Name: Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji zarodków mrówek Harpegnathos saltator z wykorzystaniem CRISPR do mutagenezy. Technika ta umożliwia badanie genetycznych podstaw komunikacji i zachowań altruistycznych w społecznościach eusocjalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują laboratoriom Danny'ego Reinberga i Claude'a Desplana na Uniwersytecie Nowojorskim oraz laboratorium Jürgena Liebiga na Uniwersytecie Stanowym Arizony za ich wsparcie w zakresie genetyki mrówek. Hua Yan dziękuje za wsparcie ze strony National Science Foundation I/UCRC, Centrum Technologii Zarządzania Stawonogami w ramach grantu nr IIP-1821914 oraz przez partnerów branżowych. Maya Saar była wspierana przez Stany Zjednoczone - Izrael Dwunarodowy Fundusz Badań i Rozwoju Rolnictwa, stypendium podoktorskie Vaadia-BARD nr FI-595-19.

1. Regularne utrzymywanie kolonii Harpegnathos saltator
<ol>
	<li>Kolonie H. saltator typu dzikiego należy utrzymywać w przezroczystych plastikowych pojemnikach w pomieszczeniu do hodowli mrówek w temperaturze 22–25 °C i fotoperiodzie 12 godzin światła: 12 godzin ciemności (12L:12D) harmonogram oświetlenia.
	<ol>
		<li>Użyj małych pudełek (9,5 x 9,5 cm2) do hodowli pojedynczych robotnic lub małych kolonii. Użyj średnich pudełek (19 x 13,5 cm2) lub dużych pudełek (27 x 19 cm2) do hodowli większych kolonii (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Aby stworzyć budki lęgowe, użyj tynku do wykonania podłóg dla budek. Gdy mokry tynk wysycha w średnich i dużych pudełkach, wciśnij blok pianki w tynk na głębokość kilku centymetrów i kilka centymetrów od tyłu pudełka, aby wyznaczyć dolny obszar gniazda. Po wyschnięciu tynku przykryj wyznaczony obszar gniazda kwadratowym kawałkiem szkła. 
		UWAGA: W małych pudełkach nie ma potrzeby wyznaczania dolnego obszaru gniazda. Jeśli mrówki zaniedbują korzystanie z wyznaczonego dolnego obszaru gniazda, pomocne może być przykrycie szkła kwadratowym kawałkiem czerwonego celofanu. Sprawia to wrażenie ciemnej podziemnej przestrzeni przypominającej gniazda, z których H. saltator korzysta na wolności i może zachęcać je do przeniesienia lęgu w wyznaczone rejon.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Karm kolonie żywymi świerszczami dwa razy w tygodniu. 
	UWAGA: Kolonie powinny być karmione na tyle, aby zjadały wszystkie świerszcze przed następnym karmieniem. Karm odizolowane mrówki i kolonie zmutowanych mrówek świerszczami użądlonymi przez robotnice zwykłej kolonii 2-3 razy w tygodniu.</li>
	<li>Regularnie nalewaj wodę na gipsową podłogę budki lęgowej za pomocą butelki do mycia. 
	UWAGA: Tynk powinien być na tyle wilgotny, aby w dotyku nie był zakurzony, ale powinien być na tyle suchy, aby cała dodana woda została wchłonięta przez tynk. Ważne jest, aby gniazda nie były nadmiernie podlewane. Średnio budki lęgowe będą wymagały dodawania niewielkiej ilości wody raz w tygodniu.</li>
	<li>Za każdym razem, gdy dochodzi do karmienia, usuwaj śmieci i martwe osobniki. Zamroź wszystkie odpady i martwe mrówki przez noc w temperaturze -30 °C przed wyrzuceniem tych materiałów jako zwykłych śmieci.</li>
	<li>Od czasu do czasu dodawaj szczyptę suszonych trocin do kolonii; pomaga to larwom w procesie przepoczwarzania i pomaga robotnicom utrzymać budkę lęgową w czystości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie igieł do mikroiniekcji ze szkła kwarcowego
<ol>
	<li>Użyj ściągacza do mikropipet, aby wyciągnąć szklane igły do mikroiniekcji.</li>
	<li>Wybierz szklankę, którą chcesz pociągnąć. Upewnij się, że używane szkło było przechowywane w wolnym od kurzu i czystym środowisku. 
	UWAGA: W tym przypadku do produkcji igieł do mikroiniekcji użyto cienkościennego nitkowatego szkła kwarcowego o średnicy zewnętrznej 1,0 mm, średnicy wewnętrznej 0,5 mm i długości 7,5 cm. W przypadku wstrzykiwania zarodka o miękkim ciele mogą być również stosowane igły borokrzemianowe, ale igły borokrzemianowe nie są w stanie przeniknąć przez twardą kosmówkę.</li>
	<li>Ustaw ustawienia parametrów ściągacza. Użyj dwuetapowego procesu do wyciągania igieł do mikroiniekcji dla zarodków H. saltator: parametry dla pierwszego etapu obejmują ciepło 575, włókno 3, prędkość 35, opóźnienie 145 i ciągnięcie 75; Parametry drugiego kroku obejmują ciepło 425, żarnik 0, prędkość 15, opóźnienie 128 i ciągnięcie 200. Po wykonaniu drugiego kroku upewnij się, że otrzymana igła ma stożek 2 mm i końcówkę 0,5 μm (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2). 
	UWAGA: Ten zestaw parametrów, wraz z parametrami dla innych typów igieł, można znaleźć w Podręczniku Obsługi17. Instrukcje obsługi ściągaczy do pipet często zawierają zalecane parametry dla różnych technik. Może być konieczne wykonanie kilku prób i błędów, aby określić, które parametry generują najlepsze igły dla określonych potrzeb. Krótki stożek jest idealny do wstrzykiwań H. saltator, ponieważ może przenikać przez twardą kosmówkę zarodków H. saltator. W przypadku wstrzyknięcia miękkiego zarodka, takiego jak ten, który został zdekorionowany (np. Drosophila), dłuższe zwężenie około 10 mm może dać lepsze wyniki. Instrukcje obsługi ściągaczy do pipet zwykle podają konkretne parametry igieł do ciągnięcia odpowiednich do różnych potrzeb. Ważne jest, aby nosić rękawice podczas obchodzenia się z włóknami szklanymi i ciągnięcia igieł. Oleje z gołych rąk mogą przenosić się na szkło, jeśli nie są noszone rękawiczki.</li>
	<li>Po ustawieniu parametrów użyj ściągacza do mikropipet, aby wyciągnąć igły do mikroiniekcji. Upewnij się, że igły są przechowywane w wolnym od kurzu i czystym środowisku do czasu użycia. 
	UWAGA: Zaleca się używanie świeżo wyciągniętych igieł do mikroiniekcji. Jeśli używane są wstępnie wyciągnięte igły, należy je odpowiednio przechowywać w pudełku, aby zapobiec uszkodzeniu końcówek igieł i potencjalnemu zanieczyszczeniu. Igły, które były poddawane długotrwałemu przechowywaniu, nie są zalecane do wstrzykiwań do zarodków.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mikrowtryskiwacza
<ol>
	<li>Użyj mikrowstrzykiwacza, aby wstrzyknąć pożądane materiały do zarodków mrówek.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę mikroiniekcji białek Cas9 i syntetyzowanych in vitro małych przewodnikowych RNA (sgRNA)10. Trzymaj mieszaninę na lodzie do momentu, gdy nadejdzie czas na załadowanie igły do mikroiniekcji. Gdy nie jest używana, należy przechowywać mieszaninę do mikroiniekcji w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Stężenia różnią się u różnych gatunków. Wysokie stężenie może powodować wysoką śmiertelność, podczas gdy niskie stężenie może zmniejszać wydajność. Do iniekcji zarodka H. saltator używamy 0,2 μg/μL białek Cas9 i 0,2 μg/μL sgRNA. Projektowanie naszych sgRNA było zgodne z wcześniej ustalonym protokołem18. Sekwencje genów uzyskano z baz danych DNA. Sekwencja genomu H. saltator była również wcześniej opisywana19,20.</li>
