Name: Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę obrazowania poklatkowego komórek MSC w czasie rzeczywistym w kierunku narządu Corti. Ta technika mikroskopii konfokalnej pozwala śledzić migrację komórek macierzystych i optymalizować ich efektywność docierania do uszkodzonych tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty badawcze (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) z Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) Korei i Hallym University Research Fund.

Wszystkie protokoły badawcze z wykorzystaniem myszy ICR zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Yonsei University at Wonju College of Medicine. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z Kodeksem Etyki Światowego Stowarzyszenia Lekarzy. W niniejszym protokole ciężarne myszy ICR utrzymywano w 12/12 h cyklu światło/ciemność z wolnym dostępem do pożywienia i wody.
1. Disekcja ślimaków
<ol>
	<li>Zesterylizować komorę z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek, włączając światło ultrafioletowe na ok. 30 min, a przed użyciem spryskać wszystkie powierzchnie 70% etanolem. Pozostawić powierzchnie do wyschnięcia.</li>
	<li>Umieścić narzędzia do sekcji w 70% etanolu na 10 min, a następnie osuszyć przed użyciem.</li>
	<li>Za pomocą skalpela przeprowadzić dekapitację myszy postnatalnych w wieku 3-4 dni (Ryc. 2A).</li>
	<li>Umieścić czaszkę pod stereomikroskopem w komorze z laminarnym przepływem powietrza i namoczyć tkankę w 70% etanolu.</li>
	<li>Szybko przepłukać tkankę w roztworze do sekcji tkanek (1x zrównoważony roztwór soli Hanksa, 1 mM HEPES), aby usunąć etanol.</li>
	<li>Naciąć linię środkową czaszki za pomocą skalpela chirurgicznego (Ryc. 2B,C).</li>
	<li>Odsłonić czaszkę, odciągając skórę w kierunku przednim i przecinając zewnętrzny przewód słuchowy ucha (Ryc. 2D).</li>
	<li>Wyciąć od przedniej do tylnej części czaszki wzdłuż linii oczu (Ryc. 2E).</li>
	<li>Otworzyć czaszkę i usunąć przedmózgowie, móżdżek oraz pień mózgu za pomocą pęsety tępej (Ryc. 2F,G).</li>
	<li>Za pomocą mikropęsety oddzielić ślimaka od kości skroniowej (Ryc. 2H).</li>
	<li>Przenieść ślimaki do szalki Petriego zawierającej roztwór do sekcji tkanek.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparować całą torebkę kostną ślimaka, pozostawiając jedynie wewnętrzną tkankę miękką ślimaka (Ryc. 2I,J).</li>
	<li>Uchwycić modiolus ślimaka jedną pęsetą, a przewód ślimaka drugą pęsetą, a następnie powoli rozdzielić obie tkanki (Ryc. 2K).</li>
	<li>Usunąć prążek naczyniowy oraz błonę tectorialną poprzez ich delikatne odwarstwienie (Ryc. 2L,M).</li>
	<li>Umieścić wysterylizowane plastikowe szkiełko nakrywką w nowym roztworze do sekcji tkanek, a następnie położyć organ Corti na szkiełku nakrywce o średnicy 9 mm, upewniając się, że błona podstawna jest skierowana w dół (Ryc. 2N-P).</li>
	<li>Unieruchomić tkankę, dociskając pęsetą błonę Reissnera i pozostałą tkankę modiolus do szkiełka nakrywki (Ryc. 2N-P).</li>
	<li>Przenieść szkiełko nakrywkowe z osadzoną tkanką do centrum naczynia konfokalnego o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Umieścić szklany cylinder klonujący na naczyniu tak, aby eksplant ślimaka znajdował się w centrum naczynia, a następnie dodać do wnętrza cylindra 100 µL pożywki do hodowli eksplantów (DMEM/F12, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% suplementu N2, ampicylina (10 µg/mL))10 (Ryc. 2Q).</li>
	<li>Wysiać 5 × 103 komórek MSC pochodzących z szpiku kostnego myszy, oznaczonych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), w 2 mL pożywki hodowlanej (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% suplementu N2, 10 µg/mL ampicyliny) poza szklanym cylindrem (Ryc. 2R).
