Name: Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj proste metody oceny metabolizmu lipidów u myszy w badaniach metabolicznych in vivo. Te dostępne techniki umożliwiają badaczom analizę funkcji metabolicznej bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez National Institutes of Health (NIH), grant R00-DK114498, oraz Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA), grant CRIS: 3092-51000-062 dla Y. Z.

Zwierzęta są trzymane w standardowych warunkach, zgodnie z protokołami opieki nad zwierzętami i eksperymentami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Baylor College of Medicine (BCM). Zwierzęta są karmione standardową lub specjalną dietą, wodą ad libitum i utrzymywane w 12-godzinnym cyklu dnia i nocy.
1. Pomiar stężenia lipidów w surowicy na czczo
<ol>
	<li>Przenieś myszy do nowej klatki po godzinie 17:00 i poszcz z wolnym dostępem do wody, przez noc (z około 16 godzinami postu przed eksperymentem). Nocny post zapewnia całkowite opróżnienie przewodu pokarmowego myszy. 
	UWAGA: Myszy zjadają kał podczas postu, więc odstawienie pokarmu nie może zapewnić, że są odpowiednio poszczone.</li>
	<li>Następnego ranka chwyć mysz za ogon i połóż ją na powierzchni. Delikatnie pociągnij do tyłu ogon myszy, aby umieścić mysz w ograniczniku. Umieść ogranicznik nosa, aby ponownie przekwalifikować ruch myszy, jednocześnie pozwalając myszy oddychać. Dokręć pokrętło ogranicznika nosa. Monitoruj ruchy klatki piersiowej, aby upewnić się, że zwierzę oddycha normalnie i zminimalizować czas, jaki mysz spędza w krępowaniach.</li>
	<li>Wykonaj powierzchowne nacięcie (nacięcie) w żyle ogonowej swobodnie poruszającej się myszy i pobierz 25 μl krwi z nacięcia do szklanej naczynia włosowatej (wypełniającej około 1/3 naczynia włosowatego) bez krępowania myszy. Szybko wdmuchnij krew do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Zatamuj krwawienie za pomocą ściągających proszków, uzupełnij karmę w klatce i upewnij się, że myszy nie wykazują oznak stresu.</li>
	<li>Zakończ pobieranie krwi dla wszystkich myszy.</li>
	<li>Pozwól krwi krzepnąć, pozostawiając ją w spokoju w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Wirować zakrzepłe próbki krwi w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w chłodzonej mikrowirówce stołowej i przenieść supernatant (surowicę) do analizy. 
	UWAGA: Surowica może być przechowywana w temperaturze –20 °C przez kilka tygodni do czasu analizy. W przypadku długotrwałego przechowywania serum należy przechowywać w temperaturze –70°C.</li>
	<li>Przeanalizuj każdy metabolit lipidowy przy użyciu protokołu dostarczonego przez producenta.</li>
</ol>
2. Doustny test tolerancji intralipidowej
<ol>
	<li>Po godzinie 17:00 zważ myszy w celu obliczenia objętości intralipidów, którą należy im podać następnego dnia. Następnie przenieś myszy do nowej klatki i pościj je przez noc (16 godzin).</li>
	<li>Następnego ranka oznacz ogony myszy trzymanych w jednej klatce, aby pomóc zidentyfikować je w kolejnych etapach krwawienia.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w żyle ogonowej i pobierz 15 μl krwi z nacięcia do szklanej kapilary (wypełniającej około 1/5 naczynia włosowatego), a następnie szybko wdmuchnij krew do probówki mikrowirówkowej na surowicę T = 0. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby tamowania krwawienia podczas testu, chyba że myszy wykazują nadmierne krwawienie.</li>
	<li>Myszy z zgłębkiem 20% intralipidu za pomocą igły do zgłębnika 18G w proporcji 15 μl na gram masy ciała, używając masy ciała przed postem. Ułóż każdą mysz o 1 minutę. 
	UWAGA: Zważ zwierzę i określ odpowiedni rozmiar igły do wbijania w zgłębnik. Ogólnie rzecz biorąc, igła do zgłębnika o rozmiarze 18 jest odpowiednia dla myszy o wadze >25 g, a igła do głębka o rozmiarze 20-22 byłaby bardziej odpowiednia dla mniejszych zwierząt. Chropij mysz, chwytając skórę przez ramiona, aby utrzymać głowę zwierzęcia na miejscu. Umieść igłębkę w jamie ustnej, a następnie delikatnie przesuwaj wzdłuż górnego podniebienia, aż dotrzesz do przełyku. Rurka powinna przejść bez oporu. Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości Intralipid może być powoli podawany. Delikatnie wyjmij igłę pod tym samym kątem podczas wprowadzania igły po podaniu Intralipidu. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i obserwuj, czy nie ma oznak trudnego oddychania lub innego niepokoju. 
