Name: Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę pomiaru potencjału czynnościowego w kardiomiocytach pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych człowieka przy użyciu szybkiej fotometrii. Protokół umożliwia wysokoprzepustowe badania elektrofizjologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Cairn Research Ltd. za ich wkład finansowy, który pokrył koszty produkcji tej publikacji. Ponadto dziękujemy Pani Ines Mueller i Pani Stefanie Kestel za ich doskonałe wsparcie techniczne.
Badania autorów są wspierane przez Niemieckie Centrum Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym (DZHK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 oraz w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości - EXC 2067/1- 390729940) oraz Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

1. Przygotowanie komórek
UWAGA: Ludzkie iPSC użyte w tym protokole zostały pozyskane od zdrowych dawców i zróżnicowane w monowarstwach przy użyciu w pełni zdefiniowanej modulacji sygnałowej WNT za pomocą małych cząsteczek oraz technik oczyszczania mleczanem, zgodnie z wcześniejszymi opisami12,13,14. iPSC-CM utrzymywano co 2-3 dni w pożywce hodowlanej opisanej poniżej.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną składającą się z pożywki podstawowej (RPMI 1640) oraz 2% dodatku (B27). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Używać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przygotować pożywkę do wysiewu składającą się z pożywki podstawowej (RPMI 1640), 2% dodatku (B27) oraz inhibitora ROCK w rozcieńczeniu 1:2000. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Używać w RT.</li>
	<li>Sterylne, okrągłe szkiełka podstawowe nr 0 o średnicy 10 mm pokryć 150 µL beztłuszczowej macierzy błony podstawnej w rozcieńczeniu 1:60 i inkubować w temperaturze 4 °C przez 4 h. 
	UWAGA: Optymalizacja objętości naniesionej na szkiełko jest niezbędna, aby zapewnić całkowite pokrycie szkła przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedniego napięcia powierzchniowego zapobiegającego rozlaniu. Dla okrągłych szkiełeczek o średnicy 10 mm zaleca się objętość 150 µL. Wielkość partii, rodzaj szkiełka, objętość naniesionego roztworu oraz rodzaj płytki hodowlanej mogą być dostosowane do potrzeb eksperymentatora.</li>
	<li>Rozpocząć dysocjację iPSC-CM za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek na bazie EDTA. Upewnić się, że monowarstwa została całkowicie odklejona, delikatnie wypłukując ją pipetą 1 000 µL.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 15 mL i dodać dwukrotną objętość pożywki do wysiewu. Wirować przez 10 min przy 100 x g.</li>
	<li>Resuspendować osad w żądanej objętości (objętość resuspensji) pożywki do wysiewu. Policzyć komórki manualnie lub elektronicznie.</li>
	<li>Wybrać optymalną gęstość na szkiełko (15 000), co umożliwi późniejszą analizę pojedynczych komórek.</li>
	<li>Obliczyć objętość „aktywnej” zawiesiny komórkowej (A) potrzebną do wysiewu na wszystkie szkiełka z zachowaniem żądanej gęstości. Zastosować poniższy wzór i odlać uzyskaną objętość do osobnej probówki: 
	<img alt="Wzór równowagi statycznej; obliczanie objętości resuspensji na schemacie gęstości komórek." src="/files/ftp_upload/61890/61890equ01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"></li>
	<li>Obliczyć objętość dodatkowej pożywki do wysiewu (B) potrzebną do uzyskania żądanej objętości na każdym szkiełku. Zastosować poniższy wzór i dodać otrzymaną objętość do probówki z aktywną zawiesiną: 
	<img alt="Wzór obliczeniowy dla szkiełka, B[μl]=(Liczba szkiełek×Objętość na szkiełko[μl])-A[μl], równanie." src="/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"></li>
	<li>Usunąć macierz ze szkiełek i nanieść na każde szkiełko odpowiednią „objętość na szkiełko” zawiesiny komórkowej (A+B). Regularnie resuspendować zawiesinę w probówce, aby zapewnić równomierny rozkład komórek.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h. Delikatnie wypełnić dołek pożywką do wysiewu.</li>
	<li>Po 24 h wymienić pożywkę na standardową pożywkę hodowlaną i wymieniać ją co 2-3 dni.</li>
</ol>
2. Układ eksperymentalny
<ol>
	<li>Do przeprowadzenia eksperymentów wyposażyć odwrócony mikroskop epifluorescencyjny w obiektyw o powiększeniu 40x i wysokiej aperturze numerycznej (N.A: &gt; 0.75).</li>
	<li>Do portu oświetlenia przeświecającego mikroskopu podłączyć szybko przełączalną diodę LED o ciepłej białej barwie. W torze światła przeświecającego umieścić prosty filtr czerwony 660 nm. 
