Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica
October 20th, 2020
Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.
Ponieważ Thermobia domestica jest owadem bazalnym, badania genetyczne tego gatunku rzucą światło na mechanizmy leżące u podstaw ewolucji kluczowych innowacji u owadów, takich jak lot z napędem i metamorfozy. Protokół ten obejmuje podstawowe techniki, od utrzymania hodowli po mikroiniekcję jaj w celu wdrożenia Thermobia jako gatunku modelowego w laboratorium. Metoda ta może być również stosowana do stosowania innych narzędzi genetycznych, takich jak knockdown genów za pośrednictwem RNI i transgeneza w termobii.
Utrzymuj populacje dzikich i zmutowanych w dużym plastikowym pojemniku ze zwykłym sztucznym pokarmem dla ryb, wodą w plastikowych kubkach z otworem wentylacyjnym na górze, złożonym papierem do ukrywania owadów i warstwową bawełną do składania jaj. Trzymaj wszystkie kultury T.domestica w inkubatorach o temperaturze 37 stopni Celsjusza i ustaw wilgotność względną wewnątrz każdego pojemnika na 60 do 80%Aby przygotować kolonie do zbierania jaj, przenieś około 20 dorosłych samców i 20 samic do średniej wielkości pojemnika z jedzeniem, zapasem wody, złożonym papierem i małym kawałkiem warstwowej bawełny do składania jaj. Stwórz kilka kolonii, aby uzyskać dużą liczbę zarodków w stadium w krótkim czasie.
W dniu wstrzyknięcia należy wymienić bawełnę znajdującą się w pojemnikach na nową bawełnę. Osiem godzin później zbierz jaja z warstwowej bawełny, oddzielając warstwy za pomocą kleszczy. Wyrównaj jajka na taśmie dwustronnej za pomocą mokrego pędzla, zachowując dwumilimetrową odległość między jajkami.
Wszystkie jaja powinny być ustawione w taki sposób, aby oś podłużna jaja była skierowana w stronę wstrzyknięcia. Delikatnie docisnąć jaja pędzlem, aby zapewnić mocne trzymanie podczas wstrzyknięcia. Załaduj dwa mikrolitry roztworu gRNA CAS9 do szklanej kapilary iniekcyjnej za pomocą mikroładowarki.
Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że w roztworze nie ma pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby postukaj w igłę, aby usunąć bąbelki. Zoptymalizuj kształt końcówki igły, lekko ją łamiąc kleszkami, aby zapobiec zatykaniu się i uzyskać lepszą trwałość podczas serii wstrzyknięć.
Wprowadzić igłę w środku osi podłużnej jaja i wstrzyknąć niewielką ilość roztworu. Dostosuj konfigurację elektronicznego mikrowtryskiwacza podczas wstrzykiwania, w zależności od kształtu końcówki igły. Umieść wstrzyknięte jaja w pojemniku o odpowiedniej wielkości wilgotności względnej od 60 do 80% w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Okresowo sprawdzaj wstrzyknięte jaja i wyrzucaj uszkodzone jaja, aby uniknąć rozwoju grzybów. Jeśli na jajku rośnie zbyt dużo grzyba, wyczyść powierzchnię jajka 70% etanolem. Przed wykluciem zanurz szklane szkiełko z wstrzykniętymi jajami w talku, aby pokryć powierzchnię taśmy dwustronnej.
Zapobiegnie to układaniu się wyklutych nimf. Przenieś szkiełka szklane malowane proszkowo do średniej wielkości pojemnika z jedzeniem, wodą i złożonym papierem. Wyizolować nimfy G1 w 24 dołkach za pomocą aspiratora lub pędzla.
Utrzymuj zapas sztucznego, regularnego pokarmu dla ryb. Umieść 24-dołkowe płytki w większym pojemniku z dopływem wody o wilgotności od 60 do 80%Szczypnij i wyciągnij cercus z nimfy lub osoby dorosłej za pomocą kleszczy i zbierz je do 0,2 mililitrowej probówki zawierającej 50 mikrolitrów etanolu. Pobrane próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.
Umieścić probówki z otwartymi pokrywkami na bloku termicznym na 15 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza w celu odparowania etanolu. Wstrzyknięcie kompleksu rybonukleoproteinowego gRNA CAS9 do zarodków w ciągu pierwszych ośmiu godzin po złożeniu jaj powoduje powstawanie indeli w miejscu docelowym gRNA. Powoduje to mutacje bialleliczne w niektórych komórkach wstrzykiwanego pokolenia i zwykle uzyskuje się zmutowane fenotypy mozaiki.
