Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Protokół ten zapewnia warunki eksperymentalne do wykonywania kontrolowanych kokultur 2D i 3D w mikrourządzeniach w celu wizualizacji i monitorowania przesłuchów komórek nowotworowo-immunologicznych oraz analizowania efektów leczenia przeciwnowotworowego. Technologia ta zapewnia łatwą wizualizację rekrutacji i interakcji komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym i może być stosowana w próbkach pochodzących od ludzi i pacjentów. Jest kompatybilny z większością najnowocześniejszych mikroskopów.

Procedurę zademonstrują Francesco Noto, doktorant na Wydziale Onkologii i Medycyny Molekularnej Istituto Superiore di Sanita oraz Nicoleta Manduca i Esther Maccafeo, doktorantki na Wydziale Medycyny Translacyjnej i Chirurgii Universita Cattolica del Sacro Cuore. Wióry są wcześniej aktywowane plazmowo w czyszczalni plazmowej lub reaktywnej maszynie do wytrawiania żelazka w pomieszczeniu czystym. Komórki mysiej śledziony i linia komórek nowotworowych są tutaj używane do naśladowania protokołów opisanych w tekście.

Przed załadowaniem zawiesin ogniw należy pobrać pożywkę ze wszystkich sześciu zbiorników. Następnie powoli załaduj 1 x 10 do 5. komórek nowotworowych zawieszonych w 10 do 50 mikrolitrach pożywki wzrostowej w lewym górnym zbiorniku i dolnej studzience. Po prawej stronie delikatnie pipetować 1 x 10 do 6. pływających komórek odpornościowych zawieszonych w 50 mikrolitrach pożywki wzrostowej do dwóch dołków.

Po dodaniu wszystkich komórek napełnij wszystkie sześć zbiorników każdego chipa maksymalnie 100 do 150 mikrolitrami pożywki wzrostowej i sprawdź, czy komórki zostały prawidłowo rozmieszczone w każdej komorze hodowlanej. Inkubuj chip przez godzinę, aby system mógł się ustabilizować przed nagraniem poklatkowym. W przypadku obrazowania żywych komórek zamontuj guz odporny na płytce chipowej na stoliku mikroskopu.

Dostosuj ustawienia przepływu pracy akwizycji w interfejsie oprogramowania mikroskopu, takiego jak Incucyte Live-Cell Analysis Software. Wybierz okna obserwacji, optymalną liczbę klatek na sekundę i czas trwania, w zależności od odpowiednich parametrów dla eksperymentu i typów badanych komórek. Zobrazuj komórki dla odpowiedniego okresu eksperymentu.

Przygotować dwie porcje matrygelu rozcieńczone pożywką zawierającą lek lub kombinację leków dla dwóch warunków doświadczalnych, używając zimnych końcówek. Delikatnie pipetować kompatybilne na żywo, barwione barwnikiem fluorescencyjnym komórki nowotworowe zawieszone w roztworze matrycowym na lodzie, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek. Trzymając płytkę wiórową na bloku chłodzącym lub na koszu z lodem, powoli wstrzyknij roztwór macierzy komórek nowotworowych leczony lekiem do lewego i prawego portu żelowego za pomocą zimnych końcówek mikropipet o pojemności 10 mikrolitrów.

Delikatnie dociśnij, aby przepchnąć roztwór matrycy z jednej strony kanału na drugą. Po załadowaniu wszystkich komórek nowotworowych umieść urządzenie w inkubatorze w pozycji pionowej na 30 minut. Pod koniec inkubacji, po zakończeniu żelowania matrycy, napełnić kanały pożywki wszystkich sześciu zbiorników 50 mikrolitrami pożywki hodowlanej.

Sprawdź integralność spolimeryzowanego żelu i rozmieszczenie komórek nowotworowych pod mikroskopem. Następnie umieść chipy w inkubatorze, aż przygotowanie komórek odpornościowych zostanie zakończone. Po inkubacji odessać pożywkę z każdej studzienki.

Umieść końcówkę w pobliżu wlotu środkowego kanału pożywki i użyj umiarkowanego nacisku, aby delikatnie wstrzyknąć 10 mikrolitrów od 10 do 6 komórek odpornościowych oznaczonych kontrastowym barwnikiem fluorescencyjnym. Wstrzyknąć od 50 do 100 mikrolitrów pożywki do każdej z czterech studzienek kanałów bocznych, od 40 do 90 mikrolitrów pożywki do górnej studzienki środkowej i od 50 do 100 mikrolitrów pożywki do dolnej studzienki środkowej. Po załadowaniu wszystkich studzienek użyj mikroskopu, aby potwierdzić, że dystrybucja komórek odpornościowych pozostała ograniczona do centralnej komory.

Następnie ostrożnie umieść urządzenie na równej powierzchni w inkubatorze do hodowli komórkowych do czasu zobrazowania. Aby obliczyć zakres żywych komórek odpornościowych barwionych fluorescencyjnie infiltrujących przedziały nowotworowe, należy zobrazować urządzenie w określonych punktach czasowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i ustawić odpowiednie parametry kamery w oprogramowaniu do obrazowania mikroskopowego, takim jak Nikon NIS-Elements. Ustaw również parametry dla znakowanych komórek odpornościowych.

Ruch leukocytów przez odpowiednio zbudowane mostki mikrokanałowe w platformie mikroprzepływowej w kierunku komórek docelowych może być śledzony za pomocą wideomikroskopii. W tej analizie śledzenia poszczególne PBMC zostały poddane obumierającym komórkom rakowym leczonym doksorubicyną lub żywym komórkom nowotworowym traktowanym PBS. Automatycznie wygenerowano odpowiednie wartości chemotaksji i wykresy migracji, a także zaobserwowano inny profil migracji komórek odpornościowych, gdy były one jednocześnie obciążone komórkami raka piersi wystawionymi na działanie doksorubicyny lub PBS.

Kiedy PBMC zostały skonfrontowane z apoptozą komórek rakowych, przekroczyły mikrokanały w kierunku umierających i martwych komórek, ale nie przeszły do żywych, nieleczonych komórek. Frakcja leukocytów o rosnącej gęstości w ciągu 24 do 48 godzin wykazywała długotrwałe kontakty z komórkami nowotworowymi leczonymi dokso. W tej analizie wykorzystano nowatorski model 3D immunokompetentnego guza do ilościowego określenia rekrutacji komórek odpornościowych w odpowiedzi na przeciwnowotworowe kombinacje leków epigenetycznych.

PBMC znakowane czerwonym barwnikiem zostały następnie równomiernie rozprowadzone w centralnej komorze fluidycznej. Następnie porównano zdolność dwóch mas guza do przyciągania PBMC, przy czym PBMC zostały solidnie zrekrutowane w tym eksperymencie do mikrokanału po prawej stronie. W przypadku modelu 3D wymieszaj roztwór z hydrożelem i komórkami na lodzie, unikając pęcherzyków i wstępnej polimeryzacji.

Wstrzykiwać go powoli, bez nadmiernego nacisku. Dostosuj etapy polimeryzacji do zastosowanej matrycy. Można wdrożyć testy żywych/martwych komórek i profilowanie wydzielania cytokin z supernatantów.

Immunofluorescencję do obrazowania konfokalnego można przeprowadzić w celu sklasyfikowania podtypów immunologicznych oraz markerów ekspresji aktywacji i dojrzewania wyczerpania.