Name: Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj budowę wszechstronnego systemu oświetlenia LED do eksperymentów optogenetycznych z kontrolą ekspresji genów światłem czerwonym i dalekoczerwonym. Protokół obejmuje montaż obwodu elektrycznego, programowanie mikrokontrolera i testowanie z konstruktami reporterowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang i Molly Allen za testowanie różnych wersji systemu LED w trakcie jego rozwoju. Praca ta była wspierana przez Kavli Institute for Brain and Mind na UC San Diego i Salk Institute, National Science Foundation za pośrednictwem NSF Center for Science of Information w ramach grantu CCF-0939370, NIH Grant NS060847 i NIH Grant R21DC018237.

<ol><li>Klewer, L., Wu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+dimerization+approaches+to+control+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+-+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Light-induced dimerization approaches to control cellular processes.</a> Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).</li>
<li>Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+optobiology+in+intact+cells+and+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).</li>
<li>Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-controlled+mammalian+cells+and+their+therapeutic+applications+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology.</a> Advanced Science. 6 (1), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 1800952(2019).</li>
<li>Kyriakakis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+orthogonal+molecules+using+ferredoxin+and+ferredoxin-NADP%2B+reductase+systems+enables+genetically+encoded+PhyB+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (2), electronic resource 706-717 (2018).</li>
<li>Allen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AND-gated+drug+and+photoactivatable+Cre-loxP+system+for+spatiotemporal+control+in+cell-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (10), electronic resource 2359-2371 (2019).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+light-controllable+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Science Advances. 6 (8), (2020).</li>
<li>Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptochrome%2C+phytochrome%2C+and+anthocyanin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production.</a> Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).</li>
<li>Hernández-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+cryptochrome+2+%28CRY2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2).</a> Methods. 164-165, 81-90 (2019).</li>
<li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li>
<li>Repina, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+illumination+devices+for+optogenetic+control+of+cellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics.</a> Cell Reports. 31 (10), 107737(2020).</li>
<li>Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gene+expression+using+a+red-+and+far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch.</a> Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).</li>
<li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, 35363(2016).</li>
<li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nature Communications. 4, 1779(2013).</li>
<li>Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-triggered+protein+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A light-triggered protein secretion system.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Zhou, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-chain+photoswitchable+CRISPR-Cas9+architecture+for+light-inducible+gene+editing+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).</li>
<li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).</li>
<li>Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+pairs+of+distinct+photoswitches+for+optogenetic+control+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins.</a> Nature Communications. 6, 6256(2015).</li>
<li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-stable+neural+state+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bi-stable neural state switches.</a> Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).</li>
<li>Gong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-sensitive+step-function+opsin+for+minimally+invasive+optogenetic+stimulation+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques.</a> Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).</li>
<li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+second-generation+CRY2-CIB+dimerizers+and+photoactivatable+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Müller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red%2Ffar-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch+to+control+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 77(2013).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li>
<li>Levskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+engineering+Escherichia+coli+to+see+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light.</a> Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).</li>
<li>Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+phytochrome-based+optogenetic+system+controllable+with+near-infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light.</a> Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).</li>
<li>Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+optogenetic+pair+for+protein+regulation+and+spectral+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing.</a> Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).</li>
<li>Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+E.+coli+near-infrared+light+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering an E. coli near-infrared light sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), electronic resource 240-248 (2018).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+with+a+photocleavable+protein%2C+PhoCl%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl.</a> Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+precise+labeling+and+control+of+neuromodulatory+circuits+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain.</a> Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).</li>
