Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych
12 stycznia 2021
Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać eksperymenty optogenetyczne w celu kontrolowania ekspresji genów za pomocą światła czerwonego i dalekiego czerwonego przy użyciu PhyB i PIF3. W zestawie znajdują się instrukcje krok po kroku, jak zbudować prosty i elastyczny system oświetlenia, który umożliwia kontrolę ekspresji genów lub innej optogenetyki za pomocą komputera.
System pozwala naukowcom na łatwe skonstruowanie niedrogiego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych. Zalety tej techniki obejmują możliwość zaprogramowania czasu oświetlenia LED z dostępnymi długościami fal, które obejmują widzialne widmo bliskiej podczerwieni, oraz to, że diody LED mogą być używane w różnych kontekstach Aby zbudować obwód elektryczny, przypnij płytkę drukowaną do pomocnych dłoni i włóż przewody połączeniowe, łącząc je w celu utworzenia otworów A1 i A3 do ziemi, przewód połączeniowy D2 do otworu D6, a zasilacz plus przewody połączeniowe numer siedem do otworka A7. Zegnij zaciski pod kątem 45 stopni i dodaj topnik.
Po przylutowaniu przytnij tyły przewodów. Włóż jeden koniec przylutowanego złącza żeńskiego przewodu do przewodu do otworu A5. Następnie podłącz jeden koniec rezystora do otworu A5.
Podłącz drugi koniec złącza do masy. Następnie podłącz drugi koniec rezystora do masy i połączenie. W przypadku złącza Arduino zaciśnij końce przewodu do złączy przewodów i przepchnij zaciśnięte końce przez prostokątne złącze.
Aby ustawić diody LED, ocynuj drut, podgrzewając go od dołu, dodając lut od góry. Umieść dużą ilość lutu na dużej końcówce lutowniczej i użyj końcówki do podgrzania podstawy LED na styku zawierającym topnik. Po kilku sekundach pojedynczo przeciągnij lut przez każdy styk i przymocuj przewód do katody za pomocą spinki do włosów.
Umieść dużą ilość lutu na dużej końcówce lutowniczej i dociśnij końcówkę do drutu, aż lut na podstawie LED się stopi. Przytrzymaj drut i wyjmij lutownicę, trzymając drut na miejscu. Umieść niewielką ilość pasty lutowniczej na padach do połączeń LED i użyj kleszczyków, aby umieścić diodę LED na padach.
Przytrzymaj wstępnie ocynowany czerwony drut na anodzie i użyj spinki do włosów, aby przyciąć drut. Dodaj lut do dużej końcówki, jak pokazano, i dociśnij końcówkę do połączenia, aż lut na podstawie LED stopi się, a pasta lutownicza stopi się i stanie się srebrna. Aby wykonać przewody LED, umieść rurkę termokurczliwą o średnicy 4.76 milimetra nad drutem przyciętym na długość i rurkę termokurczliwą o średnicy 3.18 milimetra nad złączem przewód-przewód.
Zdejmij izolację i dodaj topnik do końców drutu. Użyj pomocnych rąk, aby przypiąć przewód do złącza przewodu i przekręć koniec złącza jednym końcem przewodu. Zlutuj materiały razem i podłącz drugi przewód do zestawu w ten sam sposób i.
Następnie przypnij przewody LED do pomocnych dłoni za pomocą taśmy pod podstawą LED. Następnie wymieszaj żywicę epoksydową zgodnie z instrukcjami producenta i rozprowadź żywicę epoksydową na wierzchu przylutowanej diody LED. Za pomocą wiertła łopatkowego wywierć 1.5-centymetrowy otwór w górnej części pudełka, na którym zostanie umieszczona dioda LED, i użyj szybkoobrotowego narzędzia obrotowego, aby wykonać nacięcie po jednej stronie otworu, aby zrobić miejsce na drut LED.
Przyklej kawałek folii prywatności o grubości od 25 do 30 milimetrów do czarnego pudełka zakrywającego otwór, przez który będzie oświetlać dioda LED, i przyklej diodę LED na zewnątrz czarnej skrzynki na górze otworu. W przypadku systemu sterowania czterema diodami LED wywierć cztery otwory o średnicy 0.83 cm w odległości 3.81 cm od siebie w pokrywie pudełka i za pomocą szybkiego narzędzia obrotowego wytnij prostokątny otwór o wymiarach 1.19 na 1.90 cm w lewym górnym rogu. Za pomocą wiertła łopatkowego wywierć 1.5-centymetrowy otwór z tyłu pudełka i włóż do niego przelotkę.
W przypadku diod LED sterowanych komputerowo należy przeszlifować papierem ściernym obszar, w którym mikrokontroler zostanie przyklejony w pudełku, a także dolną stronę uchwytu mikrokontrolera. Zatrzaśnij mikrokontroler na uchwycie, a następnie pokryj go żywicą epoksydową i pudełko razem przed zamocowaniem uchwytu w czarnym pudełku. Następnie umieść taśmę dwustronną na klipsie i zabezpiecz klips wewnątrz pudełka.