	UWAGA: Światło to może być aktywowane podczas eksperymentów fotometrycznych w celu obserwacji próbki bez zakłócania zielonego sygnału fluorescencyjnego.</li>
	<li>Zamontować szybko przełączalną głowicę LED 470 nm do rejestracji fotometrycznej. W porcie epifluorescencyjnym mikroskopu umieścić filtr wzbudzenia 470/40, aby oczyścić światło generowane przez diodę LED. 
	UWAGA: Dla optymalnej kwantyfikacji sygnału zaleca się stosowanie systemu oświetlenia z szybkim sprzężeniem zwrotnym kontrolującym moc wyjściową optyki.</li>
	<li>Do karuzeli jednostki lustrzanej w mikroskopie włożyć kostkę mikroskopową zawierającą dzielnik wiązki długoprzepustowy 495 nm.</li>
	<li>Do portu C-mount mikroskopu dopasować ramię detekcyjne z regulowaną przysłoną pola, aby umożliwić wybór obszaru zainteresowania (ROI).</li>
	<li>Osobno podłączyć do mikroskopu detektor z fotopowielaczem (PMT) oraz kamerę USB. Będą one stanowić podstawę systemu detekcji emisji.</li>
	<li>Do portu PMT włożyć kostkę filtrującą zawierającą dzielnik wiązki długoprzepustowy 565 nm i filtr emisyjny 535/50. Rozdziela to światło emisji pomiędzy dwa detektory. 
	UWAGA: Kamera podłączona do portu przeświecającego systemu detekcji emisji może wykrywać światło przeświecające w polu jasnym podczas wszystkich eksperymentów.</li>
	<li>Podłączyć PMT do zasilacza i wzmacniacza PMT. Wyjście wzmacniacza PMT połączyć z analogowym pinem wejściowym systemu akwizycji danych.</li>
	<li>filtrować dane analogowe z PMT z częstotliwością 1 kHz lub wyższą.</li>
	<li>Cyfryzować dane z częstotliwością co najmniej dwukrotnie większą niż najwyższa częstotliwość występująca w sygnale analogowym (2 kHz lub wyższa), aby spełnić kryterium Nyquista i zapobiec aliasingowi.</li>
</ol>
3. Obciążanie komórek VF2.1Cl
UWAGA: Wszystkie etapy z wykorzystaniem tego barwnika muszą być przeprowadzane w warunkach słabego oświetlenia.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór kąpieli Tyroda o następującym składzie (w mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 glukozy, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl₂2, pH = 7,35 i ogrzać do 37 °C.</li>
	<li>Przygotować alikwot roztworu obciążającego w probówce do mikrocentryfugi poprzez wymieszanie 5 µL z 1000x VF2.1Cl i 50 µL 20% roztworu solubilizującego poloksameru.</li>
	<li>Zastosuj 5 µL roztworu ładującego do 5 ml podgrzanego roztworu Tyrode'a (całkowite stężenie barwnika 0,1x) w szalce Petriego o średnicy 20 mm. 
	UWAGA: Końcowe stężenie barwnika wynosi 0,1x. Jest to 1/10.th zalecaną przez producenta. Pozwala to na oszczędność zasobów, zapewnia pomijalną cytotoksyczność i, co istotne, nadal pozwala na uzyskanie wyraźnych sygnałów optycznych z obciążonych komórek przy wysokim stosunku sygnału do szumu.</li>
	<li>Dodaj do szalki pojedyncze szkiełko podstawowe z iPSC-CM i inkubuj w 37 °C przez 20 min.</li>
	<li>Zmontuj podgrzewaną komorę do obrazowania żywych komórek. Zamocuj ją na stoliku mikroskopu i napełnij 500 µL świeżego roztworu Tyrode'a.</li>
	<li>Przemyć szkiełko podstawne świeżym roztworem Tyrode'a w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś szkiełko podstawowe z iPSC-CM do uprzednio ogrzanej komory kąpieli, używając pęsety z cienkimi końcówkami. 
	UWAGA: Należy dopilnować, aby komora oraz jej zawartość były stale podgrzewane do temperatury fizjologicznej. W razie potrzeby należy rozpocząć od ciągłej perfuzji ogrzanym roztworem Tyrode'a.</li>
</ol>
4. Stymulacja polem elektrycznym
UWAGA: Zewnętrzne stymulowanie iPSC-CM jest opcjonalne, lecz przydatne w celu standaryzacji dynamiki komórkowej i parametrów eksperymentalnych. Ułatwia ono analizę i pozwala na badanie efektów zależnych od częstotliwości.
<ol>
	<li>Zamocuj w komorze pomiarowej wkład stymulujący z dwiema elektrodami platynowymi rozstawionymi w odległości 5 mm.</li>
	<li>Podłącz zewnętrzny stymulator do wkładu stymulującego. Ustaw dwubiegunowe impulsy polowe o czasie trwania 5 ms i częstotliwości 0,5 Hz.</li>
	<li>Wyznacz optymalne napięcie stymulacji, zwiększając wartość bodźca od 1 V w górę. Bodziec progowy definiuje się jako najniższe napięcie, przy którym komórki zaczynają się kurczyć. Zastosuj napięcia o około 25% wyższe od tego progu. Normalny zakres wynosi od 1 V do 30 V.</li>
	<li>Ustaw częstotliwość stymulacji za pomocą zewnętrznego stymulatora lub wyzwalaj ją przy pomocy oprogramowania do akwizycji danych.</li>
</ol>
5. Optyczna akwizycja potencjału czynnościowego
UWAGA: Niniejszy protokół wykorzystuje komercyjne oprogramowanie do akwizycji i analizy.
