Name: Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj mikroprzepływowe modele kohodowli 2D i 3D do badania interakcji nowotworowo-immunologicznych w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia dynamiczną wizualizację rekrutacji komórek immunologicznych i ocenę terapii przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. AS jest wspierany przez Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) i Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS i FM są wspierane przez Włoskie Stowarzyszenie Badań nad Rakiem (AIRC) nr 21366 do G.S.).

Opisane metody mają na celu zaprojektowanie ogólnego podejścia do podsumowania, z modulowalnym stopniem złożoności, dwóch istotnych aspektów w dziedzinie onkoimmunologii, które mogą skorzystać na przyjęciu bardziej odpowiednich modeli in vitro. Pierwszy z nich dotyczy populacji komórek nowotworowych, gdzie zajęcie się charakterystyką pojedynczych komórek może prowadzić do lepszego opisu heterogeniczności i skorelowanego znaczenia biologicznego i klinicznego, w tym oporności na terapię, skłonności do przerzutów, komórek m...

Ewolucja różnych gałęzi medycyny jako dyscyplin eksperymentalnych zależała od możliwości manipulowania populacją komórek i funkcjami organów w kontrolowanych warunkach1. Taka zdolność ma swoje korzenie w dostępności mierzalnych modeli, które są w stanie podsumować procesy zachodzące w naszym ciele.
W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki2, biologia nowotworów musi korzystać z pojawiających się modeli in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym2,3.
Mikrośrodowisko nowotworu4 (TME) to złożona tkanka, w której komórki nowotworowe nieustannie oddziałują i dynamicznie współewoluują z innymi składnikami komórkowymi (immunologicznymi, zrębowymi i śródbłonkowymi) oraz niekomórkowymi (macierz zewnątrzkomórkowa, ECM). Dynamiczna natura tego złożonego krajobrazu decyduje o tym, czy komórki odpornościowe są przyjaciółmi, czy wrogami komórek nowotworowych, co silnie wpływa zarówno na postęp choroby, jak i odpowiedź na leczenie. Obecnie wielkie wysiłki onkoimmunologów, bioinformatyków i ekspertów w dziedzinie biologii systemowej zbiegają się, aby zająć się klinicznym znaczeniem heterogeniczności raka5,6, zarówno w przestrzeni (tj. w różnych regionach guza), jak i w czasie (tj. na różnych etapach progresji nowotworu)5,6oraz scharakteryzowanie fenotypu i funkcji nowotworów i komórek odpornościowych na poziomie pojedynczej komórki. Przykładem tej synergii są obecnie rutynowo stosowane zaawansowane techniki widzenia komputerowego do przestrzennego mapowania nacieku immunologicznego w próbkach histologicznych7,8.
Na froncie modeli eksperymentalnych, łączących badania na zwierzętach i tradycyjne metody in vitro, postępy w mikrofluidyce i technikach kokulturowania dają dostęp do różnych klas mikroinżynieryjnych modeli komórkowych, takich jak organoidy, systemy mikrofizjologiczne9,10,11 (MPS), oraz organs-on-chip12,13,14 (OOC). Ich wspólną cechą jest powiększanie "szerszego obrazu" ekosystemów komórkowych i rozszerzanie potencjału in vitro w celu kontrolowania czynników mikrośrodowiskowych przy jednoczesnym wykorzystaniu mikroskopii o wysokiej zawartości15 i podejść do przetwarzania obrazu.
Obecnie, najnowocześniejsze systemy MPS i OOC zaczęły uwzględniać aspekty immunologiczne, włączając różne podtypy komórek odpornościowych w istniejących tkankach i kokulturach, aby badać i mierzyć różnorodne procesy, takie jak choroby zapalne, gojenie się ran, odporność błony śluzowej i reakcja na toksyny lub codzienne produkty spożywcze16. TME-on-a-chip models10,11,12,13,14,15,16,17, również zintegrowany z perfuzyjnymi mikronaczyniami18,19,20,21, zostały opracowane w celu badania interakcji zależnych od typu komórki, zaburzeń fizycznych i chemicznych oraz aktywności cytotoksycznej naciekających limfocytów22, a także klinicznie istotnych czynników immunomodulujących<klasa sup="xref">23.
Tutaj oferujemy wszechstronne protokoły, począwszy od ładowania komórek w chipach, a skończywszy na narzędziach do przetwarzania obrazów, aby wykorzystać zaawansowane kohodowle mikroprzepływowe odporne na nowotwory w ustawieniach 2D (sekcja 1) i 3D (sekcja 2)16, kompatybilne z dynamicznym, wieloparametrycznym24 monitorowanie i wizualizacja funkcji komórkowych. Osiąga się to przy zachowaniu łatwości użytkowania i elastyczności zarówno w zarządzaniu próbkami, jak i analizie danych, wykorzystując darmowe oprogramowanie Fiji i jego zestawy narzędzi25,26.