	<ol>
		<li>Gdy MSC osiągną 80-90% konfluencji, przeprowadzić pasażowanie komórek, odrywając je za pomocą trypsyny i kwasu etylenodiaminotetraoctowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie przenieść naczynie konfokalne do inkubatora z nawilżaczem i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.</li>
	<li>Odssać całą pożywkę z wnętrza i z zewnątrz cylindra, a następnie usunąć szklany cylinder z naczynia konfokalnego.</li>
	<li>Dodać 2 mL świeżej pożywki do naczynia konfokalnego i inkubować naczynie z hodowlą tkankową w inkubatorze z nawilżaczem do momentu rozpoczęcia analizy.</li>
</ol>
<img alt="Disekcja kości skroniowej i struktur ślimaka w badaniu biologicznym; konfiguracja analizy eksperymentalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Disekcja ślimaka myszy oraz kokultura narządu Cortiego i MSCs. (A) Dekapitacja myszy, (B) i (C) pośrodkowe cięcie strzałkowe głowy, (D) i (E) cięcie wieńcowe mózgu, (F) i (G) usunięcie mózgu i kości skroniowej, (H) ślimak, (I) usunięcie kostnej ściany ślimaka, (J) izolacja ślimaka, (K) oddzielenie przewodu ślimaka od modiolusa, (L) oddzielenie stria vascularis (SV) i więzadła spiralnego (SL) od narządu Cortiego, (M) usunięcie błony tectorialnej, (N-P) mocowanie ślimaka na plastikowym szkiełku nakrywkowym, (Q) rozmieszczenie szkiełka nakrywkowego i szklanego cylindra w szalce konfokalnej, (R) inokulacja MSCs. Biały pasek skali (A-E) = 1 cm; pomarańczowy pasek skali (F, G, P) i żółty pasek skali (H,I) = 1 mm; zielony pasek skali (J-O) = 0.5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Obrazowanie time-lapse
<ol>
	<li>W eksperymentach przedstawionych w niniejszym opracowaniu należy zastosować system mikroskopii konfokalnej z inkubatorem stołowym.</li>
	<li>Włącz mikroskop konfokalny, lampę fluorescencyjną oraz komputer.</li>
	<li>Ustaw warunki w inkubatorze nadstołowym umieszczonym na stoliku mikroskopu konfokalnego na 37 °C oraz 5% CO22 atmosfera</li>
	<li>Umieść naczynie z próbką w uchwycie do naczyń, przykryj je pokrywą mocującą, a następnie zamknij komorę górną pokrywą grzejną.</li>
	<li>Dostosuj powiększenie i ostrość, aby zlokalizować narząd Cortiego oraz MSC w polu widzenia.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazów. W sekcji zlokalizuj opcja, wybierz a obiektyw Plan-Apochromat 20x (apertura numeryczna 0,8) oraz a obszar kadrowania 0,5x.</li>
	<li>Pod Akwizycjakliknij w inteligentna konfiguracja i wybierz EGFP.</li>
	<li>Otwórz kanał zakładka poniżej Akwizycjai ustawić moc lasera do 0.2%, the otwór przypominający szpilkę Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 44 µm, the główny poziom wzmocnienia Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 750 V, oraz wzmocnienie cyfrowe do 1.0.</li>
	<li>Kliknij w ESID pod układ obrazowania, a następnie ustawić wzmocnienie ESID do 4 oraz wzmocnienie cyfrowe Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 7.5.</li>
	<li>Kliknij w Kafelki i palik w celu przygotowania 210 płytek.</li>
	<li>Otwórz Strategia skupienia i wybierz tryb koncentracji.</li>
	<li>Pod szeregi czasoweustawić czas trwania do 24 h oraz odstęp Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 10 min.</li>
	<li>Pod Akwizycja, ustaw rozmiar klatki do 512 x 512 pikseli, prędkość skanowania do 8, the kierunek do dwukierunkowy, the uśrednianie Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 4x, oraz bitów na piksel Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 16.</li>
	<li>Kliknij w rozpocznij eksperyment aby rozpocząć eksperyment.</li>
</ol>
3. Modyfikacja plików obrazów
<ol>
	<li>W sekcji przetwarzanie (processing) kliknij zszywanie (stitching), a następnie ustaw minimalne nakładanie (minimal overlay) na 5% oraz maksymalne przesunięcie (maximal shift) na 10%.</li>
	<li>Kliknij eksport filmu (movie export), ustaw opcję nieskompresowany (uncompressed) i ustaw prędkość (speed) na 7,5.</li>
</ol>
4. Immunobarwienie
<ol>
	<li>Ostrożnie odessać medium, a następnie dwukrotnie przemyć próbkę fosforanem buforowanym solą (PBS) przez 5 min.</li>
	<li>Utrwalić próbkę w 4% formalinie w PBS przez 15 min, a następnie przemyć próbkę 3 razy PBS przez 5 min.</li>
	<li>Przeprowadzić permeabilizację próbki w 0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 min, a następnie przemyć 3 razy PBS przez 5 min.</li>
	<li>Dodać 250 µL odczynnika phalloidin-iFluor 647 (rozcieńczenie 1:1000 w PBS) i inkubować próbkę przez 1 h w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Przemyć próbkę 3 razy PBS przez 5 min.</li>
	<li>Przenieść szkiełko nakrywkowe na szkiełko przedmiotowe i dodać 2 krople medium montażowego.</li>