<ol>
	<li>Wizualizuj miocyty w trybie pola jasnego, korzystając ze ścieżki światła przechodzącego i kamery USB.</li>
	<li>Wybierz odizolowaną komórkę i ściśle ogranicz jej ścieżkę optyczną za pomocą przysłony pola, aby upewnić się, że monitorowane jest tylko światło z interesującej nas komórki.</li>
	<li>Aktywuj wzmacniacz PMT i ustaw zasilanie PMT na 750 V.</li>
	<li>Uruchom protokół stymulacji (patrz krok 4) wraz z oprogramowaniem akwizycyjnym i jednocześnie aktywuj światło wzbudzenia o długości fali 470 nm. To ostatnie można wykonać za pomocą panelu zdalnego lub zautomatyzować przy stałej intensywności (sygnał TTL).</li>
	<li>Dostosuj wzmocnienie (gain) i przesunięcie (offset) wzmacniacza PMT, aby upewnić się, że sygnał nie ulega nasyceniu i jest zoptymalizowany dla zakresu detekcji systemu rejestrującego.</li>
	<li>Zarejestruj 10 przebiegów (sweeps), upewniając się, że wykryto stabilne potencjały czynnościowe.</li>
	<li>Kontynuuj rejestrację i natychmiast przesuń stolik mikroskopu, aby krótko zarejestrować sygnał tła z obszaru pozbawionego komórek. Wyłącz światło wzbudzenia. 
	UWAGA: Ta wartość tła (Foffset) zostanie wykorzystana do skorygowania ewentualnej fluorescencji tła.</li>
	<li>W razie potrzeby przeprowadź lokalną perfuzję leków referencyjnych, takich jak 1 µM nifedipiny, aby zidentyfikować odpowiedzi komórkowe na manipulację farmakologiczną.</li>
	<li>W sposób sekwencyjny powtórz kroki 5.2–5.7, wybierając za każdym razem nową komórkę. W razie potrzeby wymień szkiełka nakrywne, aby zapewnić wysoką przepustowość eksperymentu podczas jednej sesji. 
	UWAGA: Protokoły ładowania i akwizycji obrazów opisano na Rysunku 2.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz zapisane nagranie w oprogramowaniu do analizy i wyciągnij średnią z 10 prób zawierających stymulowane potencjały czynnościowe z pojedynczej komórki.</li>
	<li>Oblicz średnią wartość sygnału bazowego reprezentującego Foffset i odejmij ją od uśrednionego śladu.</li>
	<li>Oblicz ∆F/F0 za pomocą następującego wzoru (gdzie F to zmierzona fluorescencja, a F0 to fluorescencja rozkurczowa): 
	<img alt="Diagram wzoru na zmianę fluorescencji ΔF/F₀, edukacyjna koncepcja fizyczna, ilustracja wzoru." src="/files/ftp_upload/61890/61890equ03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3"></li>
	<li>Zidentyfikuj linię bazową śladu (rozkurczową) oraz obszar zainteresowania (AP) i zmierz wymagane parametry potencjału czynnościowego serca. Obejmuje to między innymi czas zaniku dla 50% (APD50) i 90% (APD90) repolaryzacji.</li>
	<li>Wyeksportuj dane z tej pojedynczej komórki do programu arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.1 – 6.5 dla wszystkich nagrań. Oceń wyniki za pomocą odpowiednich testów dla prób niezależnych lub analizy wariancji.</li>
</ol>
<img alt="Protokół wprowadzania VF2.1Cl do iPSC-CM; obejmuje ładowanie komórek i konfigurację obrazowania mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Protokoły wprowadzania i akwizycji obrazów. (A) Schemat blokowy pełnego protokołu wprowadzania VF2.1Cl do iPSC-CM oraz natywnych kardiomiocytów. (B) Uproszczony schemat konfiguracji dzielnika wiązki (BS) i filtrów użytych w tym protokole do wzbudzenia i detekcji emisji VF2.1Cl w odpowiedzi na zmiany napięcia błony komórkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+fluorescent+voltage+indicators+for+studying+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).</li>
<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
<li>Horváth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resting+membrane+potential+and+low+inward+rectifier+potassium+currents+are+not+inherent+features+of+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).</li>
<li>Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSalama%2C+G+%22Science%22">Science</a>. 191 (4226), 485-487 (1976).</li>
<li>Hortigon-Vinagre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+ratiometric+fluorescence+measurements+of+the+voltage+sensitive+dye+Di-4-ANEPPS+to+examine+action+potential+characteristics+and+drug+effects+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).</li>
<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li>
<li>Miller, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+monitoring+voltage+in+neurons+by+photo-induced+electron+transfer+through+molecular+wires%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).</li>
<li>Bedut, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+drug+profiling+with+voltage-+and+calcium-sensitive+fluorescent+probes+in+human+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).</li>
<li>McKeithan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+platform+for+assessment+of+congenital+and+drug-induced+arrhythmia+with+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Physiology. 8, 766(2017).</li>
<li>Duncan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-mediated+shortening+of+action+potentials+in+LQTS2+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).</li>
<li>Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+acquisition+and+analysis+methods+in+multi-electrode+array+experiments+with+iPS+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Kleinsorge, M., Cyganek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-directed+differentiation+of+human+iPSCs+into+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. , 100026(2020).</li>
