Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych
14 kwietnia 2021
W tym badaniu prezentujemy protokół różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego (DC) w systemie mikroprzepływowym.
W pracy przedstawiono protokół różnicowania nerwowych komórek prekursorowych indukowanego wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego w układzie mikroprzepływowym. Technika ta zapewnia korzystne podejście do skrócenia czasu przygotowania eksperymentu, objętości próbki i objętości odczynnika. Ponadto chip MOE nadaje się do obserwacji w mikroskopii konfokalnej.
Proste leczenie impulsami prądu stałego może kontrolować los mysich nerwowych komórek prekursorowych i może być wykorzystane do opracowania strategii terapeutycznych w zaburzeniach układu nerwowego. Na początek narysuj wzory dla poszczególnych warstw PMMA i taśmy dwustronnej za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Włącz rysik laserowy na dwutlenek węgla i podłącz go do komputera osobistego.
Otwórz plik zaprojektowanego wzorca za pomocą oprogramowania. Umieść arkusze PMMA lub taśmę dwustronną na platformie rysika laserowego, a następnie ustaw ostrość laser na powierzchni arkuszy PMMA lub taśmie dwustronnej za pomocą narzędzia do automatycznego ustawiania ostrości. Wybierz rysik laserowy jako drukarkę, a następnie użyj rysika laserowego, aby rozpocząć bezpośrednią ablację na arkuszu PMMA lub taśmie dwustronnej.
Usuń folię ochronną z arkuszy PMMA i oczyść powierzchnię za pomocą gazowego azotu. Aby połączyć ze sobą wiele warstw arkuszy PMMA, ułóż trzy kawałki jednomilimetrowych arkuszy PMMA i zwiąż je pod ciśnieniem pięciu kilogramów na centymetr kwadratowy w spoiwa termicznym przez 30 minut w temperaturze 110 stopni Celsjusza, aby utworzyć zespół kanału przepływu lub stymulacji elektrycznej. Przyklej 12 sztuk adapterów do poszczególnych otworów w pierwszej warstwie zespołu chipów MOE za pomocą szybko działającego kleju cyjanoakrylowego.
Zdezynfekuj jednomilimetrowe podłoża PMMA, taśmę dwustronną i trzymilimetrowy PMMA klasy optycznej za pomocą promieniowania ultrafioletowego przez 30 minut przed montażem chipa. Przyklej jednomilimetrowe podłoża PMMA do trzymilimetrowego PMMA klasy optycznej za pomocą taśmy dwustronnej, aby zakończyć montaż PMMA. Oczyszczoną pokrywę przyklej do zespołu PMMA za pomocą taśmy dwustronnej.
Uszczelnij otwory adapterów mostka agarowego białymi zatyczkami dokręcanymi palcami. Podłącz złącze z płaskim dnem do zespołu chipa MOE za pomocą adapterów wlotowych i wylotowych medium, a następnie podłącz stożkowy adapter Luer do trójdrożnych kurków. Dodać dwa mililitry 0,01% roztworu PLL za pomocą trzymililitrowej strzykawki, która łączy się z trójdrożnym kurkiem wlotu pożywki, i podłączyć pustą trzymililitrową strzykawkę do trójdrogowego kranu wylotu pożywki.
Wypełnij obszary hodowli komórkowej roztworem PLL i powoli pompuj roztwór powlekający tam iz powrotem. Zamknij dwa trójdrogowe zawory odcinające, aby uszczelnić roztwór wewnątrz regionów hodowli. Inkubuj chip MOE w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w inkubatorze wypełnionym atmosferą 5% dwutlenku węgla.
Otwórz dwa trójdrogowe zawory odcinające i wypłucz pęcherzyki w kanałach, ręcznie pompując roztwór powlekający tam iz powrotem w kanale za pomocą dwóch strzykawek. Narysuj trzy mililitry kompletnej pożywki do trzymililitrowej strzykawki, która łączy się z trójdrożnym zaworem odcinającym wlotu pożywki i dodaj go, aby zastąpić roztwór powlekający w obszarach hodowli komórkowych. Wymień białą wtyczkę dokręcaną palcami na adapter Luer i wstrzyknij 3% gorącej agarozy, aby napełnić adapter.
