Synteza zależnych od pH pirazoli, imidazolu i izoindolonu dipirynonu przy użyciu podejścia kondensacyjnego Claisena-Schmidta

Reakcja kondensacji Claisena-Schmidta jest odwieczną reakcją, po raz pierwszy opisaną przez Claisena i Schmidta jednocześnie w 1881 roku. Polega na wspomaganym zasadą dodawaniu enolanu ketonu lub aldehydu, pokazanego na niebiesko, do aldehydu aromatycznego, pokazanego na czerwono. Początkowo dodanie enolanu powoduje powstanie alkoholu, jak pokazano w nawiasach.

Jednak późniejsze odwodnienie ostatecznie prowadzi do enonu. Ponieważ aroaldehyd nie zawiera alfa wodoru, nie może tworzyć enolanu. W rezultacie, często słabe zasady, takie jak wodorotlenek, mogą być używane do wytwarzania enolanu.

Kondensacja Claisena-Schmidta była przez lata wykorzystywana do generowania wielu związków. Jednak jest szeroko stosowany do łączenia aromatycznych systemów pierścieniowych chalkonów i flawanonów, które są pokazane na czerwono i niebiesko. Niebieska część oznacza, że pochodzi z enolanu, a czerwona jest częścią aromatyczną.

chalkony i flawanony są niezbędnym rdzeniem szeregu biologicznie aktywnych cząsteczek, które mają szereg działań, takich jak przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze, przeciwzapalne i przeciwnowotworowe, w zależności od wzorca substytucji. Inną szeroką klasą cząsteczek powstających w reakcji kondensacji Claisena-Schmidta są związki mostkowane metyną, których przykłady podajemy w tym badaniu. Nasze laboratorium jest zainteresowane fluorescencyjnymi składnikami pigmentu bilirubiny, która w naturalny sposób wytwarza produkt degradacji hemu.

Synteza bilirubiny i wielu jej składników obraca się wokół kondensacji typu Claisena-Schmidta, którą można uwidocznić w strukturach wyświetlanych przez niebieski enolan i czerwone składniki aldehydu aromatycznego. Zazwyczaj bezpośrednie składniki bilirubiny, takie jak dipirynony, są niefluorescencyjne. Jeśli jednak połączy się dwie grupy azotowe grupą metylenową lub karbonylową, powstałe cząsteczki stają się wysoce fluorescencyjne, tak jak w przypadku ksantoglowów.

Zwykle dipyrynony pochłaniają promieniowanie UV lub światło niebieskie, co powoduje proces izomeryzacji od Z do E. Podobnie jak niemostkowane dipyrrynony, N w zmostkowanych dipirynonach również pochłaniają promieniowanie UV lub światło niebieskie, ale różnią się tym, że relaksują się w stanie wzbudzonym poprzez fluorescencję. Niedawno odkryliśmy szereg pochodnych dipirynonu, które w rzeczywistości fluoryzują bez mostka kowalencyjnego łączącego dwie grupy azotowe.

Zamiast tego wydaje się, że wiązanie wodorowe powstrzymuje proces izomeryzacji od Z do E, prowadząc do trybu fluorescencji. Ponadto dokonano nieoczekiwanego odkrycia, że cząsteczki te mogą być deprotonowane w ośrodkach zasadowych, co prowadzi do przesuniętych ku czerwieni widm emisyjnych absorpcji w stanach zdeprotonowanych. W związku z tym cząsteczki te mogą mieć wartość jako ratiometryczne sondy pH.

Stosowane są fluorescencyjne pochodne dipirynonu, które powodują nieznaczną adaptację w tradycyjnej reakcji kondensacji Claisena-Schmidta. Protokół ten odbiega od tradycyjnej reakcji kondensacji Claisena-Schmidta w tym, że źródłem nukleofilowym jest enolan winylu pochodzący z pirolinonu lub izoindolonu. Winylowy enolan dodaje się do aldehydu pirazolu lub imidazolu, aby wytworzyć niewielką bibliotekę analogów dipyrrynonu.

Procedura która jest używana do tworzenia tej biblioteki jest zilustrowana na filmie. Jednak analogiczne kroki można zastosować do przeprowadzenia tradycyjnej reakcji Claisena-Schmidta. Podczas gdy reakcja Claisena-Schmidta była i jest nadal szeroko stosowaną reakcją syntetyczną, jest to pierwsze zliczanie wideo tej metody, którego jesteśmy świadomi.

Aby przygotować się do syntezy fluorescencyjnego analogu dipirynonu poprzez kondensację aldolową, należy odważyć równe odpowiedniki wybranego nukleofilu i elektrofilu. Następnie dodaj je do 25-mililitrowej kolby okrągłodennej zawierającej mieszadło magnetyczne. Odmierz pięć mililitrów etanolu za pomocą cylindra z podziałką.

