Name: Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Poznaj protokół różnicowania komórek prekursorowych neuronów przy użyciu stymulacji impulsami prądu stałego w mikroprzepływowym układzie MOE. Ta metoda skraca czas przygotowania eksperymentu i zużycie odczynników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują profesorowi Tang K. Tang, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, za pomoc w dostarczeniu mysich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (mNPC). Autorzy dziękują również profesorowi Tang K. Tangowi i pani Ying-Shan Lee za ich cenną dyskusję na temat różnicowania mNPC.

1. Projektowanie i wykonanie chipa MOE
<ol>
	<li>Zaprojektuj wzory dla poszczególnych warstw polimetakrylanu metylu (PMMA) oraz taśmy dwustronnej przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (Rycina 1A, Tabela materiałów). Wytnij arkusze PMMA oraz taśmę dwustronną za pomocą grawerki laserowej CO2 (Rycina 1B).
	<ol>
		<li>Włącz grawerkę laserową CO2 i podłącz ją do komputera osobistego. Otwórz plik z zaprojektowanym wzorem w oprogramowaniu.</li>
		<li>Umieść arkusze PMMA (275 mm x 400 mm) lub taśmę dwustronną (210 mm x 297 mm) na platformie grawerki laserowej (Rycina 2A). Skup wiązkę laserową na powierzchni arkuszy PMMA lub taśmy dwustronnej, korzystając z funkcji autofokusu.</li>
		<li>Wybierz grawerkę laserową jako drukarkę, a następnie „wydrukuj” wzór, aby rozpocząć bezpośrednią ablację na arkuszu PMMA lub taśmie dwustronnej i uzyskać poszczególne wzory na arkuszu PMMA lub taśmie (Rycina 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń folię ochronną z arkuszy PMMA i oczyść powierzchnię za pomocą gazu azotowego. 
	UWAGA: Projektowanie wzoru PMMA i bezpośrednia obróbka arkusza PMMA zostały przeprowadzone zgodnie z poprzednim raportem17.</li>
	<li>Aby połączyć ze sobą wiele warstw arkuszy PMMA, ułóż trzy sztuki arkuszy PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1, 2 i 3) i złącz je pod ciśnieniem 5 kg/cm2 w spawalniczce termicznej przez 30 min w temperaturze 110 °C, aby utworzyć zespół kanałów przepływowych/stymulacji elektrycznej (Rycina 2C). 
	UWAGA: Różne partie komercyjnie pozyskanych arkuszy PMMA mają nieco różną temperaturę przejścia szklistego (Tg). Optymalną temperaturę łączenia należy sprawdzić w krokach co 5 °C w pobliżu Tg.</li>
	<li>Przyklej 12 sztuk adapterów do poszczególnych otworów w warstwie 1 zespołu chipa MOE za pomocą szybkoschnącego kleju cyjanoakrylowego. 
	UWAGA: Adaptery są wykonane z PMMA metodą wtryskową. Płaskie powierzchnie na spodzie służą do połączenia z chipem MOE. Adaptery z żebewym gwintem 1/4W-28 służą do podłączania białych korków dokręcanych palcami, złączników o płaskim spodzie lub adapterów Luer. Zachowaj ostrożność podczas używania szybkoschnącego kleju cyjanoakrylowego. Unikaj zachlapania oczu.</li>
	<li>Zdezynfekuj podłoża z PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1-3), taśmę dwustronną (warstwa 4) oraz PMMA klasy optycznej o grubości 3 mm (warstwa 5) poprzez naświetlanie promieniami ultrafioletowymi (UV) przez 30 min przed montażem chipa (Rycina 1A).</li>
	<li>Przyklej podłoża z PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1-3) do PMMA klasy optycznej o grubości 3 mm (warstwa 5) za pomocą taśmy dwustronnej (warstwa 4), aby ukończyć montaż PMMA (warstwy 1-5) (Rycina 1A).</li>
	<li>Przygotuj czyste szkiełko nakrywkę do montażu na chipie.
	<ol>
		<li>Napełnij naczynie do barwienia dziesięciokrotnym rozcieńczeniem detergentu (patrz Tabela materiałów) i oczyść szkiełko nakrywkę w tym detergencie za pomocą myjki ultradźwiękowej przez 15 min.</li>
		<li>Dokładnie wypłucz naczynie do barwienia pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć wszystkie ślady detergentu.</li>
		<li>Kontynuuj płukanie wodą destylowaną, aby usunąć wszystkie ślady wody z kranu; powtórz krok 1.7.2 dwukrotnie.</li>
		<li>Osusz oczyszczone szkiełko nakrywkę, przedmuchując je gazem azotowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdezynfekuj zespół PMMA (warstwy 1-5), taśmę dwustronną (warstwa 6) i szkiełko nakrywkę (warstwa 7) za pomocą naświetlania UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 30 min przed montażem chipa (Rycina 1A).</li>
	<li>Przyklej oczyszczone szkiełko nakrywkę (warstwa 7) do zespołu PMMA (warstwy 1-5) za pomocą taśmy dwustronnej (warstwa 6) (Rycina 1A).</li>
	<li>Inkubuj chip MOE w komorze próżniowej przez noc; użyj zestawionego chipa MOE do kolejnych procedur (Rycina 3).</li>
</ol>
2. Powlekanie poli-L-lizyną (PLL) podłoża w obszarach hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Przygotuj rurkę z politetrafluoroetylenu, konektor z płaskim dnem, konektor stożkowy, adapter stożek-Luer, biały korek dokręcany palcami (zwany również stoprem), adapter Luer, strzykawkę z zamkiem Luer oraz czarną gumową zaślepkę (Rysunek 4A, Tabela Materiałów). Wszystkie powyższe elementy wysterylizuj w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 min.</li>
	<li>Zamknij otwory adapterów mostka agarowego (Rysunek 1A) za pomocą białych korków dokręcanych palcami. Połącz konektor z płaskim dnem z zestawem chipa MOE poprzez adaptery wlotowe i wylotowe medium (Rysunek 4B). Połącz adapter stożek-Luer z kurkami trójdrożnymi.</li>
	<li>Dodaj 2 mL 0,01% roztworu PLL za pomocą strzykawki 3 mL podłączonej do kurki trójdrożnej wlotu medium (Rysunek 4B-<img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0, MA=0; schemat; badanie równowagi; analiza sił i momentów; fizyka." src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">).</li>
	<li>Podłącz pustą strzykawkę 3 mL do kurki trójdrożnej wylotu medium (Rysunek 4B-<img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; ΣFy=0; schemat; siły mechaniczne; rozkład wektorów; analiza równowagi sił." src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">).</li>
	<li>Wypełnij obszary hodowli komórkowej roztworem PLL. Ręcznie i powoli przepompowuj roztwór powlekający w przód i w tył. Zamknij obie kurki trójdrożne, aby uszczelnić roztwór wewnątrz obszarów hodowli.</li>
	<li>Inkubuj chip MOE w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze z atmosferą 5% CO2.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sieci mostków solnych
<ol>
	<li>Po wykonaniu kroku 2.6 otworzyć dwa kurki trójdrożne i usunąć pęcherzyki powietrza z kanałów, ręcznie przepompowując roztwór powlekający w przód i w tył w kanale za pomocą dwóch strzykawek.</li>
	<li>Nabrać 3 mL pożywki kompletnej (pożywka do utrzymania komórek macierzystych składająca się z DMEM/F12, 2% suplementu B-27, 20 ng/mL EGF oraz 20 ng/mL bFGF) do strzykawki o pojemności 3 mL podłączonej do kurka trójdrożnego wlotu pożywki (Rysunek 4B-<img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0, MA=0; schemat; badanie równowagi; analiza sił i momentów; fizyka." src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> i Rysunek 4B-<img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, MA=0, schemat sił, koncepcja fizyczna, suma sił, równowaga obrotowa." src="/files/ftp_upload/61917/3.png" style="vertical-align: middle;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3">).</li>
	<li>Dodać 3 mL pożywki kompletnej, aby zastąpić roztwór powlekający w obszarach hodowli komórkowej. Podłączyć pustą strzykawkę 5 mL do kurka trójdrożnego wylotu pożywki (Rysunek 4B-<img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; schemat; analiza wolnego ciała; edukacja z zakresu fizyki; zasady równowagi." src="/files/ftp_upload/61917/4.png" style="vertical-align: middle;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4">).</li>
	<li>Przygotować sieć mostków solnych (Rysunek 5).
	<ol>
		<li>Wyciąć szczelinę w czarnym gumowym korku i włożyć elektrody srebrne (Ag)/chlorku srebra (AgCl) przez gumowy korek do strzykawki z zakrętką Luer lock (Rysunek 4A).</li>
