Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica
20 października 2020
Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.
Ponieważ Thermobia domestica jest owadem bazalnym, badania genetyczne tego gatunku rzucą światło na mechanizmy leżące u podstaw ewolucji kluczowych innowacji u owadów, takich jak lot z napędem i metamorfozy. Protokół ten obejmuje podstawowe techniki, od utrzymania hodowli po mikroiniekcję jaj w celu wdrożenia Thermobia jako gatunku modelowego w laboratorium. Metoda ta może być również stosowana do stosowania innych narzędzi genetycznych, takich jak knockdown genów za pośrednictwem RNI i transgeneza w termobii.
Utrzymuj populacje dzikich i zmutowanych w dużym plastikowym pojemniku ze zwykłym sztucznym pokarmem dla ryb, wodą w plastikowych kubkach z otworem wentylacyjnym na górze, złożonym papierem do ukrywania owadów i warstwową bawełną do składania jaj. Trzymaj wszystkie kultury T.domestica w inkubatorach o temperaturze 37 stopni Celsjusza i ustaw wilgotność względną wewnątrz każdego pojemnika na 60 do 80%Aby przygotować kolonie do zbierania jaj, przenieś około 20 dorosłych samców i 20 samic do średniej wielkości pojemnika z jedzeniem, zapasem wody, złożonym papierem i małym kawałkiem warstwowej bawełny do składania jaj. Stwórz kilka kolonii, aby uzyskać dużą liczbę zarodków w stadium w krótkim czasie.
W dniu wstrzyknięcia należy wymienić bawełnę znajdującą się w pojemnikach na nową bawełnę. Osiem godzin później zbierz jaja z warstwowej bawełny, oddzielając warstwy za pomocą kleszczy. Wyrównaj jajka na taśmie dwustronnej za pomocą mokrego pędzla, zachowując dwumilimetrową odległość między jajkami.
Wszystkie jaja powinny być ustawione w taki sposób, aby oś podłużna jaja była skierowana w stronę wstrzyknięcia. Delikatnie docisnąć jaja pędzlem, aby zapewnić mocne trzymanie podczas wstrzyknięcia. Załaduj dwa mikrolitry roztworu gRNA CAS9 do szklanej kapilary iniekcyjnej za pomocą mikroładowarki.
Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że w roztworze nie ma pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby postukaj w igłę, aby usunąć bąbelki. Zoptymalizuj kształt końcówki igły, lekko ją łamiąc kleszkami, aby zapobiec zatykaniu się i uzyskać lepszą trwałość podczas serii wstrzyknięć.
Wprowadzić igłę w środku osi podłużnej jaja i wstrzyknąć niewielką ilość roztworu. Dostosuj konfigurację elektronicznego mikrowtryskiwacza podczas wstrzykiwania, w zależności od kształtu końcówki igły. Umieść wstrzyknięte jaja w pojemniku o odpowiedniej wielkości wilgotności względnej od 60 do 80% w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Okresowo sprawdzaj wstrzyknięte jaja i wyrzucaj uszkodzone jaja, aby uniknąć rozwoju grzybów. Jeśli na jajku rośnie zbyt dużo grzyba, wyczyść powierzchnię jajka 70% etanolem. Przed wykluciem zanurz szklane szkiełko z wstrzykniętymi jajami w talku, aby pokryć powierzchnię taśmy dwustronnej.
Zapobiegnie to układaniu się wyklutych nimf. Przenieś szkiełka szklane malowane proszkowo do średniej wielkości pojemnika z jedzeniem, wodą i złożonym papierem. Wyizolować nimfy G1 w 24 dołkach za pomocą aspiratora lub pędzla.
Utrzymuj zapas sztucznego, regularnego pokarmu dla ryb. Umieść 24-dołkowe płytki w większym pojemniku z dopływem wody o wilgotności od 60 do 80%Szczypnij i wyciągnij cercus z nimfy lub osoby dorosłej za pomocą kleszczy i zbierz je do 0,2 mililitrowej probówki zawierającej 50 mikrolitrów etanolu. Pobrane próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.
Umieścić probówki z otwartymi pokrywkami na bloku termicznym na 15 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza w celu odparowania etanolu. Wstrzyknięcie kompleksu rybonukleoproteinowego gRNA CAS9 do zarodków w ciągu pierwszych ośmiu godzin po złożeniu jaj powoduje powstawanie indeli w miejscu docelowym gRNA. Powoduje to mutacje bialleliczne w niektórych komórkach wstrzykiwanego pokolenia i zwykle uzyskuje się zmutowane fenotypy mozaiki.
Kiedy ten protokół został użyty do wstrzyknięcia gRNA, które zostało zaprojektowane tak, aby celować w biały gen, 32,6% nimf G0 wykazało częściową utratę pigmentacji w złożonych oczach i obszarach grzbietowych. Ocenę transformacji linii zarodkowej dorosłych osobników G0 i zmutowanych osobników G1 przeprowadzono za pomocą genomowego PCR, a następnie testu mobilności heterodupleksowej. W próbkach G1 wyraźnie można odróżnić zróżnicowane wzorce pasmowe między próbkami typu dzikiego a próbkami zmutowanymi.