<li>Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monophasic+action+potential+recordings+from+intact+mouse+heart%3A+validation%2C+regional+heterogeneity%2C+and+relation+to+refractoriness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).</li>
<li>Leopold, J. A., Loscalzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+precision+medicine+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+Leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+atrial+arrhythmogenesis+in+patients+with+paroxysmal+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation.</a> Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).</li>
<li>Fakuade, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+atrial+cytosolic+calcium+handling+contributes+to+the+development+of+postoperative+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. , doi: 10.1093/cvr/cvaa162. Online ahead of print 162(2020).</li>
<li>Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+ratiometric+fluorescence+measurement+of+the+membrane+dipole+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential.</a> Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).</li>
<li>Matiukas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+voltage-sensitive+fluorescent+dyes+optimized+for+optical+mapping+in+blood-perfused+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium.</a> Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).</li>
<li>Mutoh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrally-resolved+response+properties+of+the+three+most+advanced+fret+based+fluorescent+protein+voltage+probes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes.</a> PLoS One. 4 (2), 4555(2009).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li>
<li>Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomerically+pure+tetramethylrhodamine+voltage+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).</li>
<li>Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectra%2C+membrane+binding%2C+and+potentiometric+responses+of+new+charge+shift+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes.</a> Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).</li>
<li>Fromherz, P., Muller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+fluorescence+of+amphiphilic+hemicyanine+dyes+in+neuron+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).</li>
<li>Salama, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+new%2C+long-wavelength%2C+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+action+potentials+and+subthreshold+electrical+events+imaged+in+neurons+with+a+fluorescent+protein+voltage+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe.</a> Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).</li>
<li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3 (6), 2514(2008).</li>
<li>Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+optical+reporting+of+membrane+potential+in+situ+using+a+neuronal+tracer+dye%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye.</a> The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution%2C+contraction%2C+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).</li>
<li>Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrophysiological+and+mechanical+effects+of+2%2C3-butane-dione+monoxime+and+cytochalasin-D+in+the+Langendorff+perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).</li>
<li>Képiró, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((para-Nitroblebbistatin%2C+the+non-cytotoxic+and+photostable+Myosin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li>
</ol>

Firma Cairn Research Ltd wsparła tę publikację, pokrywając koszty produkcji pliku wideo.

W tym miejscu opisujemy podstawowy protokół umożliwiający łatwe pozyskiwanie szczegółowych profili AP z izolowanych iPSC-CM odpowiednich do modelowania elektrofizjologicznego i badań przesiewowych leków sercowych. Wykrywamy regularne, solidne AP z naszych słabo rozsianych iPSC-CM, co sugeruje zarówno funkcjonalność wskaźnika, jak i wierność metodologiczną.
Ze względu na szerokie spektrum komercyjnych metodologii przeprogramowania iPSC i brak standaryzacji protokołów różnicowania serca, modele ...

Modelowanie elektrofizjologiczne kardiomiocytów oraz budowa wydajnych platform do przesiewania leków kardiologicznych są niezbędne dla opracowania strategii terapeutycznych w przypadku wielu zaburzeń arytmicznych. Szybki rozwój technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przyniósł obiecujące postępy w modelowaniu ludzkich chorób i badaniach farmakologicznych z wykorzystaniem wyizolowanych kardiomiocytów pochodzących od pacjentów (iPSC-CM). Techniki „złotego standardu” w charakteryzacji elektrofizjologicznej tych komórek za pomocą metody patch-clamp (clamp prądowy) pozwalają na ilościowe określenie morfologii i czasu trwania potencjału czynnościowego (AP), jednak metoda ta jest niezwykle złożona i powolna, przez co nie nadaje się do wysokoprzepustowego pozyskiwania danych1. Regularnie zgłasza się, że iPSC-CM wykazują zwiększony potencjał błonowy w fazie rozkurczowej oraz zwiększony prąd przeciekowy w porównaniu z natywnymi kardiomiocytami dorosłych2. Sugeruje się, że mniejszy rozmiar komórek i zmniejszona pojemność błony obserwowana w iPSC-CM mogą powodować pewien błąd systematyczny podczas stosowania techniki clamp prądowy, co być może wyjaśnia te odchylenia3. Aby zmaksymalizować użyteczność platformy iPSC-CM, cenna jest dodatkowa metoda pozwalająca zwiększyć przepustowość i zapewnić dokładność danych podczas charakteryzacji zmian napięcia przezbłonowego na poziomie pojedynczej komórki w iPSC-CM.