		<li>Zastąpić biały korek dokręcany palcami adapterem Luer i wstrzyknąć 3% gorącą agarozę, aby wypełnić adapter Luer. 
		UWAGA: W celu przygotowania gorącej agarozy rozpuścić 3 g proszku agarozy w 100 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 min.</li>
		<li>Podłączyć strzykawkę Luer lock do adaptera Luer. Za pomocą strzykawki z igłą wstrzyknąć 3% gorącą agarozę przez czarny gumowy korek, aby wypełnić strzykawkę Luer lock. Odczekać od 10 do 20 min, aż agaroza ostygnie i stężeje. 
		UWAGA: Aby zwiększyć pojemność agarozy, strzykawka Luer lock jest zamontowana na adapterze Luer (Rysunek 4 i Rysunek 5). Następnie do strzykawki Luer lock wstawia się duże elektrody. Elektroda ta umożliwia stabilną stymulację elektryczną podczas długoterminowego eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie mNPC
<ol>
	<li>Kultury mNPCs1 w pożywce kompletnej w kolbie do hodowli komórkowej T25 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z zawartością 5% CO22 atmosferze. Przeprowadzać pasażowanie komórek co 3-4 dni, a wszystkie eksperymenty wykonywać na komórkach po 3-8 pasażach od pierwotnego źródła.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować neurosfery przy 100 × g przez 5 min. Odessać supernatant i przemyć neurosfery 1x buforem PBS Dulbecco (DPBS). Odwirować neurosfery przy 100 × g przez 5 min.</li>
	<li>Odssać 1x DPBS, a następnie resuspendować neurosfery w medium kompletnym. Wymieszać dokładnie i delikatnie.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml podać 1 ml zawiesiny neurosfer do trójdrożnego kurka odpływowego (Rycina 4B-<img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; ΣFy=0; diagram; siły mechaniczne; rozkład wektorów; analiza równowagi sił." src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">).</li>
</ol>
5. Konfiguracja systemu mikroprzepływowego do stymulacji impulsami DC (Rysunek 6)
<ol>
	<li>Zainstaluj chip MOE zasiany komórkami na przezroczystym grzałce ITO, która jest zamocowana na programowalnym zmotoryzowanym stole X-Y-Z. 
	UWAGA: Temperatura powierzchni ITO jest kontrolowana przez regulator proporcjonalno-całkująco-różniczkowy (PID) i utrzymywana na poziomie 37 °C. Termopara typu K jest zaciskana pomiędzy chipem a grzałką ITO w celu monitorowania temperatury obszarów hodowli komórkowej wewnątrz chipa. Chip MOE jest zainstalowany na programowalnym zmotoryzowanym stole X-Y-Z i nadaje się do automatycznego obrazowania time-lapse w poszczególnych sekcjach kanałów. Wykonanie grzałki ITO oraz konfiguracja systemu ogrzewania hodowli komórkowej zostały opisane wcześniej18,19.</li>
	<li>Wprowadź mNPC poprzez ręczne pompowanie do chipa MOE przez wylot medium. Inkubuj zasiany komórkami chip MOE na grzałce ITO o temperaturze 37 °C przez 4 h.</li>
	<li>Po 4 h pompuj kompletne medium przez chip MOE przez wlot medium z przepływem 20 µL/h przy użyciu pompy strzykawkowej. 
	UWAGA: mNPC są hodowane i utrzymywane w chipie przez dodatkowe 24 h przed stymulacją EF, aby umożliwić adhezję i wzrost komórek. Ciecz odpadowa jest zbierana w pustej strzykawce 5 mL połączonej z trójdrożnym kranikiem wylotowym, oznaczonej jako „waste” na Rysunku 6A. Konfiguracja mikrofluidycznego systemu MOE przedstawiona jest na Rysunku 6. Ten system mikrofluidyczny zapewnia ciągłe dostarczanie składników odżywczych do komórek. Świeże kompletne medium jest stale pompowane do chipa MOE w celu utrzymania stałej wartości pH. Dzięki temu komórki mogą być hodowane poza inkubatorem CO2.</li>
	<li>Użyj przewodów elektrycznych, aby połączyć multiplekser EF z chipem MOE poprzez elektrody Ag/AgCl znajdujące się na chipie. Połącz multiplekser EF i generator funkcji z wzmacniaczem, aby generować prostokątne impulsy DC o amplitudzie 300 mV/mm przy częstotliwości 100 Hz i cyklu pracy 50% (50% czasu włączenia i 50% czasu wyłączenia) (Rysunek 6B).
	<ol>
		<li>Podłącz przewody elektryczne do multipleksera EF. Podłącz przewody elektryczne do chipa MOE poprzez elektrody Ag/AgCl.</li>
		<li>Połącz multiplekser EF ze wzmacniaczem za pomocą przewodów elektrycznych. Podłącz generator funkcji do wzmacniacza i cyfrowego oscyloskopu. 
		UWAGA: Multiplekser EF to obwód, który uwzględnia impedancję komory hodowlanej w obwodzie i łączy wszystkie poszczególne komory w równoległej sieci elektronicznej. Każda z trzech komór hodowlanych jest połączona elektrycznie szeregowo z rezystorem zmiennym (Vr) i ampermetrem (oznaczonym jako µA na Rysunku 6A) w multiplekserze. Natężenie prądu elektrycznego przez każdą komorę hodowlaną jest regulowane poprzez zmianę Vr, a wartość prądu jest wyświetlana na odpowiadającym mu ampermetrze. Natężenie pola elektrycznego w każdym obszarze hodowli komórkowej obliczono zgodnie z prawem Ohma, I= σEA, gdzie I to natężenie prądu, σ (przyjęte jako 1,38 S·m-1 dla DMEM/F1220) to przewodność elektryczna medium hodowlanego, E to pole elektryczne, a A to powierzchnia przekroju poprzecznego komory elektrotaktycznej. Dla wymiarów obszaru hodowli komórkowej przedstawionych na Rysunku 1, natężenie prądu wynosi odpowiednio ~87 mA dla DC i ~44 mA dla impulsów DC przy 50% cyklu pracy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj mNPC działaniu prostokątnych impulsów DC o amplitudzie 300 mV/mm przy częstotliwości 100 Hz przez 48 h. Stale pompuj kompletne medium z prędkością 10 µL/h, aby zapewnić komórkom odpowiednią ilość składników odżywczych i utrzymać stałą wartość pH medium.</li>
</ol>
6. Analizy immunofluorescencyjne mNPC po stymulacji impulsowym prądem stałym
UWAGA: Na tym etapie cały odczynnik jest pompowany przez wlot medium przy użyciu pompy strzykawkowej.
<ol>
	<li>Po 3, 7 lub 14 dniach hodowli in vitro (DIV) od momentu zasiewu1, przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 25 µL/min przez 20 min.</li>
	<li>Utrwalić komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA). Pompować 4% PFA do chipa przy przepływie 25 µL/min przez 20 min, aby zastąpić 1x PBS. Aby usunąć 4% PFA, przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 25 µL/min przez 20 min.</li>
	<li>Pompować 0,1% Triton X-100 do chipa przy przepływie 50 µL/min przez 6 min w celu permeabilizacji komórek. Zmniejszyć przepływ do 50 µL/h na dodatkowe 30 min, aby umożliwić reakcję z komórkami. Aby usunąć 0,1% Triton X-100, przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 50 µL/min przez 6 min.</li>
	<li>Zablokować komórki za pomocą PBS zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby zredukować nieswoiste wiązanie przeciwciał. Pompować 1% BSA do chipa przy przepływie 50 µL/min przez 6 min. Zmniejszyć przepływ do 100 µL/h i pompować przez 1 h.</li>
	<li>Pompować przeciwciała do podwójnego immunostainingu do chipa przy przepływie 50 µL/min przez 6 min, a następnie inkubować chip przez 18 h w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 50 µL/min przez 15 min.</li>
	<li>Pompować przeciwciała wtórne koniugowane z Alexa Fluor do chipa przy przepływie 50 µL/min przez 6 min. Zmniejszyć przepływ do 50 µL/h i pompować przeciwciała przez 1 h w temperaturze pokojowej, w ciemności. Przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 50 µL/min przez 15 min.</li>
	<li>W celu barwienia jąder komórkowych pompować Hoechst 33342 do chipa przy przepływie 20 µL/min przez 10 min w temperaturze pokojowej, w ciemności. Przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 50 µL/min przez 15 min.</li>
	<li>Po immunostainingu obserwować komórki przy użyciu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
7. Analiza obrazów i przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Przeanalizuj obrazy fluorescencyjne przy użyciu oprogramowania z wbudowanymi narzędziami pomiarowymi (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Porównaj jądra barwione Hoechstem (całkowita liczba komórek) w grupach kontrolnej i badawczej, a następnie oblicz odsetek komórek wykazujących ekspresję każdego z markerów fenotypowych.</li>
</ol>