	<li>Dostosuj parametry iniekcji dla zarodków H. saltator: ciśnienie iniekcji 140 hektopaskalów (hPa), stałe ciśnienie 70 hPa i czas 0,4 sekundy. Dostosuj stałe ciśnienie tak, aby materiał płynął tylko w jednym kierunku. Ciśnienie i czas wstrzyknięcia należy dostosować tylko wtedy, gdy materiał nie przepływa z igły do zarodka. 
	UWAGA: W przypadku wstrzykiwania innego rodzaju zarodka, podstawowym parametrem, który może ulec zmianie, jest stałe ciśnienie, które jest odpowiedzialne za zapewnienie, że płyn z zarodka nie spływa z powrotem do igły. Głośność nie jest kontrolowana w tym protokole. Ustawienie parametrów mikrowtryskiwacza jest wystarczające do uzyskania spójnych iniekcji.</li>
	<li>Naładować igłę do mikroiniekcji 2 μl mieszaniny za pomocą końcówek pipet do mikroładowarki. Rób to powoli, aby upewnić się, że w mieszaninie nie tworzą się pęcherzyki. 
	UWAGA: Jeśli tworzą się pęcherzyki, utrzymanie spójnych mikroiniekcji może być trudne.</li>
	<li>Złam tylko końcówkę igły, łamiąc wzdłuż krawędzi taśmy, tak aby nadal zachowany był wąski stożek. Upewnij się, że igła jest złamana na tyle, aby końcówka była otwarta, ale nie na tyle, aby stożek został odłamany. 
	UWAGA: Co ważne, jeśli otwór igły jest zbyt szeroki po złamaniu, użytkownik zobaczy, jak płyn wypływa z igły po zamontowaniu do mikrowtryskiwacza pod ciśnieniem przed zastosowaniem ciśnienia iniekcyjnego. Niektóre protokoły mikroiniekcji zalecają łamanie igieł poprzez przecięcie końcówki nożyczkami. Ta metoda nie jest zalecana, ponieważ nożyczki mogą spowodować pęknięcie końcówki igły. Wstrzykiwanie zarodków za pomocą roztrzaskanej igły będzie bardzo szkodliwe.</li>
	<li>Zamontuj igłę do mikromanipulatora</li>
</ol>
4. Wstrzykiwanie zarodków
<ol>
	<li>Wybierać zarodki do mikroiniekcji od stadium syncytialnego: czas podczas rozwoju, w którym jądra dzielą się bez cytokinezy. 
	UWAGA: Jest to idealny czas podczas rozwoju do edycji genomu za pomocą mikroiniekcji, jak odkryto wcześniej w Drosophila21. Zarodki H. saltator przechodzą etap syncytialny i osiągają celularyzację około 36 godzin po złożeniu jaj10. Wyższą skuteczność osiąga się, jeśli do iniekcji używa się młodszych zarodków.</li>
	<li>Ułóż zarodki na kawałku dwustronnej taśmy przyklejonej do szklanego szkiełka mikroskopowego. Upewnij się, że zarodki są dobrze przymocowane do taśmy, aby zapobiec przemieszczaniu się podczas wstrzyknięcia. Ułóż zarodki w orientacji pionowej, tak aby boczna strona zarodka znajdowała się na krawędzi taśmy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Umieścić szkiełko podstawowe i wyściełane zarodki na stoliku mikroskopu w wyznaczonym stanowisku do mikroiniekcji. 
	UWAGA: Zaleca się, aby zarodki były ułożone w taki sposób, aby kolejne wstrzyknięcia można było wykonywać poprzez przesuwanie szkiełka na stoliku, zamiast dostosowywania położenia igły przy każdym wstrzyknięciu. Pozwala to na sprawniejsze wykonywanie kolejnych iniekcji.</li>
	<li>Dopasuj igłę do pierwszego zarodka, który ma zostać wstrzyknięty za pomocą mikromanipulatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 4a).</li>
	<li>Bocznie nakłuć igłę w pierwszym zarodku wzdłuż jego osi grzbietowej/brzusznej pod mikroskopem.</li>
	<li>Wstrzyknąć mieszaninę do mikroiniekcji. Zwróć uwagę na niewielki ruch zarodka, wskazujący na wzrost ciśnienia wewnętrznego spowodowany wstrzykniętym płynem. Dodatkowo obserwuj, czy na zewnętrznej błonie zarodka tworzy się mała kropelka zawierająca widoczny ślad tkanki i/lub lipidu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4b). 
	UWAGA: Obecność śladowych ilości tkanki i/lub lipidów w kropelce wskazuje, że igła z powodzeniem przebiła zarówno błonę kosmówkową, jak i błonę witelinową zarodka. Jeśli śladowe ilości tych materiałów nie są obecne, oznacza to, że wstrzyknięcie nie zostało wykonane pomyślnie i należy je powtórzyć. Po kilku sekundach kropla zostanie ponownie wchłonięta przez zarodek i nie będzie już widoczna.</li>
	<li>Natychmiast delikatnie wyjmij igłę z zarodka i przejdź do następnej, regulując położenie szkiełka mikroskopowego. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte.</li>
	<li>Po pomyślnym wstrzyknięciu wszystkich zarodków znajdujących się na szkiełku należy przenieść szkiełko do wilgotnego pudełka na 1 godzinę, aby dać zarodkom czas na regenerację po procesie wstrzykiwania przed usunięciem ze szkiełka.</li>
</ol>
5. Hodowla wstrzykniętych zarodków
<ol>
	<li>Po 1 godzinie inkubacji w wilgotnym pudełku delikatnie usuń wstrzyknięte zarodki z taśmy za pomocą szczypiec do piórek i przenieś je do probówki wypełnionej niewielką ilością 70% etanolu. Odwróć probówkę kilka razy, aby przenieść zarodki na dno probówki. Powtórz płukanie etanolem jeden raz, a następnie trzy razy przepłucz wodą w autoklawie.</li>
	<li>Za pomocą małego i miękkiego pędzla przenieś wszystkie wstrzyknięte zarodki na 1% płytki agarowe z 2% antybiotykiem-antybiotykiem. Zastosuj antybiotyk-antybiotyk po ostygnięciu wylanych płytek agarowych, rozprowadzając je po powierzchni płytki za pomocą rozsiewacza komórek. Uszczelnij płytkę agarową parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu agaru. 
	UWAGA: Nie należy próbować zwracać wstrzykniętych zarodków do kolonii po wstrzyknięciach, ponieważ robotnice mogą zniszczyć większość wstrzykniętych zarodków. Przeżywalność jest zatem optymalizowana, umożliwiając zarodkom rozwój na płytkach agarowych poza normalnym środowiskiem kolonii.</li>
	<li>Inkubować płytki agarowe w temperaturze 25 °C przez około 4 tygodnie. Regularnie sprawdzaj, czy nie ma wylęgu.</li>
	<li>Gdy z pierwszego zarodka wykluje się larwa, wszystkie zarodki i larwy należy umieścić w budce lęgowej z kilkoma młodymi pielęgniarkami, które będą opiekować się pisklętami. Nakarm się świerszczami użądlonymi przez większą kolonię dzikiego typu, usuń produkty przemiany materii i dodaj wodę zgodnie z tym samym protokołem, który omówiono w sekcji 1. 
	UWAGA: Małe pudełka (9,5 x 9,5 cm2) są idealne dla takich kolonii. H. saltator dobrze rozmnaża się w niewoli. Dlatego zmutowane zarodki mogą być hodowane do dorosłości. Izolacja zmutowanych dorosłych osobników powoduje przejście do fazy reprodukcyjnej gamergate. Kontrolowane krzyżówki są używane do tworzenia zmutowanych kolonii z osobnikami heterozygotycznymi lub homozygotycznymi (<silna klasa="xfig">Ryc. 5).</li>
</ol>

