Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Protokół ten może być wykorzystany do badania mechanizmów rządzących inwazją komórek nowotworowych do macierzy zewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona proste urządzenie do obrazowania sferoidów, co ułatwia konfigurację testu inwazji sferoidów oraz poprawia jego wydajność i koszt. Chociaż pokazujemy użycie testu inwazji sferoidalnej do modelowania raka sutka, ten test jest doskonałym modelem inwazji dowolnego guza litego do otaczającej zdrowej tkanki.

Po wydrukowaniu 3D przekładki, odważ w plastikowym kubku polimer bazowy w stosunku 10:1 do środka sieciującego i użyj jednorazowej pipety, aby dokładnie wymieszać powstały roztwór PDMS w kubku. Umieść kubek w komorze próżniowej i szybko zwolnij podciśnienie, aby usunąć powietrze uwięzione na powierzchni mieszanki i rozproszyć pozostałe pęcherzyki powietrza. Inkubuj wydrukowaną w 3D przekładkę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zwiększyć jej elastyczność i wyczyść dwie szklane płytki 100% izopropanolem.

Umieść przekładkę tak, aby znajdowała się równo między dwiema oczyszczonymi płytkami i umieść dwa duże spinki do segregatora na dolnej krawędzi i jeden na górnym rogu, aby uszczelnić formę na zewnętrznych krawędziach płyt. Sprawdź górną część formy, aby upewnić się, że przekładka jest równo ze szklanymi płytkami i użyj jednorazowej pipety z około dwoma centymetrami odciętymi od końcówki, aby powoli, ale w sposób ciągły dodawać mieszaninę PDMS do lewego górnego rogu formy. Po napełnieniu całej formy umieść ją w komorze próżniowej, aby usunąć wszelkie powstałe pęcherzyki powietrza, przed utwardzeniem PDMS przez godzinę w temperaturze 100 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji umieść formę w temperaturze pokojowej. Gdy jest chłodny w dotyku, usuń spinki do segregatora i szklane płytki z przekładki zawierającej utwardzony PDMS i użyj żyletki, aby przeciąć uszczelkę, która powstała ze wszystkich czterech stron formy między przekładką a szklaną płytką. Rozsuń formę, aby odsłonić arkusz PDMS w przekładce i użyj pęsety, aby ostrożnie oderwać arkusz PDMS od przekładki.

Umieść arkusz na macie do cięcia i za pomocą stempla do biopsji wybij krążek PDMS o średnicy 17,5 milimetra, a następnie wybij trzy równomiernie rozmieszczone otwory o średnicy 5,5 milimetra w dysku. Użyj taśmy, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu z każdej wkładki i przyklej oczyszczone wkładki na kawałku taśmy dwustronnej. Owiń taśmę wokół pokrywy 10-centymetrowej szalki Petriego i umieść pokrywkę w maszynie plazmowej wraz z otwartymi naczyniami ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów.

Aktywuj wkładki i szkło za pomocą jednej minuty obróbki plazmowej w temperaturze 300 militorów i użyj pęsety, aby szybko przymocować obrabianą stronę każdej wkładki do szklanej części jednego naczynia z dnem szkła poddanego obróbce na wkładkę. Po nałożeniu wszystkich wkładek użyj palca wskazującego i kciuka, aby równomiernie docisnąć każdą wkładkę, jednocześnie obracając naczynie, aby bezpiecznie przymocować wkładki do naczyń. Gdy wszystkie wkładki zostaną zabezpieczone, należy inkubować powstałe urządzenia do obrazowania sferoidalnego przez 20 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza, przed wykonaniem drugiej rundy obróbki plazmowej, jak pokazano.

Po drugim zabiegu dodać 35 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu powlekającego do każdego otworu wkładki. Po godzinie w temperaturze pokojowej usuń roztwór powlekający i trzykrotnie spłucz urządzenie wodą destylowaną. Po ostatnim praniu dodaj 35 mikrolitrów roztworu sieciującego do każdego otworu na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji przepłukać urządzenie trzykrotnie wodą destylowaną, jak pokazano, przed napełnieniem każdego urządzenia 70% etanolem na 30-minutową inkubację w świetle UV. Pod koniec sterylizacji przepłucz urządzenia trzykrotnie wodą destylowaną i dodaj 2,5 mililitra roztworu do przechowywania do każdego urządzenia. Aby osadzić sferoidy w kolagenie, umyj urządzenia trzy razy trzema mililitrami PBS na pranie.

Po ostatnim praniu pozostaw urządzenia do całkowitego wyschnięcia, a następnie dodaj jedną sferoidę w 30 mikrolitrach świeżo przygotowanego roztworu college one do jednego otworu wkładu i uruchom timer. Po potwierdzeniu obecności sferoidy w otworze, dodaj sferoidy do pozostałych dwóch otworów, jak pokazano. Użyj końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby wyśrodkować wszystkie sferoidy, które znajdują się blisko granicy PDMS, lub oddzielić sferoidy, jeśli dozowanych jest wiele sferoid i zatrzymać stoper.

Aby wyśrodkować sferoidę w pionie w warstwie kolagenu, po wysianiu odwróć urządzenie do góry nogami i inkubuj urządzenie pod kątem 37 stopni, aż kolagen spolimeryzuje, odwracając orientację urządzenia co dwie minuty przez łącznie 30 minut, a następnie dodaj 2,5 mililitra pożywki na urządzenie i uzyskaj obraz sferoid w punkcie czasowym godziny zero. Korzystanie z urządzenia do obrazowania sferoidalnego ułatwia efektywne osadzanie i rejestrowanie poklatkowe inwazji komórek rakowych w kolagenie lub poprzez obrazowanie podłużne. Podczas gdy sferoida ta była obrazowana podłużnie w ciągu sześciu dni, co wymagało stabilnej ekspresji cytoplazmatycznych i/lub jądrowych białek fluorescencyjnych, podobne obrazowanie podłużne można przeprowadzić w krótszym okresie czasu przy użyciu znakowania barwnikiem.

Sferoidy mogą być również utrwalone i znakowane immunologicznie. Na przykład te sferoidy były znakowane immunologicznie dla nabłonkowej kadheryny, kortaktyny i F-aktyny. Na tych obrazach można zaobserwować krok po kroku ilustrację procedury przetwarzania obrazu przy użyciu makra Fidżi do pomiaru obszaru sferoidy w czasie.

Należy pamiętać o umieszczeniu pojedynczej sferoidy w każdym otworze urządzenia do obrazowania sferoidy i umieszczeniu sferoidy na środku otworu zarówno w kierunku XY, jak i Z. Konstrukcję urządzenia można łatwo zmodyfikować, zmieniając rozmiar i rozmieszczenie otworów, wkładek i naczyń ze szklanym dnem, aby dostosować się do większej przepustowości sferoidalnej.