<li>Kim, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-gated+detection+of+protein-protein+interactions+with+transcriptional+readout%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout.</a> eLife. 6, (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj system LED został wykorzystany w naszym laboratorium do optymalizacji, scharakteryzowania i pracy z kilkoma narzędziami optogenetycznymi. W Kyriakakis et al.4 przetestowaliśmy wiele kombinacji przełączników genów PhyB-PIF równolegle. Następnie wykorzystaliśmy ten system do przetestowania impulsów światła o różnych częstotliwościach, aby zmierzyć kinetykę przełącznika genowego i efektywne natężenie światła. System ten został również wykorzystany do optymalizacji i scharakteryzowania dwóch systemów optogenetycznych, które wykorzystują światło niebieskie do stymulacji 5,6. Ponieważ tylko jedna dioda LED musiała być wystarczająco jasna, aby aktywować większość narzędzi optogenetycznych, zakup systemu z dużą liczbą diod LED nad każdą studzienką nie zawsze jest konieczny. Ta konfiguracja jest niedroga, niezawodna, łatwa do rekonfiguracji i nie wymaga wcześniejszej wiedzy elektrycznej, aby postępować zgodnie z protokołem montażu.
Na dodatkowych rysunkach uzupełniających 31–38 opisano, w jaki sposób można włączyć do systemu maksymalnie cztery diody LED. Chociaż może to ograniczyć niektóre eksperymenty wymagające dużej liczby warunków równoległych, można dodać więcej diod LED, zastępując zasilacz 9 V używany w tym protokole zasilaczem o wyższej mocy. Podobnie, kilka diod LED o mniejszej mocy można podłączyć równolegle do każdego obwodu. W tym ostatnim układzie niektóre diody LED nie będą sterowane indywidualnie, ale może to być przydatne, gdy wiele diod LED jest wymaganych do pokrycia większego obszaru. Po zapoznaniu się z elektroniką tego systemu istnieje wiele sposobów na jego dostosowanie. Dodatkowe strategie dostosowywania systemu obejmują umieszczenie diody LED dalej lub bliżej próbki i oświetlenie przez filtry/dyfuzory w celu uzyskania jednorodnych warunków oświetlenia lub zapobieżenia nagrzewaniu, jak w (rysunek uzupełniający 23) i Allen i wsp.5. Inną godną uwagi cechą naszej konstrukcji LED jest to, że jest ona pokryta żywicą epoksydową i ma zapięcie dotykowe z tyłu; pozwala to na bezpieczne umieszczenie diody LED praktycznie wszędzie: w inkubatorach, akwariach, klatkach dla zwierząt, ścianach itp.
Wiele eksperymentów, które wykorzystują optogenetykę do kontrolowania genów, szlaków sygnałowych i innej aktywności komórkowej, często wymaga pulsowania, obejmuje duże skale czasowe lub musi być przeprowadzanych w inkubatorze, co wymaga automatyzacji lub zdalnej manipulacji bez mikroskopu. Ten system LED był testowany nieprzerwanie przez kilka miesięcy w nawilżanym inkubatorze CO2 bez żadnych problemów. Dodatkowo, w przypadku systemów odwracalnych, takich jak systemy optogenetyczne PhyB, eksperymentator może być zmuszony do zaprogramowania specyficznych harmonogramów oświetlenia pulsacyjnego. W naszej poprzedniej pracy4 użyliśmy programów pulsujących do przetestowania dynamiki odwracalności przełącznika PhyB-PIF3 w komórkach ssaków za pośrednictwem interfejsu użytkownika. Korzystając z metodologii opisanej w tym manuskrypcie, programowanie protokołu pulsacyjnego jest łatwe, zapewniając elastyczność i autonomię potrzebną do wielu rodzajów eksperymentów optogenetycznych w sposób przyjazny dla użytkownika.
Najbardziej krytycznymi krokami w budowie tego systemu jest złożenie obwodu elektrycznego na płytce PCB i podłączenie komponentów, które są szczegółowo opisane w sekcji 1 i sekcji 2. Konieczne jest uważne wykonanie każdego kroku w tych sekcjach i dwukrotne sprawdzenie numerów otworków linia po linii przed każdego elementu. W sekcji 2 wyjaśniono, jak skonfigurować komponenty, które zostaną podłączone do obwodu. Aby komponenty łączyły się we właściwej orientacji, szczególnie ważne jest, aby upewnić się, że kolory czarnego i czerwonego przewodu na złączach przewód-przewód są zgodne. Drobne niedopatrzenia w tych dwóch sekcjach z dużym prawdopodobieństwem wpłyną na funkcjonalność systemu. Rzeczywiście, pierwszym krokiem w rozwiązywaniu problemów z tą metodą będzie sprawdzenie, czy obwód został zbudowany poprawnie i czy wszystkie połączenia są na swoim miejscu. Po drugie, szczególnie ważne jest sprawdzenie jakości pod kątem luźnych połączeń oraz przewodów pod kątem rozszerzających się drutów, które mogą powodować zwarcie w obwodzie. Trzecim krokiem byłoby upewnienie się, że diody LED działają poprawnie, co można zrobić za pomocą zasilacza lub akumulatora 1,5 V, przypinając dwa zaciski diody LED za pomocą zacisków krokodylkowych. Inną potencjalnie krytyczną kwestią jest zapobieganie nagrzewaniu się (w przypadku korzystania z diod LED o dużej mocy) lub rozpraszaniu światła w celu uzyskania szerszego oświetlenia. Aby rozwiązać te problemy, diody LED można zamontować na zewnątrz czarnej skrzynki z "folią prywatności" wewnątrz, jak opisano na rysunku uzupełniającym 23 i Allen et al.5. Ze względu na prostotę tego systemu, rozebranie go na części w celu weryfikacji, modyfikacji, modernizacji lub naprawy komponentów modułowych nie jest trudne.
Innym krytycznym czynnikiem dla indukowalnych systemów genowych jest rozważenie, ile aktywacji jest wymagane lub jak duża nieszczelność jest akceptowalna dla kontrolowanego systemu biologicznego. Jak pokazano na rycinie 6, mogą się one różnić w zależności od ilości reporterowego DNA. Ponadto wydajność transfekcji, a tym samym liczba kopii konstruktów reporterowych w każdej komórce, będzie się różnić. W przypadku niektórych eksperymentów korzystne może być stworzenie linii komórkowej ze stałą ilością składników reporterowych lub przełączników genów PhyB i badanie przesiewowe klonów o pożądanym zakresie indukowanej ekspresji, jak to jest powszechnie robione w przypadku systemów indukowanych przez leki. Ze względu na wielkość i niestabilność plazmidu lentiwirusowego pPK-2304, wykonaliśmy również nielentiwirusowe wersje plazmidu przełącznika PhyB w szkielecie pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) i pPK-352 (Addgene #157922).
Budując ten system oświetlenia LED zgodnie z tym protokołem, użytkownicy mają wszystkie komponenty niezbędne do przeprowadzenia szerokiej gamy eksperymentów optogenetycznych in vitro i in vivo. W połączeniu z instrukcjami dotyczącymi stosowania PhyB-PIF3 w komórkach ssaków, protokół ten pozwoli osobom niebędącym inżynierami i biologom na elastyczne i skuteczne wykorzystanie optogenetyki opartej na PhyB w różnych kontekstach.

