Rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej
5 grudnia 2020
Różne regiony móżdżku są zaangażowane w różne procesy behawioralne, jednak leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne pozostają nieznane. W pracy opisano metodę powtarzalnego i szybkiego preparowania kory móżdżku półkul, przednich i tylnych obszarów robaka oraz głębokich jąder móżdżku w celu zbadania różnic molekularnych poprzez wyizolowanie RNA i zbadanie różnic w ekspresji genów.
Tradycyjne badania molekularne móżdżku zostały przeprowadzone na całych ekstraktach móżdżku, które mogą maskować wszelkie różnice między określonymi regionami móżdżku. Protokół ten umożliwia osobną ocenę różnych regionów móżdżku i pozwala na zbadanie mechanizmów molekularnych, które mogą leżeć u podstaw ich unikalnego wkładu w różnorodność zachowań i postęp choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na powtarzalne i szybkie wypreparowanie czterech obszarów móżdżku, głębokich jąder móżdżku, przedniej i tylnej kory móżdżku robaka oraz kory móżdżku półkul.
Po odcięciu głowy uśpionej myszy wykonaj nacięcie żyletką wzdłuż przyśrodkowej linii strzałkowej głowy, zaczynając od nosa i kontynuując aż do tyłu. Oddziel skórę i użyj żyletki, aby odciąć mięsień z każdej strony, przecinając kanały słuchowe. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przytnij wiele obszarów rdzenia kręgowego aż do miejsca, w którym pień mózgu styka się z móżdżkiem, uważając, aby nie uszkodzić móżdżku.
Włóż jedno z ostrzy nożyczek naczyniowych w przestrzeń między pniem mózgu a kręgosłupem i wytnij w kierunku kanału słuchowego, unosząc się do góry podczas cięcia, aby ograniczyć uszkodzenie tkanki. Kontynuuj cięcie wzdłuż krawędzi czaszki w kierunku opuszki węchowej. Za pomocą kleszczy delikatnie oderwij tył tej czaszki, aby odsłonić tylną część mózgu i móżdżku.
Umieść kleszcze wzdłuż przeciętej krawędzi czaszki i oderwij czaszkę w górę i nad mózgiem. Przytnij resztę czaszki nożyczkami naczyniowymi i kleszczami, usuwając większość z górnej części mózgu. Lekko unieś mózg za pomocą mikroszpatułki, aby usunąć opuszki węchowe z pozostałej czaszki i odłączyć włókna przewodu wzrokowego.
W tym momencie mózg powinien łatwo się uwolnić. Umieść mózg na szalce Petriego, siedząc na lodzie i usuń pozostałą czaszkę lub inne szczątki. Delikatnie umieść mózg w macierzy mózgowej grzbietem do góry.
Upewnij się, że jest ustawiony na poziomie w macierzy i że linia środkowa znajduje się pośrodku. Umieść jedną żyletkę wzdłuż strzałkowej linii środkowej, upewniając się, że ostrze dociska się do samego dołu matrycy. Umieść kolejną żyletkę jeden milimetr z boku pierwszego ostrza.
Umieść dwa kolejne ostrza, tak aby trzy ostrza znajdowały się po jednej stronie mózgu, wszystkie oddalone od siebie o jeden milimetr. Powtórz to po drugiej stronie. Ostrożnie chwyć przód i tył żyletek i podnieś je prosto z matrycy.
Wyrzuć chusteczkę znajdującą się na zewnątrz żyletek. Powoli oddzielaj jedną żyletkę na raz od pozostałych, uważając, aby nie uszkodzić odcinków tkanki. Zsuń fragment tkanki z żyletki na szklane szkiełko za pomocą mikroszpatułki.
Należy pobrać sześć strzałkowych wycinków mózgu. Czołowe sekcje boczne będą miały widoczny DCN. Aby odizolować DCN, przytrzymaj końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów prostopadle do DCN i przeciśnij w dół przez tkankę, mocno kołysząc się we wszystkich kierunkach.