Kiedy ten protokół został użyty do wstrzyknięcia gRNA, które zostało zaprojektowane tak, aby celować w biały gen, 32,6% nimf G0 wykazało częściową utratę pigmentacji w złożonych oczach i obszarach grzbietowych. Ocenę transformacji linii zarodkowej dorosłych osobników G0 i zmutowanych osobników G1 przeprowadzono za pomocą genomowego PCR, a następnie testu mobilności heterodupleksowej. W próbkach G1 wyraźnie można odróżnić zróżnicowane wzorce pasmowe między próbkami typu dzikiego a próbkami zmutowanymi.
Edycja genomu w Thermobia zapewnia solidne podejście do analizy mechanizmów genetycznych leżących u podstaw przedwczesnych cech owadów. Pomaga zgłębić tajemnice ich niezwykłego sukcesu i naszego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia kompleksowy protokół dotyczący hodowli i mikroiniekcji jaj gatunku Thermobia domestica, ułatwiający generowan i utrzymanie szczepów mutantów poprzez edycję genomu. Przedstawione metody poprawią wykorzystanie Thermobia jako gatunku modelowego do badań genetycznych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Biologia owadów
- Protokoły laboratoryjne
Tło
- Thermobia domestica jest gatunkiem owadów bazalnych.
- Badania genetyczne na tym gatunku mogą ujawniać wgląd w ewolucję owadów.
- Kluczowe innowacje u owadów obejmują lot napędzany i metamorfozę.
- Ten protokół wspiera zastosowanie narzędzi genetycznych w Thermobia.
Cel badania
- Ustawienie Thermobia domestica jako gatunku modelowego do badań genetycznych.
- Dostarczenie szczegółowej metodologii mikroiniekcji jaj.
- Ułatwienie utrzymania populacji dzikich i mutantów.
Stosowane metody
- Utrzymanie hodowli w dużych plastikowych pojemnikach.
- Mikroiniekcja jaj w celu edycji genomu.
- Regularne karmienie sztucznym pokarmem dla ryb.
- Ustawianie warunków środowiskowych na 37°C i 60-80% wilgotności.
Główne wyniki
- Skuteczna eksploatacja kolonii hodowlanych do zbierania jaj.
- Efektywne generowanie embrionów na różnych etapach rozwoju dla badań.
- Utrzymanie zarówno szczepów dzikich, jak i mutantów.
- Zastosowanie narzędzi genetycznych do dalszych badań.
Wnioski
- Thermobia domestica jest obiecującym modelem do badań genetycznych.
- Opisany protokół poprawia wykonalność manipulacji genetycznych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać te metody do uzyskania wglądów ewolucyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Genome editing in Thermobia domestica enables functional genetic interrogation in a basal insect model, supporting evolutionary and developmental biology pipelines. The protocol's robust microinjection and colony management steps facilitate reproducible generation of mutant strains, expanding the toolkit for non-traditional model systems. This capability strengthens early discovery and target validation for insect biology and comparative genomics portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of gene function in a basal insect lineage.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene-phenotype relationships.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of evolutionary innovations.
- Provides a platform for functional target validation in non-model organisms.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized protocols for embryo microinjection and mutant generation.
- Delivers reproducible, quantitative phenotypic outputs for downstream analysis.
- Prepares validated biological systems for genetic screening workflows.
- Enables scalable colony management for high-throughput studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with comparative studies of gene function across insect taxa.
- Supports continuity from genetic manipulation to phenotypic assessment.
- Provides a foundation for translational biomarker discovery in evolutionary contexts.
- De-risks preclinical model selection by expanding available genetic tools.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early genetic manipulation to phenotypic screening and comparative analysis in insect models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in a basal insect system.
- Screening: Provides reproducible mutant phenotypes for assay development and validation.
- Analytics: Supports quantitative assessment of gene editing outcomes via PCR and mobility assays.
- Translational Research: Facilitates cross-species genetic comparisons relevant to evolutionary biology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to other non-traditional insect models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function studies and evolutionary hypotheses.
- Operational Value: Standardizes microinjection and colony management for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions in comparative genomics and model selection.
- Portfolio Impact: Expands the range of genetically tractable insect models for R&D prioritization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection and insect colony management.
- Needs access to controlled incubators and humidity regulation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible mutant generation.
- Adaptation may be necessary for other insect species with differing biology.
- Limitations include species-specific handling and environmental requirements.