	<li>Ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na preparat.</li>
	<li>Zapieczętować szkiełko nakrywkowe bezbarwnym lakierem do paznokci i przechowywać w 4 °C w ciemności do momentu obserwacji komórek.</li>
	<li>Wykonać obrazowanie preparatu za pomocą mikroskopu konfokalnego z odpowiednim filtrem przy wzbudzeniu/emisji (Ex/Em)=650/665 nm dla faloidyny oraz Ex/Em=488/507 nm dla EGFP.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+hearing+loss+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngologic+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Global hearing loss prevention.</a> Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+MSC+from+selected+species%3A+Features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mammalian MSC from selected species: Features and applications.</a> Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).</li>
<li>Rojewski, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+a+standardized+manufacturing+protocol+for+mesenchymal+stromal+cells%3A+A+systematic+comparison+of+validation+and+manufacturing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data.</a> Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).</li>
<li>Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+homing%3A+Mechanisms+and+strategies+for+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement.</a> iScience. 15, 421-438 (2019).</li>
<li>Ahn, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+enhance+efficacy+of+SPION-labeled+stem+cell+homing+by+magnetic+attraction%3A+a+systemic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).</li>
<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Sykova, E., Jendelova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+stem+cells+in+brain+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).</li>
<li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Rask-Andersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cochlea%3A+anatomical+characteristics+and+their+relevance+for+cochlear+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).</li>
<li>Kamiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+transplantation+accelerates+hearing+recovery+through+the+repair+of+injured+cochlear+fibrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes.</a> The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).</li>
<li>Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+safety+and+efficacy+of+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+sensorineural+hearing+loss+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Audiology+and+Otology%22%5BJournal%5D)">Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients.</a> Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).</li>
<li>Vanden Berg-Foels, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+tissue+regeneration%3A+chemoattractants+for+endogenous+stem+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685(2010).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przeszczepianie MSCs do uszkodzonych miejsc w celu wspomagania regeneracji uszkodzonych komórek było szeroko badane, a efekt terapeutyczny jest oczywisty. Doniesiono, że przeszczepienie i późniejsze różnicowanie MSCs przywraca słuch u szczurów z ubytkiem słuchu wywołanym przez kwas 3-nitropropionowy13. Chociaż Lee i wsp. zastosowali MSC u ludzi przezżylnie, nie osiągnęli żadnej znaczącej poprawy słuchu14. Do niedawna przeprowadzono blisko 12 eksperymentów mających na celu p...

Utrata słuchu może wystąpić wrodzenie lub postępować pod wpływem kilku czynników, w tym starzenia się, leków i hałasu. Niedosłuch jest często trudny do leczenia, ponieważ przywrócenie upośledzonej funkcji jest bardzo wymagające, gdy komórki rzęsate odpowiedzialne za słyszenie zostaną uszkodzone1. Według Światowej Organizacji Zdrowia szacuje się, że utrata słuchu dotyczy 461 milionów ludzi na całym świecie, co stanowi 6,1% populacji świata. Wśród osób z utratą słuchu 93% stanowią dorośli, a 7% dzieci.
Podjęto szereg prób leczenia utraty słuchu; w szczególności obiecującą metodą terapeutyczną okazało się podejście regeneracyjne z wykorzystaniem MSC. W przypadku uszkodzenia tkanki, MSC są naturalnie uwalniane do układu krwionośnego i migrują do miejsca urazu, gdzie wydzielają różne cząsteczki, tworząc mikrośrodowisko sprzyjające regeneracji2. W związku z tym istotne jest opracowanie metody leczenia uszkodzonych tkanek poprzez migrację zewnętrznie implantowanych MSC do organów docelowych i ich późniejszą sekrecję cząsteczek wywołujących silną regulację immunologiczną, angiogenezę oraz działanie przeciwapoptotyczne, aby usprawnić przywrócenie funkcji uszkodzonych komórek3,4,5.
