Name: Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę optymalizacji wzrostu mikrokryształów endothiapepsyny do krystalografii seryjnej. Protokół obejmuje analizę morfogramów, skalowanie do większych objętości oraz zastosowanie robotów do precyzyjnego przygotowania próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy o grant nr 701647 Marie Skłodowska-Curie. Wielkie podziękowania za pomoc i wsparcie dla naukowców z linii badawczej Swiss Light Source X10SA-PXII.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona metoda pokazuje, w jaki sposób można zoptymalizować krystalizację endotiapepsyny z dużych kryształów (≥ najdłuższym wymiarze 100 μm), hodowanych w 96-dołkowych sitach o rzadkiej matrycy, do mikrokryształów, hodowanych w probówkach wirówkowych (objętość 300 μl) za pomocą partii. Ideą protokołu jest to, że kroki podjęte w celu optymalizacji endotiapepsyny mogą być również wykorzystane do innych białek. Ostatecznie odpowiedź na problem tworzenia dużych objętości (>100 μL) mikrokryształów (10-20 μm) do eksperymentów krystalografii szeregowej na XFELach i synchrotronach.
Protokół dzieli zadanie mikrokrystalizacji o dużej objętości na trzy etapy: (1) Optymalizacja morfologii kryształów, (2) Przejście do partii i (3) Skalowanie. W Kroku 1 należy zbadać zakres form krystalicznych, które może wytworzyć białko w płytkach dyfuzyjnych. Celem powinny być warunki, w których powstają pojedyncze, pudełkowe kryształy, które ulegają dyfrakcji z wymaganą rozdzielczością. W kroku 2 wybrane warunki można następnie przekształcić z dyfuzji pary w partię. W tym przypadku kryterium optymalizacji jest czas wzrostu kryształów i znalezienie warunków, w których w ciągu 24 godzin powstają kryształy białka. Można również wykreślić morfogram, który daje eksperymentatorowi wyobrażenie o położeniu linii rozpuszczalności i granic strefy zarodkowania. Ten morfogram jest bardzo przydatny w kroku 3, Skalowanie. Mornogram da wskazówkę, czy samo zarodkowanie może zwiększyć Xn i obniżyć Xs. Wraz ze wzrostem objętości eksperymentu, Xn i Xs mogą być stale oceniane jako kluczowe kryteria sukcesu skalowania.
W przypadku endotiapepsyny, Etap 1 odkrył coś, co potencjalnie było wcześniej nieznaną morfologią kryształów endotiapepsyny. Ta morfologia miała tę samą grupę przestrzenną, co wcześniej opisywane, ale, co ważne dla krystalografii szeregowej, bardziej pudełkowy kształt. Monokryształy również wydawały się rosnąć z pojedynczych punktów zarodkowania, w przeciwieństwie do wentylatorów powstałych w innych warunkach (ryc. 4). Dla wybranego warunku Krok 2 był już częściowo spełniony, ponieważ wzrost kryształów nastąpił w ciągu < 24 godzin. Mornogram wskazał, że zarówno protokół prosty, jak i wsadowy może być skuteczny podczas skalowania w kroku 3. Początkowe skalowanie w prostej partii stworzyło warunki, w których powstały kryształy o zakresie Xn i Xs wynoszącym odpowiednio 3,6 ± 1,2 x 106 kryształów · mL-1 i 42 ± 4,1 μm. Kryształy te, choć dopuszczalne w niektórych seryjnych eksperymentach krystalograficznych, zostały uznane za zbyt duże. Przeprowadzono więc dodatkowe optymalizacje. W końcowym protokole wyprodukowano kryształy o stężeniu i zakresie wielkości 3,1 x 106 kryształów·mL-1 i 15 ± 3,9 μm, odpowiednio. Było to więcej niż idealne rozwiązanie dla planowanych eksperymentów.
Metoda koncentruje się na przekształceniu "rozpuszczalnych" kryształów białek wyhodowanych na płytkach dyfuzyjnych do wsadu. Powodem tego skupienia jest to, że zdecydowana większość rozpuszczalnych kryształów białka jest hodowana poprzez dyfuzję pary26. Przedstawione koncepcje można jednak również zastosować do rozpuszczalnych kryształów białek hodowanych przy użyciu innych metod, takich jak mikropartie. Koncepcje te mogą być również stosowane do kryształów białek błonowych hodowanych w LCP; ponieważ jest to również proces krystalizacji wsadowej.
Kluczowym aspektem protokołu jest proces przekształcania warunków kryształów hodowanych na płytkach dyfuzyjnych w taki sposób, aby można je było hodować wsadowo. Do tej transformacji metoda wykorzystuje kryterium zaproponowane przez Beale'a i in. (2019)26. Kryształy wyhodowane w procesie wsadowym, nawet na płytkach dyfuzyjnych, tworzą się szybko (< 24 godzinach). Kryterium to jest przybliżeniem opartym na prędkości równoważenia kropli dyfuzji pary i jest najbardziej prawdziwe w przypadku warunków strącania opartych na PEG. Jednak warunki krystalizacji będą zawierały szeroką gamę związków, które będą miały wpływ na czas równowagi. Zrównoważenie warunków krystalizacji na bazie soli, np. wysoko stężonego chlorku amonu, może nastąpić w ciągu 1-2 dni. W związku z tym kryterium 24 godzin może nie być prawdziwe w przypadku warunków opartych na soli. Warunki oparte na soli mogą również mieć bardziej złożone diagramy fazowe26, 30 , które mogą nie być zgodne z archetypem przedstawionym w tym protokole. Skrócenie kryterium czasu dla warunków opartych na soli do 12 lub 6 godzin może być konieczne, jeśli skalowanie do większych objętości okaże się niemożliwe.