<ol><li>Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+DC+electric+field-induced+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).</li>
<li>Li, S., Li, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+spiral+ganglion+neurite+extension+in+electrical+fields+of+charge-balanced+biphasic+pulses+and+direct+current+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro.</a> Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).</li>
<li>Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direction+of+neurite+growth+in+a+weak+DC+electric+field+depends+on+the+substratum%3A+contributions+of+adhesivity+and+net+surface+charge%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge.</a> Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+proliferation+and+differentiation+in+neural+precursor+cells+by+the+Jak+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway.</a> Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).</li>
<li>Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+directs+migration%2C+enhances+and+orients+cell+division+and+upregulates+the+chemokine+receptors+CXCR4+and+CXCR2+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).</li>
<li>Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibits+electric+field-induced+migration+of+non-small+cell+lung+cancer+%28NSCLC%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 8094(2019).</li>
<li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6 (3), 34116(2012).</li>
<li>Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).</li>
<li>Jing, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+electrical+stimulation+with+different+electric-field+intensities+in+the+regulation+of+the+differentiation+of+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells.</a> American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).</li>
<li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-powered+electrical+stimulation+for+enhancing+neural+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+on+graphene-poly%283%2C4-ethylenedioxythiophene%29+hybrid+microfibers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers.</a> American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).</li>
<li>Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+electrical+stimulation+and+cisplatin+in+HeLa+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+moderate+exogenous+electric+field+stimulation+on+activating+netrin-1%2FDCC+expression+against+mechanical+stretch-induced+injury+in+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons.</a> Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).</li>
<li>Haan, N., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+application+of+electric+fields+in+the+injured+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system.</a> Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).</li>
<li>Ariza, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+electric+fields+on+hippocampal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).</li>
<li>Huang, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+human+lung+cancer+cell+line+CL1-5+in+response+to+a+direct+current+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field.</a> PLoS One. 6 (10), e25928(2011).</li>
<li>Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+ordered+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).</li>
<li>Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+studies+of+lung+cancer+cells+using+a+multichannel+dual-electric-field+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip.</a> Journal of Visualized Experiments. 106, e53340(2015).</li>
<li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITO+patterning+by+a+low+power+Q-switched+green+laser+and+its+use+in+the+fabrication+of+a+transparent+flow+meter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).</li>
<li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+cell-culture+microchamber+with+a+variably+controlled+concentration+gradient+generator+and+flow+field+rectifier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier.</a> Biomicrofluidics. 2 (2), 24105(2008).</li>
<li>Fuhr, G., Shirley, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+handling+and+characterization+using+micron+and+submicron+electrode+arrays%3A+state+of+the+art+and+perspectives+of+semiconductor+microtools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).</li>
<li>AChang, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+electrical+currents+stimulation+promotes+both+proliferation+and+differentiation+of+fetal+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells.</a> PLoS One. 6 (4), e18738(2011).</li>
<li>Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+current+electric+fields+of+varying+frequencies%3A+effects+on+proliferation+and+differentiation+of+porcine+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells.</a> Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas wytwarzania chipa MOE adaptery są mocowane do warstwy 1 chipa MOE za pomocą szybko działającego kleju cyjanoakrylowego. Klej nakłada się na 4 rogi adapterów, a następnie równomiernie dociska się do adapterów. Należy unikać nadmiaru kleju, aby zapewnić całkowitą polimeryzację kleju. Ponadto gotowy zespół chipów MOE jest inkubowany w komorze próżniowej. Ten krok pomaga usunąć pęcherzyki między warstwą PMMA, taśmą dwustronną i szkłem nakrywkowym.
Wybór materiału elektrody opiera się na fa...