Narzędzia optogenetyczne stają się wszechobecne, a nowe technologie są stale rozwijane do optycznej kontroli procesów biologicznych, takich jak ekspresja genów, sygnalizacja komórkowa i wiele innych1,2,3. Zdolność do kontrolowania procesów komórkowych za pomocą światła pozwala na szybką kinetykę, ścisłą kontrolę przestrzenną i regulację zależną od dawki, którą można kontrolować za pomocą natężenia światła i czasu ekspozycji. Aby korzystać z tych narzędzi, niezbędne jest urządzenie do kontrolowania tych parametrów. Niedawno opracowaliśmy genetycznie kodowany przełącznik genów ssaków PhyB-PIF3, który odwracalnie aktywuje i dezaktywuje geny za pomocą odpowiednio światła czerwonego/dalekiej czerwieni4. System ten został przetestowany na kilku liniach komórkowych ssaków i umożliwił niezrównaną indukcję ekspresji genów nawet przy bardzo małych ilościach światła, w tym impulsach światła. Naukowcy, którzy chcą korzystać z przełącznika PhyB i podobnych narzędzi5,6 często proszą o informacje na temat metod kontrolowania intensywności i czasu trwania oświetlenia. Dlatego opracowaliśmy ten protokół z instrukcjami krok po kroku, aby umożliwić szersze zastosowanie tych narzędzi w optogenetyce.
Przed powszechnym zastosowaniem diod LED, szerokopasmowe źródła światła z filtrami były używane do badania białek reagujących na światło, takich jak fitochromy7. Ostatnio opublikowano niektóre systemy oświetlenia LED wraz z narzędziami optogenetycznymi8,9,10,11,12, ale te protokoły mogą wymagać znacznej wiedzy specjalistycznej w zakresie elektroniki/oprogramowania, wymagają specjalistycznego sprzętu (np. drukarek 3D, maszyn do cięcia laserowego lub fotomasek) lub nie zawierają instrukcji krok po kroku Naukowcy musieliby rozmieścić swoje potrzeby badawcze. Chociaż niezależna kontrola poszczególnych studzienek w płytce wielodołkowej może być przydatna, często nie jest konieczna, gdy badacze muszą porównać tylko kilka różnych próbek w świetle jasnym i ciemnym lub czerwonym lub w świetle dalekiej czerwieni. Ponadto wiele istniejących systemów komercyjnych jest drogich, z ograniczonymi możliwościami dostosowywania. Jednak diody LED opisane w tym protokole są ekonomiczne, jasne i można je montować na wiele sposobów; Dzięki temu mogą być używane do oświetlania kilku różnych rodzajów próbek. Dzięki dostarczonemu protokołowi i oprogramowaniu, diody LED od ultrafioletu (UV) do NIR mogą być używane i kontrolowane za pomocą oprogramowania do przeprowadzania eksperymentów optogenetycznych przy użyciu UVR813,14, Dronpa15,16, domeny LOV17,18, funkcja krokowa Opsins19,20, CRY221,22, PhyB4,23,24,25, fitochromy bakteryjne26,27,28,29 i inne systemy reagujące na światło30,31,32.
Ten protokół stanowi samouczek do montażu obwodów i innego sprzętu potrzebnego do kontrolowania różnych parametrów stymulacji światłem, a także narzędzi molekularnych/komórkowych do przeprowadzenia eksperymentu optogenetycznego. Ponadto zgłaszamy plazmidy zoptymalizowane przez Kyriakakis et al.4, które są mniejsze i bardziej stabilne do klonowania. Dzięki temu protokołowi biolodzy bez doświadczenia w elektronice i optyce mogą budować systemy oświetleniowe, które są elastyczne i wytrzymałe. Krok po kroku pokazujemy, jak budować systemy LED, usuwając techniczne wąskie gardło dla szerszego zastosowania narzędzi optogenetycznych. System ten może być z łatwością stosowany w większości inkubatorów do hodowli komórkowych, nawet jeśli nie zawierają one portów przewodowych. Na przykład przez ponad 6 miesięcy trzymaliśmy system LED w nawilżonym inkubatorze CO2 bez spadku wydajności. Wyjaśniamy również, jak podłączyć system LED do komputera i połączyć go z oprogramowaniem typu open source, które udostępniamy na GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Budowanie systemu przy użyciu tego protokołu zapewnia badaczom podstawową wiedzę do debugowania potencjalnych problemów, wymiany części oraz ulepszania/rozszerzania funkcjonalności.
Przegląd systemu