	UWAGA: Naukowcy, którzy nie mają doświadczenia w technikach wykrwawiania się z jamy ustnej lub ogona, mogą układać każdą mysz w stos przez 2 minuty lub nawet dłużej.</li>
	<li>Pobranie krwi w temperaturze T = 1, 2, 3, 4, 5 i 6 godzin: Pobrać 15 μl krwi (1/5 naczynia włosowatego) na mysz przez krwawienie z ogona i szybko wdmuchnąć krew do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Wirować próbki krwi w temperaturze 2 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut w mikrowirówce. Przenieść supernatant, łącznie z pływającą warstwą tłuszczu, do probówki do PCR w celu przechowywania. Supernatant może być przechowywany w temperaturze –20 °C przez kilka tygodni do czasu analizy. 
	UWAGA: Supernatantem powinno być osocze. Jeśli niektóre próbki już zakrzepły do czasu wirowania, nie ma to wpływu na pomiar trójglicerydów.</li>
	<li>Po ostatnim pobraniu krwi zatamuj krwawienie za pomocą proszków ściągających, uzupełnij karmę w klatce i upewnij się, że myszy nie wykazują oznak ekstremalnego stresu.</li>
	<li>Załadować 2 μl wzorca triglicerydów i zebranych supernatantów do 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Dodać 200 μl odczynnika triglicerydowego i pozostawić na płytce inkubację przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu uzyskania koloru.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 500 nm przy długości fali odniesienia 660 nm w laboratoryjnym czytniku płytek i obliczyć stężenie próbki.</li>
</ol>
3. β3 Agonista receptora adrenergicznego CL 316,243 Test lipolizy stymulowanej
<ol>
	<li>Przygotować CL 316,243 jako roztwór podstawowy 5 mg/ml (50x) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i przechowywać w temperaturze –20°C do momentu użycia.</li>
	<li>Rano zważ myszy, aby obliczyć ilość rozcieńczonego roztworu CL 316,243 potrzebną do eksperymentu. Mysz otrzyma 10 μl na gram masy ciała rozcieńczonego CL 316,243, dla ostatecznej dawki 1 mg/kg masy ciała.</li>
	<li>Przenieś myszy do nowej klatki ze swobodnym dostępem do wody i pościj je przez 4 godziny.</li>
	<li>Przygotuj wystarczającą ilość 1x CL 316,243 roztworu z 50x bulionu, używając soli fizjologicznej. Końcowe stężenie 1x roztworu CL 316,243 wynosi 0,1 mg/ml. Stosować sól fizjologiczną w grupie kontrolnej.</li>
	<li>Zaznacz ogony myszy trzymanych w tej samej klatce, aby ułatwić identyfikację podczas etapów krwawienia.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w żyle ogonowej i pobierz 15 μl krwi z nacięcia do szklanej kapilary (wypełniającej około 1/5 naczynia włosowatego) i szybko wdmuchnij krew do probówki mikrowirówkowej dla próbki T = 0. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby tamowania krwawienia podczas testu, chyba że myszy wykazują nadmierne krwawienie.</li>
	<li>Wstrzyknąć rozcieńczony roztwór CL 316,243 (lub kontrolę, jeśli został uwzględniony w doświadczeniu) dootrzewnowo o objętości 10 μl/g masy ciała. Ułóż każdą mysz w stos przez 1 minutę. Użyj maksymalnie 5 myszy na każdy 60-minutowy eksperyment lub 10 myszy na dwuosobowy zespół.</li>
	<li>Pobrać krew w T = 5, 15, 30, 60 minut: pobrać 15 μl krwi (1/5 naczynia włosowatego) na mysz przez krwawienie z ogona.</li>
	<li>Po ostatnim pobraniu krwi zatamuj krwawienie za pomocą proszków ściągających, uzupełnij karmę w klatce i upewnij się, że myszy nie wykazują oznak ekstremalnego stresu.</li>
	<li>Wirować próbki krwi w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w chłodzonej mikrowirówce. Przenieść supernatant do probówki do PCR w celu przechowywania. Supernatant może być przechowywany w temperaturze –20°C przez kilka tygodni do czasu analizy.</li>
	<li>Załadować 1 μl 2x seryjnie rozcieńczonych wzorców glicerolu (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 i 2,5 mg/ml równoważników trioleiny) i zebrać supernatanty na 96-dołkową płytkę. Dodać 100 μl wolnego odczynnika glicerolu i pozostawić na płytce inkubację przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aby rozwinął się kolor.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 540 nm za pomocą laboratoryjnego czytnika płytek i obliczyć stężenie próbki.</li>
</ol>