Kolejnym ograniczeniem tej metody jest jej pozorna złożoność. Protokół, który został zastosowany w celu optymalizacji mikrokrystalizacji endotiapepsyny, w rzeczywistości zmienił pierwotny stan z badania przesiewowego o rzadkiej matrycy stosunkowo nieznacznie. Pierwszym trafieniem zaobserwowanym w badaniu przesiewowym PACT było 0,1 HEPES, pH 7,0, 0,2 M MgCl2 i 20% (w/v) PEG 6,000. Końcowy skalowany bufor krystalizacyjny wynosił 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 40% (w/v) PEG 6,000. Jest również bardzo możliwe, że zmiana stężenia buforu z HEPES na Tris-HCl i MgCl2 w niewielkim stopniu przyczyniła się do powodzenia procesu. Pozostawiając wzrost stężenia PEG 6,000 jako jedyną optymalizację, którą można było osiągnąć w dość prosty sposób.
Ocena ta jest jednak również zbyt uproszczona. Nie tylko pomija problemy napotkane podczas skalowania (tj. użycie nasion i hartowanie), ale także fakt, że tylko dlatego, że to białko okazało się proste, nie ma gwarancji, że następne również okaże się proste. Kroki zalecane w protokole zostały opracowane, ponieważ optymalizacja skalowania objętości krystalizacji białek może być bardzo kosztowna w zakresie białka. W siedmiu pokazanych próbach skalowania endotiapepsyny spożywano 100 mg białka. Trzeba przyznać, że niektóre z tych kroków zostały wykonane w celu ukazania ich konsekwencji w świetle tego protokołu. Mimo to 100 mg białka plus potencjalnie kolejne 50 mg białka spożywanego podczas eksperymentu (Tabela 1) może być znaczącą inwestycją zarówno czasu, jak i pieniędzy.
Na szczęście nie jest jasne, czy ta masa wymaganej próbki jest wszechobecna we wszystkich białkach. Endotiapepsyna była wysoce rozpuszczalna i dlatego wymagała dużego stężenia białka, aby osiągnąć przesycenie. W innych (obecnie optymalizowanych) przesycenie można osiągnąć na poziomie 10, a nawet 5 mg/ml. Takie zmienne są specyficzne dla białka i należy je uwzględnić, gdy się pojawią.
Inne ograniczenia tej metody obejmują jej poleganie na złożonym sprzęcie, takim jak roboty do obsługi cieczy do tworzenia przesiewów i płyt oraz imagery, które w razie potrzeby automatycznie naświetlają płyty. Zaproponowano alternatywne procedury, aby ograniczyć zapotrzebowanie na niektóre z tych elementów wyposażenia, ale przestrzeganie protokołu bez nich będzie bardziej czasochłonne. Protokół sugeruje również testowanie dyfrakcji zoptymalizowanych kryształów. Dla krystalografów, którzy nie mają regularnego dostępu do synchrotronu, testy te mogą okazać się wyzwaniem. Kontrole na każdym kroku mogą nie być konieczne, ale te testy są zdecydowanie zalecane po zidentyfikowaniu trafienia oraz przed i po skalowaniu. Niedyfrakcyjne kryształy w XFEL nie są niestety rzadkim zjawiskiem. Biorąc to pod uwagę, lepiej jest zachować ostrożność w odniesieniu do założeń dotyczących dyfrakcji kryształów.
Ostatecznie, ten protokół i przedstawione tutaj wyniki będą stanowić przewodnik, pomysły i przykład dla tych, którzy zmagają się z wytwarzaniem próbek do seryjnych eksperymentów krystalograficznych. Miejmy nadzieję, że wraz z dalszym rozwojem krystalografii seryjnej wymagania dotyczące próbek tej techniki zostaną zmniejszone, co zmniejszy potrzebę stosowania takich protokołów. Jednak nawet w tym przypadku przedstawione tutaj strategie będą nadal przydatne dla tych, którzy chcą zbadać przestrzeń krystalizacji swojego białka.

Krystalografia makrocząsteczkowa w temperaturze pokojowej (RT) ponownie zyskuje popularność w środowisku biologii strukturalnej. Rozwój źródeł światła opartych na wolnoelektronowych laserach rentgenowskich (XFEL) stymulował opracowanie metod dostarczania próbek w RT1,2,3,4, a metody te zostały obecnie zastosowane w synchrotronach5,6,7,8. Metody RT nie tylko otwierają możliwość zastosowania strategii eksperymentalnych typu pompa-sonda9,10,11,12, ale istnieją również rosnące dowody na to, że sprzyjają one występowaniu alternatywnych stanów konformacyjnych białek13,14,15,16,17.
