Name: Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj czasowo-rozdzielczą analizę inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D z wykorzystaniem fluorescencyjnego obrazowania. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów inwazji w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom Temple Bioengineering za cenne dyskusje. Dziękujemy Davidowi Ambrose'owi z centrum cytometrii przepływowej (Lewis Katz School of Medicine) za pomoc w sortowaniu komórek i Tony'emu Boehmowi z IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) za pomoc w drukowaniu 3D. Dziękujemy również naszym zasobom finansowym: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 i R01 CA230777, wszystkie dla BG.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+The+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNoone%2C+A+%22SEER+Cancer+statistics+review+1975-2015%2C+based+on+November+2017+SEER+data+submission%22">SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission</a>. , (2019).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720(2011).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li>
<li>Tönisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li>
<li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116(2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135(2018).</li>
<li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li>
<li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarcello%2C+M+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and%22">Advances in Experimental Medicine and</a>. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wydrukowana w 3D przekładka została zaprojektowana do tworzenia arkuszy PDMS o grubości 1 mm, które można następnie wykorzystać do łatwego tworzenia różnych kształtów PDMS, zgodnie z wymaganiami aplikacji eksperymentalnych. Ze względu na prostotę wykonania i swobodę zmiany projektu, ta metoda odlewania PDMS została wybrana do wstępnego projektu SID. Jeśli wymagana jest duża ilość identyfikatorów SID, produkcja może być bardziej wydajna poprzez stworzenie formy wydrukowanej w 3D, która zawiera już dyski PDMS z trzema równ...

Podczas progresji nowotworu, komórki rakowe mogą uzyskać ruchliwy i inwazyjny fenotyp, co pozwala im uciec z masy guza i zaatakować otaczające tkanki1. W końcu te inwazyjne komórki rakowe mogą dotrzeć do narządów wtórnych i rosnąć w nich, w procesie zwanym przerzutami raka1. Przerzuty są przyczyną ponad 90% zgonów związanych z rakiem2. Jednym z powodów jest to, że chociaż zlokalizowane guzy są klinicznie możliwe do opanowania, nie istnieją skuteczne metody eliminacji inwazyjnych komórek rakowych po wystąpieniu przerzutów. Dlatego pojawienie się inwazyjnych komórek nowotworowych i przejście od choroby zlokalizowanej do inwazyjnej stanowi poważne wyzwanie kliniczne. Ustalenie, w jaki sposób komórki rakowe inicjują i utrzymują inwazyjne zachowanie, może prowadzić do opracowania nowych, silnych terapii.
Model sferoidalny 3D jest idealną platformą do badania ruchliwego zachowania komórek nowotworowych w kontrolowanych, ale fizjologicznie istotnych warunkach3. Rzeczywiście, w tym teście sferoidy komórek rakowych są osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), na przykład kolagen I, który naśladuje uproszczony guz. Następnie obrazowanie służy do wizualizacji inwazji komórek rakowych ze sferoidy do macierzy kolagenowej. Jednak wiele wyzwań ogranicza tę procedurę.
Pierwsze wyzwanie pojawia się na etapie osadzania, gdzie płynna matryca kolagenowa może rozprzestrzenić się po powierzchni naczynia, powodując dotknięcie sferoidy dna naczynia. W konsekwencji komórki sferoidy rozprzestrzeniały się na dwuwymiarowej (2D) powierzchni, łamiąc trójwymiarową (3D) morfologię sferoidów. Zwiększenie objętości kolagenu jest skutecznym, ale kosztownym rozwiązaniem. Aby zapobiec rozprzestrzenianiu się komórek na powierzchni 2D, przy jednoczesnym zachowaniu minimalnej objętości kolagenu, opracowaliśmy urządzenie do obrazowania sferoidalnego (SID), umieszczając wkładkę z polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 1 mm z 3 otworami na szklanym dnie.
Drugim wyzwaniem testu sferoidalnego jest znakowanie komórek rakowych w sferoidach, co jest ograniczone przez słabą penetrację przeciwciał i barwników fluorescencyjnych, efekt, który zwiększa się wraz z rozmiarem sferoidy. Podczas gdy idealnym rozwiązaniem do znakowania komórek jest ustanowienie linii komórkowych o stabilnej ekspresji białek fluorescencyjnych, opcja ta jest w większości ograniczona do unieśmiertelnionych linii komórkowych i jest ograniczona dostępnością fluorescencyjnych chimer białkowych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół barwienia immunofluorescencyjnego utrwalonych sferoid, a także efektywne wykorzystanie barwnika cytoplazmatycznego do znakowania komórek bezpośrednio przed osadzeniem sferoidy.
Trzecim wyzwaniem testu sferoidalnego jest brak prostych makr Fidżi do półautomatycznego oznaczania inwazji komórek w czasie. Aby sprostać temu wyzwaniu, opisujemy prostą metodologię analizy obszaru sferoidalnego w czasie. Zalety tego protokołu ilustrujemy na przykładach linii komórkowych 4T1 i 67NR.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Honeywell Fluka</td><td>60-014-44</td><td></td></tr><tr><td>10X Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>SH30028.LS</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368-9M</td><td></td></tr><tr><td>1X Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>T1048</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 falloidyna</td><td>Life Technologies</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antykortaktynowe</td><td>Abcam</td><td>ab33333</td><td>Rozcieńczenie od 1 do 200</td></tr><tr><td>Anti Przeciwciało E-kadheryny</td><td>Invitrogen</td><td>13-1900</td><td>Rozcieńczenie od 1 do 100</td></tr><tr><td>Roztwór atelokolagenu bydlęcego I (Nutragen)</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>501050ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX Dye</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>FisherBrand</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik</td><td>jednorazowy Zszywki</td><td></td><td>Kubki plastikowe</td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta transferowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>eBioscience</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882-100mL</td><td></td></tr><tr><td>barwnik jądrowy Hoescht</td><td>Thermo Fischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fischer</td><td>S25371A</td><td></td></tr><tr><td>MatTek naczynie (naczynie ze szklanym dnem)</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6385-100G</td><td></td></tr><tr><td>MiliQ woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gilson</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe, specyficzne dla</td><td></td><td></td><td></td>użytkownika</tr><tr><td>Rat Tail Collagen I</td><td>Corning</td><td>47747-218</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała wtórne, specyficzne dla</td><td></td><td></td><td></td>użytkownika</tr><tr><td>Slajdy</td><td>Globe Scientific</td><td>1354W-72</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonowa</td> taśma <td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10789704001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>655204-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3d