Urządzenie mikroprzepływowe, opisane w sekcji 1, jest przeznaczone do przeprowadzania 2D kokultur przylegających do siebie komórek nowotworowych i pływających. Platforma ta została zwalidowana do pomiaru in vitro zachowania komórek odpornościowych w obecności mutacji genetycznych27 i/lub immunodeficiencies28. Tutaj ilustrujemy kroki śledzenia komórek odpornościowych na poklatkowych obrazach w jasnym polu, wykorzystując półautomatyczną metodę opartą na Trackmate (wtyczka zaimplementowana w oprogramowaniu Fidżi). Procedura ta umożliwia ekstrakcję kinematycznych deskryptorów migracji immunologicznej 29 i odpowiedzi (tj. czasów interakcji) na docelowe komórki nowotworowe, leczone lub nie immunogennymi induktorami śmierci komórki27.
Co ważne, te parametry, wyodrębnione z obrazów szeregów czasowych, mogą być przetwarzane za pomocą zaawansowanych maszyn matematycznych. Jako przykład potencjału tego podejścia, nasze grupy opublikowały niedawno analizę opartą na metodach matematycznych z procesów stochastycznych i mechaniki statystycznej do modelowania właściwości sieci komórkowych i dostarczania sparametryzowanego opisu zachowania komórek odpornościowych (tj. tendencyjnego lub nieskorelowanego losowego spaceru, wysoce lub nieskoordynowanego ruchu30,31).
Ustawienie 3D, przedstawione w drugiej sekcji, opiera się na protokole wspólnej hodowli w celu odtworzenia bardziej złożonych immunokompetentnych TME osadzonych w dwóch regionach żelowych z różnymi kombinacjami typów komórek i leków w konkurencyjny sposób. W tym miejscu opisano etapy przetwarzania obrazu w celu zmierzenia, w różnych punktach czasowych, infiltracji barwionych komórek odpornościowych w ludzkich komórkach czerniaka A375M hodowanych w Matrigel, w celu oceny kombinacji środków przeciwnowotworowych32. Linia A375M, linia komórkowa pochodząca z A375P charakteryzująca się wysoce przerzutowym fenotypem, została wybrana do oceny ich zdolności do przerzutów w obecności komórek odpornościowych32.
Opisane modele mogą być w pełni zgodne z różnymi źródłami komórek (między innymi unieśmiertelnione lub pierwotne linie komórkowe myszy i człowieka, organoidy, ksenoprzeszczepy). W ostatnich badaniach przeprowadzonych w naszym laboratorium, łącząc mikroskopię wideo o wysokiej zawartości z analizą obrazu, zastosowano konkurencyjny układ 3D do zbadania: i) odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej (cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał, ADCC) i przeanalizowania roli fibroblastów w oporności na terapię trastuzumabem w modelach on-chip raka piersi HER2+33; ii) działanie komórek szpikowych (tj. makrofagów związanych z rakiem) w mechanizmach unikania nowotworu i rekrutacji limfocytów T34; iii) skuteczność schematów immunoterapeutycznych, w szczególności opartych na komórkach dendrytycznych kondycjonowanych interferonem α (IFN-DC), hodowanych z komórkami raka jelita grubego leczonymi lekami w matrycach kolagenowych, oraz w celu oceny wydajnego ruchu i następujących po nim zdarzeń fagocytozy35; iv) chemotaktyczna migracja eozynofili pochodzących ze szpiku kostnego w kierunku komórek czerniaka leczonych lub nieleczonych IL-3336.
Te zaawansowane modele mogłyby służyć jako okna obserwacyjne do zrozumienia roli tekstury immunologicznej w przerzutach raka i mechanizmach oporności, ale potrzebne są wysiłki, aby przełożyć wyniki na kliniki, wypełniając lukę w badaniach podstawowych37.
Jako wyłaniający się scenariusz, wykorzystanie mocy zautomatyzowanej mikroskopii o wysokiej zawartości w połączeniu z użyciem bardziej fizjologicznie istotnych mikrosystemów otwiera nowe potencjalne wyzwania dla obsługi, przetwarzania i interpretacji setek, a nawet tysięcy gigabajtów danych wieloparametrycznych, które mogą być wygenerowane z jednej kampanii eksperymentalnej. Oznacza to bezpośrednie powiązanie eksperymentów OOC ze sztuczną inteligencją38,39,40,41,42 (AI) algorytmy oparte zarówno na zaawansowanej automatycznej analizie, jak i generowaniu funkcji, które mogą z kolei zasilać modele krzemowe interakcji rakowo-immunologicznej43, z ekscytującymi nowymi zastosowaniami na horyzoncie, takimi jak rozwój predykcyjnych testów przesiewowych leków44.
Stale rosnący strumień wysiłków skupia się na projektowaniu modeli chorób wraz z optymalizacją strategii wdrażania wielkoskalowych ekranów perturbacyjnych z odczytami multi-omiki pojedynczej komórki. Niewątpliwie pomoże to w opracowaniu i, miejmy nadzieję, w klinicznym wdrożeniu, któremu towarzyszy odpowiedni stopień standaryzacji metody, systematycznego podejścia onkoimmunologicznego na chipie w celu uzyskania nowego wglądu w zaburzenia immunologiczne i mechanizmy rozprzestrzeniania się raka.