Głównym powodem, dla którego pod koniec lat 90. XX wieku metody kriogeniczne zyskały popularność w porównaniu do podejść w temperaturze pokojowej (RT), było spowolnienie uszkodzeń radiacyjnych dzięki utrzymywaniu kryształów w temperaturach poniżej zera18. Metody kriogeniczne19 zaczęły umożliwiać gromadzenie pełnego zestawu danych z jednego kryształu białka. Nowoczesne metody RT stosowane w XFEL i synchrotronach rozwiązały problem uszkodzeń radiacyjnych pojedynczych kryształów poprzez opracowanie strategii szybkiego (&gt; 100 Hz) dostarczania kryształów1,2,3,4. Metody te pozwalają na zebranie pełnego zestawu danych z tysięcy indywidualnie naświetlanych kryształów. Te podejścia do dostarczania próbek w RT wymagają zatem wytworzenia dużych ilości roztworów zawierających jednorodne mikrokryształy (&gt; 100 µL kryształów o rozmiarze &lt; 50 µm). Ponieważ jednak metody kriogeniczne zazwyczaj wymagają jedynie pojedynczych kryształów, metody tworzenia takich zawiesin mikrokrystalicznych nie są obecnie powszechnie stosowane we wszystkich laboratoriach krystalografii białek.
W literaturze istnieją przykłady dotyczące realizacji poszczególnych etapów procedury optymalizacji mikrokrystalizacji dla próbek do krystalografii seryjnej. Należy tutaj wprowadzić rozróżnienie pomiędzy białkami błonowymi a rozpuszczalnymi. Protokoły optymalizacji wzrostu mikrokryształów białek błonowych hodowanych w monooleinie (lub innym lipidzie) dla fazy kubicznej lipidów (LCP) zostały dobrze opisane20,21,22. Brakuje jednak metod mikrokrystalizacji białek rozpuszczalnych, w tym białek błonowych hodowanych w warunkach innych niż LCP. Poprzednie badania koncentrowały się na konkretnych fragmentach procesu, takich jak screening mikrokryształów23,24, wspomaganie nukleacji24 oraz skalowanie z wykorzystaniem dyfuzji przez swobodny interfejs25, lecz nie obejmowały one kompletnej metody.
Niedawno opisano jednak metodę26, która ma na celu przedstawienie kompletnego protokołu. Podobnie jak wiele aspektów krystalografii białek, nie jest ona nowa. Wiele z zaproponowanych koncepcji zostało już opisanych przez Raymenta (2002)27. Metoda ta ma na celu pokazanie krystalografom, jak dokonać przejścia od pojedynczego kryształu hodowanego metodą dyfuzji par do metodologii seryjnej (batch) w celu wyhodowania tysięcy mikrokryształów. Metoda koncentruje się na dyfuzji par jako powszechnym punkcie wyjścia, ponieważ 95% wszystkich depozycji w Protein Data Bank (PDB) pochodzi z kryształów hodowanych na płytkach do dyfuzji par26. Dyfuzja par nie jest jednak idealną metodą do mikrokrystalizacji26, dlatego opisano metodologię konwersji dyfuzji par na krystalizację seryjną. Gdy kryształy mogą być hodowane seryjnie, możliwe staje się praktyczne skalowanie do większych objętości. Biorąc pod uwagę nieprzewidywalność krystalizacji białek, autorzy podkreślają, że metoda ta nie jest niezawodna. Niemniej jednak protokół ten powinien co najmniej dostarczyć informacji na temat „przestrzeni krystalizacji” danego białka.
Metoda ta opiera się na wykresie fazowym krystalizacji białek oraz na tym, w jaki sposób zrozumienie tego wykresu może służyć jako wskazówka podczas optymalizacji mikrokrystalizacji. Wykres fazowy białka jest zazwyczaj przedstawiany jako wykres x/y, gdzie na osi x i y naniesiono odpowiednio stężenia wytrącającego i białka (Rysunek 1A). Od punktu czystej wody (lewy dolny róg – Rysunek 1A), stężenie zarówno białka, jak i wytrącającego rośnie, aż do osiągnięcia linii rozpuszczalności. Linia rozpuszczalności wyznacza punkt przesycenia (fioletowa linia – Rysunek 1A). Gdy białko jest przesycone, roztwór staje się termodynamicznie niestabilny i zaczyna rozdzielać się na dwie fazy: fazę „bogatą w białko” oraz stabilny roztwór nasycony. Rozdzielenie to może nastąpić w dowolnym punkcie poza linią rozpuszczalności, a jego kinetyka zależy od właściwości białka i składników roztworu.
Gdy stężenia białka i czynnika wytrącającego są zbyt wysokie, białko ulega niestabilnemu wytrąceniu z roztworu, co prowadzi do powstania osadu amorficznego (obszar różowy – Rysunek 1A). Jednak w obszarze nukleacji może dojść do uporządkowanego rozdziału faz [szczegółowy opis znajduje się w pracy Garcia-Ruiz (2003)28], a zarodki kryształów mają tendencję do formowania się (obszar zielony – Rysunek 1A). Nukleacja i wzrost powodują usunięcie białka z roztworu i przenoszą kroplę do obszaru metastabilnego, w którym wzrost może być kontynuowany aż do osiągnięcia linii rozpuszczalności [szczegółowa dyskusja w pracy McPherson i Kuznetsov (2014)29]. Dla zdecydowanej większości warunków krystalizacji powyższy schemat jest znacznym uproszczeniem30. Niemniej jednak, schemat ten pozostaje niezwykle użyteczny dla mikrokrystalografów, ponieważ jego mapowanie pozwala na wyznaczenie linii rozpuszczalności oraz kinetyki nukleacji.
W kontekście tworzenia mikrokryształów, dwoma czynnikami podczas krystalizacji, które wymagają optymalizacji, są liczba kryształów (Xn) oraz ich średni najdłuższy wymiar (Xs). Xn będzie proporcjonalna do liczby zdarzeń nukleacji (n) (Równanie 1).
