Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Protokół ten może zapewnić wysokoprzepustowe pomiary elektrofizjologii komórkowej w sposób, który pasuje do szybko rozwijającej się technologii indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest mniej złożona i mniej pracochłonna niż tradycyjna technika zaciskania krosowego, a mimo to jest w stanie uzyskać równoważne wyniki. Tak więc protokół ten może zostać rozszerzony na potrzeby zakrojonych na szeroką skalę programów badań przesiewowych toksyczności przy użyciu indukowanych przez człowieka kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Na przykład kompleksowy test proarytmii in vitro. Aby przygotować do eksperymentu indukowane pluripotencjalne kultury kardiomiocytów pochodzące z komórek macierzystych, najpierw pokryj pojedyncze 10-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe o numerze zero 150 mikrolitrami matrycy błony podstawnej w skali 1:60 w każdym dołku 24-dołkowej płytki i inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny. Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar matrycy z szkiełek nakrywkowych i nałożyć odpowiednią objętość komórek na każdy szkiełko nakrywkowe.

Po godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza ostrożnie napełnij każdą studzienkę podłożem galwanicznym i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. Aby przygotować się do obrazowania barwnika wrażliwego na napięcie, wyposaż odwrócony mikroskop epifluorescencyjny w obiektyw o 40-krotnym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej i podłącz szybko przełączającą się diodę LED w kolorze ciepłej bieli do portu transmitowanego oświetlenia. Włóż prosty czerwony filtr 660 nanometrów do ścieżki światła przechodzącego i zamontuj szybko przełączającą się głowicę LED 470 nanometrów do rejestracji fotometrycznej.

Umieść filtr wzbudzenia 470/40 w porcie epifluorescencji, aby oczyścić światło generowane przez diodę LED, a następnie włóż kostkę mikroskopową zawierającą rozdzielacz wiązki o długości 495 nanometrów w karuzeli lustrzanej w mikroskopie. Zamontuj ramię detekcyjne zawierające regulowaną membranę polową do portu mocowania C, aby umożliwić wybór obszaru zainteresowania, a następnie połącz detektor PMT i kamerę USB z mikroskopem. Włóż kostkę filtrującą zawierającą rozdzielacz wiązki o długości 565 nanometrów i filtr emisyjny 535/50 do portu PMT, aby rozdzielić światło emisyjne między dwa detektory.

Podłącz PMT do zasilacza i wzmacniacza PMT, a następnie podłącz wyjście wzmacniacza PMT do analogowego pinu wejściowego systemu akwizycji danych. Aby spełnić kryteria Nyquista i zapobiec aliasingowi, należy przefiltrować dane analogowe z PMT z częstotliwością co najmniej jednego kiloherca i zdigitalizować dane z częstotliwością co najmniej dwukrotnie większą niż najwyższa częstotliwość obecna w sygnale analogowym. Aby załadować ogniwa barwnikiem wrażliwym na napięcie, wymieszaj pięć mikrolitrów 1000x FluoVolt i 50 mikrolitrów roztworu obciążenia mocy, a następnie dodaj trzy mikrolitry powstałego roztworu ładującego do trzech mililitrów podgrzanego roztworu Tyrode na szalce Petriego.

Dodaj do naczynia pojedynczy indukowany pluripotencjalny szkiełko nakrywkowe pokryte kardiomiocytami pochodzącymi z komórek macierzystych i umieść naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Zamontuj podgrzewaną komorę do obrazowania żywych komórek na stoliku mikroskopu i napełnij komorę 500 mikrolitrami świeżego roztworu Tyrode. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe świeżym roztworem tyrodu w temperaturze 37 stopni Celsjusza i za pomocą cienkich kleszczyków punktowych ostrożnie przenieś szkiełko nakrywkowe do wstępnie ogrzanej komory kąpielowej.

Aby ustandaryzować dynamikę komórkową i parametry eksperymentalne, włóż dwie platynowe elektrody do komory, w odstępach pięciu milimetrów od siebie, i podłącz elektrody do zewnętrznego stymulatora. Ustaw stymulator na pięć milisekundowych impulsów pola dwubiegunowego o częstotliwości 0,5 herca i zwiększaj bodziec od jednego wolta, aż komórki zaczną się kurczyć. Następnie ustaw napięcie na około 25% powyżej tego progu.

Do optycznej akwizycji potencjału czynnościowego użyj ścieżki światła przechodzącego i kamery USB do wizualizacji miocytów w warunkach jasnego pola. Wybierz izolowaną komórkę i użyj przysłony polowej, aby ściśle przyciąć jej ścieżkę optyczną, upewniając się, że monitorowane jest tylko światło z komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Aktywuj PMT amplifier i ustaw zasilanie PMT na 750 woltów.

Uruchom protokół stymulacji wraz z oprogramowaniem akwizycyjnym, jednocześnie aktywując światło wzbudzające o długości 470 nanometrów. Nagraj 10 przemiatań, upewniając się, że wykryte są stabilne potencjały czynnościowe. Po ostatnim przemiataniu natychmiast przesuń stolik mikroskopu, nadal nagrywając, aby na krótko uzyskać sygnał tła z obszaru pozbawionego komórek i wyłączyć światło wzbudzenia.

Aby przeanalizować dane dotyczące potencjału czynnościowego, otwórz zapisane nagranie w odpowiednim oprogramowaniu analitycznym i uśrednij 10 przemiatania zawierających wymuszone potencjały czynnościowe z pojedynczej komórki. Odejmij średnią sygnału podstawowego reprezentującego przesunięcie fluorescencji od średniego śladu, a następnie użyj wzoru do obliczenia zmiany fluorescencji przy użyciu fluorescencji rozkurczowej jako F0. Zidentyfikuj obszary zainteresowania rozkurczowe i potencjału czynnościowego i zmierz pożądane parametry potencjału czynnościowego serca, w tym między innymi czas trwania przy 50% i 90% repolaryzacji. Następnie wyeksportuj dane z tej pojedynczej komórki do programu arkusza kalkulacyjnego.

Metoda ta pozwala na szybką i precyzyjną kwantyfikację mechaniki repolaryzacji, co może dostarczyć cennych informacji na temat nieprawidłowości jonowych w komórkach. Wyraźne cechy fazy pierwszej można zaobserwować w sygnałach optycznych z kardiomiocytów myszy, które są morfologicznie różne od kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ponadto ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych reagują na manipulację farmakologiczną nifedypiną, znanym antagonistą kanału wapniowego typu L.

Podczas ciągłego stosowania leku zaobserwowano 41,5% skrócenie czasu trwania potencjału czynnościowego przy 90% repolaryzacji, co sugeruje funkcjonalność obrazowania opartego na wskaźnikach napięcia fluorescencyjnego jako platformy dla prospektywnych wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków sercowych. Ważne jest, aby pamiętać, że chociaż barwnik wrażliwy na napięcie zastosowany w tym badaniu jest mniej cytotoksyczny niż inne, światło wzbudzające powinno być nadal używane oszczędnie, aby zachować żywotność komórek. Sprzęt do fotometrii modulacyjnej używany w tym protokole jest niezwykle wszechstronny.

Na przykład może być używany do jednoczesnych pomiarów innych parametrów elektrofizjologicznych, takich jak wewnątrzkomórkowy wapń.