Neuronalne komórki prekursorowe (NPC, znane również jako nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe) mogą być obiecującym kandydatem do neurodegeneracyjnej strategii terapeutycznej1. Niezróżnicowane NPC mają zdolność do samoodnawiania, wielomoc i zdolność proliferacji2,3. Poprzednie badanie wykazało, że macierz zewnątrzkomórkowa i mediatory molekularne regulują różnicowanie NPC. Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) promują proliferację NPC, utrzymując w ten sposób stan niezróżnicowany4.
Poprzednie badania wykazały, że stymulacja elektryczna może regulować czynności fizjologiczne komórki, takie jak podział5, migration6,7,8, differentiation1,9,10, oraz śmierć komórki11. Pola elektryczne (EF) odgrywają istotną rolę w rozwoju i regeneracji ośrodkowego układu nerwowego12,13,14. Od 2009 do 2019 roku laboratorium to badało odpowiedzi komórkowe na zastosowanie EF w systemie mikroprzepływowym1,6,7,8,15,16,17. Wielokanałowy, optycznie przezroczysty chip elektrotaktyczny (MOE) został zaprojektowany tak, aby nadawał się do barwienia immunofluorescencyjnego w mikroskopii konfokalnej. Chip charakteryzował się wysoką przezroczystością optyczną i dobrą trwałością oraz pozwalał na jednoczesne przeprowadzenie trzech niezależnych eksperymentów stymulacyjnych i kilku warunków barwienia immunologicznego w jednym badaniu. System mikroprzepływowy jest korzystny w upraszczaniu ogólnej konfiguracji eksperymentalnej, a co za tym idzie, zużycia odczynnika i próbki. W artykule opisano rozwój mikroprzepływowego systemu hodowli komórek, który został wykorzystany do długoterminowego badania różnicowania komórek.