<img alt="Równowaga statyczna; równanie: Xₙ ∝ n; wyrażenie matematyczne; koncepcja proporcjonalności." src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">     Równ. 1
Xs jest proporcjonalne do stężenia wolnego białka powyżej linii rozpuszczalności (Ps) podzielonego przez Xn (Eq. 2).
<img alt="Wzór na równowagę statyczną, schemat z symbolem proporcjonalności, zastosowanie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">     Równ. 2
W idealnych warunkach każde zdarzenie nukleacji prowadziłoby do powstania potencjalnego kryształu, a każdy z tych kryształów miałby równy dostęp do białka dostępnego w roztworze. Rysunek 2 stanowi graficzną reprezentację idealnego scenariusza relacji między Xn a Xs. W praktyce głównym sposobem kontrolowania Xn oraz Xs przez krystalografa jest wpływanie na stopień nukleacji lub dodawanie kryształów zarodkowych. Krystalograf zajmujący się mikrokryształami musi ocenić, w jaki sposób zwiększyć Xn, aby uzyskać jednocześnie odpowiednie stężenie i wielkość kryształów.
Większość technik krystalizacji wymaga tzw. „okresu przejściowego” (Ryc. 1B). Na przykład w eksperymencie z dyfuzją pary, po zmieszaniu roztworów białka i precypitantu, stężenia obu składników będą ulegać zmianom w miarę równoważenia się kropli z roztworem w studzience. Zakłada się, że zmiany te stopniowo wprowadzą kroplę w strefę nukleacji, w której wzrośnie skłonność do krystalizacji. W miarę jak kryształy zaczynają nukleować i rosnąć, ilość białka w roztworze będzie spadać, co zmniejszy prawdopodobieństwo dalszej nukleacji. Ostateczna ilość nukleacji będzie specyficzna dla białka i zastosowanych warunków, a także zależna od głębokości wejścia w strefę nukleacji. Biorąc pod uwagę ograniczoną penetrację strefy nukleacji w metodach wymagających etapu przejściowego, poziom nukleacji będzie ostatecznie ograniczony do szybkości nukleacji na granicy obszaru metastabilnego i strefy nukleacji.
Z uwagi na znaczenie możliwości zwiększenia poziomu nukleacji dla mikrokrystalografa, istotne jest przejście na metodologię krystalizacji okresowej (batch). Metoda ta pozwala w większym stopniu wykorzystać cały obszar nukleacji (Rycina 1C). W metodach okresowych założeniem jest zmieszanie białka z precypitantem w taki sposób, aby powstał roztwór nasycony bez konieczności wprowadzania zmian w stężeniach składników. Nukleacja powinna być możliwa natychmiast po zmieszaniu. Metody okresowe pozwalają zatem teoretycznie na osiągnięcie całej strefy nukleacji. Można wówczas wykorzystać każdy wzrost kinetyki nukleacji wykraczający poza granicę metastabilna-nukleacyjną.
Jeśli podstawowy poziom nukleacji kryształów jest niewystarczający do uzyskania dużej wartości Xn, można zastosować metody mikrozasiewu. W mikrozasiewie uprzednio wyhodowane kryształy są rozdrabniane w celu stworzenia zawiesiny fragmentów krystalicznych, które mogą służyć jako rusztowanie dla wzrostu nowych kryształów31,32. Mikrozasiew jest szeroko stosowany w seryjnym przygotowywaniu próbek krystalograficznych jako sposób na zwiększenie Xn bez konieczności zwiększania nukleacji kryształów (Rycyna 1C).
Przejście z dyfuzji pary do metody batch można zwizualizować na wykresie fazowym jako przesunięcie eksperymentalnego punktu wyjścia z obszarów nienasyconych lub metastabilnych do strefy nukleacji. Można to osiągnąć poprzez zwiększenie stężenia białka i/lub precypitantu i/lub zmiane ich stosunku wewnątrz kropli (Rysunek 1D) oraz obserwację, w których warunkach kryształy pojawiają się szybko (&lt; 24 h)26. Pełna równowaga kropli w procesie dyfuzji pary może trwać wiele dni lub tygodni33. Zatem, poszukując warunków, w których kryształy pojawiają się szybko, można ustalić warunki batch bez konieczności przejścia na alternatywne formaty screeningu krystalizacji, takie jak micro-batch34,35,36,37.
Po znalezieniu strefy nukleacji oraz odpowiednich warunków dla metody wsadowej (batch), można stworzyć morfogram – w tym przypadku wstępny diagram fazowy. Morfogram jest niezwykle użyteczny przy rozważaniu wyboru między protokołem wsadowym z zaszczepieniem (seeded-batch) a standardowym protokołem wsadowym. Poprzez wykreślenie Xn jako funkcji stężenia białka i precypitantu, można dokonać oceny kinetyki nukleacji26. Jeśli Xn pozostaje niska w całej strefie nukleacji, może być wymagane zastosowanie metody seeded-batch, aby zwiększyć Xn do wartości wystarczającej do ograniczenia wzrostu kryształów. Ocena ta jest pierwszym krokiem w procesie skalowania do większych objętości (&gt; 100 µL).