<table><tbody><tr><td>Materiały do hodowli komórkowych&nbsp; </mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki 50 ml</td><td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>CLS430828</td><td>probówki wirówkowe</td></tr><tr><td>5-aza-2'-deoksycytydyna DAC</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>A3656</td><td>Środek hipometylujący DNA</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>CLS3506</td><td>szalki hodowlane</td></tr><tr><td>75 cm2 kolba</td> <td>poddawana działaniu hodowli komórkowychCorning, Nowy Jork, NY</td><td>430641U</td><td>kolby hodowlane</td></tr><tr><td>A365M</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td><<td>br/> CVCL_B222</td><td>ludzka linia komórkowa czerniaka</td></tr><tr><td>chlorowodorek doksorubicyny</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>D1515</td><td>antybiotyk antracyklinowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM</td><td>EuroClone Spa, Mediolan, Włochy</td><td>ECM0728L</td><td>Pożywka hodowlana dla komórek SK-MEL-28&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Dulbecco Saline bez wapnia bez magnezu</td><td>EuroClone Spa, Mediolan, Włochy</td><td>ECB4004L</td><td>roztworu buforowego soli</td></tr> fizjologicznej <tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>EuroClone Spa, Mediolan, Włochy</td><td>ECS0180L</td><td>pomocniczy do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE-Heathcare</td><td>17-1440-02</td><td>oddzielanie komórek jednojądrzastych od ludzkiej krwi.</td></tr><tr><td>hemocytometr</td><td>Neubauer</td><td></td><td>Licznik komórek</td></tr><tr><td>Fiolki z heparyną</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>Fiolki do pobierania krwi żylnej</td></tr><tr><td>interferon alfa-2b</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>SRP4595</td><td>rekombinowana ludzka cytokina</td></tr><tr><td>L-Glutamina 100X</td><td>EuroClone Spa, Mediolan, Włochy</td><td>ECB3000D</td><td>pomocnicze do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Pożywka</td> do separacji komórek limfolitów z ciekłym azotem <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cedarlane Labs, Burlington, Kanada</td><td></td><td>Separacja limfocytów przez wirowanie w gradiacji gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norwegia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, Nowy Jork, NY</td><td>354230</td> czynnik <td>wzrostu zredukowany macierz błony podstawnej</td></tr><tr><td>MDA-MB-231&nbsp;</td><td>Kolekcja Kultur Typu Amerykańskiego (ATCC), Manassas, VA&</td><td>nbsp; HTB-26</td><td>ludzka linia komórkowa raka piersi</td></tr><tr><td>Penicylina/ Streptomycyna 100X&nbsp; &nbsp;</td><td>EuroClone Spa, Mediolan, Włochy</td><td>ECB3001D</td><td>pomocnicze do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Pomoc do pipetowania</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>4-000-201</td><td>Obsługa cieczy</td></tr><tr><td>PKH26 Łącznik komórek czerwonej fluorescencji</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>PKH26GL</td><td>czerwony barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>PKH67 Zielony fluorescencyjny łącznik komórek</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>PKH67GL</td><td>zielony barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>EuroClone Spa, Mediolan, Włochy</td><td>ECM2001L</td><td>Pożywka hodowlana do pipet serologicznych komórek MDA-MB-231</td></tr><tr><td>(2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml)</td><td>Corning-Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490</td> Sterylne końcówki <td>do pracy z cieczami</td></tr><tr><td>(1-10 &mu; L, 10-20 &mu; L, 20-200 &mu; L, 1000 &mu; L)</td><td>EuroClone Spa, Mediolan, Włochy</td><td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005</td><td>końcówki do mikropipet</td></tr><tr><td>Timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue roztwór</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>barwienie komórek do oceny żywotności komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>EuroClone Spa, Mediolan, Włochy</td><td>ECM0920D</td><td>odczynnik dysocjacyjny do przylegających komórek</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do hodowli komórkowych</ Mikroskop</td> fluorescencyjny