Edycja genomu w Thermobia zapewnia solidne podejście do analizy mechanizmów genetycznych leżących u podstaw przedwczesnych cech owadów. Pomaga zgłębić tajemnice ich niezwykłego sukcesu i naszego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia kompleksowy protokół hodowli i mikroiniekcji jaj ogonka domowego Thermobia domestica, co ułatwia generowanie i utrzymywanie szczepów mutantów poprzez edycję genomu. Opisane metody zwiększą wykorzystanie Thermobia jako gatunku modelowego w badaniach genetycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Biologia owadów
- Protokoły laboratoryjne
Wstęp
- Thermobia domestica jest bazowym gatunkiem owadów.
- Badania genetyczne nad tym gatunkiem mogą dostarczyć wiedzy na temat ewolucji owadów.
- Kluczowe innowacje u owadów obejmują aktywny lot oraz przeobrażenie.
- Niniejszy protokół wspiera zastosowanie narzędzi genetycznych u Thermobia.
Cel badania
- Ustanowienie *Thermobia domestica* jako organizmu modelowego do badań genetycznych.
- Przedstawienie szczegółowej metodologii mikroiniekcji jaj.
- Ułatwienie utrzymania populacji typu dzikiego oraz populacji mutantów.
Zastosowane metody
- Utrzymywanie hodowli w dużych plastikowych pojemnikach.
- Mikroiniekcja jaj w celu edycji genomu.
- Regularne karmienie sztuczną karmą dla ryb.
- Ustawienie warunków środowiskowych na 37°C i wilgotność 60-80%.
Główne wyniki
- Skuteczne utworzenie kolonii hodowlanych do pozyskiwania jaj.
- Efektywne generowanie embrionów na różnych etapach rozwoju do celów badawczych.
- Utrzymanie szczepów typu dzikiego oraz mutantów.
- Zastosowanie narzędzi genetycznych w dalszych badaniach.
Wnioski
- Thermobia domestica jest obiecującym modelem do badań genetycznych.
- Opisany protokół zwiększa wykonalność manipulacji genetycznych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać te metody do uzyskania wglądu w procesy ewolucyjne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Edycja genomu u Thermobia domestica umożliwia funkcjonalną analizę genetyczną w bazowym modelu owada, wspierając procesy badawcze w biologii ewolucyjnej i rozwojowej. Solidne etapy mikroiniekcji i zarządzania koloniami opisane w protokole ułatwiają powtarzalne generowanie szczepów mutantów, rozszerzając zestaw narzędzi dla nietradycyjnych systemów modelowych. Możliwość ta wzmacnia wczesne etapy odkryć i walidację celów w obszarze biologii owadów oraz genomiki porównawczej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie funkcji genów w podstawowej linii owadów.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez wyjaśnienie zależności między genem a fenotypem.
- Ułatwia badanie innowacji ewolucyjnych w oparciu o sformułowane hipotezy.
- Zapewnia platformę do funkcjonalnej walidacji celów w organizmach nie modelowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia standaryzowane protokoły mikroiniekcji embrionów i generowania mutantów.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki fenotypowe do dalszych analiz.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do procesów screeningu genetycznego.
- Umożliwia skalowalne zarządzanie koloniami na potrzeby badań wysokoprzepustowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z badaniami porównawczymi funkcji genów w różnych taksonach owadów.
- Zapewnia ciągłość od manipulacji genetycznej do oceny fenotypowej.
- Stanowi podstawę dla translacyjnego odkrywania biomarkerów w kontekstach ewolucyjnych.
- Minimalizuje ryzyko przy wyborze modelu przedklinicznego poprzez rozszerzenie dostępnych narzędzi genetycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnych manipulacji genetycznych, po przesiewy fenotypowe i analizy porównawcze na modelach owadów.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w podstawowym systemie owadzim.
- Screening: Zapewnia powtarzalne fenotypy mutantów do opracowywania i walidacji testów.
- Analityka: Wspiera ilościową ocenę wyników edycji genów za pomocą PCR i analizy mobilności.
- Badania translacyjne: Ułatwia międzygatunkowe porównania genetyczne istotne dla biologii ewolucyjnej.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje protokół wielokrotnego użytku, który można dostosować do innych niestandardowych modeli owadziego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad funkcją genów oraz w hipotezach ewolucyjnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje mikroiniekcje i zarządzanie koloniami w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w genomice porównawczej i wyborze modelu.
- Wpływ na portfolio: Rozszerza zakres genetycznie manipulowalnych modeli owadów dla priorytetyzacji działań B+R.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu mikroiniekcji oraz zarządzania koloniami owadów.
- Konieczny jest dostęp do kontrolowanych inkubatorów oraz infrastruktury do regulacji wilgotności.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu powtarzalnego generowania mutantów.
- Można być zmuszonym do adaptacji metody dla innych gatunków owadów o odmiennej biologii.
- Ograniczenia obejmują specyficzne dla gatunku zasady postępowania oraz wymagania środowiskowe.