Proces homingu, w którym MSC migrują do uszkodzonych tkanek, może stanowić najważniejszą przeszkodę do pokonania. MSC posiadają systemowy mechanizm homingu, obejmujący sekwencyjne etapy tetheringu/toczenia, aktywacji, zatrzymania, transmigracji/diapedezy oraz migracji6,7,8. Obecnie podejmowane są wysiłki w celu zidentyfikowania sposobów usprawnienia tych etapów. Przetestowano różne strategie, w tym modyfikacje genetyczne, inżynierię powierzchni komórkowych, priming in vitro oraz naprowadzanie magnetyczne6,7. Ponadto podjęto kilka prób promowania ochrony i regeneracji słuchowych komórek rzęskowych poprzez kierowanie MSC do miejsca uszkodzenia ślimaka. Jednakże śledzenie MSC in vivo jest czasochłonne, pracochłonne i wymaga wysoko specjalistycznych umiejętności9.
Aby rozwiązać ten problem opracowano metodę obserwacji homingu MSC w ślimaku za pomocą konfokalnej mikroskopii poklatkowej, która pozwala na fotografowanie migracji komórek w ciągu kilku godzin (Rysunek 1). Metoda ta została opracowana na początku 20th wieku i stała się ostatnio potężnym narzędziem do badania migracji specyficznych komórek.
<img alt="Schemat hodowli tkanek roślinnych; ustawienie szalki Petriego; proces inkubacji; wzrost komórek w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Abstrakt graficzny. (A) Po przytwierdzeniu wypreparowanego narządu Cortiego do plastikowego szkiełka nakrywkowego za pomocą pęsety, szkiełko jest umieszczane w 35 mm szalce do mikroskopii konfokalnej z szklanym dnem, a następnie (B) pozycjonowany jest szklany cylinder. (C) Po wypełnieniu wnętrza szklanego cylindra pożywką, (D) poza cylinder ostrożnie dodaje się MSCs znakowane GFP wraz z pożywką. (E) Po inkubacji przez noc, (F) szklany cylinder jest usuwany, a obrazy są rejestrowane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; MSCs = mezenchymalne komórki macierzyste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>10X PBS Bufor</td><td>GenDEPOT</td><td>P2100-104</td><td></td></tr><tr><td>4% Formalina</td><td>T& I</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>sigma&nbsp;</td><td>A5354-10ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma&nbsp;</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>czasza konfokalna</td><td>SPL</td><td>200350</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>konfokalny&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>szkiełko nakrywkowe</td><td>SPL</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermo Fisher 16140071</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy Fluorsheild z DAPI</td><td>sigma&nbsp;</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>Dumont</td><td>0508-L5-P0</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher naukowy</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher naukowy</td><td>suplement 15630080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td> Phalloidin-iFluor 647 <td></td></tr><tr><td>abcam</td><td>ab176759</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Stage Top</td><td>TOKAI Mysie</td> meszenchymalne komórki macierzyste HIT <td>WELSX</td><td></td></tr><tr><td>Strain C57BL/6 z</td><td>cyagenem</td> GFP <td>MUBMX-01101</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>sigma&nbsp;</td><td>Zobacz materiał T8787</td><td></td></tr></tbody></table> TGL

obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu cortiego

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

Aby zbadać wpływ mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) na regenerację i leczenie komórek, ta metoda śledzi migrację MSC i zmiany morfologiczne po wspólnej hodowli z nabłonkiem ślimaka. Narząd Cortiego został unieruchomiony na plastikowym szkiełku nakrywkowym poprzez naciśnięcie części błony Reissnera powstałej podczas sekcji. MSCs zamknięte w szklanym cylindrze migrowały w kierunku nabłonka ślimaka po usunięciu cylindra. Ich dominującą lokalizację zaobserwowano w modiolusie narządu Cortiego, ustawionym w kierunku podobnym do włókien nerwowych. Jednak niektóre MSCs były zlokalizowane w obszarze rąbka i wykazywały poziomo wydłużony kształt. Ponadto migracja w obszar komórek rzęsatych została zwiększona, a morfologia MSCs zmieniła się na różne formy po leczeniu kanamycyną. Podsumowując, wyniki tego badania wskazują, że kokultura MSCs z nabłonkiem ślimaka będzie przydatna do opracowywania terapii poprzez przeszczep komórek oraz do badań nad regeneracją komórek, które mogą badać różne warunki i czynniki.