<ol><li>Dixon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+chylomicron+uptake+into+lacteals%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).</li>
<li>Nuno, J., de Oya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+lipase%3A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Cl%C3%ADnica+Espa%C3%B1ola%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein lipase: review.</a> Revista Clínica Española. 170 (3-4), 83-87 (1983).</li>
<li>Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+processes+that+handle+--+and+mishandle+--+dietary+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).</li>
<li>Burla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS-based+lipidomics+of+human+blood+plasma%3A+a+community-initiated+position+paper+to+develop+accepted+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines.</a> Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).</li>
<li>Umpleby, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+measurement+guidelines%3A+Tracing+lipid+metabolism%3A+the+value+of+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes.</a> Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).</li>
<li>Mitchell, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paired+sibling+analysis+of+the+beta-3+adrenergic+receptor+and+obesity+in+Mexican+Americans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).</li>
<li>Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caloric+restriction+in+C57BL%2F6J+mice+mimics+therapeutic+fasting+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans.</a> Lipids in Health and Disease. 5, 13(2006).</li>
<li>Hayek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fat+increases+high+density+lipoprotein+%28HDL%29+levels+both+by+increasing+the+transport+rates+and+decreasing+the+fractional+catabolic+rates+of+HDL+cholesterol+ester+and+apolipoprotein+%28Apo%29+A-I.+Presentation+of+a+new+animal+model+and+mechanistic+studies+in+human+Apo+A-I+transgenic+and+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).</li>
<li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+B%3A+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).</li>
<li>Tall, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+cholesterol+ester+transfer+protein+and+relationship+to+coronary+artery+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk.</a> Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).</li>
<li>Singh, A. K., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+and+cardiovascular+risk%3A+A+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal.</a> Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).</li>
<li>Miller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglycerides+and+cardiovascular+disease%3A+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).</li>
<li>Dron, J. S., Hegele, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Genetics of Hypertriglyceridemia.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455(2020).</li>
<li>Dole, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relation+between+non-esterified+fatty+acids+in+plasma+and+the+metabolism+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose.</a> Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).</li>
<li>Bartelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+activity+controls+triglyceride+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance.</a> Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).</li>
<li>de Souza, C. J., Burkey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+3-adrenoceptor+agonists+as+anti-diabetic+and+anti-obesity+drugs+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans.</a> Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).</li>
<li>Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-adrenergic+control+of+lipolysis+and+thermogenesis+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues.</a> Journal of Experimental Biology. 221, Pt Suppl 1 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Trzy opisane testy działają solidnie w laboratorium, z kilkoma krytycznymi względami. Nocny post jest wymagany do określenia poziomu lipidów w surowicy na czczo i doustnego testu tolerancji intralipidowej. W przypadku doustnego testu tolerancji intralipidowej bardzo ważne jest wirowanie krwi w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować tworzenie się warstwy tłuszczu, szczególnie w 1- i 2-godzinnych punktach czasowych; Ważne jest, aby nie wyrzucać tej warstwy tłuszczu, jeśli się utworzy. Upewnij się, że supernatant został...