Podnieś pipetę do góry i wizualnie potwierdź obecność tkanki w końcówce. Umieść jeden palec na górze końcówki i popchnij w dół, powodując wybrzuszenie tkanki. Włóż końcówkę do prawidłowo oznakowanej probówki z mikrofiszami i upewnij się, że dziurkacz do tkanek jest umieszczony na dnie probówki.
Powtórz to dla pozostałych trzech sekcji, umieszczając stemple DCN w tej samej probówce. Błyskawicznie zamroź probówkę w ciekłym azocie. Wypchnij resztę tkanki mózgowej wokół móżdżku w sekcjach, w których wyodrębniono DCN.
Użyj kleszczy, aby delikatnie podnieść te sekcje kory móżdżku półkuli i umieścić je w odpowiednich probówkach z mikrofiszami, a następnie błyskawicznie je zamrozić. W przypadku dwóch ostatnich odcinków brzucha odepchnij otaczającą tkankę mózgową, aby pozostawić tylko móżdżek. Za pomocą żyletki wykonaj nacięcie oddzielające przednie wargi sromowe od tylnych warg.
Upewnij się, że cięcie następuje tuż po utworzeniu wargowej szóstki i nie obejmuje wargi sromowej 10. Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść przednie odcinki kory móżdżku i tylne odcinki kory móżdżku w odpowiednich rurkach z mikrofiszami i błyskawicznie je zamroź, pozostawiając rurki w ciekłym azocie na pięć minut. Umieść probówki z mikrofiszami na lodzie, aby zapobiec zbyt szybkiemu rozmrożeniu tkanki i nałóż 150 mikrolitrów zimnego roztworu izolacyjnego RNA do probówki z mikrofiszami, a następnie homogenizuj za pomocą wysterylizowanego tłuczka.
Po homogenizacji tkanki pipetuj roztwór w górę iw dół, aby upewnić się, że nie pozostała nienaruszona tkanka. Ponadto rozdrobnij wszelkie małe kawałki tkanki, wciągając je kilka razy do strzykawki insulinowej. Dodaj kolejne 350 mikrolitrów odczynnika, pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać i pozostaw w temperaturze pokojowej na pięć minut.
Dodaj 150 mikrolitrów chloroformu do probówki i energicznie nią potrząśnij, a następnie odstaw na dwie do trzech minut. Wirować w temperaturze 12 000 razy G w temperaturze 15 stopni Celsjusza przez 10 minut. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki i ustaw temperaturę wirówki na cztery stopnie Celsjusza.
Przenieść tylko klarowną fazę wodną do nowej probówki, uważając, aby nie zakłócić nieprzezroczystej interfazy. Zachowaj lub wyrzuć pozostały roztwór w probówkach. Dodaj 100% alkohol izopropylowy w proporcji jeden do dwóch i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół.
Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby wytrącić RNA z roztworu. Wirować w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, umieszczając wszystkie probówki w tej samej orientacji, aby ułatwić wizualizację osadu. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki i usuń supernatant za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu.
Osad jest żelowy i trudny do zobaczenia, więc oszacuj, gdzie się znajduje, na podstawie orientacji probówek w wirówce. Po usunięciu całego supernatantu dodać 500 mikrolitrów 75% etanolu, krótko wirować i wirować w temperaturze 7 500 razy G i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu.
Pozostaw nakrętki otwarte, aby wysuszyć próbkę przez pięć do 10 minut. Po wyschnięciu ponownie zawiesić osad w wolnej wodzie DNA o stężeniu 20 mikrolitrów do próbek dla DCN i 30 mikrolitrów dla wszystkich pozostałych. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy.