Podłącz strzykawkę Luer lock do adaptera Luer i wstrzyknij 3% gorącej agarozy przez czarne gumowe bongo, aby napełnić strzykawkę Luer lock. Odczekaj 10 do 20 minut, aż agaroza ostygnie i stężeje. Zainstaluj układ MOE z zasiewaniem ogniw na przezroczystej grzałce ITO, która jest przymocowana do programowalnego stopnia z napędem XYZ utrzymywanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Wlej mNPC, ręcznie pompując do chipa MOE przez wylot pożywki, a następnie inkubuj chip MOE z nasionami komórek na grzałce ITO przez cztery godziny. Użyj przewodów elektrycznych, aby podłączyć multiplekser EF do układu MOE za pomocą elektrod na chipie. Podłącz multiplekser EF i generator funkcyjny do wzmacniacza, aby wyprowadzać impulsy prądu stałego o fali prostokątnej.
Usuń wszystkie płaskie dolne złącze i adaptery z chipa MOE i napełnij adaptery PBS, a następnie uszczelnij otwory adaptera parafilmem. Po barwieniu immunologicznym obserwuj komórki za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Stymulacja impulsem prądu stałego spowodowała jednoczesne różnicowanie się mNPC w neurony, astrocyty i oligodendrocyty w pożywce podtrzymującej komórki macierzyste.
Przedstawiono tutaj procentowy udział neuronów, astrocytów i oligodendrocytów w grupie kontrolnej i w grupie stymulacji. Po leczeniu impulsem DC, mNPC wyrażały znacznie dużą liczbę neuronów w DIV 7, astrocyty w DIV 3 i oligodendrocyty w DIV 7 i DIV 14 były obecne na stosunkowo wyższych poziomach w grupach stymulacji niż w grupie kontrolnej. Neurosfery utworzone przez 30 do 40 komórek są preferowane do inicjowania różnicowania mNPC.
Nadmierny wzrost mNPC upośledza przeżycie komórek podczas procesu różnicowania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół różnicowania komórek prekursorowych neuronów indukowanego stymulacją impulsami prądu stałego w systemie mikroprzepływowym. Technika ta skraca czas przygotowania układu eksperymentalnego oraz zmniejsza objętość próbek i odczynników, co czyni ją wydajną w zastosowaniach badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Mikrofluidyka
Wstęp
- Komórki prekursorowe neuronów (NPCs) są kluczowe dla zrozumienia rozwoju układu nerwowego.
- Stymulacja impulsami prądu stałego może wpływać na różnicowanie komórek.
- Systemy mikroprzepływowe umożliwiają precyzyjną kontrolę warunków eksperymentalnych.
- Podejście to może pomóc w opracowywaniu terapii zaburzeń układu nerwowego.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnego protokołu różnicowania NPC.
- Wykorzystanie stymulacji prądem stałym jako metody kontrolowania losu komórek.
- Wykazanie skuteczności systemu mikroprzepływowego w badaniach z zakresu neuronauki.
Zastosowane metody
- Projektowanie wzorów dla warstw PMMA oraz taśmy dwustronnej.
- Wykorzystanie laserowego skrybera CO₂ do procesu wytwarzania.
- Zastosowanie stymulacji impulsowej prądem stałym w komórkach NPC.
- Przeprowadzenie obserwacji za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu analizy.
Główne wyniki
- Skuteczne różnicowanie NPC z wykorzystaniem proponowanego protokołu.
- Skrócenie czasu przygotowania układu doświadczalnego i zmniejszenie zużycia zasobów.
- Wykazanie możliwości zastosowania chipa MOE w mikroskopii.
- Potencjalne zastosowania w strategiach terapeutycznych zaburzeń układu nerwowego.
Wnioski
- Protokół oferuje usprawnione podejście do różnicowania NPC.
- Stymulacja prądem stałym jest skuteczna w kontrolowaniu losu komórek.
- Systemy mikroprzepływowe zwiększają efektywność eksperymentalną w neuronauce.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta platforma mikroprzepływowa umożliwia precyzyjną kontrolę różnicowania prekursorowych komórek neuronalnych za pomocą stymulacji impulsami prądu stałego, oferując skalowalny i efektywny zasobowo model do walidacji celów w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Poprzez ograniczenie złożoności eksperymentalnej oraz zużycia odczynników, system wspiera wczesny etap ograniczania ryzyka mechanistycznego oraz zwiększa pewność prognostyczną strategii modulacji losu komórek. Kompatybilność systemu z długotrwałą stymulacją i zautomatyzowanym obrazowaniem pozwala na jego integrację z procesami odkrywczymi skoncentrowanymi na terapiach układu nerwowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie sygnałów elektrycznych jako regulatorów losu komórek prekursorowych neuronów, co wspiera testowanie hipotez dotyczących celów w szlakach neurorozwojowych.
