Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Eksperymenty z krystalografią seryjną mogą być trudne. Kluczową przeszkodą w ich praktyce jest tworzenie próbek mikrokrystalicznych. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób takie próbki mogą być niezawodnie tworzone.

Metoda ta wykorzystuje endotiapepsynę, aby zapewnić ramy do optymalizacji dużych kryształów hodowanych na płytkach dyfuzyjnych o małej objętości do mikrokrystalicznych zawiesin o dużej objętości. Nie możemy twierdzić, że ten protokół odniesie powszechny sukces. Mamy jednak nadzieję, że zaproponowane tutaj pomysły i metody dostarczą innym ram eksperymentalnych, które będą mogli zastosować na innych białkach.

Na początek przygotuj dwukroplową płytkę 96-dołkową z buforem krystalizacyjnym za pomocą robota Formulatrix. Używając mieszanki robota do obsługi cieczy, wymieszaj 150 nanolitrów świeżo rozmrożonej endotiapepsyny ze 150 nanolitrami buforu krystalizacyjnego w każdym dołku. Zamknij płytkę i pozwól kryształom rosnąć przez 24 godziny w hotelu Formulatrix.

Po 24 godzinach rozbij i usuń kryształy z pięciu dołków 96-dołkowej płytki krystalizacyjnej. Umieść je w 250 mikrolitrach buforu krystalizacyjnego w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej umieszczonej w wiadrze na lód. Dodaj 10 do 15 szklanych kulek o wielkości jednego milimetra do probówki wirówkowej.

Wiruj kryształy i koraliki z prędkością 1000 obr./min przez 30 sekund i umieść je na lodzie na 30 sekund. Nasiona można następnie wykorzystać od razu lub przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić eksperyment morfogramu, dodaj od pięciu do 40% stężeń PEG 6000 z jednym molowym Tris-HCl przy pH siódmym i 0,15 molowym chlorku magnezu wzdłuż kolumn płytki dwukroplowego 96-dołkowego sita siatkowego Napraw sekwencyjne rozcieńczenie endotiapepsyny w 0,1 molowym octanie sodu od 100 do 12,5 miligrama na mililitr w ciągu ośmiu kroków.

Następnie odpipetować osiem mikrolitrów każdego rozcieńczenia, a następnie dwa mikrolitry materiału siewnego na płytę robota do obsługi cieczy. Za pomocą robota do obsługi cieczy dozować 150 nanolitrów każdego rozcieńczenia endotiapepsyny do podstudzienek pierwszego i drugiego sita. Wielokrotnego zasysania 50 nanolitrów rozmrożonego materiału siewnego i 100 nanolitrów roztworu studzienki z drugiej studzienki i dozowania obu do roztworu białkowego.

Wymieszać roztwory trzykrotnie po dodaniu buforu krystalizacyjnego lub buforu krystalizacyjnego i mieszanki zarodków. Teraz zapieczętuj płytkę i obraz na zero, trzy, sześć, 12, 18 i 24 godziny pierwszego dnia codziennie przez pierwszy tydzień i co tydzień przez następne cztery tygodnie w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach spójrz na płytkę pod mikroskopem, oszacuj liczbę kryształów w każdym dołku i zmierz próbkę kryształów.

Zapisz te szacunki w dostarczonym arkuszu generatora morfogramów. Wprowadzić początkowe stężenia endotiapepsyny i PEG 6000 do odpowiednich pól. Arkusz roboczy automatycznie wykreśli wyniki w tradycyjnym formacie diagramu fazowego ze stężeniami strącania i białka odpowiednio na osi X i Y.

Cóż, warunki, które powodują powstawanie kryształów tylko w ich zaszczepionych kroplach, wskazują na region MetaStabilny diagramu, podczas gdy warunki z kryształami zarówno w zaszczepionych, jak i niezaszczepionych kroplach wskazują na strefę zarodkowania. Z analizy morfogramu wybierz najbardziej obiecujący warunek do skalowania do płytek 24-dołkowych. Następnie zacznij od 100 miligramów na mililitr endotiapepsyny i 35% PEG 6000.

Przygotuj pięć mililitrów buforu krystalizacyjnego z 35% PEG 6000, 0,1 molowego Tris-HCl o pH siedem i 0,15 molowego chlorku magnezu. Teraz umieść 0,5 mililitra buforu krystalizacyjnego w trzech dołkach natłuszczonej 24-dołkowej wiszącej płytki kroplowej. Wymieszać 15 mikrolitrów endotiapepsyny z 15 mikrolitrami roztworu krystalizacyjnego na szklanym szkiełku nakrywkowym.

