrzykiwanego (G0), w związku z czym w G0 zazwyczaj uzyskuje się mozaikowe fenotypy mu...

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Ponieważ Thermobia domestica jest owadem bazalnym, badania genetyczne tego gatunku rzucą światło na mechanizmy leżące u podstaw ewolucji kluczowych innowacji u owadów, takich jak lot z napędem i metamorfozy. Protokół ten obejmuje podstawowe techniki, od utrzymania hodowli po mikroiniekcję jaj w celu wdrożenia Thermobia jako gatunku modelowego w laboratorium. Metoda ta może być również stosowana do stosowania innych narzędzi genetycznych, takich jak knockdown genów za pośrednictwem RNI i transgeneza w termobii.Utrzymuj populacje dzikich i zmutowanych w dużym plastikowym pojemniku ze zwykłym sztucznym pokarmem dla ryb, wodą w plastikowych kubkach z otworem wentylacyjnym na górze, złożonym papierem do ukrywania owadów i warstwową bawełną do składania jaj. Trzymaj wszystkie kultury T.domestica w inkubatorach o temperaturze 37 stopni Celsjusza i ustaw wilgotność względną wewnątrz każdego pojemnika na 60 do 80%Aby przygotować kolonie do zbierania jaj, przenieś około 20 dorosłych samców i 20 samic do średniej wielkości pojemnika z jedzeniem, zapasem wody, złożonym papierem i małym kawałkiem warstwowej bawełny do składania jaj. Stwórz kilka kolonii, aby uzyskać dużą liczbę zarodków w stadium w krótkim czasie.W dniu wstrzyknięcia należy wymienić bawełnę znajdującą się w pojemnikach na nową bawełnę. Osiem godzin później zbierz jaja z warstwowej bawełny, oddzielając warstwy za pomocą kleszczy. Wyrównaj jajka na taśmie dwustronnej za pomocą mokrego pędzla, zachowując dwumilimetrową odległość między jajkami.Wszystkie jaja powinny być ustawione w taki sposób, aby oś podłużna jaja była skierowana w stronę wstrzyknięcia. Delikatnie docisnąć jaja pędzlem, aby zapewnić mocne trzymanie podczas wstrzyknięcia. Załaduj dwa mikrolitry roztworu gRNA CAS9 do szklanej kapilary iniekcyjnej za pomocą mikroładowarki.Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że w roztworze nie ma pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby postukaj w igłę, aby usunąć bąbelki. Zoptymalizuj kształt końcówki igły, lekko ją łamiąc kleszkami, aby zapobiec zatykaniu się i uzyskać lepszą trwałość podczas serii wstrzyknięć.Wprowadzić igłę w środku osi podłużnej jaja i wstrzyknąć niewielką ilość roztworu. Dostosuj konfigurację elektronicznego mikrowtryskiwacza podczas wstrzykiwania, w zależności od kształtu końcówki igły. Umieść wstrzyknięte jaja w pojemniku o odpowiedniej wielkości wilgotności względnej od 60 do 80% w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Okresowo sprawdzaj wstrzyknięte jaja i wyrzucaj uszkodzone jaja, aby uniknąć rozwoju grzybów. Jeśli na jajku rośnie zbyt dużo grzyba, wyczyść powierzchnię jajka 70% etanolem. Przed wykluciem zanurz szklane szkiełko z wstrzykniętymi jajami w talku, aby pokryć powierzchnię taśmy dwustronnej.Zapobiegnie to układaniu się wyklutych nimf. Przenieś szkiełka szklane malowane proszkowo do średniej wielkości pojemnika z jedzeniem, wodą i złożonym papierem. Wyizolować nimfy G1 w 24 dołkach za pomocą aspiratora lub pędzla.Utrzymuj zapas sztucznego, regularnego pokarmu dla ryb. Umieść 24-dołkowe płytki w większym pojemniku z dopływem wody o wilgotności od 60 do 80%Szczypnij i wyciągnij cercus z nimfy lub osoby dorosłej za pomocą kleszczy i zbierz je do 0,2 mililitrowej probówki zawierającej 50 mikrolitrów etanolu. Pobrane próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.Umieścić probówki z otwartymi pokrywkami na bloku termicznym na 15 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza w celu odparowania etanolu. Wstrzyknięcie kompleksu rybonukleoproteinowego gRNA CAS9 do zarodków w ciągu pierwszych ośmiu godzin po złożeniu jaj powoduje powstawanie indeli w miejscu docelowym gRNA. Powoduje to mutacje bialleliczne w niektórych komórkach wstrzykiwanego pokolenia i zwykle uzyskuje się zmutowane fenotypy mozaiki.Kiedy ten protokół został użyty do wstrzyknięcia gRNA, które zostało zaprojektowane tak, aby celować w biały gen, 32,6% nimf G0 wykazało częściową utratę pigmentacji w złożonych oczach i obszarach grzbietowych. Ocenę transformacji linii zarodkowej dorosłych osobników G0 i zmutowanych osobników G1 przeprowadzono za pomocą genomowego PCR, a następnie testu mobilności heterodupleksowej. W próbkach G1 wyraźnie można odróżnić zróżnicowane wzorce pasmowe między próbkami typu dzikiego a próbkami zmutowanymi.Edycja genomu w Thermobia zapewnia solidne podejście do analizy mechanizmów genetycznych leżących u podstaw przedwczesnych cech owadów. Pomaga zgłębić tajemnice ich niezwykłego sukcesu i naszego.

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film opisuje mikroiniekcję, powszechną metodę tworzenia transgenicznych szczepów C. elegans. W przykładzie zobaczymy mikroiniekcję użytą do wprowadzenia kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) do edycji genów zasad CRISPR.

Mikroiniekcja gonad: metoda dostarczania związków bezpośrednio do linii rozrodczej C. elegans

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej w celu przeprowadzenia funkcjonalnych testów genomicznych, takich jak transformacja linii zarodkowej i edycja genomu CRISPR/Cas9.

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania jaj świerszczy, technikę, która służy jako podstawowa metoda w wielu eksperymentach na świerszczu, w tym, ale nie tylko, interferencji RNA i manipulacji genomem.

Wstrzykiwanie jaj Gryllus bimaculatus

Tutaj przedstawiono protokół do produkcji i hodowli ryb elektrycznych z nokautem genomu CRISPR/Cas9. Szczegółowo przedstawiono wymagane wymagania z zakresu biologii molekularnej, hodowli i hodowli zarówno dla żywiciela, jak i mormyryda, a także techniki iniekcji w celu wytworzenia larw indelu F0 indukowanych przez Cas9.

Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Udana transformacja linii zarodkowej u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda, została osiągnięta przy użyciu mRNA nadpobudliwej transposazy piggyBac.

Nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggyBac u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Poznaj protokół mikroiniekcji jaj i hodowli Thermobia domestica w celu edycji genomu. Ta metoda umożliwia generowanie i utrzymywanie szczepów mutacyjnych w badaniach genetycznych.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Przeglądaj więcej filmów