<table><tbody><tr><td>Podłoża PMMA 1 mm (warstwy 1-3)</td><td>BHT</td><td>K2R20</td><td>Polimetakrylan metylu (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html</td></tr><tr><td>15 ml plastikowa tuba</td><td>Protech Technology Enterprise Co., Ltd</td><td>CT-15-PL-TW</td><td>Stożkowa rurka z dnem z nakrętką, zmontowana, wstępnie sterylizowana</td></tr><tr><td>strzykawka 3 ml</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>Strzykawki doustne 3 ml, bez igły</td></tr> 3 <tr><td>mm klasy optycznej PMMA (warstwa 5)</td><td>CHI MEI Corporation</td><td>ACRYPOLY PMMA Arkusz</td><td>Klasa optyczna PMMA</td></tr><tr><td>3-drożny kran</td><td>NIPRO</td><td>NCN-3L</td><td>Sterylna jednorazowa strzykawka 3-drożna</td></tr><tr><td>5 ml</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3410</td> 5 <td>ml strzykawka doustna, bez igły</td></tr><tr><td>Adapter</td><td>Dong Zhong Co., Ltd.</td><td>Dostosowany</td><td>adapter PMMA</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Agaroza, niska temperatura żelowania</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>A.A. Lab Systems Ltd</td><td>A-304</td><td>Wzmacniacz wysokiego napięcia</td></tr><tr><td>Oprogramowanie AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>Wersja edukacyjna</td><td>Szkic</td></tr><tr><td>suplementu B-27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>B-27 suplement (50x), bez witaminy A</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>Nazywany również rekombinowanym ludzkim FGF-basic</td></tr><tr><td>Czarna gumowa zatyczka</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>Ze strzykawek doustnych 3 ml, bez igły</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td>Odczynnik blokujący&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>HSIANGTAI</td><td>CV2060</td><td>Wirówka</td></tr><tr><td>CO2 traser laserowy</td><td>Laser Tools and Technics Corp.&nbsp;</td><td>ILS-II Zakupiony</td><td>od http://www.lttcorp.com/index.htm</td></tr><tr><td>Łącznik stożkowy</td><td>IDEX Health & Science</td><td>F-120X</td><td>Jednoczęściowy stożek 10-32 dokręcany palcem, do adaptera 1/16" OD naturalnego</td></tr><tr><td>stożka-Luer</td><td>IDEX Zdrowie & Science</td><td>P-659</td><td>Luer Adapter 10-32 żeński na żeński Luer,</td></tr><tr><td>konfokalny mikroskop fluorescencyjny</td> PEEK <td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td>Instrukcja obsługi Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>OLYMPUS</td><td>E-330</td><td>Automatyczna akwizycja zdjęć poklatkowych</td></tr><tr><td>Oscyloskop cyfrowy</td><td>Tektronix</td><td>TDS2024</td><td>Mierz sygnały napięcia lub prądu w czasie w obwodzie elektronicznym lub komponencie, aby wyświetlić amplitudę i częstotliwość.</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>3M&nbsp;</td><td>PET 8018</td><td>Zakupiony od http://en.thd.com.tw/</td></tr> <tr><td>Dulbecco" s zmodyfikowany Orzeł" s podłoże / mieszanka składników odżywczych szynki F-12 (DMEM / F12)</td> <td>Gibco</td><td>12400024</td><td>DMEM / F-12, proszek, HEPES</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)</td> <td>Gibco</td><td>21600010</td><td>DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezu</td></tr><tr><td>Multiplekser</td><td>EF Asiatic Sky Co., Ltd.</td><td>Dostosowane</td><td>Monitoruj i kontroluj prąd elektryczny w poszczególnych kanałach</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Zwany również rekombinowanym ludzkim EGF</td></tr><tr><td>Szybko działający klej cyjanoakrylowy</td><td>3M&nbsp;</td><td>7004T</td><td>Wytrzymałość kleju błyskawicznego (płyn)</td></tr><tr><td>Łącznik z płaskim dnem</td><td>IDEX Zdrowie & Science</td><td>P-206</td><td>Nakrętka męska bezkołnierzowa Delrin, 1/4-28 płaska denna, do 1/16" OD niebieski</td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>Agilent Technologies</td><td>33120A Wysokowydajny</td><td>15 MHz syntetyzowany&nbsp; Generator funkcji&nbsp; z wbudowaną funkcją arbitralnego kształtu fali</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysi IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150117</td><td>Kozia anty-mysia IgG H& L (Alexa Fluor 488) wstępnie zaadsorbowany</td></tr><tr><td>kozioł anty-króliczy IgG H& L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150086</td><td>Kozie przeciwciało poliklonalne drugorzędowe przeciwko króliczej IgG - H& L (Alexa Fluor 555), wstępnie zaadsorbowany</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Barwienie jądrowe</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.48v</td><td>Analizuj obrazy fluorescencyjne&nbsp;</td></tr><tr><td>Ind&ndash; Puszka&ndash; szkło tlenkowe (ITO)</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>Do grzejnika ITO</td></tr><tr><td>Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazami</td><td>OLYMPUS</td><td>CKX41</td><td>Do obserwacji morfologii komórek</td></tr><tr><td>Termopara typu K</td><td>Tecpel</td><td>TPK-02A</td><td>Temperatura&nbsp; termopary</td></tr><tr><td>Adapter Luer</td><td>IDEX Zdrowie & Science</td><td>P618-01</td><td>Adapter Luer żeński Luer na 1/4-28 męski polipropylenowy</td></tr><tr><td>strzykawka Luer lock</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>Do mostków solnych agarowych</td></tr><tr><td>Mysz anty-GFAP</td><td>eBioscience</td><td>14-9892</td><td>Marker astrocytów</td></tr><tr><td>Oligodendrocyty &nbsp; znacznik&nbsp; O4&nbsp; przeciwciało</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1326</td><td>Marker oligodendrocytów</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mocowanie Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&nbsp; agent</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Basic Life</td><td>BL2651</td><td>Roztwór myjący</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna (PLL)</td><td>SIGMA</td><td>P4707</td><td>Roztwór powlekający</td></tr><tr><td>Precyzyjne szkła nakrywkowe grubość Nr 1,5H</td><td>MARIENFELD</td><td>107242</td><td>https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html</td></tr><tr><td>Programowalny zmotoryzowany stolik X-Y-Z</td><td>Tanlian Inc</td><td>Dostosowane</td><td>Zakupione od http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm</td></tr><tr><td>Proporcjonalne&ndash; całka&ndash; regulator pochodny (PID)</td><td>Toho Electronics</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>Regulator temperatury&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurka PTFE</td><td>Professional Plastics Inc. Oddział na Tajwanie</td><td>Średnica zewnętrzna 1/16 cala</td><td>Biała półprzezroczysta rurka PTFE</td></tr><tr><td>Królik anty-Tuj1</td><td>Abcam</td><td>ab18207</td><td>Marker neuron</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>New Era Systems Inc</td><td>NE-1000</td><td>NE-1000 programowalna pojedyncza pompa strzykawkowa</td></tr><tr><td>Detergent TFD4</td><td>FRANKLAB</td><td>TFD4</td><td>Środek do czyszczenia szkła nakrywkowego</td></tr><tr><td>Klej termiczny</td><td>Kuan-MIN Tech Co.</td><td>Dostosowane</td><td>Zakupione od http://kmtco.com.tw/</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Roztwór przepuszczalny</td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>LEO</td><td>LEO-300S</td><td>Ultradźwiękowa myjka sterykalna</td></tr><tr><td>Komora próżniowa</td><td>DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.</td><td>DOV-30</td><td>Suszarka próżniowa</td></tr><tr><td>Biała wtyczka doszczelna</td><td>IDEX Zdrowie & Science</td><td>P-316</td><td>1/4-28 Płasko-Dno, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html</td></tr></tbody></table>

różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Fizjologiczne pola elektryczne (EF) odgrywają istotną rolę w migracji, różnicowaniu, podziale i śmierci komórek. W artykule opisano mikroprzepływowy system hodowli komórek, który został wykorzystany do długoterminowego badania różnicowania komórek przy użyciu mikroskopii. System mikroprzepływowy składa się z następujących głównych elementów: optycznie przezroczystego układu elektrotaktycznego, przezroczystej grzałki tlenku indu i cyny (ITO), pompy do napełniania pożywki hodowlanej, zasilacza elektrycznego, wzmacniacza mocy wysokiej częstotliwości, multipleksera EF, programowalnego stopnia z napędem silnikowym X-Y-Z oraz mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym wyposażonego w kamerę cyfrową. System mikroprzepływowy jest korzystny w upraszczaniu ogólnej konfiguracji eksperymentalnej, a co za tym idzie, zużycia odczynnika i próbki. Praca ta polega na różnicowaniu nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych stymulacją impulsami prądu stałego (DC). W pożywce podtrzymującej komórki macierzyste mysie NPC (mNPC) różnicowały się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty po stymulacji impulsem DC. Wyniki sugerują, że proste leczenie impulsem prądu stałego może kontrolować los mNPC i może być wykorzystane do opracowania strategii terapeutycznych w zaburzeniach układu nerwowego. System może być używany do hodowli komórkowych w wielu kanałach, do długotrwałej stymulacji EF, do obserwacji morfologicznej komórek oraz do automatycznej akwizycji obrazów poklatkowych. Ten układ mikroprzepływowy nie tylko skraca wymagany czas eksperymentu, ale także zwiększa dokładność kontroli nad mikrośrodowiskiem.