Następnie dodać etanol do kolby okrągłodennej. Odmierz 2,4 mililitra wcześniej przygotowanego 10-molowego wodorotlenku potasu za pomocą cylindra z podziałką. Następnie dodać wodorotlenek potasu do kolby.

Aby ustawić kolbę w pozycji refluksowej, należy nałożyć wystarczającą ilość smaru próżniowego na zmielone szklane złącze kondensatora reakcyjnego, aby zapobiec zatarciu zmielonych szklanych złączy. Podłącz skraplacz do źródła zimnej wody, a następnie przymocuj nasmarowane złącze skraplacza do kolby okrągłodennej. Następnie umieść kolbę w kąpieli olejowej lub na aluminiowym bloku grzewczym, który może utrzymać stałą temperaturę za pomocą pary termicznej z mieszadłem z płytą grzejną.

Podgrzej do temperatury refluksu, pozwalając reakcji się wymieszać. Mieszanina reakcyjna powinna być monitorowana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej po jednej, trzech, sześciu, 12 i 24 godzinach w celu zmierzenia szybkości reakcji i sprawdzenia całkowitego zużycia materiałów wyjściowych. Pozostawić kolbę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie odparować rozpuszczalnik etanolowy za pomocą wyparki obrotowej.

Umieścić kolbę w łaźni lodowej i pozostawić kolbę do równowagi do temperatury łaźni lodowej w ciągu pięciu minut. Zneutralizować pozostały wodorotlenek potasu w kolbie, dodając 1,7 mililitra kwasu octowego w jednej porcji. Jeśli po neutralizacji doszło do tworzenia się kryształów, postępuj zgodnie z procedurą oczyszczania filtracji próżniowej.

Jeśli nie zaobserwowano tworzenia się kryształów, należy postępować zgodnie z procedurą oczyszczania metodą chromatografii kolumnowej flash. Umieść okrągły kawałek bibuły filtracyjnej na górze lejka i lekko zwilż bibułę wodą dejonizowaną, aby przykleić ją do lejka. Aby przygotować się do filtracji próżniowej kryształów, należy przymocować lejek Hirscha lub Buchnera do kolby bocznej za pomocą zamontowanego gumowego adaptera.

Aby uniknąć zatykania się bibuły filtracyjnej, które może utrudniać filtrację, zastosowaliśmy większy lejek Hirscha lub Buchnera niż jest to typowe dla procesów filtracji na podobną skalę. Wylać zawartość kolby z okrągłodennego na bibułę filtracyjną i pozostawić mieszaninę do przefiltrowania. Opłucz kryształy podczas procesu filtracji za pomocą 10 mililitrów lodowatej wody dejonizowanej.

Po przefiltrowaniu przenieść kryształy do kolby okrągłodennej o pojemności 25 mililitrów. Nałóż cienką warstwę smaru próżniowego na szklany adapter przewodu próżniowego o dużej mocy, a następnie podłącz adapter do kolby z okrągłym dnem. Zabezpiecz szklane złącze za pomocą klipsa Keck.

Aby przygotować próżnię o dużej mocy do suszenia kryształów pozostałości rozpuszczalnika, należy odpowiednio schłodzić szklany odwadniacz próżniowy mieszaniną suchego lodu i acetonu. Podłącz przewód próżniowy o dużej mocy do szklanego adaptera dołączonego do kolby z okrągłym dnem. Włącz pompę próżniową o dużej mocy i pozwól kryształom wyschnąć przez co najmniej godzinę.

Gdy kryształy zostaną wystarczająco wysuszone w próżni, wyłącz pompę próżniową i zwolnij uszczelkę próżniową w celu wyjęcia kolby okrągłodennej. Zważyć wysuszone kryształy, aby podać procentową wydajność reakcji. Aby przygotować się do oczyszczania za pomocą chromatografii kolumnowej z błyskiem, dodać mieszaninę potraktowaną kwasem, która nie utworzyła kryształów w procesie syntezy, do lejka separacyjnego.

Odmierzyć 10 mililitrów dichlorometanu za pomocą cylindra z podziałką i użyć go do rozcieńczenia mieszaniny potraktowanej kwasem w rozdzielaczu. Zamknij i delikatnie potrząśnij rozdzielaczem, upewniając się, że często odpowietrzasz. Następnie w lejku separacyjnym powinny być widoczne dwie oddzielne warstwy.

Ekstrahować warstwę wodną za pomocą dodatkowych pięciu mililitrów dichlorometanu. Wykonaj ten krok jeszcze dwa razy. Połącz wszystkie frakcje organiczne i dodaj odpowiednią ilość bezwodnego siarczanu sodu w celu wysuszenia frakcji organicznych.