Budowa systemu oświetlenia obejmuje (1) zbudowanie obwodu elektronicznego, (2) zbudowanie urządzeń peryferyjnych (przewód zasilający, wyłącznik zasilania, itp.), (3) zbudowanie diod LED, (4) montaż wszystkich tych komponentów i (5) zainstalowanie oprogramowania do sterowania diodami LED za pomocą interfejsu użytkownika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Po zakończeniu system oświetlenia może sterować maksymalnie czterema diodami LED niezależnie za pomocą interfejsu użytkownika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Interfejs użytkownika umożliwia każdej diodzie LED pulsowanie w określonych odstępach czasu i wyłączanie po określonym czasie. Istnieje również opóźnienie startu, aby rozpocząć programy oświetlenia o określonej godzinie. Potencjometry (POT) regulują intensywność każdej diody LED niezależnie lub mogą być używane do ręcznego sterowania diodami LED bez komputera. Przewody do diod LED mogą mieć dowolną niestandardową długość, co pozwala na łatwe umieszczenie ich w inkubatorze lub laboratorium. Ze względu na dużą moc tych diod LED można je wykorzystać do oświetlenia dużego obszaru za pomocą pojedynczej diody LED z dużej odległości.
Opis sterownika LED
Aby zasilić i kontrolować intensywność diod LED, ten protokół przejdzie przez kolejne kroki w celu zbudowania "sterownika LED". Każda dioda LED ma zakres napięć, w których pracuje (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Podczas pracy napięcie wyjściowe regulatora, które steruje natężeniem światła, można dostroić za pomocą potencjometru. POT zmienia rezystancję, dostosowując napięcie wyjściowe / jasność. Strojenie za pomocą POT 1kΩ (1 kiloom) daje to, co nazywamy "obwodem wysokiego napięcia" i ma zakres od 1,35 V do 2,9 V. Ponieważ 2,9 V jest zbyt wysokie do obsługi diod LED o niższym napięciu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C), pokazujemy pojedynczą modyfikację (Rezystor 3 lub "R3" Rysunek uzupełniający 1A), która ogranicza zakres do dopasowania do niskonapięciowych diod LED. R3 służy do obniżenia maksymalnego napięcia przyłożonego do diod LED do 1,85 V (montaż szczegółowo opisany na rysunku uzupełniającym 8), gdy są one równoległe do potencjometru. Wykorzystując napięcie do sterowania jasnością zamiast prądu, system jest bardziej elastyczny w przypadku diod LED o różnych napięciach roboczych. Rysunek 1C zawiera listę diod LED wysokiego i niskiego napięcia, które pomogą w wyborze optymalnego obwodu. Taka konstrukcja utrzymuje minimalne napięcie na tyle niskie, że dioda LED jest całkowicie wyłączona, gdy potencjometr jest wyłączony i nie pozwala, aby napięcie przekroczyło typowe napięcie robocze diody LED. Do optogenetyki PhyB używamy diod LED w kolorze głębokiej czerwieni i dalekiej czerwieni, które wykorzystują obwód niskiego napięcia.
Opis systemu sterowania komputerowego LED
System oświetlenia LED może być używany do stałego oświetlenia bez komputera czy mikrokontrolera. Jednak do programów pulsacyjnych i do sterowania indywidualnym czasem diody LED musi być zainstalowany mikrokontroler. Aby użyć mikrokontrolera do sterowania diodami LED, wymagany jest tranzystor do podłączenia mikrokontrolera do obwodu. Tranzystor ten wyczuwa napięcie z mikrokontrolera i przełącza się z przewodzącego lub izolującego. Do sterowania włączaniem i wyłączaniem używamy tak zwanego "tranzystora przełączającego NPN" (2N22222) jako sterowanego bocznika w poprzek R2 (rysunek uzupełniający 1A). Gdy napięcie z mikrokontrolera zostanie przyłożone do bazy tranzystora, tranzystor staje się przewodzący i sprawia, że napięcie LED jest niskie, wyłączając diodę LED. W ten sposób stany włączenia i wyłączenia diody LED i tranzystora są bezpośrednio kontrolowane przez mikrokontroler, który jest sterowany przez oprogramowanie zainstalowane na komputerze.
Do stworzenia systemu oświetlenia wymagane są następujące kroki: Zbuduj obwód elektryczny; zbuduj zasilanie, ręczny wyłącznik zasilania, POTy i połączenie mikrokontrolera; zbuduj diody LED; pomieścisz czarną skrzynkę, aby pasowała do systemu oświetlenia; podłącz wszystkie okablowanie i urządzenia; zainstaluj oprogramowanie sterujące LED, stymuluj komórki światłem; zmierz ekspresję genów za pomocą podwójnego testu lucyferazy.