Metodę tę zaprojektowano w taki sposób, aby można było ją przeprowadzić w większości laboratoriów krystalizacji, korzystając ze standardowego sprzętu do krystalizacji metodą dyfuzji pary. Przeprowadzono również wiele badań opisujących techniki ułatwiające poszczególne etapy tego procesu, o ile dostępny jest odpowiedni sprzęt. Należą do nich między innymi: dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)25,27, obrazowanie nieliniowe20,24,25, dyfrakcja proszkowa20,24,27 oraz mikroskopia elektronowa26 [patrz: Cheng et al. (2020)40 w celu zapoznania się z przejrzystym przeglądem literatury].
Celem niniejszej pracy jest przedstawienie wizualnej demonstracji metody przejścia z krystalizacji metodą dyfuzji pary w małych objętościach (&lt; 500 nL) do krystalizacji seryjnej (batch) w dużych objętościach (&gt; 100 µL). Jako układ przykładowy do zademonstrowania tego przejścia wykorzystano endotiapepsynę z Cryphonectria parasitica. Rodzaj eksperymentu oraz metoda dostarczania próbek, dla których wymagane są mikrokryształy, wpływają na optymalną wartość końcową Xs26. W przypadku eksperymentów mieszania wymagających rozdzielczości czasowej rzędu milisekund41 lub zastosowania gazodynamicznych dysz wirtualnych42, pożądana może być końcowa wartość Xs &lt; 5 µm. W niniejszym przypadku celem było otrzymanie kryształów białka dyfrakcyjnych do około 1.5 Å, na potrzeby eksperymentu pompowo-sondującego aktywowanego fotonami, z zastosowaniem metody dostarczania na stałym celu.
Aby zilustrować wymagania dotyczące próbek dla takiego seryjnego eksperymentu krystalograficznego z użyciem endotiapepsyny, w Tabeli 1 przedstawiono parametry eksperymentalne hipotetycznego badania. Informacje o próbkach oparto na opisanym poniżej protokole. Przyjmując konserwatywne szacunki dotyczące współczynników trafień oraz wymagań w zakresie gromadzenia danych, całkowite zużycie próbki dla całego eksperymentu szacuje się na 50 mg.
Rysunek 3 przedstawia schemat blokowy pełnego procesu optymalizacji, od początkowej krystalizacji metodą dyfuzji pary w małych objętościach po krystalizację seryjną w dużym rozmiarze. W większości projektów krystalografii seryjnej protokół ten rozpocznie się od Kroku 2: „przejście do metody batch”, ponieważ białko docelowe będzie już wcześniej skrystalizowane. Niemniej jednak, Krok 1 został uwzględniony dla kompletności oraz aby przypomnieć czytelnikom o jego znaczeniu. Znalezienie warunków, które prowadzą do powstania pojedynczego, dużego kryształu dobrze dyfraktującego, jest najlepszym punktem wyjścia dla optymalizacji mikrokryształów. W Kroku 2 warunki te można następnie zoptymalizować, przechodząc z dyfuzji pary na metodę batch, a następnie wykreślić morfogram obszarów nukleacji i metastabilności. Po wykonaniu tych czynności, w Kroku 3 można przeprowadzić skalowanie warunków metody batch do większych objętości. Na końcu ścieżki przedstawionej na schemacie krystalograf opracuje powtarzalny, wielkoskalowy (&gt; 100 µL) protokół mikrokrystalizacji metodą batch dla endotiapsyny. Metodę tę można następnie zastosować do konkretnego białka będącego przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Swissci 96-dołkowe płytki 2-kroplowe</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD11-002</td><td>96-dołkowa 2-kroplowa płytka krystalizacyjna</td></tr><tr><td>Swissci 96-dołkowa 3-kroplowa</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD11-003</td><td>96-dołkowa 3-kroplowa płytka krystalizacyjna</td></tr><tr><td>komar LCP Robot do obsługi cieczy</td><td>sptlabtech</td><td>mosquito LCP</td><td>Robot krystalizacyjny</td></tr><tr><td>ClearVue Arkusze Wymiary</td><td>molekularne</td><td>MD6-015</td><td>96-dołkowe uszczelki płytkowe do krystalizacji</td></tr><tr><td>Safe-Tube 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1,5 ml probówki wirówkowe</td></tr><tr><td>Scaple</td><td>Swan i Morton</td><td>No. 3 i rękojeść nr 3</td><td>Skalpel do cięcia otwartych uszczelek płytowych</td></tr><tr><td>MS 3 Vortex</td><td>IKA</td><td>3319000</td><td>Vortex do mieszania roztworu i wytwarzania zapasów nasion</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka XRL</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD3-11</td><td>24-dołkowe płytki wiszące</td></tr><tr><td>Rewolwer/rotator rurkowy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>88881001</td><td>Rewolwer rurkowy do mieszania roztworu podczas skalowania</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipety</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Gama pipet ręcznych, 0,5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 i mikro; L</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Zakres rozmiarów końcówek do pipet ręcznych</td></tr><tr><td>Suparen 600</td><td>Prochem AG</td><td>Suparen 600</td><td>Endotiapepsyna roztwór</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>241245-1KG</td><td>Octan