Węglowodany i lipidy to dwa główne substraty metabolizmu energetycznego. Nieprawidłowy metabolizm lipidów powoduje wiele chorób u ludzi, w tym cukrzycę typu II, choroby układu krążenia, stłuszczenie wątroby i nowotwory. Lipidy dietetyczne, głównie trójglicerydy, są wchłaniane przez jelito do układu limfatycznego i dostają się do krążenia żylnego w chylomikronach w pobliżu serca1. Lipidy są przenoszone przez cząsteczki lipoprotein w krwiobiegu, gdzie cząstki kwasów tłuszczowych są uwalniane przez działanie lipazy lipoproteinowej na narządy obwodowe, takie jak mięśnie i tkanka tłuszczowa2. Pozostałe cząsteczki bogate w cholesterol są usuwane przez liver3. Myszy są szeroko stosowane w laboratoriach jako model badawczy do badania metabolizmu lipidów. Dzięki dostępnym kompleksowym zestawom narzędzi genetycznych i stosunkowo krótkiemu cyklowi hodowlanemu są one potężnym modelem do badania, w jaki sposób lipidy są wchłaniane, syntetyzowane i metabolizowane.
Ze względu na złożoność metabolizmu lipidów, zaawansowane badania lipidomiczne lub badania znaczników izotopowych są zwykle używane do ilościowego określania zbiorów gatunków lipidów lub związanych z lipidami przepływów metabolicznych i losów4,5. Stanowi to ogromne wyzwanie dla badaczy, którzy nie mają specjalistycznego sprzętu ani specjalistycznej wiedzy. W tym artykule przedstawiamy trzy testy, które mogą służyć jako wstępne testy przed zastosowaniem trudnych technicznie technik. Są to procedury nieterminalne dla myszy, a zatem bardzo przydatne do identyfikacji potencjalnych różnic w zdolności do obsługi lipidów i zawężenia procesów, na które wpływają.
Po pierwsze, pomiar cząsteczek lipidowych w surowicy na czczo może pomóc w ustaleniu ogólnego profilu lipidowego myszy. Myszy powinny być na czczo, ponieważ wiele gatunków lipidów podnosi się po posiłkach, a na stopień tego wzrostu duży wpływ ma skład diety. Wiele cząsteczek lipidów, w tym cholesterol całkowity, trójglicerydy i nieestryfikowane kwasy tłuszczowe (NEFA), można zmierzyć za pomocą komercyjnego zestawu i czytnika płytek, który może odczytać absorbancję.
Po drugie, doustny test tolerancji wewnątrzlipidowej ocenia zdolność do radzenia sobie z lipidami jako efekt netto wchłaniania i metabolizmu. Doustnie podawany intralipid powoduje skok poziomu krążących trójglicerydów (1-2 godziny), po czym poziom trójglicerydów w surowicy wraca do poziomu podstawowego (4-6 godzin). Ten test dostarcza informacji o tym, jak dobrze mysz radzi sobie z egzogennymi lipidami. Serce, wątroba i brunatna tkanka tłuszczowa są aktywnymi konsumentami trójglicerydów, podczas gdy biała tkanka tłuszczowa przechowuje je jako rezerwę energii. Zmiany w tych funkcjach będą prowadziły do różnic w wynikach testów.
Na koniec, promowanie lipolizy w celu mobilizacji zmagazynowanych lipidów jest uważane za możliwą strategię utraty wagi. Szlak sygnałowy receptora β3-adrenergicznego w tkance tłuszczowej odgrywa ważną rolę w lipolizie adipocytów, a ludzka genetyka zidentyfikowała polimorfizm utraty funkcji Trp64Arg w receptorze β3-adrenergicznym skorelowany z otyłością6. CL 316,243, specyficzny i silny agonista receptora β3-adrenergicznego, stymuluje lipolizę tkanki tłuszczowej i uwalnianie glicerolu. Ocena reakcji myszy na CL 316,243 może dostarczyć cennych informacji na temat rozwoju, poprawy i zrozumienia skuteczności tego związku.
Łącznie, te testy mogą być używane jako wstępne badanie przesiewowe zmian w stanie metabolizmu lipidów u myszy. Są one wybierane ze względu na dostępność narzędzi i odczynników. Dzięki wynikom uzyskanym z tych testów naukowcy mogą stworzyć ogólny obraz sprawności metabolicznej swoich zwierząt i zdecydować się na bardziej wyrafinowane i ukierunkowane podejścia.