<ol><li>Evans, J. D., Wheeler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiles+during+honeybee+caste+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression profiles during honeybee caste determination.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).</li>
<li>Keller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+the+genetics+of+social+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adaptation and the genetics of social behaviour.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).</li>
<li>Cahan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+genetic+differences+between+queens+and+workers+in+hybridizing+Pogonomyrmex+harvester+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants.</a> Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).</li>
<li>Volny, V. P., Gordon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+queen-worker+dimorphism+in+a+social+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eusocial+insects+as+emerging+models+for+behavioural+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).</li>
<li>Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+ant+workers+capable+of+colony+foundation%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Are ant workers capable of colony foundation.</a> Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).</li>
<li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+topics+in+epigenetics%3A+ants%2C+brains%2C+and+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).</li>
<li>Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+reproduction+by+both+queens+and+workers+in+the+ponerine+ant+Harpegnathos+saltator%5BTitle%5D)+AND+%22Insectes+Sociaux%22%5BJournal%5D)">Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator.</a> Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).</li>
<li>Trible, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((orco+mutagenesis+causes+loss+of+antennal+lobe+glomeruli+and+impaired+social+behavior+in+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants.</a> Cell. 170 (4), 727-735 (2017).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li>
<li>Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+knockout+mutants+by+CRISPR%2FCas9+in+the+European+honeybee%2C+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Science%22%5BJournal%5D)">Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L.</a> Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).</li>
<li>Kohno, H., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKast+is+dispensable+for+normal+development+and+sexual+maturation+of+the+male+European+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+integration+and+expression+of+piggyBac-derived+cassettes+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).</li>
<li>Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+honeybee+%28Apis+mellifera%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).</li>
<li>Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+mediated+by+CRISPR%2FCas9+in+the+red+imported+fire+ant%2C+Solenopsis+invicta%5BTitle%5D)+AND+%22Insectes+Sociaux%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta.</a> Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+transcriptomic+analysis+of+chemosensory+receptors+in+a+pair+of+divergent+ant+species+reveals+sex-specific+signatures+of+odor+coding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding.</a> PLoS Genetics. 8 (8), 1002930(2012).</li>
<li>Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSutter%2C++%22Sutter+Instrument+Company%22">Sutter Instrument Company</a>. , (2012).</li>
<li>Perry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+color+vision+in+butterflies%3A+molecular+logic+behind+three+way+stochastic+choices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices.</a> Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).</li>
<li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+comparison+of+the+ants+Camponotus+floridanus+and+Harpegnathos+saltator%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator.</a> Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).</li>
<li>Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+genome+assemblies+reveal+long+non-coding+RNAs+expressed+in+ant+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains.</a> Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).</li>
<li>Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHenderson%2C+DS+%22Drosophila+Cytogenetics+Protocols%22">Drosophila Cytogenetics Protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
<li>Kern, R., Stobrawa, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKern%2C+R+%22Step-by-Step+Guide%3A+Microinjection+of+Adherent+Cells+with+the+Eppendorf+Injectman%C2%AE+4+and+Femtojet%C2%AE+4%22">Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4</a>. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ewolucja eusocjalności wśród owadów, w tym mrówek, pszczół, os i termitów, doprowadziła do pojawienia się nowych cech behawioralnych i morfologicznych, z których wiele uważa się za zależne od kombinacji czynników środowiskowych i genetycznych 1,2,3,4. Niestety, atrakcyjność i przydatność owadów eusocjalnych jako modeli badawczych w dziedzinie genetyki została utrudniona przez trudności związane...