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Inwazja komórek rakowych z guza pierwotnego do sąsiednich zdrowych tkanek jest wczesnym etapem przerzutów. Inwazyjne komórki nowotworowe stanowią poważne wyzwanie kliniczne, ponieważ nie istnieje skuteczna metoda ich eliminacji po ich rozsiewaniu. Lepsze zrozumienie mechanizmów regulujących inwazję komórek nowotworowych może doprowadzić do opracowania nowych, silnych terapii. Ze względu na ich fizjologiczne podobieństwo do nowotworów, sferoidy osadzone w kolagenie I były szeroko wykorzystywane przez naukowców do badania mechanizmów rządzących inwazją komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Test ten jest jednak ograniczony przez (1) brak kontroli nad osadzaniem sferoid w ECM; (2) wysoki koszt naczyń z kolagenem I i szklanym dnem, (3) nierzetelne znakowanie immunofluorescencyjne ze względu na nieefektywną penetrację przeciwciał i barwników fluorescencyjnych oraz (4) czasochłonne przetwarzanie obrazu i kwantyfikacja danych. Aby sprostać tym wyzwaniom, zoptymalizowaliśmy trójwymiarowy (3D) protokół sferoidalny, aby obrazować fluorescencyjnie znakowane komórki rakowe osadzone w kolagenie I, za pomocą filmów poklatkowych lub obrazowania podłużnego, i analizować inwazję komórek rakowych. Po pierwsze, opisujemy wytwarzanie urządzenia do obrazowania sferoidalnego (SID) w celu niezawodnego osadzania sferoid w minimalnej objętości kolagenu I, zmniejszając koszt testu. Następnie nakreślamy etapy solidnego znakowania fluorescencyjnego żywych i stałych sferoid. Wreszcie, oferujemy łatwe w użyciu makro Fidżi do przetwarzania obrazu i kwantyfikacji danych. Podsumowując, ta prosta metodologia zapewnia niezawodną i niedrogą platformę do monitorowania inwazji komórek rakowych w kolagenie I. Co więcej, protokół ten można łatwo modyfikować w celu dopasowania do potrzeb użytkowników.