strong><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS-FL</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>Mikroskop fluorescencyjny do żywych komórek</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórek humifikatowych&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td>311 Forma Inkubator COInkubator ciepła bezpośredniego; TC 230</td><td>Inkubacja kultur komórkowych w temperaturze 37 °; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Juli Microscope</td><td>Nanoentek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjna lodówka (4 &stopnie; C)</td> Laboratoryjna szafa bezpieczeństwa <td>FDM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(klasa II)</td> <td>Sterylny VBH 72 MP</td><td></td><td>Okap z przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka chłodnicza</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> termostatyczna <tr><td>< mocna > materiały do mikrofabrykacji&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropylo)trietoksysilan (Aptes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3648</td><td>środek silanizujący do klejenia PDMS z plastikowym szkiełkiem nakrywkowym</td></tr><tr><td>Maski z kwarcu chromowego / 4"x4", HRC / No AZ&nbsp;</td><td>MB W& A,&nbsp; Niemcy</td><td></td><td>maski optyczne do fotolitografii</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, szkło D 263 M Schott,&nbsp; (170 &plusmn; 5 &mikro; m)</td><td>Ibidi, Niemcy</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru 30%</td> <td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>412081</td><td>odczynniki do roztworu piranii</td></tr><tr><td>Odczynniki do ketonu metylowo-izobutylowego</td><td>Carlo Erba</td><td>461945</td><td>Wywoływacz oporności wiązki elektronów PMMA</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe (zestaw 50 szkiełek) 76,2 mm x 25,4 mm&nbsp;</td><td>Podłoża Sail Brand</td><td>7101</td><td>do klejenia wiórów</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji Miltex z tłokiem, ID 1,0 mm</td><td>Stemple do</td> biopsji skórnej Tedpella <td></td><td>do zbiorników na wióry</td></tr><tr><td>PMMA&nbsp; 950 kDa</td><td>Allresist, Niemcy</td><td>AR-P. 679.04</td><td>Dodatnie rezystu elektroniczne do modelowania masek optycznych</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe polimerowe nieobrobione</td><td>Ibidi, Niemcy</td><td>10813</td><td>podłoża do klejenia wiórów</td></tr><tr><td>Prime CZ-Si Wafel,&nbsp; 4", (100), domieszkowany borem</td><td>Gambetti Xenologia Srl, Włochy</td><td>30255</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki Propan-2-ol</td><td>Carlo Erba</td><td>415238</td><td></td></tr><tr><td>Octan eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484431-4L</td><td>SU-8 odporny na wywoływacz</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>Technologia mikrorezystu, Niemcy</td><td>C1.02.003-0001</td><td>Negatywny Fotorezystu</td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Technologia mikrorezystu, Niemcy</td><td>C1.02.003-0005</td><td>Zestaw fotorezystorów</td></tr><tr><td>ujemnych Biopunch, ID 4,0 mm, 6,0 mm, 8,0 mm</td><td>Tedpella</td><td>15111-40, 15111-60, 15111-80</td><td>stemple do biopsji skórnej do zbiorników na wióry</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy 96%</td><td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>410381</td><td>odczynniki do roztworu piranii</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dowsil, Dow Corning</td><td>11-3184-01</td><td>Elastomer silikonowy (PDMS)</td></tr><tr><td>Trimetylochlorosilan (TMCS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360-100ML</td><td>środek silanizujący do wzorców SU-8 masters</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do mikrofabrykacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 kV litografia wiązki elektronicznej</td><td>Raith-Vistec EBPG 5HR</td><td></td><td></td></tr> płyta <tr><td>grzewcza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optyczny system litograficzny</td><td>EV-420 dwutwarzowa maska-wyrównywacz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reaktywny system trawienia jonowego</td> System <td>Oxford plasmalab 80 plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td></td><td></td><td></td> próżniowy</tr></tbody></table>

mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

Złożone modele chorób wymagają najnowocześniejszych narzędzi, które są w stanie dostarczyć fizjologicznie i patologicznie istotnych, użytecznych spostrzeżeń, a także ujawnić procesy niewidoczne w inny sposób. Zaawansowane testy komórkowe, ściśle naśladujące scenerię in vivo, stają się nowymi sposobami wizualizacji i pomiaru dwukierunkowej interakcji między guzem a gospodarzem, wpływającej na postęp raka. W tym miejscu opisujemy dwa wszechstronne protokoły do odtwarzania wysoce kontrolowanych kokultur 2D i 3D w mikrourządzeniach, naśladując złożoność mikrośrodowiska guza (TME), pod naturalnym i indukowanym terapią nadzorem immunologicznym. W sekcji 1 przedstawiono warunki eksperymentalne do monitorowania przesłuchów między przylegającymi komórkami nowotworowymi a pływającymi populacjami immunologicznymi, za pomocą mikroskopii poklatkowej w jasnym polu. Jako scenariusz aplikacyjny analizujemy wpływ leczenia przeciwnowotworowego, takiego jak tzw. immunogenne induktory śmierci komórek nowotworowych na rekrutację i aktywację komórek odpornościowych. W sekcji 2 mikrośrodowiska 3D odporne na nowotwór są zebrane w konkurencyjny układ. Różnicowy naciek immunologiczny jest monitorowany za pomocą migawek fluorescencyjnych trwających do 72 godzin, w celu oceny skojarzonych strategii terapeutycznych. W obu ustawieniach zilustrowano etapy przetwarzania obrazu w celu wyodrębnienia wielu parametrów komórek odpornościowych (np. migracji i interakcji komórek odpornościowych, odpowiedzi na środki terapeutyczne). Te proste i potężne metody można dodatkowo dostosować do symulacji złożoności TME, obejmującej heterogeniczność i plastyczność podtypów komórek nowotworowych, zrębowych i odpornościowych, a także ich wzajemne interakcje jako czynniki napędzające ewolucję raka. Zgodność tych szybko rozwijających się technologii z obrazowaniem o wysokiej zawartości w żywych komórkach może prowadzić do generowania dużych zbiorów danych informacyjnych, co rodzi nowe wyzwania. Rzeczywiście, trójkąt "kohodowle/mikroskopia/zaawansowana analiza danych" wyznacza drogę do precyzyjnej parametryzacji problemu, która może pomóc w opracowaniu dostosowanych do potrzeb protokołów terapeutycznych. Oczekujemy, że przyszła integracja układu scalonego odpornego na raka ze sztuczną inteligencją do przetwarzania o wysokiej przepustowości będzie stanowić synergię w wykorzystaniu możliwości jako narzędzi predykcyjnych i przedklinicznych dla precyzyjnej i spersonalizowanej onkologii.