Ewolucja eusocjalności u owadów, a konkretnie tych z rzędów Hymenoptera i Blattodea (dawniej Isoptera), zaowocowała unikalnymi i często wyrafinowanymi cechami behawioralnymi, które manifestują się zarówno na poziomie indywidualnym, jak i kolonii. Reprodukcyjny podział pracy, cecha charakteryzująca najbardziej zaawansowane grupy owadów społecznych, często obejmuje systemy kastowe złożone z kilku behawioralnie i często morfologicznie odrębnych grup. Taka behawioralna i morfologiczna różnorodność między kastami jest kontrolowana nie tylko przez ich system genetyczny, ale często także przez środowisko1,2,3,4, co sprawia, że owady eusocjalne są atrakcyjnym obiektem badań genetycznych i epigenetycznych.
Zdolność do manipulowania systemem genetycznym owadów eusocjalnych okazała się wyzwaniem, ponieważ wiele gatunków nie łączy się w pary i nie rozmnaża w warunkach laboratoryjnych. Większość owadów eusocjalnych ma również bardzo mało osobników reprodukcyjnych w kolonii, co ogranicza liczbę potomstwa, które można wyprodukować, a co za tym idzie, ogranicza wielkość próby do manipulacji genetycznej5. Dodatkowo, wiele owadów eusocjalnych ma długi czas generacji w porównaniu z owadami powszechnie używanymi do badań genetycznych (takimi jak Drosophila), co dodatkowo utrudnia ustalenie linii genetycznych5. Niektóre gatunki eusocjalne mogą jednak generować dużą część aktywnych reprodukcyjnie osobników w kolonii, co łagodzi wyzwania i stwarza możliwości tworzenia zmutowanych lub transgenicznych linii.
W przypadku gatunku mrówek ponerine, Harpegnathos saltator, wszystkie robotnice mogą stać się aktywne reprodukcyjnie po śmierci królowej lub izolacji społecznej. Te workery są określane jako "gamergates" i mogą być używane do generowania nowych kolonii6. Co więcej, w kolonii może znajdować się więcej niż jedna brama gry, co zwiększa produkcję potomstwa5,7,8. Do tej pory zmutowane i/lub transgeniczne linie zostały opracowane u europejskiej pszczoły miodnej, Apis mellifera, oraz u gatunku mrówek, H. saltator, Ooceraea biroi i Solenopsis invicta9,10,11,12,13,14,15. Analizy genetyczne pszczół i mrówek społecznych utorowały drogę do lepszego zrozumienia eusocjalności, dostarczając szeregu możliwości badania genów i ich wpływu na zachowanie owadów eusocjalnych i fizjologię specyficzną dla danej kasty.
Tutaj udostępniamy protokół modyfikacji genetycznej za pomocą systemu CRISPR/Cas9 w H. saltator. W szczególności technika ta została wykorzystana do wygenerowania mutacji linii zarodkowej w orco, genie kodującym obligatoryjny koreceptor wszystkich receptorów zapachowych (OR)10. Geny OR zostały znacznie rozszerzone u owadów eusocjalnych błonkoskrzydłych16, a orco odgrywa istotną rolę w węchu owadów; w przypadku jego braku sale operacyjne nie montują się ani nie działają normalnie. Mutacje genu orco zaburzają zatem czucie węchowe, rozwój neuronalny i związane z nim zachowania społeczne9,10.
W tym protokole, białka Cas9 i małe przewodnikowe RNA (sgRNA) są wprowadzane do embrionów mrówek za pomocą mikroiniekcji w celu wywołania mutagenezy docelowego genu. W tym miejscu szczegółowo opiszemy procedurę mikroiniekcji wraz ze wskazówkami dotyczącymi pielęgnacji kolonii i wstrzykniętych zarodków. Metody te są odpowiednie do indukowania mutagenezy w wielu różnych genach u mrówek H. saltator i mogą być stosowane do szerszego spektrum owadów błonkoskrzydłych.