<table><tbody><tr><td>18AWG 2pin CZERWONY przewód</td><td>Amazon</td><td>15M-28AWG-2468</td><td>Niedrogi przewód do podłączenia diod LED do obwodu zasilania. https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Potencjometr 1K Ohm</td><td>Amazon</td><td>52161500</td><td>potencjometr potencjometru 2 x 1K Ohm + 2 x czarne pokrętło sterujące. https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Silikonowe złącze JST o grubości 20</td><td></td> Amazon <td>SIM & NAT 5,9 cala 2-pinowe męskie żeńskie złącza wtykowe JST RCY</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>22 AWG solidne przewody połączeniowe</td><td>Amazon</td><td>WJW-60B-R</td><td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Zestaw zworek przewodów 350 każdy 22 AWG, 14 długości 10 kolorów 25 każdej długości. https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>560 omów 1/2 wata 1% tolerancji Amazon</td><td></td><td>a14051600ux0301</td><td>Uxcell a14051600ux0301 60-częściowy przewód osiowy 1% tolerancji Kolorowy pierścień Rezystor z folii metalowej Rezystancja, 560 Ohm 1 / 2W. https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td></tr><tr><td>820 ohm 1/2watt 1% tolerancji</td><td>Amazon</td><td>TTL-A-8035-50Ea</td><td>Zestaw rezystora metalowego 50Ea 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td></tr><tr><td>męski na B męski (10 stóp)</td><td>Amazon</td><td>Część # 30-001-10B</td><td>dołączony do Arduino nie mieści się dobrze w pudełku. https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Ardiuino UNO odpowiednik</td><td>Amazon</td><td>Elegoo EL-CB-001</td><td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 z USB do Arduino. https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Uchwyt Arduino</td><td>Digikey</td><td>X000018</td><td>Pasuje bardzo ciasno. https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td></tr><tr><td>Czarne skrzynki do obwodów i komór świetlnych</td><td>Amazon</td><td>1591ESBK</td><td>Hammond 1591ESBK ABS Project Box. https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Niebieska dioda LED</td><td>Digikey</td><td>LXML-PB01-0040</td><td>LED LUXEON REBEL NIEBIESKI SMD. Używa "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td></tr><tr><td>Opaski kablowe</td><td>Amazon</td><td>sd027</td><td>Tarvol Nylonowe opaski zaciskowe (zestaw 100 sztuk) 8 cali z samoblokującymi się opaskami kablowymi (biały). </td></tr><tr><td>Klipsy do lodówki https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch Command</td><td>Amazon</td><td>17210CLR</td><td>Klipsy do przytrzymywania płytki drukowanej wewnątrz czarnej skrzynki. Można również użyć listew sterujących. https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Cyan LED</td><td>Digikey</td><td>LXML-PE01-0070</td><td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Wykorzystuje taśmę izolacyjną "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td></tr><tr><td>- 3M Scotch #35 Taśma izolacyjna Value Pack</td><td>Amazon</td><td>03429NA</td><td>Taśma izolacyjna Scotch 700, 03429NA, 3/4 cala x 66 ft. https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td></tr><tr><td>Dalred LED 720nm</td><td>Luxeon Star LED</td><td>LXML-PF01</td><td>Daleka czerwień (720nm) LUXEON Rebel LED. Wykorzystuje "Saber 20 mm Star base" https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td></tr><tr><td>Farred LED 740nm</td><td>Ushio</td><td>EDC740D-1100-S5</td><td>Wykorzystuje "STAR XP 3535" podstawa https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td></tr><tr><td>Farred LED 780nm</td><td>Ushio</td><td>EDC780D-1100</td><td>Wykorzystuje "STAR XP 3535" podstawa http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td></tr><tr><td>Farred LED 810nm</td><td>Ushio</td><td>EDC810D-1100</td><td>Wykorzystuje "STAR XP 3535" podstawa http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td></tr><tr><td>Farred LED 850nm</td><td>Ushio</td><td>EDC850D-1100</td><td>Wykorzystuje przelotki "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>Pico 6120D</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td></tr><tr><td>Klipsy do włosów/aligatora</td><td>Amazon</td><td></td><td>1-3/4 cala (45 mm) - spinki do włosów Jednobolcowe metalowe klipsy krokodylkowe Akcesoria do łuków do włosów -Srebrne, 50 szt. https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Podstawa LED</td><td>Luxeon Star Diody LED</td><td>LXB-RS20A</td><td>Saber 20 mm Star Blank Aluminiowa podstawa MCPCB do diod LED Rebel https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td></tr><tr><td>LED PCB dla diod LED</td> <td>UshioRozwiązania Adura LED</td><td>Pakiet LED STAR XP 3535</td><td>Pasuje do wielu innych diod LED firmy Ushio http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td></tr><tr><td>Loctite Epoxy Clear Wielofunkcyjna, 0,85-uncjowa strzykawka</td><td>Amazon</td><td>1943587</td><td>Loctite Epoxy Clear Wielofunkcyjna, 0,85 uncji płynu. https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td></tr><tr><td>NTE Heat Shrink 2: 1 Różne kolory i rozmiary 160 sztuk</td><td>Amazon</td><td>B000FIDTYG</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Wiszące paski na rzepy</td><td>Amazon</td><td>PH204-16NA</td><td>Dzięki nim możesz zawiesić diody LED w wielu miejscach. https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Amazon</td><td>tb013</td><td>Każda inna przetwornica AC/DC 9V 1.5Z wystarczy, ponieważ i tak odcinamy koniec. https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Przełącznik zasilania Przełącznik kołyskowy</td><td>Amazon</td><td>SIXQJZML</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011</td></tr><tr><td>Łączniki prostokątne - do przewodów zaciskanych</td><td>Digikey</td><td>2183-1905-ND</td><td>6 Łączniki