Szczegółowa konfiguracja chipa MOE została przedstawiona na Ryc. 1. Chip mikrofluidyczny zapewnia korzystne rozwiązanie w celu zmniejszenia rozmiaru zestawu doświadczalnego, objętości próbek oraz objętości odczynników. Chip MOE został zaprojektowany tak, aby umożliwić jednoczesne przeprowadzenie trzech niezależnych eksperymentów stymulacji EF oraz kilku warunków immunobarwienia w ramach jednego badania (Ryc. 3). Ponadto chip MOE,...

W tym badaniu prezentujemy protokół różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego (DC) w systemie mikroprzepływowym.

Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

W pracy przedstawiono protokół różnicowania nerwowych komórek prekursorowych indukowanego wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego w układzie mikroprzepływowym. Technika ta zapewnia korzystne podejście do skrócenia czasu przygotowania eksperymentu, objętości próbki i objętości odczynnika. Ponadto chip MOE nadaje się do obserwacji w mikroskopii konfokalnej.Proste leczenie impulsami prądu stałego może kontrolować los mysich nerwowych komórek prekursorowych i może być wykorzystane do opracowania strategii terapeutycznych w zaburzeniach układu nerwowego. Na początek narysuj wzory dla poszczególnych warstw PMMA i taśmy dwustronnej za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Włącz rysik laserowy na dwutlenek węgla i podłącz go do komputera osobistego.Otwórz plik zaprojektowanego wzorca za pomocą oprogramowania. Umieść arkusze PMMA lub taśmę dwustronną na platformie rysika laserowego, a następnie ustaw ostrość laser na powierzchni arkuszy PMMA lub taśmie dwustronnej za pomocą narzędzia do automatycznego ustawiania ostrości. Wybierz rysik laserowy jako drukarkę, a następnie użyj rysika laserowego, aby rozpocząć bezpośrednią ablację na arkuszu PMMA lub taśmie dwustronnej.Usuń folię ochronną z arkuszy PMMA i oczyść powierzchnię za pomocą gazowego azotu. Aby połączyć ze sobą wiele warstw arkuszy PMMA, ułóż trzy kawałki jednomilimetrowych arkuszy PMMA i zwiąż je pod ciśnieniem pięciu kilogramów na centymetr kwadratowy w spoiwa termicznym przez 30 minut w temperaturze 110 stopni Celsjusza, aby utworzyć zespół kanału przepływu lub stymulacji elektrycznej. Przyklej 12 sztuk adapterów do poszczególnych otworów w pierwszej warstwie zespołu chipów MOE za pomocą szybko działającego kleju cyjanoakrylowego.Zdezynfekuj jednomilimetrowe podłoża PMMA, taśmę dwustronną i trzymilimetrowy PMMA klasy optycznej za pomocą promieniowania ultrafioletowego przez 30 minut przed montażem chipa. Przyklej jednomilimetrowe podłoża PMMA do trzymilimetrowego PMMA klasy optycznej za pomocą taśmy dwustronnej, aby zakończyć montaż PMMA. Oczyszczoną pokrywę przyklej do zespołu PMMA za pomocą taśmy dwustronnej.Uszczelnij otwory adapterów mostka agarowego białymi zatyczkami dokręcanymi palcami. Podłącz złącze z płaskim dnem do zespołu chipa MOE za pomocą adapterów wlotowych i wylotowych medium, a następnie podłącz stożkowy adapter Luer do trójdrożnych kurków. Dodać dwa mililitry 0,01% roztworu PLL za pomocą trzymililitrowej strzykawki, która łączy się z trójdrożnym kurkiem wlotu pożywki, i podłączyć pustą trzymililitrową strzykawkę do trójdrogowego kranu wylotu pożywki.Wypełnij obszary hodowli komórkowej roztworem PLL i powoli pompuj roztwór powlekający tam iz powrotem. Zamknij dwa trójdrogowe zawory odcinające, aby uszczelnić roztwór wewnątrz regionów hodowli. Inkubuj chip MOE w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w inkubatorze wypełnionym atmosferą 5% dwutlenku węgla.Otwórz dwa trójdrogowe zawory odcinające i wypłucz pęcherzyki w kanałach, ręcznie pompując roztwór powlekający tam iz powrotem w kanale za pomocą dwóch strzykawek. Narysuj trzy mililitry kompletnej pożywki do trzymililitrowej strzykawki, która łączy się z trójdrożnym zaworem odcinającym wlotu pożywki i dodaj go, aby zastąpić roztwór powlekający w obszarach hodowli komórkowych. Wymień białą wtyczkę dokręcaną palcami na adapter Luer i wstrzyknij 3% gorącej agarozy, aby napełnić adapter.Podłącz strzykawkę Luer lock do adaptera Luer i wstrzyknij 3% gorącej agarozy przez czarne gumowe bongo, aby napełnić strzykawkę Luer lock. Odczekaj 10 do 20 minut, aż agaroza ostygnie i stężeje. Zainstaluj układ MOE z zasiewaniem ogniw na przezroczystej grzałce ITO, która jest przymocowana do programowalnego stopnia z napędem XYZ utrzymywanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wlej mNPC, ręcznie pompując do chipa MOE przez wylot pożywki, a następnie inkubuj chip MOE z nasionami komórek na grzałce ITO przez cztery godziny. Użyj przewodów elektrycznych, aby podłączyć multiplekser EF do układu MOE za pomocą elektrod na chipie. Podłącz multiplekser EF i generator funkcyjny do wzmacniacza, aby wyprowadzać impulsy prądu stałego o fali prostokątnej.Usuń wszystkie płaskie dolne złącze i adaptery z chipa MOE i napełnij adaptery PBS, a następnie uszczelnij otwory adaptera parafilmem. Po barwieniu immunologicznym obserwuj komórki za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Stymulacja impulsem prądu stałego spowodowała jednoczesne różnicowanie się mNPC w neurony, astrocyty i oligodendrocyty w pożywce podtrzymującej komórki macierzyste.Przedstawiono tutaj procentowy udział neuronów, astrocytów i oligodendrocytów w grupie kontrolnej i w grupie stymulacji. Po leczeniu impulsem DC, mNPC wyrażały znacznie dużą liczbę neuronów w DIV 7, astrocyty w DIV 3 i oligodendrocyty w DIV 7 i DIV 14 były obecne na stosunkowo wyższych poziomach w grupach stymulacji niż w grupie kontrolnej. Neurosfery utworzone przez 30 do 40 komórek są preferowane do inicjowania różnicowania mNPC.Nadmierny wzrost mNPC upośledza przeżycie komórek podczas procesu różnicowania.

electric-field-induced-neural-precursor-cell-differentiation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

W tym protokole pokazujemy, jak konstruować niestandardowe komory, które pozwalają na zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego, aby umożliwić obrazowanie poklatkowe translokacji komórek prekursorowych pochodzenia nerwowego w dorosłym mózgu podczas galwanotaksji.

Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

Ten film demonstruje użycie mikroprzepływowego chipa pokrytego macierzą zewnątrzkomórkową do różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych lub NPC za pomocą stymulacji elektrycznej. Po wysianiu i przyleganiu do pokrytego obszaru NPC rosną, a zastosowanie prądu stałego wyzwala ich różnicowanie w neurony, astrocyty i oligodendrocyty.

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych wywołane stymulacją elektryczną

Film pokazuje tworzenie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego. Neuronalne komórki prekursorowe i komórki progenitorowe mięśni są umieszczane w różnych studzienkach w urządzeniu i pozostawiane do dojrzewania odpowiednio w neuronach ruchowych i miotubach. Stworzenie gradientu objętościowego i chemicznego prowadzi do rozwoju aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generowanie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Film pokazuje różnicowanie nerwowych komórek macierzystych (NSC) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego składającego się z przedziału somatycznego i aksonalnego oddzielonych barierą mikrorowkową. NSC są wprowadzane do kompartmentu somatycznego i mogą przylegać. NSC różnicują się w neurony wewnątrz przedziału somatycznego i rozciągają aksony przez barierę mikrorowkową do przedziału aksonalnego.

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych do neuronów za pomocą przedziałowego urządzenia mikroprzepływowego

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Ten protokół demonstruje użycie podzielonych na przedziały mikroprzepływowych chipów, formowanych wtryskowo w cyklicznym kopolimerze olefin, do hodowanych neuronów zróżnicowanych od ludzkich komórek macierzystych. Chipy te są wstępnie zmontowane i łatwiejsze w użyciu niż tradycyjne urządzenia z poli(dimetylosiloksanu) z przedziałami. Opisano tutaj wiele powszechnych paradygmatów eksperymentalnych, w tym znakowanie wirusów, izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Podział neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych na wstępnie zmontowane plastikowe chipy mikroprzepływowe

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Komórki raka piersi wykazują inne właściwości dielektryczne w porównaniu do komórek nabłonka piersi niebędących nowotworami. Postawiono hipotezę, że w oparciu o tę różnicę we właściwościach dielektrycznych, obie populacje można rozdzielić do celów immunoterapii. Aby to wesprzeć, modelujemy urządzenie mikroprzepływowe do sortowania komórek MCF-7 i MCF-10A.

Urządzenie mikroprzepływowe do separacji komórek raka piersi bez przerzutów (MCF-7) i nienowotworowych (MCF-10A) za pomocą dielektroforezy prądu przemiennego

Poznaj protokół różnicowania komórek prekursorowych neuronów przy użyciu stymulacji impulsami prądu stałego w mikroprzepływowym układzie MOE. Ta metoda skraca czas przygotowania eksperymentu i zużycie odczynników.

Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych

Przeglądaj więcej filmów