- Wartość operacyjna: Redukuje objętość próbek i odczynników dzięki ograniczeniu mikrofluidycznemu, co obniża koszty we wczesnych kampaniach przesiewowych celów terapeutycznych.
- Wartość prognostyczna: Zapewnia ilościowe odczyty różnicowania neuronalnego, astrocytycznego i oligodendrocytycznego, umożliwiając podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o dane dotyczące celów modulatoryjnych.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje standaryzowane, powtarzalne wyniki różnicowania w kontrolowanych parametrach pola elektrycznego, co jest odpowiednie do optymalizacji testów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia multipleksowe testowanie warunków dzięki konstrukcjom opartym na kanałach, co zwiększa przepustowość podczas oceny związków lub bodźców.
- Gotowość do analizy: Wspiera długoterminowe hodowle i obrazowanie poklatkowe, umożliwiając profilowanie kinetyki dynamiki różnicowania w celu walidacji testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystanie mysich komórek prekursorowych neuronów w zdefiniowanym mikrośrodowisku zwiększa istotność procesu w odniesieniu do różnicowania neuronalnego in vivo.
- Modelowanie przedkliniczne: Umożliwia generowanie linii glejowych i neuronalnych ze wspólnego progenitora, co jest przydatne w modelowaniu zaburzeń układu nerwowego.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Pozwala na ocenę preferencji różnicowania pod wpływem stymulacji, co dostarcza informacji do profilowania mechanistycznego bezpieczeństwa i skuteczności.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, w szczególności w fazy walidacji punktów uchwytu oraz identyfikacji związków wiodących, gdzie kluczowe jest zrozumienie mechanizmów działania regulatorów losu komórek. Wspiera ona kampanie przesiewowe, zapewniając kontrolowany i mierzalny system oceny aktywności biologicznej modulatorów elektrycznych lub farmakologicznych. Wyniki generowane przez platformę — wskaźniki różnicowania specyficzne dla danej linii komórkowej — są przekazywane do potoków analitycznych służących do priorytetyzacji punktów uchwytu z predykcyjną pewnością w zakresie mechanizmów naprawy neuronalnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków sygnalizacji bioelektrycznej w komórkach prekursorowych neuronów, zmniejszając niejednoznaczność w określaniu mechanizmu docelowego.
- Screening: Umożliwia powtarzalne, ilościowe testy różnicowania pod wpływem określonej stymulacji elektrycznej, co zwiększa wiarygodność analizy.
- Analityka: Dostarcza mierzalne punkty końcowe (np. % neuronów, astrocytów, oligodendrocytów) do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Modeluje dynamikę różnicowania istotną dla zaburzeń układu nerwowego, wspierając ciągłość badań przedklinicznych.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Zaprojektowano do wielokrotnego wykorzystania w wielu warunkach doświadczalnych, co sprzyja standaryzacji i spójności międzyprojektowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez wyizolowanie stymulacji elektrycznej jako zdefiniowanej zmiennej w determinacji losu komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły różnicowania dzięki precyzji mikroprzepływowej, poprawiając odtwarzalność w różnych ośrodkach i zespołach.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając wczesnych odczytów mechanistycznych dotyczących determinacji linii komórkowej, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów modulujących różnicowanie neuronalne w oparciu o dostosowane do ryzyka podejście, poprawiając efektywność kapitałową w portfolio z zakresu neuronauki.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie montażu urządzeń mikroprzepływowych, elektrofizjologii oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych.
- Metoda zależy od dostępu do narzędzi do wytwarzania laserowego, grzałek ITO, multiplekserów EF oraz systemów mikroskopii odwróconej.
- W celu uzyskania powtarzalnych wyników konieczna jest standaryzacja parametrów elektrycznych (szerokość impulsu, częstotliwość, amplituda) we wszystkich eksperymentach.
- Adaptacja do ludzkich komórek prekursorowych neuronów może wymagać optymalizacji parametrów stymulacji i warunków hodowli.
- Praktycznymi ograniczeniami, które należy wziąć pod uwagę w badaniach nad stymulacją chroniczną, są długoterminowa stabilność elektrod oraz biofouling.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