Protokół ten został wykorzystany do wypreparowania czterech odrębnych regionów móżdżku myszy i zbadania regionalnych różnic w ekspresji genów. Poziomy ekspresji aldolazy C, parwalbuminy i KCNG4 oceniano za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Aldolaza C ulega silniejszej ekspresji w tylnym robaku móżdżku.
Ale niżej w DCN i przedniej części robaka w porównaniu z masowym rozwarstwieniem móżdżku. Parwalbumina jest podobnie obecna w przednim robaku DCN, tylnym robaku i półkuli kory móżdżku, w porównaniu z ekstraktami z móżdżku luzem. KCNG4 jest znacznie wzbogacony w DCN i robak wewnętrzny, ale nie w tylnym robaku lub półkulach w porównaniu z ekstrakcją masową.
Aby bezpośrednio porównać ekspresję aldolazy C w korze móżdżku, poziomy ekspresji porównano z przednim robakiem. Poziom ekspresji aldolazy C był znacznie wyższy w tylnej części robaka i wykazywał tendencję wyższą w półkulach móżdżku. RNA wyekstrahowane z tych regionów może być również wykorzystane w sekwencjonowaniu RNA, eksperymentach.
Porównanie sekwencji RNA dla regionów móżdżku dostarczyłoby bardziej szczegółowych informacji na temat mechanizmów molekularnych, leżących u podstaw dyskretnych funkcji tych regionów. A także potencjalne różnice w ich podatności na choroby.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę powtarzalnej i szybkiej dyssekcji poszczególnych obszarów móżdżku — w szczególności półkul, przedniej i tylnej części robaka oraz głębokich jąder móżdżku. Celem jest wyjaśnienie różnic molekularnych w ekspresji genów, które mogą leżeć u podstaw unikalnych odpowiedzi behawioralnych związanych z konkretnymi obszarami móżdżku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia molekularna
- Ekspresja genów
Wstęp
- Wiadomo, że móżdżek wpływa na różne przejawy behawioralne.
- Tradycyjne badania często analizują ekstrakty z całego móżdżka, co może maskować różnice regionalne.
- Ukierunkowane podejście może pomóc w odkryciu specyficznych mechanizmów molekularnych w poszczególnych obszarach móżdżka.
Cel badania
- Opracowanie metody izolacji RNA z określonych obszarów móżdżku.
- Porównanie ekspresji genów w różnych obszarach móżdżku.
- Ułatwienie badania molekularnych podstaw zachowania i chorób.
Zastosowane metody
- Metoda polega na wycinaniu obszarów móżdżku od uśpionych myszy.
- Kluczowy model biologiczny obejmuje tkanki móżdżku mysiego.
- Wyizolowane RNA jest poddawane obróbce w celu analizy ekspresji genów.
- Krytyczne kroki procedury obejmują staranną dyssekcję, szybkie zamrażanie oraz homogenizację tkanki.
Główne wyniki
- Protokół ten umożliwia identyfikację różnic molekularnych pomiędzy regionami móżdżku.
- Wyniki obejmują spostrzeżenia dotyczące tego, w jaki sposób poszczególne regiony mogą w unikalny sposób wpływać na zachowanie.
- Proces ten pozwala na badanie zmian w ekspresji genów istotnych dla funkcji móżdżku.
Wnioski
- Niniejsza praca prezentuje nowatorską metodę dyssekcji i analizy obszarów móżdżku na potrzeby badań molekularnych.
- Zastosowane podejście ułatwia zrozumienie związku pomiędzy mechanizmami specyficznymi dla poszczególnych regionów móżdżku a efektami behawioralnymi.