sodu</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>8382T014</td><td>Tris</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1kg</td><td>Chlorek magnezu</td></tr><tr><td>PEG 6,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81255-1kg</td><td>PEG 6,000</td></tr><tr><td>Glikol ethelyenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558-1L</td><td>Glikol ethelyenowy do cyroochrony kryształów</td></tr><tr><td>Ekran PACT Premier HT</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD1-36</td><td>PACT 96-dołkowy ekran kryształkowy</td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy DOW CORNING</td><td>Wymiary molekularne</td> Smar <td>MD6-02</td><td> do uszczelniania płytek 24-dołkowych</td></tr><tr><td>Hirschmann 22 x 22 mm prowadnice osłonowe glaser</td><td>Hirschmann</td><td>8000104</td><td>Szkiełka pokrywowe do uszczelniania 24-dołkowych płytek opadowych do siedzenia</td></tr><tr><td>Kołki kryształowe</td><td>PSI</td><td>Produkowane we własnym zakresie</td><td>Cienkowarstwowe nośniki do mikrokryształów.</td></tr><tr><td>1-1,3 mm SiLibeads Type S</td><td>Faust</td><td>6239547</td><td>Koraliki szklane do robienia naczyń mikoziarnistych</td></tr><tr><td>Macbook Pro</td><td>Apple</td><td>Macbook Pro</td><td>Komputer do analizy danych</td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania CCP4</td><td>CCP4</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania danych o wzorcach dyfrakcyjnych</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office</td><td>Narzędzie do kreślenia diagramu fazowego</td></tr><tr><td>Komora licząca Hausser Scientific Bright-Line</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>02-671-51B</td><td>Narzędzie do obliczania stężenia kryształów</td></tr><tr><td>PACT Premier</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-29-ECO</td><td>Ekran krystalizacji w matrycy rzadkiej</td></tr><tr><td>Imager skał</td><td>Formulatrix</td><td>Rock Imager</td><td>Magazyn i obrazowanie płyt kryształowych z kontrolowaną temperaturą</td></tr><tr><td>Rock MakerWeb</td><td>Formulatrix</td><td>Rock MakerWeb</td><td>Oprogramowanie do tworzenia i przechowywania obrazów na płytkach kryształowych</td></tr><tr><td>Formulator</td><td>Formulatrix</td><td>Formulator</td><td>96-dołkowy robot do tworzenia ekranów kryształowych do obsługi cieczy</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica MZ16</td> Mikroskop <td>Leica</td><td>Leica MZ16</td><td>Mikroskop świetlny</td></tr><tr><td>LAS V4.6</td><td>Oprogramowanie Leica</td><td>LAS V4.6</td><td>do mikroskopów</td></tr><tr><td>Leica Rurki dializacyjne Spectra/Por 3,5 kDa</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra/Por 3 Membrana dializacyjna</td><td>Membrana dializowa 3,5 kDa</td></tr><tr><td>Zamknięcia węży do dializy</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra/Por 3 Duniversal Zamknięcia</td><td>Zaciski do uszczelniania końcówek przewodów dializacyjnych Koncentrator</td></tr><tr><td>odśrodkowy Amicon 10 kDa</td><td>Merck-Millipore</td><td>Koncentrator odśrodkowy Amicon Ultra-15 10 kDa</td><td>Filtr odśrodkowy</td></tr><tr><td>5810 R Wirówka z kubełkiem obrotowym</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R Wirówka</td><td>Wirówka z kubełkiem obrotowym</td></tr></tbody></table>

optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Tutaj prezentowany jest protokół ułatwiający tworzenie dużych ilości (> 100 μL) mikrokrystalicznych zawiesin odpowiednich do eksperymentów krystalograficznych w synchrotronach i XFEL-ach. Metoda opiera się na zrozumieniu diagramu faz kryształów białka i tego, jak można wykorzystać tę wiedzę. Metoda jest podzielona na trzy etapy: (1) optymalizacja morfologii kryształów, (2) przejście do partii oraz (3) skalowanie. Etap 1 polega na znalezieniu dobrze dyfrakcyjnych monokryształów, miejmy nadzieję, ale niekoniecznie, prezentujących się w morfologii przypominającej sześcian. W Etapie 2 warunek Etapu 1 jest optymalizowany przez czas wzrostu kryształów. Ta strategia może przekształcić kryształy wyhodowane przez dyfuzję pary w partię. Gdy wzrost kryształów może nastąpić w ciągu około 24 godzin, można wykreślić morfogram mieszaniny białka i osadu i wykorzystać go jako podstawę strategii skalowania (etap 3). Gdy kryształy mogą być hodowane partiami, można podjąć próbę skalowania, a rozmiar i stężenie kryształów optymalizować wraz ze wzrostem objętości. Endotiapepsyna została wykorzystana jako białko demonstracyjne w tym protokole. Niektóre z przedstawionych decyzji są specyficzne dla endotiapepsyny. Jest jednak nadzieja, że sposób, w jaki zostały zastosowane, zainspiruje sposób myślenia o tej procedurze, który inni będą mogli dostosować do własnych projektów.

Celem tego artykułu jest dać widzowi solidne zrozumienie, jak przekształcić ich protokół małej objętości dyfuzji parowej, do hodowli dużych, pojedynczych kryształów białka, w metodę mikrokrystalizacji wsadowej o dużej objętości dla krystalografii szeregowej.