Infiltracja immunologiczna guza jest parametrem odpowiedzi przeciwnowotworowej gospodarza. Guzy są heterogeniczne pod względem składu, gęstości, lokalizacji i stanu funkcjonalnego infiltrujących leukocytów, których oddziaływania z komórkami rakowymi mogą dostarczać istotnych klinicznie informacji pozwalających przewidzieć przebieg choroby i odpowiedź na terapię. W tym sensie technologie mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane jako komplementarne i uprzywilejowane narzędzia in vitro do badania kontekstury immunologicznej ...

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...

Protokół ten zapewnia warunki eksperymentalne do wykonywania kontrolowanych kokultur 2D i 3D w mikrourządzeniach w celu wizualizacji i monitorowania przesłuchów komórek nowotworowo-immunologicznych oraz analizowania efektów leczenia przeciwnowotworowego. Technologia ta zapewnia łatwą wizualizację rekrutacji i interakcji komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym i może być stosowana w próbkach pochodzących od ludzi i pacjentów. Jest kompatybilny z większością najnowocześniejszych mikroskopów.Procedurę zademonstrują Francesco Noto, doktorant na Wydziale Onkologii i Medycyny Molekularnej Istituto Superiore di Sanita oraz Nicoleta Manduca i Esther Maccafeo, doktorantki na Wydziale Medycyny Translacyjnej i Chirurgii Universita Cattolica del Sacro Cuore. Wióry są wcześniej aktywowane plazmowo w czyszczalni plazmowej lub reaktywnej maszynie do wytrawiania żelazka w pomieszczeniu czystym. Komórki mysiej śledziony i linia komórek nowotworowych są tutaj używane do naśladowania protokołów opisanych w tekście.Przed załadowaniem zawiesin ogniw należy pobrać pożywkę ze wszystkich sześciu zbiorników. Następnie powoli załaduj 1 x 10 do 5. komórek nowotworowych zawieszonych w 10 do 50 mikrolitrach pożywki wzrostowej w lewym górnym zbiorniku i dolnej studzience. Po prawej stronie delikatnie pipetować 1 x 10 do 6. pływających komórek odpornościowych zawieszonych w 50 mikrolitrach pożywki wzrostowej do dwóch dołków.Po dodaniu wszystkich komórek napełnij wszystkie sześć zbiorników każdego chipa maksymalnie 100 do 150 mikrolitrami pożywki wzrostowej i sprawdź, czy komórki zostały prawidłowo rozmieszczone w każdej komorze hodowlanej. Inkubuj chip przez godzinę, aby system mógł się ustabilizować przed nagraniem poklatkowym. W przypadku obrazowania żywych komórek zamontuj guz odporny na płytce chipowej na stoliku mikroskopu.Dostosuj ustawienia przepływu pracy akwizycji w interfejsie oprogramowania mikroskopu, takiego jak Incucyte Live-Cell Analysis Software. Wybierz okna obserwacji, optymalną liczbę klatek na sekundę i czas trwania, w zależności od odpowiednich parametrów dla eksperymentu i typów badanych komórek. Zobrazuj komórki dla odpowiedniego okresu eksperymentu.Przygotować dwie porcje matrygelu rozcieńczone pożywką zawierającą lek lub kombinację leków dla dwóch warunków doświadczalnych, używając zimnych końcówek. Delikatnie pipetować kompatybilne na żywo, barwione barwnikiem fluorescencyjnym komórki nowotworowe zawieszone w roztworze matrycowym na lodzie, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek. Trzymając płytkę wiórową na bloku chłodzącym lub na koszu z lodem, powoli wstrzyknij roztwór macierzy komórek nowotworowych leczony lekiem do lewego i prawego portu żelowego za pomocą zimnych końcówek mikropipet o pojemności 10 mikrolitrów.Delikatnie dociśnij, aby przepchnąć roztwór matrycy z jednej strony kanału na drugą. Po załadowaniu