- Uzyskane wyniki mogą przyczynić się do poszerzenia wiedzy na temat podstaw molekularnych udziału móżdżku w różnych jednostkach chorobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Regionalna dyssekcja móżdżku umożliwia precyzyjną analizę molekularną odrębnych obszarów mózgu, rozwiązując kluczowy problem w badaniach neuronaukowych, w których ekstrakty z całej tkanki maskują heterogeniczność funkcjonalną. Podejście to wspiera walidację celów terapeutycznych poprzez powiązanie wzorców ekspresji genów z konkretnymi podregionami móżdżku zaangażowanymi w ścieżki ruchu, poznania, afektu i nagrody. Dzięki umożliwieniu powtarzalnej izolacji tkanki z określonych stref anatomicznych, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych i dostarcza informacji niezbędnych do minimalizacji ryzyka mechanistycznego w programach odkrywania leków ukierunkowanych na OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację sygnatur molekularnych z obszarów móżdżku zaangażowanych w kontrolę motoryczną oraz funkcje neuropsychiatryczne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany schemat postępowania przy dyssekcji głębokich jąder móżdżku, kory robaka oraz kory półkul, co ogranicza zmienność w późniejszych analizach omicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie specyficznych dla danego regionu próbek RNA odpowiednich do qPCR i RNA-seq, co umożliwia ilościowe porównanie ekspresji genów w obrębie podregionów móżdżku.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację analizy poprzez zastosowanie szybkiego mrożenia oraz spójnych protokołów homogenizacji, co poprawia powtarzalność wyników między laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia badanie regionalnej podatności w modelach chorób poprzez porównywanie profili molekularnych w anatomicznie zdefiniowanych strefach móżdżku.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biobankowanie wypreparowanych tkanek w temperaturze −80°C, co wspiera badania podłużne oraz porównania międzyeksperymentalne w procesach walidacji celów terapeutycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnych etapów odkryć, wspierając identyfikację celów terapeutycznych opartą na hipotezach oraz walidację przedkliniczną poprzez dostarczanie danych molekularnych o rozdzielczości anatomicznej z móżdżku.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie korelacji ekspresji genów (np. Aldolase C, parvalbumin, KCNG4) z regionalną funkcją móżdżku.
- Przesiewy: Pozwala na uzyskanie standaryzowanych ekstraktów RNA odpowiednich do detekcji o wysokiej czułości, co ułatwia wiarygodne porównywanie stanów molekularnych w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki z qPCR oraz RNA-seq, które pozwalają zespołom badawczym oceniać zaangażowanie celu i modulację szlaków z regionalną precyzją.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne z fenotypami behawioralnymi poprzez umożliwienie analizy obszarów związanych z afektem, poznaniem i koordynacją ruchową w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat sekcji, który można zastosować w wielu szczepach myszy i modelach chorobowych, co ogranicza konieczność redundantnego opracowywania metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do celu poprzez ujawnienie specyficznych dla regionu mechanizmów molekularnych, które są maskowane w analizach całego móżdżku.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym etapom sekcji, mrożenia i izolacji RNA, co minimalizuje zmienność techniczną.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go, zapewniając przejrzystość mechanistyczną w odniesieniu do celów w móżdżku, co redukuje ryzyko niepowodzenia na późnych etapach programów CNS.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o regionalne wzorce ekspresji i istotność dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu neuroanatomii oraz technik mikrochirurgicznej dyssekcji, aby zapewnić precyzyjne oddzielenie obszarów móżdżku.
- Zależne od dostępu do sprzętu kriogenicznego (ciekły azot, zamrażarka −80°C) oraz precyzyjnych narzędzi (nożyczki wektorowe, pęsety tępe, mikroszpatułka) do manipulacji tkanką.
- Wymaga ustandaryzowanego przeszkolenia zespołów w celu zachowania spójności głębokości pobierania wycinków tkanki oraz identyfikacji obszarów.
- Należy uwzględnić ryzyko degradacji RNA poprzez minimalizację czasu przetwarzania oraz utrzymanie łańcucha chłodniczego od momentu dyssekcji do resuspensji.
- Ograniczone przez niską wydajność tkanki z małych obszarów, takich jak DCN, co wymaga optymalizacji ilości materiału wejściowego dla dalszych zastosowań, np. low-input RNA-seq.