<table><tbody><tr><td>20% Intralipid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I141</td><td></td></tr><tr><td>BD Sterylne strzykawki z końcówką ślizgową 1 ml</td><td>Shaotong</td><td>B07F1KRMYN</td><td></td></tr><tr><td>CL 316,243 Hydrate</td> Zakrzywione igły do karmienia <td>Sigma-Aldrich</td><td>C5976</td><td></td></tr><tr><td>(18 rozmiarów)</td><td>Kent Scientific</td><td>FNC-18-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do glicerolu bez glicerolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wzorcowy glicerolu</td><td>Sigma</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)ODCZYNNIK KOLOROWY A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)ODCZYNNIK KOLORYSTYCZNY B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostyka</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw referencyjny chemii Matrix Plus Mikroprobówki</td><td>wirówkowe Verichem</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-168</td><td></td></tr><tr><td>Rurka kapilarna z mikrohematrokrytem, nie heparanizowana</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td></td></tr><tr><td>STANDARDOWE ROZWIĄZANIE NEFA</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Odczynnik do trójglicerydów</td><td>Fisher Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do cholesterolu całkowitego</td><td>Thermo Scientifi</td><td>TR13421</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Ocena metabolizmu lipidów jest podstawą oceny funkcji metabolicznej i jest uważana za niezbędną do badań metabolizmu in vivo. Lipidy to klasa wielu różnych cząsteczek z wieloma szlakami zaangażowanymi w ich syntezę i metabolizm. Potrzebny jest punkt wyjścia do oceny hemostazy lipidowej w badaniach nad odżywianiem i otyłością. W tym artykule opisano trzy łatwe i dostępne metody, które wymagają niewielkiej wiedzy lub praktyki do opanowania, a które mogą być zaadaptowane przez większość laboratoriów do badań przesiewowych pod kątem nieprawidłowości metabolizmu lipidów u myszy. Metody te to (1) pomiar kilku cząsteczek lipidów w surowicy na czczo przy użyciu komercyjnych zestawów, (2) oznaczanie zdolności do radzenia sobie z lipidami w diecie za pomocą doustnego testu tolerancji wewnątrzlipidowej oraz (3) ocena odpowiedzi na związek farmaceutyczny, CL 316,243, u myszy. Łącznie metody te zapewnią ogólny przegląd zdolności do radzenia sobie z lipidami u myszy.

W trzech fragmentach wykazujemy, że każdy z testów dostarcza cennych informacji na temat metabolizmu lipidów u myszy. W przypadku samców myszy C57BL/6J, poddanych ośmiotygodniowej diecie wysokotłuszczowej (HFD) rozpoczynającej się w ósmym tygodniu życia, poziomy cholesterolu całkowitego były znacząco podwyższone, podczas gdy poziomy triglicerydów i NEFA w surowicy nie uległy zmianie (Table 1), co sugeruje, że poziomy triglicerydów i NEFA we krwi nie są regulowane głównie przez podaż tłuszczów w diecie. W...

Ten artykuł zawiera trzy łatwe i łatwo dostępne testy do oceny metabolizmu lipidów u myszy.

Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Ocena metabolizmu lipidów jest podstawą oceny funkcji metabolicznej i jest uważana za niezbędną w badaniach metabolizmu in vivo. Ze względu na złożoność metabolizmu lipidów zwykle stosuje się zaawansowane badania lipidomiczne lub badania znaczników izotopowych, co stanowi ogromne wyzwanie dla badaczy nieposiadających specjalistycznego sprzętu lub wiedzy specjalistycznej. Protokół ten przedstawia łatwe i dostępne testy do oceny metabolizmu lipidów u myszy.Procedurę zademonstruje Mingyang Huang, asystent naukowy z laboratorium Zhu. Zacznij od przeniesienia myszy do nowej klatki i poszczenia ich przez noc ze swobodnym dostępem do wody na 16 godzin przed eksperymentem, co zapewnia całkowite opróżnienie przewodu pokarmowego myszy. Następnego ranka wykonaj powierzchowne nacięcie w żyle ogonowej myszy.I pobierz 25 mikrolitrów krwi z nacięcia do szklanej naczynia włosowatego. Szybko wdmuchnij krew do probówki mikrowirówkowej. Zatamuj krwawienie za pomocą proszków septycznych, a następnie uzupełnij karmę w klatce i upewnij się, że myszy nie wykazują oznak ekstremalnego stresu.Wykonaj pobranie krwi na wszystkich myszach. Pozwól krwi skrzepnąć, pozostawiając ją w spokoju w temperaturze pokojowej na jedną godzinę, a następnie wiruj skrzepnięte próbki krwi w temperaturze 2000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w chłodzonej mikrowirówce stołowej. Zebrać supernatant do analizy metabolitów lipidowych.Po godzinie 17:00 zważ myszy, aby obliczyć objętość intralipidów, która zostanie im podana następnego dnia. Następnie przenieś je do nowej klatki i pościj przez noc. Następnego ranka zaznacz opowieści o myszach trzymanych w jednej klatce, aby pomóc w ich identyfikacji w kolejnych etapach krwawienia.Zrób nacięcie w żyle ogonowej i upuść 15 mikrolitrów krwi z nacięcia do szklanej kapilary i szybko wdmuchnij krew do probówki mikrowirówkowej na surowicę T 0. Myszy z głębkiem z 20% intralipidem za pomocą igły do zgłębnika o rozmiarze 18 w stosunku 15 mikrolitrów na gram masy ciała przy użyciu masy ciała przed postem. Pobieraj krew po 1, 2, 3, 4, 5 i 6 godzinach.Wirować próbki krwi o masie 2000 x g przez 10 minut w mikrowirówce. Przenieść sklarowany nad osadem, łącznie z pływającą warstwą tłuszczu, do probówki do PCR w celu przechowywania. Supernatant może być przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez kilka tygodni do czasu analizy.Po ostatnim pobraniu krwi zatamuj krwawienie za pomocą proszków septycznych, uzupełnij karmę w klatce i upewnij się, że myszy nie wykazują oznak ekstremalnego stresu. Załaduj dwa mikrolitry wzorca trójglicerydów i zebranych supernatantów do 96-dołkowej płytki. Dodaj 200 mikrolitrów odczynnika triglicerydowego i pozwól płytce inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu uzyskania koloru.Zmierzyć absorbancję przy 500 nanometrach przy referencyjnej długości fali 660 nanometrach w czytniku płytek i obliczyć stężenie próbki. Rano zważ myszy, aby obliczyć ilość rozcieńczonego roztworu CL 316, 243 potrzebnego do eksperymentu. Przenieś myszy do nowej klatki ze swobodnym dostępem do wody i pościj je przez cztery godziny.Przygotuj wystarczającą ilość roztworu 1X CL z 50-krotnego bulionu, który został przygotowany przez rozpuszczenie pięciu miligramów proszku CL 316, 243 w jednym mililitrowym sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub PBS. Stosować sterylną sól fizjologiczną lub PBS dla grupy kontrolnej. Przefiltruj przez filtr membranowy PES Millipore 0,22 mikrona, aby wysterylizować roztwór.Zaznacz opowieści o myszach trzymanych w tej samej klatce, aby ułatwić ich identyfikację na etapie krwawienia. Wykonaj nacięcie w żyle ogonowej i pobierz 15 mikrolitrów krwi z nacięcia do szklanej kapilary, a następnie szybko przelej krew do probówki mikrowirówkowej dla próbki T 0. Rozcieńczony roztwór związku CL wstrzykiwać dootrzewnowo w objętości 10 mikrolitrów na gram masy ciała.Użyj maksymalnie pięciu myszy na każdy 60-minutowy eksperyment lub 10 myszy na dwuosobowy zespół. Pobrać krew po 5, 15, 30 i 60 minutach od wstrzyknięcia. Po ostatnim pobraniu krwi zatamuj krwawienie za pomocą proszków septycznych, uzupełnij karmę w klatce i upewnij się, że myszy nie wykazują oznak ekstremalnego stresu.Wirować próbki krwi w temperaturze 2000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut w chłodzonej mikrowirówce, a następnie przenieść supernatant do probówki PCR w celu przechowywania. Supernatant może być przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez kilka tygodni do czasu analizy. Załaduj jeden mikrolitr 2X seryjnie rozcieńczonych wzorców glicerolu i zebranych supernatantów do 96-dołkowej płytki.Dodaj 100 mikrolitrów wolnego odczynnika glicerolowego i pozwól płytce inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby rozwinął się kolor. Zmierzyć absorbancję przy 540 nanometrach za pomocą laboratoryjnego czytnika płytek i obliczyć stężenie każdej próbki. Kiedy samce myszy C57BL6 / J zostały poddane ośmiotygodniowej diecie wysokotłuszczowej, poziom cholesterolu całkowitego był znacznie podwyższony.Tymczasem trójglicerydy w surowicy i NEFA nie były, co sugeruje, że na trójglicerydy i NEFA we krwi nie ma głównie wpływu przewlekła dieta wysokotłuszczowa. W drugiej kohorcie myszy podszczepy C57BL6 były karmione dietą wysokotłuszczową przez osiem tygodni, począwszy od ósmego tygodnia życia. Ich poziomy trójglicerydów w surowicy porównano po doustnym prowokacji intralipidowej.Podszczep 6/J miał znacznie wyższy pik w porównaniu z podszczepem 6/N, co wskazuje na zwiększoną absorpcję lub znacznie wolniejszy klirens trójglicerydów. U ośmiotygodniowych myszy C57BL6 / J karmionych normalną karmą, pojedyncze leczenie CL 316, 243 doprowadziło do znacznego wzrostu stężenia glicerolu w surowicy. Jednak codzienne wstępne leczenie dootrzewnowe myszy związkiem CL przez jeden tydzień doprowadziło do stępienia reakcji na leczenie związkiem CL, co sugeruje szybki rozwój oporności na ten związek.Prostota jest zarówno mocną, jak i słabą stroną tego protokołu. Nie nakłada to na eksperymentatorów znaczącej przeszkody technicznej, ale wyniki wymagają starannej interpretacji. W celu przeprowadzenia badań kontrolnych należy wykonać pomiar określonej cząsteczki lipidowej za pomocą spektrometrii mas lub bardziej kompleksowej lipidomiki.Technika śledzenia izotopów jest zwykle stosowana w celu zrozumienia przepływu metabolizmu lipidów.