Barwniki napięciowo-wrażliwe (VSD) od dawna są proponowaną metodą zapewniającą szybszą, nieinwazyjną i równoważną analizę kinetyki potencjału czynnościowego (AP) serca w porównaniu do technik tradycyjnych4. Niedawne badanie wykazało przydatność ratiometrycznej fotometrii z użyciem sond napięciowo-wrażliwych do dokładnego ilościowego określenia AP serca5. Co więcej, możliwość łatwego skalowania metod fotometrii optycznej sprawia, że technika ta nadaje się do wielkoskalowych badań kardiotoksyczności, które są kluczowe w rozwoju leków terapeutycznych (np. CiPA). Opracowanie ustandaryzowanych protokołów kardiotoksyczności w ślepym badaniu wieloośrodkowym z wykorzystaniem macierzy mikroelektrod oraz optycznych technik pomiaru napięcia wykazało kluczową wartość tego podejścia6.
Wiele barwników potencjometrycznych jest dostępnych w handlu, a trwający rozwój syntetyczny nowych sond wykazuje obiecujący potencjał w zakresie usprawnienia ich skuteczności w różnorodnych konstrukcjach kardiologicznych i neuronalnych. Idealny VSD powinien charakteryzować się zwiększoną kinetyką i czułością, przy jednoczesnym obniżeniu obciążenia pojemnościowego, fotowyblakaniu i cytotoksyczności. Niedawno zsyntetyzowany VF2.1Cl (FluoVolt) wykazuje wiele z tych korzystnych właściwości, co wynika głównie z jego nowatorskiej molekularnej struktury opartej na „przewodzie”, wspólnej dla innych członków nowej rodziny VoltageFluor (VF)7. W przeciwieństwie do powszechnych elektrochromowych VSD, w których proste sondy sprzęgają się molekularnie i elektrycznie z błoną plazmatyczną, barwnik ten składa się z pasywnie wstawionego, syntetycznego przewodu przechodzącego przez błonę, który łączy donora bogatego w elektrony z modyfikowanym fluoroforem fluoresceiny (FITC). Szczegóły mechanistyczne przedstawiono na Rysunku 1. Barwnik ten wykazuje doskonałą czułość na fluktuacje napięcia błony, wykazując 27% zmianę natężenia emisji na każde 100 mV, w przeciwieństwie do ~10% obserwowanych w innych powszechnych sondach przy porównywalnych prędkościach7. Ponadto systemy PeT oparte na przewodach nie oddziałują bezpośrednio z komórkowym polem elektrycznym, co generuje minimalne zakłócenia elektryczne i pomijalne zmiany w komórkowym obciążeniu pojemnościowym.
<img alt="Fluorescencja w dwuwarstwie fosfolipidowej; proces PeT; VF2.1Cl, wykres długości fali, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Parametry chemiczne, spektralne i mechanistyczne barwnika VF2.1Cl. (A) Struktura chemiczna VF2.1Cl. Wśród cech molekularnych należy zwrócić uwagę na liczne grupy alkilowe w obrębie molekularnego drutu fenyleno-winylenowego, które ułatwiają wbudowanie w błonę plazmatyczną. Ujemnie naładowana grupa kwasu sulfonowego sprzężona z sondą FITC zapewnia stabilizację fluoroforu na powierzchni zewnętrznej i wspomaga wbudowanie niemal prostopadłe w stosunku do pola elektrycznego dwuwarstwy lipidowej. (B) Uproszczony schemat prostopadłego osadzenia VF2.1Cl w błonie plazmatycznej komórki docelowej. (C) Widma absorpcji i emisji barwnika VF2.1Cl. Widma są identyczne jak w przypadku standardowych sond FITC i GFP. (D) Przedstawienie mechanistycznego trybu działania VF2.1Cl. W warunkach spoczynku (hiperpolaryzacji), ujemne napięcia wewnątrzkomórkowe kierują wolne elektrony w stronę rostralnego fluoroforu. Obfitość elektronów sprawia, że fotoindukowany transfer elektronu (PeT) jest preferowaną drogą wyjścia ze stanu wzbudzonego po wzbudzeniu optycznym, co skutecznie wygasza fluorescencję. W przeciwieństwie do tego, zdepolaryzowany potencjał błonowy wpływa na ruch elektronów w dół, co sprzyja fluorescencji po wzbudzeniu optycznym. Wynikowa odpowiedź fluorescencyjna jest liniowo powiązana z napięciem błony i może być precyzyjnie wykorzystana do gromadzenia szczegółowych informacji czasowych o kinetyce elektrofizjologicznej komórek. (E) Reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym (górny) oraz fluorescencyjne przy 470 nm (dolny) kardiomiocytów króliczych obciążonych VF2.1Cl. (F) Stos Z pojedynczego obciążonego kardiomiocytu. Strzałki wskazują obszary wyraźnej lokalizacji VF2.1Cl w błonie komórkowej. Obrazy pozyskano za pomocą konfokalnego systemu z dyskiem wirującym, składającego się z głowicy konfokalnej X-lightv3 z dyskiem wirującym i wzorem otworów pinhole 50 µm; iluminatora LDI-7; kamery Prime95B oraz obiektywu PlanApo Lambda 100x. Pasek skali: 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Sonda FITC sprzężona z VF2.1Cl zapewnia możliwość efektywnego wykorzystania jej w standardowych konfiguracjach filtrów oraz filtrach GFP i wymaga jedynie jednokanałowego systemu akwizycji, co jest powszechną cechą platform obrazowania fluorescencyjnego. Analiza gęstych monowarstw ludzkich iPSC-CM z użyciem tego barwnika została opisana w niedawnych publikacjach8,9,10,11. Nasz protokół różni się od tych badań ze względu na analizę pojedynczych, izolowanych iPSC-CM, niepodlegających wpływom elektrycznym i parakrynnym gęstych monowarstw syncytialnych, a także zastosowanie przystępnego cenowo i konfigurowalnego systemu fotometrii zamiast złożonych układów obrazowania konfokalnego lub szerokopolowego.