Ze względu na swoją biokompatybilność, PDMS jest szeroko stosowany do mikrofabrykacji studzienek ograniczających, stempli i form, co zrewolucjonizowało mikrowzorowanie oraz urządzenia mikrofluidyczne. W opisanej tutaj metodzie jest on wykorzystywany do tworzenia SIDs, czyli konfigurowalnych studzienek, które optymalizują proces osadzania i obrazowania sferoidów. Rycina 1 przedstawia główne komponenty wykorzystywane do wykonania SIDs. Aby odlać formę z PDMS, drukuje się w technologii 3D przek...

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Protokół ten może być wykorzystany do badania mechanizmów rządzących inwazją komórek nowotworowych do macierzy zewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona proste urządzenie do obrazowania sferoidów, co ułatwia konfigurację testu inwazji sferoidów oraz poprawia jego wydajność i koszt. Chociaż pokazujemy użycie testu inwazji sferoidalnej do modelowania raka sutka, ten test jest doskonałym modelem inwazji dowolnego guza litego do otaczającej zdrowej tkanki.Po wydrukowaniu 3D przekładki, odważ w plastikowym kubku polimer bazowy w stosunku 10:1 do środka sieciującego i użyj jednorazowej pipety, aby dokładnie wymieszać powstały roztwór PDMS w kubku. Umieść kubek w komorze próżniowej i szybko zwolnij podciśnienie, aby usunąć powietrze uwięzione na powierzchni mieszanki i rozproszyć pozostałe pęcherzyki powietrza. Inkubuj wydrukowaną w 3D przekładkę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zwiększyć jej elastyczność i wyczyść dwie szklane płytki 100% izopropanolem.Umieść przekładkę tak, aby znajdowała się równo między dwiema oczyszczonymi płytkami i umieść dwa duże spinki do segregatora na dolnej krawędzi i jeden na górnym rogu, aby uszczelnić formę na zewnętrznych krawędziach płyt. Sprawdź górną część formy, aby upewnić się, że przekładka jest równo ze szklanymi płytkami i użyj jednorazowej pipety z około dwoma centymetrami odciętymi od końcówki, aby powoli, ale w sposób ciągły dodawać mieszaninę PDMS do lewego górnego rogu formy. Po napełnieniu całej formy umieść ją w komorze próżniowej, aby usunąć wszelkie powstałe pęcherzyki powietrza, przed utwardzeniem PDMS przez godzinę w temperaturze 100 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji umieść formę w temperaturze pokojowej. Gdy jest chłodny w dotyku, usuń spinki do segregatora i szklane płytki z przekładki zawierającej utwardzony PDMS i użyj żyletki, aby przeciąć uszczelkę, która powstała ze wszystkich czterech stron formy między przekładką a szklaną płytką. Rozsuń formę, aby odsłonić arkusz PDMS w przekładce i użyj pęsety, aby ostrożnie oderwać arkusz PDMS od przekładki.Umieść arkusz na macie do cięcia i za pomocą stempla do biopsji wybij krążek PDMS o średnicy 17,5 milimetra, a następnie wybij trzy równomiernie rozmieszczone otwory o średnicy 5,5 milimetra w dysku. Użyj taśmy, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu z każdej wkładki i przyklej oczyszczone wkładki na kawałku taśmy dwustronnej. Owiń taśmę wokół pokrywy 10-centymetrowej szalki Petriego i umieść pokrywkę w maszynie plazmowej wraz z otwartymi naczyniami ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów.Aktywuj wkładki i szkło za pomocą jednej minuty obróbki plazmowej w temperaturze 300 militorów i użyj pęsety, aby szybko przymocować obrabianą stronę każdej wkładki do szklanej części jednego naczynia z dnem szkła poddanego obróbce na wkładkę. Po nałożeniu wszystkich wkładek użyj palca wskazującego i kciuka, aby równomiernie docisnąć każdą wkładkę, jednocześnie obracając naczynie, aby bezpiecznie przymocować wkładki do naczyń. Gdy wszystkie wkładki zostaną zabezpieczone, należy inkubować powstałe