assessing-whole-body-lipid-handling-capacity-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Ten protokół opisuje użycie analizatora składu ciała i systemu monitorowania metabolizmu zwierząt do charakteryzowania składu ciała i parametrów metabolicznych u myszy. Jako przykład zastosowania tych technik podaje się model otyłości wywołanej przez żywienie wysokotłuszczowe.

Analiza składu ciała i metabolicznego umieszczania w klatkach u myszy karmionych wysokotłuszczowo

Lipidomika oparta na spektrometrii mas typu shotgun dostarcza czuły ilościowy obraz szerokiego spektrum klas lipidów jednocześnie w jednym pomiarze z różnych tkanek gryzoni.

Lipidomika tkanek gryzoni

Obecny protokół opisuje szczegółowy protokół chirurgiczny izolowania przepływającej limfy jelitowej w odpowiedzi na infuzje składników odżywczych dodwunastnicy u myszy. Pozwala to na fizjologiczne określenie całkowitego wchłaniania lipidów w jelitach oraz syntezy i wydzielania chylomikronu w odpowiedzi na różne eksperymentalne składniki odżywcze.

Izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu

Lipoliza triglicerydowa w adipocytach jest ważnym procesem metabolicznym, w wyniku którego uwalniane są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru podstawowej i stymulowanej lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy.

Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro

Ten protokół przedstawia szczegółowe podejście do replikacji mysiego modelu niewydolności serca wywołanej hiperlipidemią z zachowaną frakcją wyrzutową (HFpEF). Projekt łączy w sobie podawanie receptora lipoproteiny T-lipoproteiny o niskiej gęstości związanego z wirusem 9-sercowym troponiny (AAV9-cTnT-LDLR) i poloksamemu-407 (P-407).

Mysi model niewydolności serca wywołanej hiperlipidemią z zachowaną frakcją wyrzutową

Klirens insuliny wątrobowej jest kluczowy dla regulacji homeostazy glukozy. W tym artykule opisano przyjazną dla użytkownika procedurę perfuzji wątroby do bezpośredniej oceny szybkości klirensu insuliny w wątrobie in situ u myszy.

Ocena klirensu insuliny u myszy za pomocą perfuzji wątrobowej in situ

Programowa stymulacja elektryczna umożliwia określenie właściwości przewodzenia w sercu oraz indukcję i terminację arytmii serca przy użyciu różnych protokołów stymulacji. Przy użyciu cewnika przezżylnego można uzyskać zapisy elektrogramów wewnątrzsercowych u myszy po zastosowaniu protokołów programowej stymulacji elektrycznej w celu zidentyfikowania podłoży arytmogennych.

Programowana stymulacja elektryczna u myszy

Poznaj proste metody oceny metabolizmu lipidów u myszy w badaniach metabolicznych in vivo. Te dostępne techniki umożliwiają badaczom analizę funkcji metabolicznej bez specjalistycznego sprzętu.

Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy

Przeglądaj więcej filmów