<table><tbody><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (100X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Białko Cas9 z NLS, wysokie stężenie</td><td>PNA Bio</td><td>CP02</td><td></td></tr><tr><td>Cellophane Roll 20 cali X 5 stóp</td><td>Produkty o podwyższonym połysku</td><td>B00254CNJA</td><td>Produkt występuje w wielu wariantach kolorystycznych. Kup go w kolorze czerwonym do wykorzystania do budowy gniazd mrówek.</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy Eclipse Ci-S&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Ci-S</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce piórkowe, wąska końcówka</td><td>BioQuip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz FemtoJet ll</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Ten produkt nie jest już sprzedawany ani wspierany przez firmę Eppendorf. Zamiast tego można zastosować porównywalny mikroiniektor.</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>NCBI Baza</td> danych <td>National Center for Biotechnology Information</td><td>Identyfikator genu: 105183395&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>P-2000 Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000/G</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka plastikowe (19 X 13,5 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>079C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka plastikowe (27 X 19 cm<s>2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>195C</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki plastikowe (9,5 X 9,5 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>028C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szkło kwarcowe bez żarnika</td><td>Sutter Instruments</td><td>Q100-50-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas, 8,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Winsor & Newton Cotman Akwarela Seria 111 Pędzel syntetyczny z krótką rękojeścią - okrągły #000</td><td>Winsor i Newton</td><td>5301030</td><td></td></tr></tbody></table>

iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem crispr u mrówki harpegnathos saltator

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Unikalne cechy owadów eusocjalnych, takie jak zachowanie społeczne i reprodukcyjny podział pracy, są kontrolowane przez ich system genetyczny. Aby dowiedzieć się, w jaki sposób geny regulują cechy społeczne, opracowaliśmy zmutowane mrówki poprzez dostarczanie kompleksu CRISPR do młodych zarodków w stadium syncytialnym. W tym miejscu przedstawiamy protokół mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u Harpegnathos saltator, gatunku mrówki ponerine, który wykazuje uderzającą plastyczność fenotypową. Mrówki H. saltator są łatwo hodowane w warunkach laboratoryjnych. Zarodki są pobierane do mikroiniekcji z białkami Cas9 i syntetyzowane in vitro małe przewodnikowe RNA (sgRNA) za pomocą domowych igieł kwarcowych. Zarodki po wstrzyknięciu są hodowane poza kolonią. Po pojawieniu się pierwszej larwy wszystkie zarodki i larwy są transportowane do budki lęgowej z kilkoma robotnicami karmiącymi w celu dalszego rozwoju. Protokół ten jest odpowiedni do indukowania mutagenezy w celu analizy fizjologii i zachowań społecznych specyficznych dla kasty u mrówek, ale może być również stosowany do szerszego spektrum błonkoskrzydłych i innych owadów.

Zastosowanie przedstawionego tutaj protokołu pozwoliło na skuteczne przeprowadzenie edycji genomu w embrionach Harpegnathos saltator. Wyniki te zostały zweryfikowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy oraz klonowania pGEM DNA wyizolowanego z wstrzykniętych embrionów, a następnie poprzez sekwencjonowanie DNA. Efektywność mutagezy somatycznej z wykorzystaniem tego protokołu wyniosła około 40%. Samce mutanty F1 krzyżowano z samicami typu dzikiego w celu uzyskania heterozygotyc...