wszystkich komórek nowotworowych umieść urządzenie w inkubatorze w pozycji pionowej na 30 minut. Pod koniec inkubacji, po zakończeniu żelowania matrycy, napełnić kanały pożywki wszystkich sześciu zbiorników 50 mikrolitrami pożywki hodowlanej.Sprawdź integralność spolimeryzowanego żelu i rozmieszczenie komórek nowotworowych pod mikroskopem. Następnie umieść chipy w inkubatorze, aż przygotowanie komórek odpornościowych zostanie zakończone. Po inkubacji odessać pożywkę z każdej studzienki.Umieść końcówkę w pobliżu wlotu środkowego kanału pożywki i użyj umiarkowanego nacisku, aby delikatnie wstrzyknąć 10 mikrolitrów od 10 do 6 komórek odpornościowych oznaczonych kontrastowym barwnikiem fluorescencyjnym. Wstrzyknąć od 50 do 100 mikrolitrów pożywki do każdej z czterech studzienek kanałów bocznych, od 40 do 90 mikrolitrów pożywki do górnej studzienki środkowej i od 50 do 100 mikrolitrów pożywki do dolnej studzienki środkowej. Po załadowaniu wszystkich studzienek użyj mikroskopu, aby potwierdzić, że dystrybucja komórek odpornościowych pozostała ograniczona do centralnej komory.Następnie ostrożnie umieść urządzenie na równej powierzchni w inkubatorze do hodowli komórkowych do czasu zobrazowania. Aby obliczyć zakres żywych komórek odpornościowych barwionych fluorescencyjnie infiltrujących przedziały nowotworowe, należy zobrazować urządzenie w określonych punktach czasowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i ustawić odpowiednie parametry kamery w oprogramowaniu do obrazowania mikroskopowego, takim jak Nikon NIS-Elements. Ustaw również parametry dla znakowanych komórek odpornościowych.Ruch leukocytów przez odpowiednio zbudowane mostki mikrokanałowe w platformie mikroprzepływowej w kierunku komórek docelowych może być śledzony za pomocą wideomikroskopii. W tej analizie śledzenia poszczególne PBMC zostały poddane obumierającym komórkom rakowym leczonym doksorubicyną lub żywym komórkom nowotworowym traktowanym PBS. Automatycznie wygenerowano odpowiednie wartości chemotaksji i wykresy migracji, a także zaobserwowano inny profil migracji komórek odpornościowych, gdy były one jednocześnie obciążone komórkami raka piersi wystawionymi na działanie doksorubicyny lub PBS.Kiedy PBMC zostały skonfrontowane z apoptozą komórek rakowych, przekroczyły mikrokanały w kierunku umierających i martwych komórek, ale nie przeszły do żywych, nieleczonych komórek. Frakcja leukocytów o rosnącej gęstości w ciągu 24 do 48 godzin wykazywała długotrwałe kontakty z komórkami nowotworowymi leczonymi dokso. W tej analizie wykorzystano nowatorski model 3D immunokompetentnego guza do ilościowego określenia rekrutacji komórek odpornościowych w odpowiedzi na przeciwnowotworowe kombinacje leków epigenetycznych.PBMC znakowane czerwonym barwnikiem zostały następnie równomiernie rozprowadzone w centralnej komorze fluidycznej. Następnie porównano zdolność dwóch mas guza do przyciągania PBMC, przy czym PBMC zostały solidnie zrekrutowane w tym eksperymencie do mikrokanału po prawej stronie. W przypadku modelu 3D wymieszaj roztwór z hydrożelem i komórkami na lodzie, unikając pęcherzyków i wstępnej polimeryzacji.Wstrzykiwać go powoli, bez nadmiernego nacisku. Dostosuj etapy polimeryzacji do zastosowanej matrycy. Można wdrożyć testy żywych/martwych komórek i profilowanie wydzielania cytokin z supernatantów.Immunofluorescencję do obrazowania konfokalnego można przeprowadzić w celu sklasyfikowania podtypów immunologicznych oraz markerów ekspresji aktywacji i dojrzewania wyczerpania.