urządzenia do obrazowania sferoidalnego przez 20 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza, przed wykonaniem drugiej rundy obróbki plazmowej, jak pokazano.Po drugim zabiegu dodać 35 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu powlekającego do każdego otworu wkładki. Po godzinie w temperaturze pokojowej usuń roztwór powlekający i trzykrotnie spłucz urządzenie wodą destylowaną. Po ostatnim praniu dodaj 35 mikrolitrów roztworu sieciującego do każdego otworu na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji przepłukać urządzenie trzykrotnie wodą destylowaną, jak pokazano, przed napełnieniem każdego urządzenia 70% etanolem na 30-minutową inkubację w świetle UV. Pod koniec sterylizacji przepłucz urządzenia trzykrotnie wodą destylowaną i dodaj 2,5 mililitra roztworu do przechowywania do każdego urządzenia. Aby osadzić sferoidy w kolagenie, umyj urządzenia trzy razy trzema mililitrami PBS na pranie.Po ostatnim praniu pozostaw urządzenia do całkowitego wyschnięcia, a następnie dodaj jedną sferoidę w 30 mikrolitrach świeżo przygotowanego roztworu college one do jednego otworu wkładu i uruchom timer. Po potwierdzeniu obecności sferoidy w otworze, dodaj sferoidy do pozostałych dwóch otworów, jak pokazano. Użyj końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby wyśrodkować wszystkie sferoidy, które znajdują się blisko granicy PDMS, lub oddzielić sferoidy, jeśli dozowanych jest wiele sferoid i zatrzymać stoper.Aby wyśrodkować sferoidę w pionie w warstwie kolagenu, po wysianiu odwróć urządzenie do góry nogami i inkubuj urządzenie pod kątem 37 stopni, aż kolagen spolimeryzuje, odwracając orientację urządzenia co dwie minuty przez łącznie 30 minut, a następnie dodaj 2,5 mililitra pożywki na urządzenie i uzyskaj obraz sferoid w punkcie czasowym godziny zero. Korzystanie z urządzenia do obrazowania sferoidalnego ułatwia efektywne osadzanie i rejestrowanie poklatkowe inwazji komórek rakowych w kolagenie lub poprzez obrazowanie podłużne. Podczas gdy sferoida ta była obrazowana podłużnie w ciągu sześciu dni, co wymagało stabilnej ekspresji cytoplazmatycznych i/lub jądrowych białek fluorescencyjnych, podobne obrazowanie podłużne można przeprowadzić w krótszym okresie czasu przy użyciu znakowania barwnikiem.Sferoidy mogą być również utrwalone i znakowane immunologicznie. Na przykład te sferoidy były znakowane immunologicznie dla nabłonkowej kadheryny, kortaktyny i F-aktyny. Na tych obrazach można zaobserwować krok po kroku ilustrację procedury przetwarzania obrazu przy użyciu makra Fidżi do pomiaru obszaru sferoidy w czasie.Należy pamiętać o umieszczeniu pojedynczej sferoidy w każdym otworze urządzenia do obrazowania sferoidy i umieszczeniu sferoidy na środku otworu zarówno w kierunku XY, jak i Z. Konstrukcję urządzenia można łatwo zmodyfikować, zmieniając rozmiar i rozmieszczenie otworów, wkładek i naczyń ze szklanym dnem, aby dostosować się do większej przepustowości sferoidalnej.

time-resolved-fluorescence-imaging-analysis-cancer-cell-invasion-3d

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Wpływ inhibitorów migracji na migrację komórek raka glejaka w trójwymiarowych (3D) testach inwazji z użyciem inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) charakteryzuje się mikroskopią konfokalną o wysokiej rozdzielczości.

Charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Poznaj czasowo-rozdzielczą analizę inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D z wykorzystaniem fluorescencyjnego obrazowania. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów inwazji w czasie rzeczywistym.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Przeglądaj więcej filmów