W próbkach transfekowanych w celu ekspresji fitochromu B, ale nie biliny fikocyjaniny, nieszczelność wzrasta wraz ze wzrostem ilości reporterowego DNA. Ponadto, gdy cały przełącznik genu fitochromu B, w tym plazmid wytwarzający chromofour fikocyjaniny, jest oświetlony dalekim czerwonym światłem, ekspresja lucyferazy również wzrasta wraz ze wzrostem ilości konstruktu reporterowego w mieszance transfekcyjnej. Podobnie, gdy komórki wrażliwe na światło są oświetlone czerwonym światłem, ekspresja lucyferazy również wzrasta wraz ze wzrostem ilości reportera.
Porównując poziomy indukcji komórek traktowanych światłem czerwonym z komórkami traktowanymi światłem dalekiej czerwieni, stwierdza się niewielki spadek aktywacji fałdu wraz ze wzrostem ilości reportera. Konieczne jest uważne śledzenie każdego kroku podczas budowy obwodu elektrycznego i dwukrotne sprawdzenie numerów otworków linia po linii przed każdego elementu. Protokół ten może być stosowany do stymulacji optycznej wielu rodzajów próbek lub narzędzi optogenetycznych przy użyciu różnych długości fal i umożliwia programowanie harmonogramów oświetlenia.
Przegląd
Ten protokół opisuje budowę wszechstronnego systemu iluminacji do eksperymentów optogenetycznych, umożliwiającego kontrolę ekspresji genów za pomocą czerwonego i dalekoczerwonego światła. Dostarczane są szczegółowe instrukcje budowy systemu i programowania iluminacji LED.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Optogenetyka
- Kontrola ekspresji genów
- Systemy iluminacji
Tło
- Optogenetyka pozwala na precyzyjną kontrolę funkcji komórkowych za pomocą światła.
- PhyB i PIF3 są kluczowymi komponentami w regulacji genów reagujących na światło.
- Diody LED mogą być zaprogramowane na różne harmonogramy iluminacji.
- System ten został zaprojektowany tak, aby być opłacalnym i przystosowanym do różnych konfiguracji eksperymentów.
Cel badania
- Dostarczyć szczegółowy protokół budowy systemu iluminacji optogenetycznej.
- Umożliwić badaczom kontrolę ekspresji genów za pomocą określonych długości fal światła.
- Ułatwić używanie narzędzi optogenetycznych w różnych kontekstach eksperymentalnych.
Stosowane metody
- Budowa obwodu elektrycznego do sterowania LED.
- Programowanie czasu i długości fal iluminacji LED.
- Zestawienie mikrokontrolera do zautomatyzowanego sterowania.
- Testowanie systemu z różnymi konstruktami reporterowymi.
Główne wyniki
- Udana budowa elastycznego systemu iluminacji.
- Zwiększona ekspresja luciferazy obserwowana przy większych ilościach DNA reporterowego.
- Wykazana kontrola nad ekspresją genów za pomocą czerwonego i dalekoczerwonego światła.
- System umożliwia optyczną stymulację różnych typów próbek.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę eksperymentów optogenetycznych.
- Badacze mogą wykorzystywać ten system do różnych zastosowań w regulacji genów.
- Ściśle przestrzegane protokoły zapewniają pomyślne wyniki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of cellular pathways enables precise mechanistic interrogation in target validation and phenotypic screening. A low-cost, programmable illumination system supports reproducible light delivery for gene expression studies, reducing technical variability in preclinical models. This approach enhances predictive confidence by allowing standardized optical stimulation across diverse experimental contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of light-sensitive gene switches to clarify pathway function and target mechanism.
- Operational Value: Provides adjustable LED intensity and timing for controlled perturbation of signaling pathways in cellular assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports preparation of standardized biological systems for quantifying optogenetic responses across compound or genetic perturbations.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through programmable illumination schedules and wavelength selection for reproducible readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from discovery through preclinical validation by enabling optical stimulation of disease-relevant systems with tunable light parameters.
- Operational Value: Allows risk-adjusted advancement decisions by quantifying dose-dependent responses to red and far-red light in reporter-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The illumination system integrates into discovery biology workflows by enabling controlled optical perturbation of gene expression, supporting lead identification through quantifiable phenotypic outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise temporal and spatial control of optogenetic tools to interrogate target function.
- Screening: Enables quantitative dependent variable measurements such as luciferase expression under defined illumination conditions.
- Analytics: Generates reproducible light-dose response data that inform statistical analysis for target validation and hit confirmation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable platform for testing optogenetic constructs in disease models.
- Enterprise Reuse: Designed as a scalable, adaptable capability for multiple projects requiring optical control of cellular processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in light-controlled experiments.
- Operational Value: Standardization and scalability of illumination protocols across laboratories and experimental setups.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable, quantifiable optogenetic readouts that reduce false positives in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible optical stimulation outcomes.
Implementation Considerations
- Basic electronics proficiency for circuit assembly and soldering of LED connections.
- Access to Arduino-compatible microcontrollers and soldering instrumentation for system construction.
- Standardization of illumination protocols across teams to ensure reproducible experimental conditions.
- Adaptation considerations for different optogenetic tools requiring specific wavelengths or intensity ranges.
- Practical limitation: Manual calibration may be required to optimize LED positioning and light penetration for specific sample types.