W niniejszej pracy opisujemy nasz protokół szybkiej akwizycji i analizy stabilnych optycznych potencjałów czynnościowych (APs) z izolowanych kardiomiocytów pochodzących z ludzkich iPSC oraz kardiomiocytów natywnych (patrz Plik uzupełniający). Wykorzystujemy VF2.1Cl w połączeniu z konfigurowalną, nowoczesną platformą do pomiarów fotometrii pojedynczych komórek. Niniejsze protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez komisję etyki Centrum Medycznego Uniwersytetu w Getyndze (nr 10/9/15).

<table><tbody><tr><td><silne>odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 Trypsyna EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>Suplement B27&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN04.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza bezwodna&nbsp; BioChemica</td><td>ITW Odczynniki</td><td>A1422</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw potencjału membranowego FluoVolt&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN77.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Lamanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Nifedypina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21829-25-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK Y27632</td><td>Stemolekuła</td><td>04-0012-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Średni&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>61870010</tr><tr><td>Versene EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15040033</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>495LP Dichroiczny rozdzielacz wiązki&nbsp;</td><td>Wzmacniacz Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B&nbsp;</td>Urządzenia <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe, grubość 0</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podwójny zasilacz OptoLED&nbsp;</td><td>Badania Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia ET470/40x&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET535/50m</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrawiony hemacytometr Neubauera</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kostki filtracyjne&nbsp;</td><td>Badania Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony IX73&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr>Badania <td>MonoLED</td><td>Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptery wieloportowe&nbsp;</td><td>Badania Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stymulator komórek mięśniobójczych&nbsp;</td><td>Migawka IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optomask&nbsp;</td><td>Badania Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontroler systemu Optoscan</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platforma z kontrolowaną temperaturą PH-1&nbsp; &nbsp;</td><td>Instrumenty Warnera&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detektor fotopowielaczy&nbsp;</td><td>Badania Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wkładka wzmacniacza PMT</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wkładka zasilająca PMT</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC-26G Otwarta komora kąpielowa&nbsp;</td><td>Instrumenty Warnera&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adapter sceniczny SA-OLY/2AL&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T565lpxr Dichroiczny rozdzielacz wiązki&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T660lpxr Dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-20 Dwukanałowy regulator temperatury&nbsp;</td><td>npi Elektroniczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>obiektyw UPLFLN 40X</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolorowa kamera USB 3.0&nbsp;</td><td>Źródło</td><td></td><td></td> obrazowania</tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex 11.1</td><td>Urządzenia molekularne&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia molekularne</td> <td>Clampfit 11.1</td>&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td>Przechwytywanie IC 2.4&nbsp;</td><td>Źródło obrazowania&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pryzmat 8</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Konwencjonalne techniki wewnątrzkomórkowych mikroelektrod do ilościowego określania elektrofizjologii kardiomiocytów są niezwykle złożone, pracochłonne i zazwyczaj przeprowadzane z niską przepustowością. Szybki i ciągły rozwój technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) stanowi nowy standard w badaniach sercowo-naczyniowych, a alternatywne metody są obecnie niezbędne do zwiększenia przepustowości danych elektrofizjologicznych na poziomie pojedynczej komórki. VF2.1Cl to niedawno uzyskany barwnik wrażliwy na napięcie, który zapewnia szybką, jednokanałową, wysoką reakcję na wahania potencjału błony. Posiada kinetykę lepszą niż inne istniejące wskaźniki napięcia i udostępnia dane funkcjonalne równoważne z tradycyjnymi technikami mikroelektrodowymi. W tym miejscu demonstrujemy uproszczoną, nieinwazyjną charakterystykę potencjału czynnościowego w zewnętrznie stymulowanych ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu modułowego i bardzo przystępnego cenowo systemu fotometrycznego.