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Eksperymenty z krystalografią seryjną mogą być trudne. Kluczową przeszkodą w ich praktyce jest tworzenie próbek mikrokrystalicznych. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób takie próbki mogą być niezawodnie tworzone.Metoda ta wykorzystuje endotiapepsynę, aby zapewnić ramy do optymalizacji dużych kryształów hodowanych na płytkach dyfuzyjnych o małej objętości do mikrokrystalicznych zawiesin o dużej objętości. Nie możemy twierdzić, że ten protokół odniesie powszechny sukces. Mamy jednak nadzieję, że zaproponowane tutaj pomysły i metody dostarczą innym ram eksperymentalnych, które będą mogli zastosować na innych białkach.Na początek przygotuj dwukroplową płytkę 96-dołkową z buforem krystalizacyjnym za pomocą robota Formulatrix. Używając mieszanki robota do obsługi cieczy, wymieszaj 150 nanolitrów świeżo rozmrożonej endotiapepsyny ze 150 nanolitrami buforu krystalizacyjnego w każdym dołku. Zamknij płytkę i pozwól kryształom rosnąć przez 24 godziny w hotelu Formulatrix.Po 24 godzinach rozbij i usuń kryształy z pięciu dołków 96-dołkowej płytki krystalizacyjnej. Umieść je w 250 mikrolitrach buforu krystalizacyjnego w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej umieszczonej w wiadrze na lód. Dodaj 10 do 15 szklanych kulek o wielkości jednego milimetra do probówki wirówkowej.Wiruj kryształy i koraliki z prędkością 1000 obr./min przez 30 sekund i umieść je na lodzie na 30 sekund. Nasiona można następnie wykorzystać od razu lub przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić eksperyment morfogramu, dodaj od pięciu do 40% stężeń PEG 6000 z jednym molowym Tris-HCl przy pH siódmym i 0,15 molowym chlorku magnezu wzdłuż kolumn płytki dwukroplowego 96-dołkowego sita siatkowego Napraw sekwencyjne rozcieńczenie endotiapepsyny w 0,1 molowym octanie sodu od 100 do 12,5 miligrama na mililitr w ciągu ośmiu kroków.Następnie odpipetować osiem mikrolitrów każdego rozcieńczenia, a następnie dwa mikrolitry materiału siewnego na płytę robota do obsługi cieczy. Za pomocą robota do obsługi cieczy dozować 150 nanolitrów każdego rozcieńczenia endotiapepsyny do podstudzienek pierwszego i drugiego sita. Wielokrotnego zasysania 50 nanolitrów rozmrożonego materiału siewnego i 100 nanolitrów roztworu studzienki z drugiej studzienki i dozowania obu do roztworu białkowego.Wymieszać roztwory trzykrotnie po dodaniu buforu krystalizacyjnego lub buforu krystalizacyjnego i mieszanki zarodków. Teraz zapieczętuj płytkę i obraz na zero, trzy, sześć, 12, 18 i 24 godziny pierwszego dnia codziennie przez pierwszy tydzień i co tydzień przez następne cztery tygodnie w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach spójrz na płytkę pod mikroskopem, oszacuj liczbę kryształów w każdym dołku i zmierz próbkę kryształów.Zapisz te szacunki w dostarczonym arkuszu generatora morfogramów. Wprowadzić początkowe stężenia endotiapepsyny i PEG 6000 do odpowiednich pól. Arkusz roboczy automatycznie wykreśli wyniki w tradycyjnym formacie diagramu fazowego ze stężeniami strącania i białka odpowiednio na osi X i Y.Cóż, warunki, które powodują powstawanie kryształów tylko w ich zaszczepionych kroplach, wskazują na region MetaStabilny diagramu, podczas gdy warunki z kryształami zarówno w zaszczepionych, jak i niezaszczepionych kroplach wskazują na strefę zarodkowania. Z analizy morfogramu wybierz najbardziej obiecujący warunek do skalowania do płytek 24-dołkowych. Następnie zacznij od 100 miligramów na mililitr endotiapepsyny i 35% PEG 6000.Przygotuj pięć mililitrów buforu krystalizacyjnego z 35% PEG 6000, 0,1 molowego Tris-HCl o pH siedem i 0,15 molowego chlorku magnezu. Teraz umieść 0,5 mililitra buforu krystalizacyjnego w trzech dołkach natłuszczonej 24-dołkowej wiszącej płytki kroplowej. Wymieszać 15 mikrolitrów endotiapepsyny z 15 mikrolitrami roztworu krystalizacyjnego na szklanym szkiełku nakrywkowym.Umieść roztwór nad studzienkami i pozostaw płytkę na 24 godziny. Po 24 godzinach spójrz na płytkę pod mikroskopem, oszacuj liczbę kryształów w kropli i zmierz ich wielkość. Jeśli kryształy są nieprawidłowe, powtórz ten krok, ale zmień stężenie białka lub dodaj nasiona, jeśli zarodkowanie kryształów nie jest wystarczająco wysokie.Powtórz eksperyment z skalowaniem 24-dołkowym, dodając nasiona o wyższym stężeniu PEG 6000. Umieść 0,5 mililitra nowego buforu krystalizacyjnego w trzech dołkach natłuszczonej 24-dołkowej wiszącej płytki kroplowej. Umieścić 15 mikrolitrów endotiapepsyny na szklanym szkiełku nakrywkowym i wymieszać pięć mikrolitrów bulionu nasiennego i 10 mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego z roztworem endotiapepsyny.Odwróć szkiełka nakrywkowe, umieść je nad studzienkami i pozostaw na 24 godziny. Ponownie sprawdź krople, aby zobaczyć, czy kryształy są mniejsze i mają wyższe stężenie. Oszacuj liczbę kryształów w kropli i ponownie zmierz ich rozmiar, aby sprawdzić, czy mają teraz prawidłowy rozmiar.Aby wykonać protokół wsadu, należy przygotować bufor krystalizacyjny składający się z 40% PEG 6000, 0,1 