prostokątne - Obudowy Czarne 0,100" (2,54mm) https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td></tr><tr><td>Czerwona dioda LED</td><td>Digikey</td><td>LXM3-PD01</td><td>LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Wykorzystuje papier ścierny "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td></tr><tr>Papier<td>ścierny</td><td>Amazon</td><td>B002NEV6GS</td><td>3M Wetordry, 03022, ziarnistość 800, 3 2/3 cala x 9 cali. https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1</td></tr><tr><td>Lut do drutów i elementów obwodów</td><td>Amazon</td><td>Mudder Bezołowiowy drut lutowniczy Sn99 Ag0,3 Cu0,7 z rdzeniem kalafoniowym do elektrycznego 0,22 funta (0,6 mm)</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td></tr><tr><td>Płytka stykowa do do budowy obwodu</td><td>Amazon</td><td>GK1007</td><td>Gikfun Płytka prototypowa do Pozłacane wykończenie Proto Board PCB DIY Kit dla Arduino (zestaw 5 sztuk) GK1007. https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Wiertło łopatkowe</td><td>Amazon</td><td>Irwin 88811</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit</td></tr><tr><td>Tranzystor</td><td>Newark</td><td>2N2222A</td><td>Można kupić w wielu miejscach. http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td></tr><tr><td>Regulator napięcia</td><td>Newark</td><td>LM317T</td><td>Odpowiednik NTE956. https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|dopasowanie|p|slid||produkt||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|& s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!! g!! LM317T& CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td></tr><tr><td>Tablet z systemem Windows 10</td><td>Amazon</td><td>B08BYTT79Y</td><td>Każdy komputer z systemem Windows 10 zrobi.<br/</td></tr><tr><td>> https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1Cell Culture Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzka nerka embrionalna 293 komórki HEK293</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1573</td><td>Common Cell line. https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher</td><td>26140079</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele ich odpowiedników. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td></tr><tr><td>Dulbecco" s Zmodyfikowany Eagle Średnio-Wysoki Poziom Glukozy</td><td>ThermoFisher</td><td>11965&minus; 092</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele ich odpowiedników. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118</td></tr><tr><td>10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 &mikro; g/ml streptomycyny</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele ich odpowiedników. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td></tr><tr><td>White Corning 96-dołkowe stałe czarne lub białe mikropłytki polistyrenowe</td><td>ThermoFisher</td><td>07-200-589</td><td>Preferowane są białe talerze. Nie używaj przezroczystych płytek. https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td></tr><tr><td>PEI MAX - Liniowy chlorowodorek polietyleniminy klasy transfekcyjnej (MW 40 000)</td><td>PolySciences</td><td>24765-1</td><td>Można zastąpić innym odczynnikiem do transfekcji. https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa sprzętu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do cięcia bocznego (110mm)</td><td>Amazon</td><td>Proskit 1PK-037S</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11</td></tr><tr><td>Dremil 3000 z narzędziem tnącym i szlifierką</td><td>Amazon</td><td>Dremel 3000</td><td>Zestaw narzędzi obrotowych Dremel 3000-2/28 o zmiennej prędkości - 1 Nasadki i 28 Akcesoria - szlifierka, szlifierka, polerka, frezarka i grawer. https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3</td></tr><tr><td>Narzędzie do cięcia i szlifowania Dremil</td><td>Amazon</td><td>Dremel 200-1/15</td><td>Każdy podobny Dremil będzie działać. https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Końcówka szlifierska Dremil</td><td>Amazon</td><td>Dremel 84922</td><td>Kamień szlifierski z węglika krzemu. https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922</td></tr><tr><td>EDSYN Oryginalny Deluxe SOLDAPULLT</td><td>Amazon</td><td>DS017</td><td>Do usuwania lutu/błędów. https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td></tr><tr><td>Pomocna dłoń ze szkłem powiększającym</td><td>Amazon</td><td>SE MZ101B</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Szczypce mikro ze spiczastym noskiem</td><td>Amazon</td><td>Hakko CHP PN-20-M</td><td>Stalowe mikroszczypce Super Specialty ze szpiczastym noskiem i gładkimi szczękami, 1,0 mm Nose. https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Mała śruba sterowniki</td><td>Amazon</td><td>Wiha 26197</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set</td></tr><tr><td>Lutownica</td><td></td><td>cyfrowa</td> <td>Amazon Yihua 939D+Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td></tr><tr><td>TraceTech No-Clean Flux Pen</td><td>Amazon</td><td>2507-N</td><td>Tech Spray 2507-N No-Clean Topnik Dozujący długopis, 11,5 mL. https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1</td></tr><tr><td>Weller WSA350 120v Stołowy pochłaniacz dymu</td><td>Amazon</td><td>WSA350</td><td>Do bezpiecznego. https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td></tr><tr><td>Szczypce do ściągania izolacji</td><td>Amazon</td><td>CSP-30-7</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td></tr><tr><td>IWISS IWS-3220M Narzędzie do zaciskania pinów mikrozłączy 0,03-0,52 mm i sup2; 32-20AWG</td><td>Amazon</td><td>IWS-3220M</td><td>Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników. https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1</td></tr></tbody></table>

budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Kontrolowanie procesów biologicznych za pomocą światła zwiększyło dokładność i szybkość, z jaką badacze mogą manipulować wieloma procesami biologicznymi. Kontrola optyczna pozwala na bezprecedensową zdolność do analizowania funkcji i ma potencjał do umożliwienia nowatorskich terapii genetycznych. Jednak eksperymenty optogenetyczne wymagają odpowiednich źródeł światła z kontrolą przestrzenną, czasową lub intensywnością, co często stanowi wąskie gardło dla badaczy. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak zbudować tani i wszechstronny system oświetlenia LED, który można łatwo dostosować do różnych dostępnych narzędzi optogenetycznych. System ten można skonfigurować do sterowania ręcznego lub komputerowego z regulowaną intensywnością diod LED. Udostępniamy ilustrowany przewodnik krok po kroku dotyczący budowy obwodu, sterowania nim za pomocą komputera i konstruowania diod LED. Aby ułatwić montaż tego urządzenia, omawiamy również kilka podstawowych technik i wyjaśniamy obwody używane do sterowania diodami LED. Korzystając z naszego interfejsu użytkownika o otwartym kodzie źródłowym, użytkownicy mogą zautomatyzować precyzyjne odmierzanie czasu i pulsowanie światła na komputerze osobistym (PC) lub niedrogim tablecie. Ta automatyzacja sprawia, że system jest przydatny w eksperymentach, które wykorzystują diody LED do kontrolowania genów, szlaków sygnałowych i innych działań komórkowych, które obejmują duże skale czasowe. W przypadku tego protokołu nie jest wymagana wcześniejsza wiedza z zakresu elektroniki, aby zbudować wszystkie potrzebne części lub wykorzystać system oświetlenia do przeprowadzania eksperymentów optogenetycznych.