<img alt="Badanie kardiomiocytów: mysie vs ludzkie iPSC-CM, przesiewanie leków, porównanie APD, schemat doświadczalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Profile optycznego potencjału czynnościowego (AP) izolowanych natywnych kardiomiocytów oraz kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-CM). (A) Repreze...

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Protokół ten może zapewnić wysokoprzepustowe pomiary elektrofizjologii komórkowej w sposób, który pasuje do szybko rozwijającej się technologii indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest mniej złożona i mniej pracochłonna niż tradycyjna technika zaciskania krosowego, a mimo to jest w stanie uzyskać równoważne wyniki. Tak więc protokół ten może zostać rozszerzony na potrzeby zakrojonych na szeroką skalę programów badań przesiewowych toksyczności przy użyciu indukowanych przez człowieka kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych.Na przykład kompleksowy test proarytmii in vitro. Aby przygotować do eksperymentu indukowane pluripotencjalne kultury kardiomiocytów pochodzące z komórek macierzystych, najpierw pokryj pojedyncze 10-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe o numerze zero 150 mikrolitrami matrycy błony podstawnej w skali 1:60 w każdym dołku 24-dołkowej płytki i inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny. Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar matrycy z szkiełek nakrywkowych i nałożyć odpowiednią objętość komórek na każdy szkiełko nakrywkowe.Po godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza ostrożnie napełnij każdą studzienkę podłożem galwanicznym i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. Aby przygotować się do obrazowania barwnika wrażliwego na napięcie, wyposaż odwrócony mikroskop epifluorescencyjny w obiektyw o 40-krotnym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej i podłącz szybko przełączającą się diodę LED w kolorze ciepłej bieli do portu transmitowanego oświetlenia. Włóż prosty czerwony filtr 660 nanometrów do ścieżki światła przechodzącego i zamontuj szybko przełączającą się głowicę LED 470 nanometrów do rejestracji fotometrycznej.Umieść filtr wzbudzenia 470/40 w porcie epifluorescencji, aby oczyścić światło generowane przez diodę LED, a następnie włóż kostkę mikroskopową zawierającą rozdzielacz wiązki o długości 495 nanometrów w karuzeli lustrzanej w mikroskopie. Zamontuj ramię detekcyjne zawierające regulowaną membranę polową do portu mocowania C, aby umożliwić wybór obszaru zainteresowania, a następnie połącz detektor PMT i kamerę USB z mikroskopem. Włóż kostkę filtrującą zawierającą rozdzielacz wiązki o długości 565 nanometrów i filtr emisyjny 535/50 do portu PMT, aby rozdzielić światło emisyjne między dwa detektory.Podłącz PMT do zasilacza i wzmacniacza PMT, a następnie podłącz wyjście wzmacniacza PMT do analogowego pinu wejściowego systemu akwizycji danych. Aby spełnić kryteria Nyquista i zapobiec aliasingowi, należy przefiltrować dane analogowe z PMT z częstotliwością co najmniej jednego kiloherca i zdigitalizować dane z częstotliwością co najmniej dwukrotnie większą niż najwyższa częstotliwość obecna w sygnale analogowym. Aby załadować ogniwa barwnikiem wrażliwym na napięcie, wymieszaj pięć mikrolitrów 1000x FluoVolt i 50 mikrolitrów roztworu obciążenia mocy, a następnie dodaj trzy mikrolitry powstałego roztworu ładującego do trzech mililitrów podgrzanego roztworu Tyrode na szalce Petriego.Dodaj do naczynia pojedynczy indukowany pluripotencjalny szkiełko nakrywkowe pokryte kardiomiocytami pochodzącymi z komórek macierzystych i umieść naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Zamontuj podgrzewaną komorę do obrazowania żywych komórek na stoliku mikroskopu i napełnij komorę 500 mikrolitrami świeżego roztworu Tyrode. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe świeżym roztworem tyrodu w temperaturze 37 stopni Celsjusza i za pomocą cienkich kleszczyków punktowych ostrożnie przenieś szkiełko nakrywkowe do wstępnie ogrzanej komory kąpielowej.Aby ustandaryzować dynamikę komórkową i parametry eksperymentalne, włóż dwie platynowe elektrody do komory, w odstępach pięciu milimetrów od siebie, i podłącz elektrody do zewnętrznego stymulatora. Ustaw stymulator na pięć milisekundowych impulsów pola dwubiegunowego o częstotliwości 0,5 herca i zwiększaj bodziec od jednego wolta, aż komórki zaczną się kurczyć. Następnie ustaw napięcie na około 25% powyżej tego progu.Do optycznej akwizycji potencjału czynnościowego użyj ścieżki światła przechodzącego i kamery USB do wizualizacji miocytów w warunkach jasnego pola. Wybierz izolowaną komórkę i użyj przysłony polowej, aby ściśle przyciąć jej ścieżkę optyczną, upewniając się, że monitorowane jest tylko światło z komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Aktywuj