molowego Tris-HCl o pH siedmiu i 0,15 molowego chlorku magnezu. Wymieszaj wstępnie 50 mikrolitrów wywaru siewnego i 100 mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego i wymieszaj z roztworem białkowym w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. Obracaj rurkę przez 10 sekund i umieść ją na kołysce lub shakerze w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Weź 2,5 mikrolitra podwielokrotności roztworu wsadowego co 20 minut. Monitoruj rozmiar i liczbę kryształów za pomocą hemocytometru. Policz liczbę kryształów i zmierz ich wielkość pod mikroskopem.Gdy kryształy osiągną wymiar około 15 mikronów, wygasić reakcję 150 mikrolitrami 0,5-molowego octanu sodu uzupełnionego 0,5 molowym Tris-HCl, 0,075 molowym chlorkiem magnezu i 20% PEG 6000. Ponownie sprawdź rozmiar i stężenie kryształów za pomocą hemocytometru. Przechowuj kryształy w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Analiza morfogramu endotiapepsyny sugerowała, że na zarodkowanie miały wpływ zarówno stężenia białka, jak i strącania. Regiony MetaStabil, nukleacji i opadów na diagramie można dobrze rozróżnić. Dodanie nasion znacznie zwiększyło liczbę kryształów w porównaniu z kroplami bez nasion.Analiza mikrokrystalizacji endotiapepsyny w objętościach od 200 do 300 mikrolitrów ujawniła zmiany w zarodkowaniu kryształów i najdłuższy wymiar w czasie. Zwiększenie stężenia PEG do 35% znacznie poprawiło krystalizację, z końcowym stężeniem kryształów około 3,6 razy od 10 do sześciu na mililitr i najdłuższym wymiarem kryształu wynoszącym 42 mikrometry. Aby zmniejszyć rozmiar końcowych kryształów, zastosowano podejście polegające na redukcji stężenia białka, które niestety znacznie zmniejszyło stężenie kryształów, a ostatecznie wytworzyło jeszcze większe kryształy.Jednak podejście polegające na zwiększeniu stężenia PEG do 40% dało kryształy około 3,1 razy 10 do sześciu na mililitr i wielkość około 39 mikrometrów. Co więcej, dodanie nasion doprowadziło do znacznego wzrostu stężenia kryształów, około 1,1 razy 10 do ośmiu na mililitr i mniejszych wymiarów około 4,2 mikrometra. Efekt hartowania próbowany w reakcji krystalizacji dał końcowe stężenie kryształów około 2,6 razy 10 do sześciu na mililitr i wielkość około 15 mikrometrów.Połowa CC wykreślona w stosunku do rozdzielczości z danych rentgenowskich wykazała niewielki spadek rozdzielczości kryształów z 10 mikrolitrów do 200 do 300 mikrolitrów. Jednak kryształ nadal ulegał dyfrakcji do 1,5 angstrum, co uznano za wystarczające. Endotiapepsyna jest białkiem wybaczającym błędy do pracy.Mamy nadzieję, że wypróbowanie tego protokołu endotiapepsyny zaowocuje użytecznymi pomysłami i metodami dla innych białek. Szczególnie w przypadku krystalografii korzystne jest obserwowanie, jak rzeczy wyglądają i działają, a nie tylko próba przestrzegania pisemnego protokołu. Mamy nadzieję, że ten film da ci trochę tego uczucia.

optimizing-growth-endothiapepsin-crystals-for-serial-crystallography

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Tutaj opisujemy ogólną metodę losowego przesiewania matryc mikronasion. Wykazano, że technika ta znacznie zwiększa wskaźnik sukcesu eksperymentów przesiewowych krystalizacji białek, zmniejsza potrzebę optymalizacji i zapewnia niezawodne dostarczanie kryształów do zbierania danych i eksperymentów z moczeniem ligandów.

Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Tutaj prezentujemy protokół kontrolowanej produkcji mikrokryształów białka. W procesie wykorzystuje się zautomatyzowane urządzenie pozwalające na kontrolowaną manipulację kilkoma parametrami krystalizacji. Krystalizacja białka odbywa się poprzez kontrolowane i zautomatyzowane dodawanie roztworów krystalizacyjnych przy jednoczesnym monitorowaniu i badaniu rozkładu promienia cząstek w kropli krystalizacji.

Hodowla kryształów białkowych o różnych wymiarach przy użyciu automatycznej krystalizacji połączonej z dynamicznym rozpraszaniem światła in situ

Powodzenie eksperymentu z seryjną krystalografią femtosekundową z rozdzielczością czasową zależy od efektywnego dostarczania próbki. W tym miejscu opisujemy protokoły optymalizujące wytłaczanie mikrokryształów bakteriorodopsyny z wtryskiwacza do mikroekstruzji o wysokiej lepkości. Metodologia opiera się na homogenizacji próbki za pomocą nowatorskiego łącznika trójdrożnego i wizualizacji za pomocą szybkiej kamery.

Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Badania strukturalne biomakromolekuł za pomocą krystalografii wymagają kryształów wysokiej jakości. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys (w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium) i/lub przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.

Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Poznaj metodę optymalizacji wzrostu mikrokryształów endothiapepsyny do krystalografii seryjnej. Protokół obejmuje analizę morfogramów, skalowanie do większych objętości oraz zastosowanie robotów do precyzyjnego przygotowania próbek.

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Przeglądaj więcej filmów