Przenieść wysuszone frakcje organiczne do kolby okrągłodennej i usunąć dichlorometan za pomocą wyparki obrotowej. Pozostałą pozostałość rozcieńczyć dodatkowymi pięcioma mililitrami dichlorometanu. Przygotować kolumnę z około 75 gramów żelu krzemionkowego i użyć jej do przeprowadzenia chromatografii kolumnowej flash na próbce, używając 10% metanolu w dichlorometanie jako eluentu.

Odparować eluent z zebranych frakcji za pomocą wyparki obrotowej. Przygotować pompę próżniową o dużej mocy i szklaną pułapkę rozpuszczalnika, jak opisano wcześniej w procedurze oczyszczania filtracji próżniowej, i pozostawić zebrane ciało stałe do wyschnięcia w wysokiej próżni przez co najmniej jedną godzinę. Gdy kryształy zostaną wystarczająco wysuszone w próżni, zważ wysuszone kryształy, aby podać procentową wydajność reakcji.

Aby potwierdzić strukturę każdego z analogów dipirrinonu w bibliotece, zastosowano kilka metod spektroskopowych w połączeniu, w tym spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego, spektroskopię w podczerwieni i spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości. UV-Vis i spektroskopia fluorescencyjna zostały wykorzystane w charakterystyce fotofizycznej fluorescencyjnych analogów dipirynonu. Korzystając z reakcji kondensacji Claisena-Schmidta, byliśmy w stanie zsyntetyzować niewielką bibliotekę 10 związków, w tym związek kontrolny, który nie może angażować się w międzycząsteczkowe wiązania wodorowe.

Wydajność analogów dipirrynonu wahała się od około 40% do prawie ilościowej i jest wymieniona poniżej każdej cząsteczki. Związki o najwyższych wydajnościach kwantowych, zarówno w formie protonowanej, jak i deprotonowanej, pochodziły z 2-formyloimidazolu i są prezentowane w różowych ramkach. Związek kontrolny, który nie fluoryzuje, znajduje się w niebieskozielonym pudełku.

Pochodne dipirynonu pod standardową lampą o długości fali 365 nanometrów dają obserwowaną fluorescencję. Można wizualnie zaobserwować fluorescencję przesuniętą ku czerwieni, która powstaje w wyniku deprotonacji. Poprzez kolor fiolek przechodzą z koloru niebieskiego do cyjanowego.

Aby uzyskać więcej danych ilościowych na temat fotofizycznych i innych właściwości fizycznych pochodnych dipyrrynonu, kierujemy czytelników do tabeli drugiej w pisemnej części manuskryptu. Ogólnie rzecz biorąc, reakcja kondensacji Claisena-Schmidta zapewnia dostęp do szeregu bicyklicznych związków aromatycznych związanych z metą. Istnieją jednak pewne ograniczenia.

Reakcja jest zależna od użycia zarówno enolizującego nukleofilu, jak i nieenolizującego elektrofilu aldehydowego, takiego jak aro-aldehyd, w celu pomyślnej kondensacji. W przypadku niespełnienia tego podstawowego wymogu, próby przeprowadzenia tej reakcji prawdopodobnie spowodują niemożność połączenia ze sobą systemów pierścieniowych i/lub wygenerowania konkurencyjnych produktów ubocznych. Inną kwestią jest to, że do generowania nukleofilu enolanowego wykorzystywane są podstawowe warunki, które mogą powodować niezgodności z grupami funkcyjnymi, które są podatne na reakcje z wodorotlenkiem.

W takich przypadkach możliwe jest zastąpienie wodorotlenku zasadami azotowymi lub węglanem, co zostało osiągnięte za pomocą DBU, trietyloaminy, piperydyny, zasady Huniga i węglanu sodu. Po prostu zdecydowaliśmy się użyć wodorotlenku potasu ze względu na jego dostępność i względny koszt. Pomimo tych ograniczeń, metoda opisana w protokole może zapewnić sposób sprzęgania pierścieni aromatycznych dla wielu systemów za pomocą proceduralnie prostej i opłacalnej jednoetapowej reakcji.

W przypadku zsyntetyzowanych przez nas analogów dipirrynonu, kondensacja Claisena-Schmidta umożliwiła jedną z najbardziej dostępnych dróg do fluoroforów zależnych od pH opisanych do tej pory. Niemniej jednak przyszłe projekty analogów dipirrinonu będą opracowywane z wykorzystaniem opisanej procedury w celu wytworzenia związków fluorescencyjnych o silniejszej zdolności międzycząsteczkowych wiązań wodorowych i niższych wartościach pKa. Można się spodziewać, że te ulepszone sondy zależne od pH będą charakteryzować się wyższą wydajnością kwantową, umożliwiając jednocześnie wizualizację wahań pH dla szerszego zakresu zdarzeń wewnątrzkomórkowych.