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Protokół ten pozwala nam na generowanie genetycznie modyfikowanych mrówek, aby zrozumieć funkcję genów w komunikacji i zachowaniu w środowisku społecznym. Manipulowanie systemem genetycznym owadów eusocjalnych jest trudne, ponieważ wiele gatunków nie łączy się w pary i nie rozmnaża w warunkach laboratoryjnych. Uderzająca plastyczność fenotypowa w dnie komórek hipernosa mrówek pozwala nam ustalić linie mutantów, w których pośredniczy CRISPR.Procedurę zademonstruje Kayli Sieber, doktorantka z laboratorium. Utrzymuj kolonie H. saltator typu dzikiego w przezroczystych plastikowych pudełkach w pomieszczeniu do hodowli mrówek w temperaturze od 22 do 25 stopni Celsjusza i 12-godzinnym jasnym, 12-godzinnym ciemnym oświetleniu. Używaj małych pudełek do hodowli pojedynczych robotnic lub małych kolonii oraz średnich lub dużych pudełek do hodowli większych kolonii.Aby stworzyć budki lęgowe, użyj tynku do wykonania podłóg. Gdy mokry tynk wysycha w średnich i dużych pudełkach, wciśnij blok pianki w tynk na głębokość kilku centymetrów i kilka centymetrów od tyłu pudełka, aby wyznaczyć dolny obszar gniazda. Po wyschnięciu tynku przykryj wyznaczony obszar gniazda kwadratowym kawałkiem szkła.Karm kolonie żywymi świerszczami dwa razy w tygodniu i regularnie nakładaj wodę na plastikową podłogę budki lęgowej za pomocą butelki do mycia. Za każdym razem, gdy dochodzi do karmienia, usuwaj śmieci i martwe osobniki. Zamroź wszystkie odpady i martwe mrówki przez noc w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza przed wyrzuceniem tych materiałów jako zwykłych śmieci.Okresowo dodawaj szczyptę suszonych trocin do kolonii, aby pomóc larwom w procesie przepoczwarzania i pomóc robotniczym utrzymać budkę lęgową w czystości. Użyj ściągacza do mikropipet, aby wyciągnąć szklane igły do mikroiniekcji. Upewnij się, że używane szkło było przechowywane w wolnym od kurzu i czystym środowisku.Użyj dwuetapowego procesu, aby wyciągnąć igły do mikroiniekcji. W pierwszym kroku ustaw ciepło na 575, żarnik na 3, prędkość na 35, opóźnienie na 145, a ciągnięcie na 75. W drugim kroku ustaw ciepło na 425, żarnik na 0, prędkość na 15, opóźnienie na 128, a ciągnięcie na 200.Upewnij się, że powstała igła ma stożek 2 milimetrów i końcówkę 0,5 mikrometra. Po wyciągnięciu igieł należy je przechowywać w wolnym od kurzu i czystym środowisku do czasu użycia. Przygotować mieszaninę mikroiniekcji białek kazeinowych i syntetyzowanych in vitro małych przewodnikowych RNA.Trzymaj mieszaninę na lodzie do momentu, gdy nadejdzie czas na załadowanie igły do mikroiniekcji. Gdy nie jest używana, mieszaninę do mikroiniekcji należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ustaw parametry iniekcji na ciśnienie iniekcji 140 hektopaskalów, stałe ciśnienie 70 hektopaskala i czas 0,4 sekundy.Ustawić stałe ciśnienie tak, aby materiał przepływał tylko w jednym kierunku, i dostosować ciśnienie i czas iniekcji tylko wtedy, gdy żaden materiał nie przepływa z igły do zarodka. Załadować igłę do mikroiniekcji dwoma mikrolitrami mieszaniny za pomocą końcówek pipet do mikroładowarek. Rób to powoli, aby upewnić się, że w mieszaninie nie tworzą się pęcherzyki.Złamij tylko końcówkę igły wzdłuż krawędzi taśmy, tak aby nadal zachowany był wąski stożek. Upewnij się, że igła jest złamana na tyle, aby końcówka była otwarta, ale nie na tyle, aby stożek został odłamany. Następnie zamontuj igłę do mikromanipulatora.Selekcjonować zarodki do mikroiniekcji od etapu syncytialnego, czyli kiedy jądra dzielą się bez cytokinezy. Wyłóż zarodki na płytce z taśmy dwustronnej przyklejonej do szklanego szkiełka mikroskopowego, upewniając się, że są dobrze przymocowane do taśmy, aby zapobiec przesuwaniu się podczas wstrzykiwania. Ułóż zarodki w orientacji pionowej tak, aby boczna strona każdego zarodka znajdowała się na krawędzi taśmy.Umieścić szkiełko i wyściełane zarodki na stoliku mikroskopu w wyznaczonym stanowisku do mikroiniekcji. Wyrównaj igłę z pierwszym zarodkiem, który ma zostać wstrzyknięty za pomocą mikromanipulatora, a następnie nakłuj bocznie pierwszy zarodek wzdłuż jego osi grzbietowej lub brzusznej pod mikroskopem. Wstrzyknąć mieszaninę do mikroiniekcji i poszukać niewielkiego ruchu zarodka, wskazującego na wzrost ciśnienia wewnętrznego spowodowany wstrzykniętym płynem.Dodatkowo zwróć uwagę na tworzenie się małej kropelki zawierającej widoczne ślady tkanki lub lipidu na zewnętrznej błonie zarodka. Delikatnie wyjmij igłę z zarodka i przejdź do następnego zarodka, regulując położenie szkiełka mikroskopowego. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte.Po pomyślnym wstrzyknięciu wszystkich zarodków znajdujących się na szkiełku należy przenieść szkiełko do wilgotnego pudełka na jedną godzinę, aby dać zarodkom czas na regenerację przed usunięciem ich ze szkiełka. Po inkubacji umyj szkiełko etanolem, delikatnie usuń wstrzyknięte zarodki z taśmy za pomocą szczypiec do piórek i przenieś je do probówki wypełnionej niewielką ilością 70% etanolu. Odwróć rurkę kilka razy.Za pomocą małego i miękkiego pędzla przenieś wszystkie wstrzyknięte zarodki na 1% płytki agarowe z 2% antybiotykiem przeciwgrzybiczym. Inkubować płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez około cztery tygodnie, regularnie sprawdzając, czy się wykluwają. Gdy z pierwszego zarodka wykluje się larwa, wszystkie zarodki i larwy należy umieścić w budce lęgowej z kilkoma młodymi pielęgniarkami, które będą opiekować się pisklętami.Utrzymuj kolonię zgodnie z wcześniej zademonstrowanymi metodami. Protokół ten został wykorzystany do pomyślnego przeprowadzenia edycji genomu w zarodkach Harpegnathos saltator. Wyniki zweryfikowano za pomocą PCR i klonowania pGEM DNA wyekstrahowanego z wstrzykniętych zarodków, a następnie sekwencjonowania DNA.Skuteczność mutagenezy somatycznej przy użyciu tego protokołu osiągnęła około 40% zmutowane samce F1 zostały skrzyżowane z samicami typu dzikiego w celu wytworzenia heterozygotycznych samic F2, które, jeśli nie zostały pokryte, dały samce F3. Zmutowane samce F3 zostały skrzyżowane z heterozygotycznymi samicami, aby uzyskać homozygotyczne zmutowane samice F4. W wyniku udanej mutagenezy zaobserwowano nietypowe zachowania, które korelowały z utratą genu docelowego.Utrata Orco wiąże się z utratą wyczucia feromonów, niezdolnością do wykrycia zdobyczy, upośledzoną płodnością i wędrówką z kolonii. Podczas wykonywania tego protokołu należy zminimalizować uszkodzenia zarodków podczas wstrzykiwania. Można tego dokonać, upewniając się, że końcówka igły nie jest zbyt szeroko otwarta i powoli przesuwając igłę podczas wstrzykiwania.Podobne techniki mogą być wykorzystane do generowania i utrzymywania transgenicznych mrówek, co zapewni bardziej wyrafinowane narzędzia do badania aktywności i zachowania neuronów. Neurogeneza za pośrednictwem CRISPR została wykorzystana u innych gatunków owadów eusocjalnych, takich jak pszczoły miodne, klonalne mrówki najeźdźcy i mrówki ogniste. Modyfikacje genetyczne ułatwią badania funkcjonalne nad rozwojem, fizjologią i zachowaniami społecznymi owadów eusocjalnych.