microfluidic-co-culture-models-for-dissecting-immune-response-in

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy procedurę wykonania i obsługi urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza heterogeniczne mikrośrodowiska nowotworowe in vitro. Zmienność apoptozy w obrębie tkanki nowotworowej została określona ilościowo przy użyciu barwników fluorescencyjnych, a następnie oceniono efektywny współczynnik dyfuzji leku chemioterapeutycznego, doksorubicyny, do tkanki nowotworowej.

Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

Ten film demonstruje metodę tworzenia trójwymiarowej kohodowli sferoidów guza i limfocytów T. Przygotowuje się odlew agarozowy z mikrostudzienkami zawierającymi sferoidy guza, a następnie dodaje się limfocyty T. Po inkubacji układ ten pozwala na badanie interakcji limfocytów T ze sferoidami guza w kontrolowanym trójwymiarowym środowisku.

Trójwymiarowy model kohodowli naciekających limfocytów T w sferoidach nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Prezentujemy mikroprzepływowy model raka na chipie, technologię "Akcelerator Ewolucji", która zapewnia kontrolowaną platformę do długoterminowych badań ilościowych dynamiki raka w czasie rzeczywistym w dobrze zdefiniowanych warunkach środowiskowych na poziomie pojedynczej komórki. Oczekuje się, że technologia ta sprawdzi się jako model in vitro do badań podstawowych lub przedklinicznego opracowywania leków.

Generowanie heterogenicznych gradientów leków w różnych populacjach nowotworów w akceleratorze ewolucji mikroprzepływowej do obserwacji w czasie rzeczywistym

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Tutaj szczegółowo opisujemy prosty, szybki i niezawodny protokół wspomagany wieloparametryczną cytometrią przepływową i nowotworem na chipie, aby monitorować i charakteryzować etapy składające się na cykl rak-odporność. Rzeczywiście, dogłębne zrozumienie wzajemnych zależności między rakiem a komórkami odpornościowymi dostarcza kluczowych informacji, które pozwalają przechytrzyć nowotwory i kierować opieką kliniczną.

Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Poznaj mikroprzepływowe modele kohodowli 2D i 3D do badania interakcji nowotworowo-immunologicznych w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia dynamiczną wizualizację rekrutacji komórek immunologicznych i ocenę terapii przeciwnowotworowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Przeglądaj więcej filmów