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać eksperymenty optogenetyczne w celu kontrolowania ekspresji genów za pomocą światła czerwonego i dalekiego czerwonego przy użyciu PhyB i PIF3. W zestawie znajdują się instrukcje krok po kroku, jak zbudować prosty i elastyczny system oświetlenia, który umożliwia kontrolę ekspresji genów lub innej optogenetyki za pomocą komputera.

Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

System pozwala naukowcom na łatwe skonstruowanie niedrogiego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych. Zalety tej techniki obejmują możliwość zaprogramowania czasu oświetlenia LED z dostępnymi długościami fal, które obejmują widzialne widmo bliskiej podczerwieni, oraz to, że diody LED mogą być używane w różnych kontekstach Aby zbudować obwód elektryczny, przypnij płytkę drukowaną do pomocnych dłoni i włóż przewody połączeniowe, łącząc je w celu utworzenia otworów A1 i A3 do ziemi, przewód połączeniowy D2 do otworu D6, a zasilacz plus przewody połączeniowe numer siedem do otworka A7. Zegnij zaciski pod kątem 45 stopni i dodaj topnik.Po przylutowaniu przytnij tyły przewodów. Włóż jeden koniec przylutowanego złącza żeńskiego przewodu do przewodu do otworu A5. Następnie podłącz jeden koniec rezystora do otworu A5.Podłącz drugi koniec złącza do masy. Następnie podłącz drugi koniec rezystora do masy i połączenie. W przypadku złącza Arduino zaciśnij końce przewodu do złączy przewodów i przepchnij zaciśnięte końce przez prostokątne złącze.Aby ustawić diody LED, ocynuj drut, podgrzewając go od dołu, dodając lut od góry. Umieść dużą ilość lutu na dużej końcówce lutowniczej i użyj końcówki do podgrzania podstawy LED na styku zawierającym topnik. Po kilku sekundach pojedynczo przeciągnij lut przez każdy styk i przymocuj przewód do katody za pomocą spinki do włosów.Umieść dużą ilość lutu na dużej końcówce lutowniczej i dociśnij końcówkę do drutu, aż lut na podstawie LED się stopi. Przytrzymaj drut i wyjmij lutownicę, trzymając drut na miejscu. Umieść niewielką ilość pasty lutowniczej na padach do połączeń LED i użyj kleszczyków, aby umieścić diodę LED na padach.Przytrzymaj wstępnie ocynowany czerwony drut na anodzie i użyj spinki do włosów, aby przyciąć drut. Dodaj lut do dużej końcówki, jak pokazano, i dociśnij końcówkę do połączenia, aż lut na podstawie LED stopi się, a pasta lutownicza stopi się i stanie się srebrna. Aby wykonać przewody LED, umieść rurkę termokurczliwą o średnicy 4.76 milimetra nad drutem przyciętym na długość i rurkę termokurczliwą o średnicy 3.18 milimetra nad złączem przewód-przewód.Zdejmij izolację i dodaj topnik do końców drutu. Użyj pomocnych rąk, aby przypiąć przewód do złącza przewodu i przekręć koniec złącza jednym końcem przewodu. Zlutuj materiały razem i podłącz drugi przewód do zestawu w ten sam sposób i.Następnie przypnij przewody LED do pomocnych dłoni za pomocą taśmy pod podstawą LED. Następnie wymieszaj żywicę epoksydową zgodnie z instrukcjami producenta i rozprowadź żywicę epoksydową na wierzchu przylutowanej diody LED. Za pomocą wiertła łopatkowego wywierć 1.5-centymetrowy otwór w górnej części pudełka, na którym zostanie umieszczona dioda LED, i użyj szybkoobrotowego narzędzia obrotowego, aby wykonać nacięcie po jednej stronie otworu, aby zrobić miejsce na drut LED.Przyklej kawałek folii prywatności o grubości od 25 do 30 milimetrów do czarnego pudełka zakrywającego otwór, przez który będzie oświetlać dioda LED, i przyklej diodę LED na zewnątrz czarnej skrzynki na górze otworu. W przypadku systemu sterowania czterema diodami LED wywierć cztery otwory o średnicy 0.83 cm w odległości 3.81 cm od siebie w pokrywie pudełka i za pomocą szybkiego narzędzia obrotowego wytnij prostokątny otwór o wymiarach 1.19 na 1.90 cm w lewym górnym rogu. Za pomocą wiertła łopatkowego wywierć 1.5-centymetrowy otwór z tyłu pudełka i włóż do niego przelotkę.W przypadku diod LED sterowanych komputerowo należy przeszlifować papierem ściernym obszar, w którym mikrokontroler zostanie przyklejony w pudełku, a także dolną stronę uchwytu mikrokontrolera. Zatrzaśnij mikrokontroler na uchwycie, a następnie pokryj go żywicą epoksydową i pudełko razem przed zamocowaniem uchwytu w czarnym pudełku. Następnie umieść taśmę dwustronną na klipsie i zabezpiecz klips wewnątrz pudełka.W próbkach transfekowanych w celu ekspresji fitochromu B, ale nie biliny fikocyjaniny, nieszczelność wzrasta wraz ze wzrostem ilości reporterowego DNA. Ponadto, gdy cały przełącznik genu fitochromu B, w tym plazmid wytwarzający chromofour fikocyjaniny, jest oświetlony dalekim czerwonym światłem, ekspresja lucyferazy również wzrasta wraz ze wzrostem ilości konstruktu reporterowego w mieszance transfekcyjnej. Podobnie, gdy komórki wrażliwe na światło są oświetlone czerwonym światłem, ekspresja lucyferazy również wzrasta wraz ze wzrostem ilości reportera.Porównując poziomy indukcji komórek traktowanych światłem czerwonym z komórkami traktowanymi światłem dalekiej czerwieni, stwierdza się niewielki spadek aktywacji fałdu wraz ze wzrostem ilości reportera. Konieczne jest uważne śledzenie każdego kroku podczas budowy obwodu elektrycznego i dwukrotne sprawdzenie numerów otworków linia po linii przed każdego elementu. Protokół ten może być stosowany do stymulacji optycznej wielu rodzajów próbek lub narzędzi optogenetycznych przy użyciu różnych długości fal i umożliwia programowanie harmonogramów oświetlenia.

building-simple-versatile-illumination-system-for-optogenetic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Neurony powstałe w wieku dorosłym wykazujące ekspresję ChR2 mogą być manipulowane w preparatach elektrofizjologicznych w plastrach tkankowych w celu zbadania ich wkładu w funkcjonowanie węchowych obwodów neuronalnych.

Wykorzystanie przystępnych cenowo mat LED do fotostymulacji neuronów

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Przedstawiono protokół budowy iluminatora penetrującego tkanki, który dostarczałby światło na duże objętości o minimalnej średnicy.

Duże objętościowe, behawioralnie istotne oświetlenie dla optogenetyki u naczelnych innych niż ludzie

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Ten protokół obejmuje transfekcję czujników cAMP i bPAC-nLuc, białka optogenetycznego, w celu dokładnego śledzenia jego dystrybucji komórkowej i odpowiedzi na stymulację światłem. Innowacyjne podejście polegające na stworzeniu mapy odpowiedzi cAMP przy użyciu systemu skanowania punktowego ma potencjał do przyspieszenia badań nad białkami optogenetycznymi w różnych dziedzinach.

Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Poznaj budowę wszechstronnego systemu oświetlenia LED do eksperymentów optogenetycznych z kontrolą ekspresji genów światłem czerwonym i dalekoczerwonym. Protokół obejmuje montaż obwodu elektrycznego, programowanie mikrokontrolera i testowanie z konstruktami reporterowymi.

Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych

Przeglądaj więcej filmów