PMT amplifier i ustaw zasilanie PMT na 750 woltów.Uruchom protokół stymulacji wraz z oprogramowaniem akwizycyjnym, jednocześnie aktywując światło wzbudzające o długości 470 nanometrów. Nagraj 10 przemiatań, upewniając się, że wykryte są stabilne potencjały czynnościowe. Po ostatnim przemiataniu natychmiast przesuń stolik mikroskopu, nadal nagrywając, aby na krótko uzyskać sygnał tła z obszaru pozbawionego komórek i wyłączyć światło wzbudzenia.Aby przeanalizować dane dotyczące potencjału czynnościowego, otwórz zapisane nagranie w odpowiednim oprogramowaniu analitycznym i uśrednij 10 przemiatania zawierających wymuszone potencjały czynnościowe z pojedynczej komórki. Odejmij średnią sygnału podstawowego reprezentującego przesunięcie fluorescencji od średniego śladu, a następnie użyj wzoru do obliczenia zmiany fluorescencji przy użyciu fluorescencji rozkurczowej jako F0. Zidentyfikuj obszary zainteresowania rozkurczowe i potencjału czynnościowego i zmierz pożądane parametry potencjału czynnościowego serca, w tym między innymi czas trwania przy 50% i 90% repolaryzacji. Następnie wyeksportuj dane z tej pojedynczej komórki do programu arkusza kalkulacyjnego.Metoda ta pozwala na szybką i precyzyjną kwantyfikację mechaniki repolaryzacji, co może dostarczyć cennych informacji na temat nieprawidłowości jonowych w komórkach. Wyraźne cechy fazy pierwszej można zaobserwować w sygnałach optycznych z kardiomiocytów myszy, które są morfologicznie różne od kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ponadto ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych reagują na manipulację farmakologiczną nifedypiną, znanym antagonistą kanału wapniowego typu L.Podczas ciągłego stosowania leku zaobserwowano 41,5% skrócenie czasu trwania potencjału czynnościowego przy 90% repolaryzacji, co sugeruje funkcjonalność obrazowania opartego na wskaźnikach napięcia fluorescencyjnego jako platformy dla prospektywnych wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków sercowych. Ważne jest, aby pamiętać, że chociaż barwnik wrażliwy na napięcie zastosowany w tym badaniu jest mniej cytotoksyczny niż inne, światło wzbudzające powinno być nadal używane oszczędnie, aby zachować żywotność komórek. Sprzęt do fotometrii modulacyjnej używany w tym protokole jest niezwykle wszechstronny.Na przykład może być używany do jednoczesnych pomiarów innych parametrów elektrofizjologicznych, takich jak wewnątrzkomórkowy wapń.

single-cell-optical-action-potential-measurement-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Tutaj prezentujemy metodę optycznego obrazowania potencjałów czynnościowych, szczególnie w indukowanych komorowo indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych. Metoda opiera się na sterowanej przez promotor ekspresji wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego.

Specyficzne dla podtypu zapisy optycznego potencjału czynnościowego w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach komorowych pochodzących z komórek macierzystych

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Kombinacja poracji laserowej i matryc mikroelektrod (MEA) pozwala na rejestrację kardiomiocytów z hodowanych pierwotnych i pochodzących z komórek macierzystych zapisów podobny do potencjału czynnościowego. Kształt fali zapewnia lepszy wgląd w sposób działania badanych związków niż standardowe nagrania. Łączy on patch-clamp i odczyt MEA, aby jeszcze bardziej zoptymalizować badania nad bezpieczeństwem kardiologicznym w przyszłości.

Indukowane laserowo pomiary potencjału czynnościowego kardiomiocytów na układach mikroelektrod w celu zwiększenia predykcyjności bezpieczeństwa farmakologii

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj demonstrujemy nieinwazyjną metodę oceny kurczliwości kardiologicznych urządzeń medycznych przy użyciu monowarstw 2D indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM), platerowanych na elastycznym podłożu, w połączeniu z mikroskopią opartą na wideo. Narzędzie to będzie przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) to rozwijająca się technologia umożliwiająca obrazowanie kontrastów absorpcji optycznej in vivo z rozdzielczością i czułością na poziomie komórkowym. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję wizualną dotyczącą protokołów eksperymentalnych OR-PAM, obejmującą konfigurację systemu, jego kalibrację, typowe procedury eksperymentalne in vivo oraz schematy obrazowania funkcjonalnego.

Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej

Poznaj metodę pomiaru potencjału czynnościowego w kardiomiocytach pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych człowieka przy użyciu szybkiej fotometrii. Protokół umożliwia wysokoprzepustowe badania elektrofizjologii komórkowej.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów