Name: Rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę szybkiej i powtarzalnej dyssekcji regionów móżdżku myszy, w tym jąder głębokich oraz kory półkul i wermisu. Technika umożliwia analizę ekspresji genów w poszczególnych obszarach móżdżku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Austinowi Ferro i Juao-Guilherme Rosa z laboratorium Cvetanovic za ich pomoc w rozwiązywaniu problemów z sekcjami oraz w ekstrakcji RNA i RTqPCR. Badania te są finansowane przez M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH).

1. Konfiguracja
<ol>
	<li>Zbierz niezbędny sprzęt, w tym nożyczki do dekapitacji, kleszcze, nożyczki do preparacji, nożyczki naczyniowe, mikroszpatułkę, strzałkową matrycę mózgu myszy, żyletki, końcówki do pipet 200 μl, szklaną szalkę Petriego, szklaną szkiełko i wiadro na lód. Rozłóż cały sprzęt na podkładce chłonnej.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego, szklany talerz i macierz mózgową na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą żyletki ustawionej pod prostopadłym kątem odetnij około 5 mm końcówki jednej końcówki pipety o pojemności 200 μl. To sprawia, że rozmiar otworu na końcu końcówki ma około 1 mm szerokości. Powinno to wystarczyć do wybicia DCN. Ale można to również dostosować w razie potrzeby w zależności od sekcji. Przygotuj wiele końcówek do łatwej wymiany i regulacji.</li>
	<li>Oznacz probówki do mikrofug o pojemności 1,5 ml z identyfikacją zwierzęcia i obszarem móżdżku (cztery probówki na zwierzę).</li>
	<li>Napełnij pojemnik cryosafe ciekłym azotem, aby błyskawicznie zamrozić tkankę po ekstrakcji.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja i sekcja mózgu
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetów ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Minnesoty.
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przy użyciu 5% ekspozycji na CO2 . Po ustaniu oddychania wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Odetnij głowę myszy nożyczkami do dekapitacji i wyrzuć tuszę do odpowiedniego pojemnika.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie żyletką wzdłuż przyśrodkowej linii strzałkowej głowy, zaczynając od nosa i kontynuując aż do tyłu. Oddziel skórę, rozchylając się po obu stronach linii środkowej. Użyj żyletki, aby odciąć mięsień z każdej strony, przecinając kanały słuchowe.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych przytnij wszystkie obszary rdzenia kręgowego, aż do miejsca, w którym pień mózgu styka się z móżdżkiem, uważając, aby nie uszkodzić móżdżku.</li>
	<li>Włóż jedno z ostrzy nożyczek naczyniowych w przestrzeń między pniem mózgu a kręgosłupem i przetnij w kierunku kanału słuchowego, podnosząc nożyczki, aby czysto przeciąć kość, ale ograniczyć uszkodzenie tkanki.</li>
	<li>Kontynuuj cięcie wzdłuż krawędzi czaszki w kierunku opuszki węchowej, kontynuując podnoszenie podczas cięcia, aby ograniczyć uszkodzenie tkanki mózgowej.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie oderwij tylną część czaszki, odsłaniając tylną część mózgu i móżdżku.</li>
	<li>Używając kleszczy wzdłuż krawędzi czaszki, która właśnie została przecięta, oderwij resztę czaszki w górę i nad mózgiem. Ten krok powinien usunąć większość czaszki, odsłaniając mózg.</li>
	<li>Przytnij resztę czaszki nożyczkami naczyniowymi i kleszczami, usuwając większość czaszki z górnej części mózgu.</li>
	<li>Za pomocą mikroszpatułki lekko unieś mózg, zgarnij go i przesuń w górę, aby usunąć opuszki węchowe z pozostałej czaszki i odłączyć włókna przewodu wzrokowego. W tym momencie mózg powinien łatwo się uwolnić.</li>
	<li>Umieść mózg na szalce Petriego siedząc na lodzie i usuń pozostałą czaszkę lub inne szczątki.</li>
	<li>Za pomocą mikroszpatułki delikatnie umieść mózg w macierzy mózgowej grzbietem do góry. Poświęć trochę czasu, aby upewnić się, że jest ustawiony na poziomie w macierzy, zwłaszcza że linia środkowa znajduje się w środku macierzy. Ta matryca jest przeznaczona dla tkanki mózgowej dorosłej myszy, tkanka od młodszych lub chorych zwierząt może spoczywać niżej w matrycy, ale nadal powinno być możliwe osiągnięcie powtarzalnych wyników w próbkach.</li>
	<li>Umieść jedną żyletkę wzdłuż strzałkowej linii środkowej, upewniając się, że ostrze dociska się do samego dołu matrycy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
	<li>Umieść kolejną żyletkę 1 mm z boku pierwszego ostrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Umieść dwa kolejne ostrza w odległości 1 mm od siebie. Efektem końcowym powinny być trzy ostrza umieszczone po jednej stronie mózgu, wszystkie oddalone od siebie o 1 mm. Zrób to samo z drugą stroną. W sumie 7 ostrzy zostanie rozmieszczonych w odległości 1 mm od siebie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Ostrożnie chwyć przedni i tylny koniec żyletek i podnieś prosto z matrycy. Tkankę znajdującą się na zewnątrz żyletek można wyrzucić.</li>
	<li>Powoli oddzielaj jedną żyletkę na raz od pozostałych, uważając, aby nie uszkodzić odcinków tkanki.</li>
	<li>Ostrożnie zsuń fragment tkanki z żyletki na szkiełko za pomocą mikroszpatułki. W sumie będzie to sześć strzałkowych sekcji mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>4 najbardziej boczne sekcje będą miały widoczny DCN (fioletowe pole, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). Aby wyizolować DCN, przytrzymaj przyciętą końcówkę pipety o pojemności 200 μl prostopadle do DCN i mocno dociśnij tkankę, kołysząc się we wszystkich kierunkach, aby w pełni wypreparować DCN z otaczającej tkanki. Podnieś prosto z powrotem, aby czysto usunąć DCN i wizualnie potwierdzić obecność tkanki w końcówce.</li>
	<li>Umieść jeden palec na górze końcówki i popchnij w dół, powodując wybrzuszenie tkanki. Umieść końcówkę w prawidłowo oznakowanej probówce do mikrofugi i upewnij się, że dziurkacz do tkanek jest umieszczony na dnie tuby. Powtórzyć czynności 2.17 dla pozostałych trzech sekcji, umieszczając stemple DCN w tej samej probówce. Umieść probówkę w ciekłym azocie, aby błyskawicznie zamrozić. Reprezentacja rozmiaru każdego stempla w <silna klasa="xfig">Rysunek 1E.</li>
	<li>Sekcje, z których wyekstrahowano DCN, kwalifikują się jako półkula móżdżku. W tych sekcjach odepchnij resztę tkanki mózgowej wokół móżdżku. Użyj kleszczy i delikatnie podnieś te sekcje kory móżdżku półkuli i umieść w odpowiedniej probówce do mikrofuge. Błyskawiczne zamrożenie.</li>
	<li>Dla dwóch ostatnich sekcji robaka (jasnoniebieska ramka, <silna klasa="xfig">Ryc. 1D) odepchnij otaczającą tkankę mózgową, pozostawiając tylko móżdżek. Za pomocą żyletki wykonaj nacięcie oddzielające przednie zraziki od tylnych zrazików. Cięcie powinno nastąpić tuż po utworzeniu zrazika 6 i nie powinno obejmować zrazika 10 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść przednie odcinki kory móżdżku i tylne odcinki kory móżdżku w odpowiednich rurkach do mikrofuge i błyskawicznie zamroź, pozostawiając rurki w ciekłym azocie na 5 minut. Stąd przejdź do ekstrakcji RNA lub może przechowywać probówki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja RNA 
UWAGA: Ten protokół jest zmodyfikowany w stosunku do protokołu Cold Spring Harbor dla ekstrakcji RNA za pomocą TRIzol20. TRIzol rozpuszcza materiał biologiczny, umożliwiając ekstrakcję RNA.
<ol>
	<li>Umieść probówki do mikrofuge w lodzie, aby zapobiec zbyt szybkiemu rozmrażaniu tkanki, nałóż 150 μl zimnego TRIzolu do probówki do mikrofugi. Homogenizować za pomocą wysterylizowanego tłuczka. Po homogenizacji tkanki pipetuj roztwór w górę iw dół, aby upewnić się, że nie ma nienaruszonej pozostałej tkanki. Następnie rozdrobnij wszelkie małe kawałki tkanki, wciągając je kilka razy do strzykawki insulinowej.</li>
	<li>Dodaj kolejne 350 μl TRIzolu i pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać. Odstawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
	<li>Do probówki dodać 150 μl chloroformu i energicznie wstrząsnąć, a następnie odstawić na 2-3 minuty. Chloroform rozdziela homogenizowany roztwór tkankowy na fazy (RNA, DNA i białko).</li>
	<li>Wirować przy 12 000 x g, w temperaturze 15°C, przez 10 minut. Upewnij się, że wszystkie rurki są w tej samej orientacji.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij probówki i ustaw temperaturę wirówki na 4°C. Do nowej probówki (jest to RNA), należy usunąć tylko klarowną fazę wodną (RNA), uważając, aby nie zakłócić nieprzezroczystej interfazy (DNA). Najniższa faza będzie czerwona i będzie zawierać białko. Pozostały roztwór w probówkach można zachować lub wyrzucić.</li>
	<li>Dodać 100% alkoholu izopropylowego w stosunku 1:2 (w przypadku usunięcia 200 ul fazy wodnej dodać 100 μl alkoholu izopropylowego). Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Odstaw w temperaturze pokojowej na 10 minut. Alkohol izopropylowy wytrąca RNA z roztworu.</li>
	<li>Wirować przy 12 000 x g, w temperaturze 4°C, przez 10 minut. Pamiętaj, aby umieścić wszystkie rurki w tej samej orientacji, aby ułatwić wizualizację granulki. Powstała osadka będzie wyekstrahowanym RNA.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć probówki, usunąć sklarowany osad pipetą, uważając, aby nie naruszyć osadu. Osad jest nieco żelowy i będzie trudny do zobaczenia, ale powinien być w stanie oszacować, gdzie się znajduje, na podstawie orientacji probówek w wirówce.</li>
	<li>Po usunięciu całego supernatantu dodać 500 μl 75% etanolu, krótko zmieszać i odwirować przy 7500 x g, w temperaturze 4°C, przez 5 minut. Etanol dodatkowo myje granulki.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu. Pozostawić otwarte nakrętki w celu wysuszenia próbki. Zwykle zajmuje to 5-10 minut, ale może się różnić w zależności od tego, ile etanolu pozostało na granulce. Nie suszyć zbyt mocno.</li>
	<li>Po wyschnięciu ponownie zawiesić granulki w wodzie wolnej od DNaz. Dodać 20 μl do próbek dla DCN i 30 μl dla wszystkich pozostałych.</li>
	<li>Po ponownym zawieszeniu próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub przejść do dalszych badań.</li>
</ol>
4. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RTqPCR)
<ol>
	<li>Przed tym krokiem konieczne będzie poddanie RNA działaniu DNazy w celu usunięcia genomowego DNA i wygenerowania cDNA za pomocą iScript firmy BioRad. Pamiętaj, aby znormalizować stężenie RNA przed wytworzeniem cDNA. Ponadto ważne jest, aby zoptymalizować startery pod kątem qPCR. Postępuj zgodnie z opisanymi tutaj metodami, aby wykonać ten krok21. Krótki opis qPCR poniżej.</li>
	<li>Wszystkie podkłady są kupowane w IDT. Sekwencje do przodu i do tyłu znajdują się w tej samej probówce z próbką i są przechowywane w stężeniu 20x. 
	Rps18 (gen kontrolny): 
	Naprzód – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' 
	Rewers – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3' 
	Parwalbumina (białko wiążące wapń, komórki hamujące): 
	Naprzód – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3' 
	Rewers – '5-AGCGTCTTTTTTTCTTTAGCAG-3' 
	Kcng4 (podjednostka kanału potasowego): 
	Naprzód – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3' 
	Rewers – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' 
	Aldolaza C (Zebrin II, różnicowo wyrażana w korze móżdżku): 
	Naprzód – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3' 
	Rewers – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3'</li>
	<li>Warunki qPCR były następujące. Okres wstępnej inkubacji, 5 minut, w temperaturze 95°C. Okres amplifikacji, 50 cykli: 10 minut w temperaturze 95°C, 10 minut w temperaturze 62°C i 10 minut w temperaturze 72°C. Okres krzywej topnienia: 5 sekund w temperaturze 95°C, jedna minuta w temperaturze 65°C, i ustaw szybkość narastania na 0,07°C/sekundę, aż do temperatury docelowej 97°C. Następnie okres schładzania przez 10 minut do 40°C. Wszystkie reakcje qPCR przeprowadzono trzykrotnie, a ekspresję genów analizowano przy użyciu 2-ΔΔCt z Rps18 jako kontroli obciążenia w celu normalizacji ekspresji genów. Jako odniesienie użyto ekstraktu z móżdżku luzem.</li>
</ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia%2Fneuron+ratio%3A+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li>
<li>Schmahmann, J. D., Caplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognition%2C+enotion%2C+and+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cognition, enotion, and the cerebellum.</a> Brain. 129 (2), 290-292 (2006).</li>
<li>Badura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+cognitive+and+social+development+require+posterior+cerebellar+activity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity.</a> eLife. 7, 36401(2018).</li>
<li>Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Transform+or+Multiple+Functionality%3F+Understanding+the+Contribution+of+the+Human+Cerebellum+across+Task+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains.</a> Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).</li>
<li>Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellum+and+Nonmotor+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellum and Nonmotor Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).</li>
<li>King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+boundaries+in+the+human+cerebellum+revealed+by+a+multi-domain+task+battery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery.</a> Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).</li>
<li>Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+the+human+cerebellum+estimated+by+intrinsic+functional+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity.</a> Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).</li>
<li>Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+movement+to+thought%3A+Anatomic+substrates+of+the+cerebellar+contribution+to+cognitive+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Brain+Mapping%22%5BJournal%5D)">From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing.</a> Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).</li>
<li>Kelly, R. M., Strick, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+Loops+with+Motor+Cortex+and+Prefrontal+Cortex+of+a+Nonhuman+Primate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).</li>
<li>Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Location+of+lesion+determines+motor+vs.+cognitive+consequences+in+patients+with+cerebellar+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%3A+Clinical%22%5BJournal%5D)">Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke.</a> NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).</li>
<li>Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-selective+vulnerability+of+the+human+cerebellum+to+Alzheimer%27s+disease+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Brain. 139 (5), (2016).</li>
<li>Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+regional+cerebellar+atrophy+in+genetic+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%3A+Clinical%22%5BJournal%5D)">Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia.</a> NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Mouse+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Cerebellum.</a> The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).</li>
<li>Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Excitability+and+Parallel+Fiber+Synaptic+Properties+of+Zebrin-Positive+and+-Negative+Purkinje+Cells+in+Lobule+VIII+of+the+Mouse+Cerebellar+Slice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513(2019).</li>
<li>Manto, M., Oulad Ben Taib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+nuclei%3A+Key+Roles+for+Strategically+Located+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures.</a> The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).</li>
<li>Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+analysis+towards+understanding+tissue+vulnerability+in+spinocerebellar+ataxia+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1.</a> eLife. , (2018).</li>
<li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+brain+region+-+dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19 (3), 504(2016).</li>
<li>Ingram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+Transcriptome+Profiles+of+ATXN1+Transgenic+Mice+Reveal+SCA1+Disease+Progression+and+Protection+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways.</a> Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).</li>
<li>Cendelin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCendelin%2C+J+%22From+mice+to+men+%3A+lessons+from+mutant+ataxic+mice%22">From mice to men : lessons from mutant ataxic mice</a>. , 1-21 (2014).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+Using+TRIzol+%28TRI+Reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li>
<li>Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglia+contribute+to+the+pathogenesis+of+spinocerebellar+ataxia+Type+1+%28SCA1%29+in+a+biphasic%2C+stage-of-disease+specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner.</a> Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).</li>
<li>Chopra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Capicua+expression+drives+regional+Purkinje+neuron+vulnerability+through+ion+channel+gene+dysregulation+in+spinocerebellar+ataxia+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana metoda umożliwia ocenę podstawowej ekspresji genów i mechanizmów molekularnych w czterech odrębnych regionach móżdżku – głębokich jądrach móżdżku (DCN), przedniej korze móżdżku robaka (CCaV), tylnej korze móżdżku robaka (CCpV) i korze móżdżku półkul (CCH). Możliwość oceny tych regionów oddzielnie poszerzy naszą wiedzę na temat heterogeniczności poszczególnych regionów móżdżku i być może rzuci światło na ich wkład w różne zachowania.
Poprzez przekrojenie całej tkanki mózgowej strzałkowo...

Móżdżek zawiera ponad połowę neuronów w mózgu i historycznie był określany jako centrum kontroli motorycznej i równowagi w mózgu1. Niedawne badania wykazały, że móżdżek odgrywa kluczową rolę w różnych innych funkcjach, w tym w poznaniu, przetwarzaniu nagrody i afekcie2,3,4,5.
Móżdżek ma dobrze opisaną anatomię: obszar kory składa się z granulek, Purkinjego i warstw molekularnych. Komórki ziarniste tworzą warstwę komórek ziarnistych i wysyłają dane wejściowe przez równoległe włókna do dendrytów komórek Purkinjego warstwy molekularnej, które również otrzymują dane wejściowe od włókien pnących pochodzących z dolnej oliwki. Komórki Purkiniego wysyłają hamujące projekcje do komórek w głębokich jądrach móżdżku (DCN), które służą jako główne wyjście z móżdżku. Wyjście tego obwodu móżdżku jest dodatkowo modulowane przez aktywność interneuronów hamujących w korze móżdżku, w tym komórek Golgiego, gwiaździstych i koszyczkowych4. Ta jednostka funkcjonalna móżdżku jest rozmieszczona we wszystkich zrazikach kory móżdżku. Pomimo tego stosunkowo jednolitego obwodu w móżdżku, dowody z literatury neuroobrazowej na temat ludzkiej neuroobrazowania i badań na pacjentach wskazują na funkcjonalną heterogeniczność móżdżku6,7.
Kora móżdżku może być podzielona na dwa główne obszary: wermisy zdefiniowane przez linię środkową i półkule boczne. Robak można dalej podzielić na płatki przednie i tylne. Te odrębne obszary móżdżku są zaangażowane w przyczynianie się do różnych zachowań. Wzorce aktywności wywołane zadaniami lub wolne od zadań sugerowały, że przednie obszary robaka bardziej przyczyniają się do funkcji motorycznych, podczas gdy tylne robaki bardziej przyczyniają się do poznania6,7. Robak jest również związany z afektem i emocjami, podczas gdy półkule móżdżku przyczyniają się do funkcji wykonawczych, wzrokowo-przestrzennych, językowych i innych funkcji mnemotechnicznych8. Ponadto badania anatomiczne dostarczyły dowodów na to, że funkcjonalnie odrębne regiony móżdżku są połączone z różnymi obszarami kory mózgowej9. Mapowanie objawów zmian ujawniło, że pacjenci z udarami wpływającymi na przednie płatki (rozciągające się do zrazika VI) mieli gorszą wydajność w zadaniach motorycznych, podczas gdy pacjenci z uszkodzeniem tylnych obszarów płata i półkul wykazywali deficyty poznawcze przy braku zespołu motorycznego móżdżku10. Wreszcie, regionalna patologia móżdżku w chorobie wskazuje, że funkcjonalnie odrębne regiony móżdżku są również różnie podatne na chorobę11,12.
Chociaż znacznie mniej zbadane, wstępne dowody wskazują na wyraźne sygnatury ekspresji genów w obszarach kory móżdżku. Ekspresja Zebryny II w komórkach Purkinjego wykazuje specyficzne dla regionu wzorce w robaku, tak że w tylnych zrazikach jest więcej komórek dodatnich Zebryny II, a mniej w przednich płatkach13. Koreluje to również z regionalnie odmienną funkcją fizjologiczną, ponieważ komórki Purkinjego ujemne Zebrin II wykazują wyższą częstotliwość wypalania tonicznego niż komórki Purkinjego, które są Zebrin II dodatnie14.
Oprócz kory móżdżku, móżdżek zawiera głębokie jądra móżdżku (DCN), które służą jako główne wyjście dla móżdżku. Jądra składają się z jąder przyśrodkowych (MN), interlokowanych (IN) i bocznych (LN). Obrazowanie funkcjonalne i badania na pacjentach wykazały, że DCN również uczestniczy w różnych zachowaniach15, ale bardzo niewiele badań analizuje zmianę ekspresji genów w DCN.
Postępy w technikach molekularnych umożliwiły ocenę regionalnej ekspresji genów w mózgu i odkryły niejednorodność między i wewnątrz różnych regionów mózgu, zarówno w stanach fizjologicznych, jak i chorobowych16. Takie badania sugerują, że móżdżek różni się od innych obszarów mózgu. Na przykład stosunek neuronów do komórek glejowych w móżdżku jest odwrócony w porównaniu z innymi obszarami mózgu1. Nawet w normalnych warunkach fizjologicznych ekspresja genów prozapalnych jest zwiększona w móżdżku w porównaniu z innymi obszarami mózgu17. Techniki molekularne okazały się również bardzo przydatne w identyfikacji szlaków, które przyczyniają się do patogenezy chorób móżdżku. Na przykład sekwencjonowanie RNA całych ekstraktów móżdżku zidentyfikowało geny zmienione w transgenicznym mysim modelu ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1 (SCA1) specyficznym dla komórek Purkinjego w porównaniu z ich kontrolami typu dzikiego. Takie dowody ujawniły kluczowe szlaki molekularne leżące u podstaw patogenezy komórek Purkinjego móżdżku i pomogły zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne18. Jednak ostatnie badania sugerują, że istnieją różnice w podatności na choroby w różnych regionach móżdżku11,12,19. Może to wskazywać, że w różnych regionach móżdżku zachodzą kluczowe zmiany, które mogą być zamaskowane lub niewykryte za pomocą ekstraktów z całego móżdżku. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania technik, które pozwolą naukowcom badać profile molekularne w różnych obszarach móżdżku.
Proponowana tutaj technika opisuje powtarzalną metodę preparowania czterech odrębnych regionów móżdżku myszy w celu wyizolowania RNA z tych regionów i zbadania regionalnych różnic w ekspresji genów. Schemat móżdżku myszy w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A podkreśla robaki na niebiesko, a półkule na żółto. W szczególności technika ta umożliwia wyizolowanie czterech regionów: głębokich jąder móżdżku (DCN) (pola z czerwonymi kropkami w <silna klasa="xfig">Ryc. 1A), kora móżdżku przedniego robaka (CCaV) (ciemnoniebieska w <silna klasa="xfig">Ryc. 1A), kora móżdżku tylnego robaka (CCpV) (jasnoniebieska w <silna klasa="xfig">Ryc. 1A) i kora móżdżku półkul (CCH) (żółta w <silna klasa="xfig">Rycina 1A)). Oceniając ekspresję genów w tych regionach oddzielnie, możliwe będzie zbadanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw dyskretnych funkcji tych różnych regionów, a także potencjalnych różnic w ich podatności na choroby.

<table><tbody><tr><td>1.5 Probówki do mikrowirówek</td><td>ThermoScietific</td><td>3456</td><td></td></tr><tr><td>100% alkohol izopropylowy</td><td>VWR Nauki przyrodnicze</td><td>1106C361</td><td></td></tr><tr><td>200 ul Końcówki do pipet</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-200</td><td></td></tr><tr><td>Matryca mózgu dorosłej myszy strzałkowa</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>RBMA-200S</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Macron</td><td>220905</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>do dekapitacji</tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>preparacyjne</tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Szkiełko szklane Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>(do elektroforezy)</td><td>Homogenizator BIORAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimble</td><td>6HAZ6</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro</td><td></td><td></td><td></td> na lód</tr><tr><td>Strzykawka insulinowa (.5ml)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv zestaw cDNA do RT-qPCR</td><td>BIORAD</td><td>1725037</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>do nosa</tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer do aldolazy C</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58>43415246</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer dla Kcng4</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.56a.9448518</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer dla parvalbuminy</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.7596729</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer Rps18&nbsp;</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.12109666</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza jednoostrzowe</td><td>Litera GEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne tłuczki do użytku syglerowego</td><td>FisherScientific</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Odczynnik</td><td>Ambion by Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td> naczyniowe</tr></tbody></table>

rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Móżdżek odgrywa ważną rolę w kilku kluczowych funkcjach, takich jak kontrola ruchu, równowaga, poznanie, nagroda i afekt. Badania obrazowe wskazują, że różne regiony móżdżku przyczyniają się do tych różnych funkcji. Badania molekularne badające regionalne różnice móżdżku pozostają w tyle, ponieważ są one w większości wykonywane na całych ekstraktach móżdżku, maskując w ten sposób wszelkie różnice w określonych regionach móżdżku. Tutaj opisujemy technikę powtarzalnego i szybkiego preparowania czterech różnych obszarów móżdżku: głębokich jąder móżdżku (DCN), przedniej i tylnej kory móżdżku oraz kory móżdżku półkul. Wyodrębnienie tych odrębnych regionów pozwala na zbadanie mechanizmów molekularnych, które mogą leżeć u podstaw ich unikalnego wkładu w równowagę, ruch, afekt i poznanie. Technika ta może być również wykorzystana do zbadania różnic w patologicznej podatności tych konkretnych regionów w różnych modelach chorób myszy.

Do tych eksperymentów wykorzystano cztery jedenastotygodniowe samice myszy typu dzikiego C57/Black6. Jedną mysz wykorzystano do przeprowadzenia pełnej sekcji móżdżku, określanej jako „cały móżdżek” (bulk cerebellum), co pozwoliło na porównanie poziomów RNA w wysekcjonowanych regionach z pełną sekcją. Pozostałe trzy myszy wykorzystano do przeprowadzenia sekcji móżdżku opisanej w niniejszym protokole. Wykorzystanie trzech myszy pozwala zapewnić, że trendy wykryte w poziomach RNA są powtarza...

Różne regiony móżdżku są zaangażowane w różne procesy behawioralne, jednak leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne pozostają nieznane. W pracy opisano metodę powtarzalnego i szybkiego preparowania kory móżdżku półkul, przednich i tylnych obszarów robaka oraz głębokich jąder móżdżku w celu zbadania różnic molekularnych poprzez wyizolowanie RNA i zbadanie różnic w ekspresji genów.

Rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Tradycyjne badania molekularne móżdżku zostały przeprowadzone na całych ekstraktach móżdżku, które mogą maskować wszelkie różnice między określonymi regionami móżdżku. Protokół ten umożliwia osobną ocenę różnych regionów móżdżku i pozwala na zbadanie mechanizmów molekularnych, które mogą leżeć u podstaw ich unikalnego wkładu w różnorodność zachowań i postęp choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na powtarzalne i szybkie wypreparowanie czterech obszarów móżdżku, głębokich jąder móżdżku, przedniej i tylnej kory móżdżku robaka oraz kory móżdżku półkul.Po odcięciu głowy uśpionej myszy wykonaj nacięcie żyletką wzdłuż przyśrodkowej linii strzałkowej głowy, zaczynając od nosa i kontynuując aż do tyłu. Oddziel skórę i użyj żyletki, aby odciąć mięsień z każdej strony, przecinając kanały słuchowe. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przytnij wiele obszarów rdzenia kręgowego aż do miejsca, w którym pień mózgu styka się z móżdżkiem, uważając, aby nie uszkodzić móżdżku.Włóż jedno z ostrzy nożyczek naczyniowych w przestrzeń między pniem mózgu a kręgosłupem i wytnij w kierunku kanału słuchowego, unosząc się do góry podczas cięcia, aby ograniczyć uszkodzenie tkanki. Kontynuuj cięcie wzdłuż krawędzi czaszki w kierunku opuszki węchowej. Za pomocą kleszczy delikatnie oderwij tył tej czaszki, aby odsłonić tylną część mózgu i móżdżku.Umieść kleszcze wzdłuż przeciętej krawędzi czaszki i oderwij czaszkę w górę i nad mózgiem. Przytnij resztę czaszki nożyczkami naczyniowymi i kleszczami, usuwając większość z górnej części mózgu. Lekko unieś mózg za pomocą mikroszpatułki, aby usunąć opuszki węchowe z pozostałej czaszki i odłączyć włókna przewodu wzrokowego.W tym momencie mózg powinien łatwo się uwolnić. Umieść mózg na szalce Petriego, siedząc na lodzie i usuń pozostałą czaszkę lub inne szczątki. Delikatnie umieść mózg w macierzy mózgowej grzbietem do góry.Upewnij się, że jest ustawiony na poziomie w macierzy i że linia środkowa znajduje się pośrodku. Umieść jedną żyletkę wzdłuż strzałkowej linii środkowej, upewniając się, że ostrze dociska się do samego dołu matrycy. Umieść kolejną żyletkę jeden milimetr z boku pierwszego ostrza.Umieść dwa kolejne ostrza, tak aby trzy ostrza znajdowały się po jednej stronie mózgu, wszystkie oddalone od siebie o jeden milimetr. Powtórz to po drugiej stronie. Ostrożnie chwyć przód i tył żyletek i podnieś je prosto z matrycy.Wyrzuć chusteczkę znajdującą się na zewnątrz żyletek. Powoli oddzielaj jedną żyletkę na raz od pozostałych, uważając, aby nie uszkodzić odcinków tkanki. Zsuń fragment tkanki z żyletki na szklane szkiełko za pomocą mikroszpatułki.Należy pobrać sześć strzałkowych wycinków mózgu. Czołowe sekcje boczne będą miały widoczny DCN. Aby odizolować DCN, przytrzymaj końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów prostopadle do DCN i przeciśnij w dół przez tkankę, mocno kołysząc się we wszystkich kierunkach.Podnieś pipetę do góry i wizualnie potwierdź obecność tkanki w końcówce. Umieść jeden palec na górze końcówki i popchnij w dół, powodując wybrzuszenie tkanki. Włóż końcówkę do prawidłowo oznakowanej probówki z mikrofiszami i upewnij się, że dziurkacz do tkanek jest umieszczony na dnie probówki.Powtórz to dla pozostałych trzech sekcji, umieszczając stemple DCN w tej samej probówce. Błyskawicznie zamroź probówkę w ciekłym azocie. Wypchnij resztę tkanki mózgowej wokół móżdżku w sekcjach, w których wyodrębniono DCN.Użyj kleszczy, aby delikatnie podnieść te sekcje kory móżdżku półkuli i umieścić je w odpowiednich probówkach z mikrofiszami, a następnie błyskawicznie je zamrozić. W przypadku dwóch ostatnich odcinków brzucha odepchnij otaczającą tkankę mózgową, aby pozostawić tylko móżdżek. Za pomocą żyletki wykonaj nacięcie oddzielające przednie wargi sromowe od tylnych warg.Upewnij się, że cięcie następuje tuż po utworzeniu wargowej szóstki i nie obejmuje wargi sromowej 10. Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść przednie odcinki kory móżdżku i tylne odcinki kory móżdżku w odpowiednich rurkach z mikrofiszami i błyskawicznie je zamroź, pozostawiając rurki w ciekłym azocie na pięć minut. Umieść probówki z mikrofiszami na lodzie, aby zapobiec zbyt szybkiemu rozmrożeniu tkanki i nałóż 150 mikrolitrów zimnego roztworu izolacyjnego RNA do probówki z mikrofiszami, a następnie homogenizuj za pomocą wysterylizowanego tłuczka.Po homogenizacji tkanki pipetuj roztwór w górę iw dół, aby upewnić się, że nie pozostała nienaruszona tkanka. Ponadto rozdrobnij wszelkie małe kawałki tkanki, wciągając je kilka razy do strzykawki insulinowej. Dodaj kolejne 350 mikrolitrów odczynnika, pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać i pozostaw w temperaturze pokojowej na pięć minut.Dodaj 150 mikrolitrów chloroformu do probówki i energicznie nią potrząśnij, a następnie odstaw na dwie do trzech minut. Wirować w temperaturze 12 000 razy G w temperaturze 15 stopni Celsjusza przez 10 minut. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki i ustaw temperaturę wirówki na cztery stopnie Celsjusza.Przenieść tylko klarowną fazę wodną do nowej probówki, uważając, aby nie zakłócić nieprzezroczystej interfazy. Zachowaj lub wyrzuć pozostały roztwór w probówkach. Dodaj 100% alkohol izopropylowy w proporcji jeden do dwóch i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół.Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby wytrącić RNA z roztworu. Wirować w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, umieszczając wszystkie probówki w tej samej orientacji, aby ułatwić wizualizację osadu. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki i usuń supernatant za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu.Osad jest żelowy i trudny do zobaczenia, więc oszacuj, gdzie się znajduje, na podstawie orientacji probówek w wirówce. Po usunięciu całego supernatantu dodać 500 mikrolitrów 75% etanolu, krótko wirować i wirować w temperaturze 7 500 razy G i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu.Pozostaw nakrętki otwarte, aby wysuszyć próbkę przez pięć do 10 minut. Po wyschnięciu ponownie zawiesić osad w wolnej wodzie DNA o stężeniu 20 mikrolitrów do próbek dla DCN i 30 mikrolitrów dla wszystkich pozostałych. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy.Protokół ten został wykorzystany do wypreparowania czterech odrębnych regionów móżdżku myszy i zbadania regionalnych różnic w ekspresji genów. Poziomy ekspresji aldolazy C, parwalbuminy i KCNG4 oceniano za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Aldolaza C ulega silniejszej ekspresji w tylnym robaku móżdżku.Ale niżej w DCN i przedniej części robaka w porównaniu z masowym rozwarstwieniem móżdżku. Parwalbumina jest podobnie obecna w przednim robaku DCN, tylnym robaku i półkuli kory móżdżku, w porównaniu z ekstraktami z móżdżku luzem. KCNG4 jest znacznie wzbogacony w DCN i robak wewnętrzny, ale nie w tylnym robaku lub półkulach w porównaniu z ekstrakcją masową.Aby bezpośrednio porównać ekspresję aldolazy C w korze móżdżku, poziomy ekspresji porównano z przednim robakiem. Poziom ekspresji aldolazy C był znacznie wyższy w tylnej części robaka i wykazywał tendencję wyższą w półkulach móżdżku. RNA wyekstrahowane z tych regionów może być również wykorzystane w sekwencjonowaniu RNA, eksperymentach.Porównanie sekwencji RNA dla regionów móżdżku dostarczyłoby bardziej szczegółowych informacji na temat mechanizmów molekularnych, leżących u podstaw dyskretnych funkcji tych regionów. A także potencjalne różnice w ich podatności na choroby.

cerebellar-regional-dissection-for-molecular-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film opisuje metodę generowania wycinków tkanek z móżdżku myszy. Wycinki móżdżku mogą być używane do hodowli organotypowej, która zapewnia wgląd w mechanizmy neurorozwojowe, w tym dynamikę mielinizacji.

Rozwarstwienie móżdżku i przygotowanie plastrów: metoda generowania wycinków tkanek z móżdżku myszy

Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.

Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

Białka otoczki jądrowej odgrywają kluczową rolę w wielu podstawowych procesach biologicznych i są związane z różnymi chorobami ludzkimi.  Protokół ten opisuje nowy model myszy oparty na Cre/Lox, który pozwala na czasoprzestrzenną kontrolę zakłóceń kompleksów LINC.

Walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów LINC w sposób specyficzny dla komórki

Konwencjonalne badania utraty funkcji genów przy użyciu zwierząt nokautujących często były kosztowne i czasochłonne. Mutageneza somatyczna oparta na CRISPR oparta na elektroporacji jest potężnym narzędziem do zrozumienia funkcji genów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę analizy fenotypów nokautu w proliferujących komórkach móżdżku.

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

U niektórych zwierząt manipulowanych genami, użycie pojedynczego protokołu może nie wywołać LTD w komórkach Purkinjego móżdżku, a między LTD a uczeniem motorycznym może wystąpić rozbieżność. Do oceny indukcji LTD u zwierząt manipulowanych genami koniecznych jest wiele protokołów. Pokazane są standardowe protokoły.

Ocena długotrwałej indukcji depresji w wycinkach móżdżku u dorosłych

Ta procedura opisuje zbieranie dyskretnie zamrożonych obszarów mózgu w celu uzyskania wysokiej jakości białka i RNA przy użyciu tanich i powszechnie dostępnych narzędzi.

Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Sekcja kriogeniczna pozwala na świeże, zamrożone przygotowanie największej niszy neurogennej w mysim mózgu do głębokiej ilościowej analizy proteomu. Metoda jest precyzyjna, skuteczna i powoduje minimalne zaburzenia tkanek. Dlatego idealnie nadaje się do badania mikrośrodowiska molekularnego tej niszy, a także innych narządów, regionów i gatunków.

Kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu

Przedstawiono standardowy rurociąg do badania morfometrii istoty szarej móżdżku. Rurociąg łączy w sobie najnowocześniejsze podejścia o wysokiej rozdzielczości do zoptymalizowanej i zautomatyzowanej parcelacji móżdżku oraz rejestracji móżdżku na podstawie wokseli w celu wolumetrycznej oceny ilościowej.

Ustandaryzowany rurociąg do badania morfometrii istoty szarej móżdżku człowieka za pomocą strukturalnego rezonansu magnetycznego

Komórki Purkinjego móżdżku (PC) są szczególnie wrażliwe na braki w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Przedstawiono protokół do wizualnej oceny dynamiki odpowiedzi PC na uszkodzenie DNA, która polega na barwieniu łańcuchów poli(ADP-rybozy) związanych z białkami w kulturach organotypowych móżdżku.

Wizualizacja odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego za pomocą kultur organotypowych móżdżku

Poznaj metodę szybkiej i powtarzalnej dyssekcji regionów móżdżku myszy, w tym jąder głębokich oraz kory półkul i wermisu. Technika umożliwia analizę ekspresji genów w poszczególnych obszarach móżdżku.

Rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej

Przeglądaj więcej filmów