Umieść roztwór nad studzienkami i pozostaw płytkę na 24 godziny. Po 24 godzinach spójrz na płytkę pod mikroskopem, oszacuj liczbę kryształów w kropli i zmierz ich wielkość. Jeśli kryształy są nieprawidłowe, powtórz ten krok, ale zmień stężenie białka lub dodaj nasiona, jeśli zarodkowanie kryształów nie jest wystarczająco wysokie.

Powtórz eksperyment z skalowaniem 24-dołkowym, dodając nasiona o wyższym stężeniu PEG 6000. Umieść 0,5 mililitra nowego buforu krystalizacyjnego w trzech dołkach natłuszczonej 24-dołkowej wiszącej płytki kroplowej. Umieścić 15 mikrolitrów endotiapepsyny na szklanym szkiełku nakrywkowym i wymieszać pięć mikrolitrów bulionu nasiennego i 10 mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego z roztworem endotiapepsyny.

Odwróć szkiełka nakrywkowe, umieść je nad studzienkami i pozostaw na 24 godziny. Ponownie sprawdź krople, aby zobaczyć, czy kryształy są mniejsze i mają wyższe stężenie. Oszacuj liczbę kryształów w kropli i ponownie zmierz ich rozmiar, aby sprawdzić, czy mają teraz prawidłowy rozmiar.

Aby wykonać protokół wsadu, należy przygotować bufor krystalizacyjny składający się z 40% PEG 6000, 0,1 molowego Tris-HCl o pH siedmiu i 0,15 molowego chlorku magnezu. Wymieszaj wstępnie 50 mikrolitrów wywaru siewnego i 100 mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego i wymieszaj z roztworem białkowym w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. Obracaj rurkę przez 10 sekund i umieść ją na kołysce lub shakerze w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Weź 2,5 mikrolitra podwielokrotności roztworu wsadowego co 20 minut. Monitoruj rozmiar i liczbę kryształów za pomocą hemocytometru. Policz liczbę kryształów i zmierz ich wielkość pod mikroskopem.

Gdy kryształy osiągną wymiar około 15 mikronów, wygasić reakcję 150 mikrolitrami 0,5-molowego octanu sodu uzupełnionego 0,5 molowym Tris-HCl, 0,075 molowym chlorkiem magnezu i 20% PEG 6000. Ponownie sprawdź rozmiar i stężenie kryształów za pomocą hemocytometru. Przechowuj kryształy w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Analiza morfogramu endotiapepsyny sugerowała, że na zarodkowanie miały wpływ zarówno stężenia białka, jak i strącania. Regiony MetaStabil, nukleacji i opadów na diagramie można dobrze rozróżnić. Dodanie nasion znacznie zwiększyło liczbę kryształów w porównaniu z kroplami bez nasion.

Analiza mikrokrystalizacji endotiapepsyny w objętościach od 200 do 300 mikrolitrów ujawniła zmiany w zarodkowaniu kryształów i najdłuższy wymiar w czasie. Zwiększenie stężenia PEG do 35% znacznie poprawiło krystalizację, z końcowym stężeniem kryształów około 3,6 razy od 10 do sześciu na mililitr i najdłuższym wymiarem kryształu wynoszącym 42 mikrometry. Aby zmniejszyć rozmiar końcowych kryształów, zastosowano podejście polegające na redukcji stężenia białka, które niestety znacznie zmniejszyło stężenie kryształów, a ostatecznie wytworzyło jeszcze większe kryształy.

Jednak podejście polegające na zwiększeniu stężenia PEG do 40% dało kryształy około 3,1 razy 10 do sześciu na mililitr i wielkość około 39 mikrometrów. Co więcej, dodanie nasion doprowadziło do znacznego wzrostu stężenia kryształów, około 1,1 razy 10 do ośmiu na mililitr i mniejszych wymiarów około 4,2 mikrometra. Efekt hartowania próbowany w reakcji krystalizacji dał końcowe stężenie kryształów około 2,6 razy 10 do sześciu na mililitr i wielkość około 15 mikrometrów.

Połowa CC wykreślona w stosunku do rozdzielczości z danych rentgenowskich wykazała niewielki spadek rozdzielczości kryształów z 10 mikrolitrów do 200 do 300 mikrolitrów. Jednak kryształ nadal ulegał dyfrakcji do 1,5 angstrum, co uznano za wystarczające. Endotiapepsyna jest białkiem wybaczającym błędy do pracy.

Mamy nadzieję, że wypróbowanie tego protokołu endotiapepsyny zaowocuje użytecznymi pomysłami i metodami dla innych białek. Szczególnie w przypadku krystalografii korzystne jest obserwowanie, jak rzeczy wyglądają i działają, a nie tylko próba przestrzegania pisemnego protokołu. Mamy nadzieję, że ten film da ci trochę tego uczucia.