embryo-injections-for-crispr-mediated-mutagenesis-ant-harpegnathos

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania jaj świerszczy, technikę, która służy jako podstawowa metoda w wielu eksperymentach na świerszczu, w tym, ale nie tylko, interferencji RNA i manipulacji genomem.

Wstrzykiwanie jaj Gryllus bimaculatus

Tutaj przedstawiono protokół do produkcji i hodowli ryb elektrycznych z nokautem genomu CRISPR/Cas9. Szczegółowo przedstawiono wymagane wymagania z zakresu biologii molekularnej, hodowli i hodowli zarówno dla żywiciela, jak i mormyryda, a także techniki iniekcji w celu wytworzenia larw indelu F0 indukowanych przez Cas9.

Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

To są protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków skoczka kukurydzianego w celu modyfikacji ich genomu poprzez edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 lub dodawanie oznaczonych elementów transpozycyjnych poprzez transformację linii zarodkowej.

Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Badanie to opracowało sposób tworzenia i utrzymania stabilnych linii mutantów dla ślimaka jabłkowego słodkowodnego, Pomacea canaliculata. Protokoły obejmują zbieranie zygot, mikrowstrzyknięcie ich komponentami systemu CRISPR/Cas9 w celu wywołania edycji genomu, hodowlę zarodków ex ovo oraz genotypizację po kontrolowanych krzyżowaniach.

Złota jabłka ślimaka Pomacea canaliculata: od zygot do stabilnych linii mutantów

Poznaj metodę mikroiniekcji zarodków mrówek Harpegnathos saltator z wykorzystaniem CRISPR do mutagenezy. Technika ta umożliwia badanie genetycznych podstaw komunikacji i zachowań altruistycznych w społecznościach eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Przeglądaj więcej filmów