Migrację MSC in vitro w trybie trójwymiarowym oceniano za pomocą systemu Transwell lub tradycyjną metodą gojenia ran (wound healing), aby obserwować migrację w trybie dwuwymiarowym (2D)11. Organ Corti jest złożoną strukturą składającą się z różnych komórek, takich jak komórki Boettchera, komórki Claudiusa, komórki Deitersa, komórki filarowe, komórki Hensenowe, zewnętrzne komórki rzęsiste, wewnętrzne komórki rzęsiste, włókna nerwowe, błona podstawna oraz błona siate...

W tym badaniu prezentujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej do obserwacji komórek poruszających się w kierunku uszkodzonej tkanki poprzez inkubację ex vivo z nabłonkiem ślimaka zawierającym narząd Cortiego.

Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Istniejące metody in vitro do badania migracji MSC obejmują protokoły Transwell lub gojenie ran. Opisana tutaj metoda może być wykorzystana do śledzenia migracji MSCs do eksplantacji w czasie rzeczywistym. Jeśli chodzi o hodowlę eksplantatów, zaletą tej metody w porównaniu z innymi jest to, że pozwala ona na skrócenie czasu i kosztów, a także uproszczenie etapów eksperymentalnych.Technika ta może być wykorzystana do obserwacji naprowadzania komórek macierzystych na cel w czasie rzeczywistym, co prowadzi do opracowania modeli o zoptymalizowanej wydajności naprowadzania. Usunięcie membrany tektorialnej jest trudne dla niedoświadczonych badaczy. W zależności od etapu rozwoju, zrozumienie właściwego czasu na usunięcie membrany tektorialnej jest ważne dla powodzenia tego protokołu.Procedurę zademonstrują dr Jeong-Eun Park i Dr.Su Hoon Lee, profesorowie z mojego laboratorium. Rozpocznij od wysterylizowania okapu do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, włączając światło ultrafioletowe na około 30 minut. Przed użyciem spryskaj wszystkie powierzchnie 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.Umieść narzędzia do preparowania w 70% etanolu na 10 minut, a następnie wysusz je przed użyciem. Po odcięciu głowy trzy- lub czterodniowej myszy, namocz ją w 70% etanolu i umieść pod mikroskopem szeregowym w kapturze z przepływem laminarnym. Szybko namocz tkankę w roztworze do rozwarstwiania tkanek, aby usunąć etanol.Przetnij linię środkową czaszki ostrzem chirurgicznym, a następnie odsłoń czaszkę, ciągnąc skórę do przodu i przecinając zewnętrzny kanał słuchowy ucha. Przetnij od przedniej do tylnej części czaszki w poprzek linii oczu, a następnie otwórz czaszkę i usuń przodomózgowie, móżdżek i pień mózgu kleszczami. Za pomocą mikrokleszczy oddziel ślimak od kości skroniowej i przenieś go na szalkę Petriego zawierającą roztwór do preparowania tkanek.Ostrożnie przeciąć całą torebkę ślimakową, pozostawiając tylko wewnętrzną tkankę miękką ślimaka. Przytrzymaj modiolus ślimaka kleszczami, a przewód ślimakowy kolejną parą kleszczy, a następnie powoli oddziel dwie tkanki. Usuń prążki, naczynia krwionośne i błonę ochronną, delikatnie je odrywając.Umieść wysterylizowane plastikowe szkiełko nakrywkowe w nowym roztworze do preparowania tkanek, a następnie umieść narząd Cortiego na szkiełku nakrywkowym, upewniając się, że błona podstawna jest skierowana w dół. Unieruchomić tkankę, dociskając błonę Reissnera i pozostałą tkankę modiolus do szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy. Przenieś szkiełko nakrywkowe z osadzoną tkanką na środek 35-milimetrowego naczynia konfokalnego.Umieść szklany cylinder do klonowania na szalce z eksplantatem ślimakowym umieszczonym na środku naczynia i dodaj do niego 100 mikrolitrów pożywki do hodowli eksplantatów. Umieść 5 000 mezenchymalnych komórek macierzystych lub MSC pochodzących ze szpiku kostnego oznaczonych GFP w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej na zewnątrz szklanego cylindra i umieść naczynie w inkubatorze. Po wyhodowaniu komórek zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, należy zassać całe podłoże do wnętrza i na zewnątrz cylindra i wyjąć szklany cylinder z naczynia konfokalnego.Dodaj dwa mililitry świeżej pożywki hodowlanej do naczynia. Umieść go w nawilżonym inkubatorze, aż będzie gotowy do analizy. Użyj systemu mikroskopii konfokalnej z inkubatorem ze stopniem.Włącz mikroskop konfokalny, światło fluorescencyjne i komputer. Ustaw warunki inkubatora stage top na 37 stopni Celsjusza i 5% atmosfery dwutlenku węgla. Umieść naczynie na próbkę w naczyniu mocującym naczynie, przykryj je pokrywką mocującą naczynie i zamknij komorę górną pokrywą grzałki.Dostosuj powiększenie i ostrość, aby zlokalizować narząd Cortiego i MSC w polu widzenia. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu. W opcji lokalizacji wybierz obiektyw planapochromatyczny 20X lub aperturę numeryczną 0,8 i obszar kadrowania 0,5x.W sekcji Przejęcie kliknij inteligentną konfigurację i wybierz EGFP. Otwórz zakładkę kanału w sekcji akwizycja i ustaw moc lasera na 0,2%, otworek na 44 mikrometry, wzmocnienie główne na 750 woltów, a wzmocnienie cyfrowe na 1,0. Kliknij ESID w ustawieniach obrazowania i ustaw wzmocnienie ESID na cztery, a wzmocnienie cyfrowe na 7,5.Kliknij na kafelki i postaw stawkę, aby wyprodukować 210 płytek. Otwórz strategię ostrości i wybierz tryb ostrości. W obszarze szeregi czasowe ustaw czas trwania na 24 godziny, a interwał na 10 minut.W obszarze Akwizycja ustaw rozmiar klatki na 512 na 512 pikseli, szybkość skanowania na osiem, kierunek na dwukierunkowy, uśrednianie na 4X, a liczbę bitów na piksel na 16. Kliknij Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć eksperyment. Dwuwymiarowa ścieżka mezenchymalnych komórek macierzystych lub MSCs była śledzona w metodzie gojenia ran przy użyciu szklanego cylindra jako bariery między MSCs a narządem Cortiego.Kiedy narząd Cortiego został wyhodowany, fibroblasty rosły bardzo szybko na zewnątrz od zewnętrznych komórek rzęsatych w najbardziej zewnętrznej warstwie. Większość MSCs znakowanych GFP została wypchnięta przez szybko rosnące fibroblasty. Niemniej jednak niektóre przeniknęły przez warstwę fibroblastów i z powodzeniem migrowały do narządu Cortiego.Wyniki 72-godzinnej inkubacji wykazały, że MSCs migrowały do narządu Cortiego i były zlokalizowane głównie w modiolusie i obszarze, w którym włókna nerwowe ślimaka były oddzielone od modiolus. Morfologia MSCs została zmieniona na kształt promienisty podobny do kształtu włókien nerwowych. Komórki zostały przekształcone w kształt liniowy wzdłuż linii rąbka, a nie w obszarze komórki rzęsastej.MSCs były w stanie migrować i rosnąć w obszarze gromadzenia włókien nerwowych, przenikając przez różne warstwy komórkowe i bariery fizyczne. Gdy uszkodzenie komórek rzęsatych zostało wywołane przez 16-godzinną kurację kanamycyną, a komórki hodowano przez kolejne 72 godziny po usunięciu kanamycyny, MSCs były zlokalizowane nie tylko w modiolus, ale także w zewnętrznych komórkach rzęsatych. Unieruchomienie tkanki jest ważnym krokiem w tym protokole, do którego przyczepiony jest narząd Cortiego.Nie odpada łatwo. Jest to trywialna, ale pomocna wskazówka dotycząca udanej hodowli eksplantatów. Metoda ta może być zaadaptowana do badania skuteczności egzosomów wydzielanych z MSCs.

in-vitro-time-lapse-live-cell-imaging-to-explore-cell-migration

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Źródło: Wiegreffe, C., et. al.,  Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017) Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Obrazowanie na żywo ślimaka embrionalnego ssaka jest wyzwaniem, ponieważ procesy rozwojowe przebiegają w tempie czasowym przez dziesięć dni. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli, a następnie obrazowania embrionalnej tkanki eksplantatu ślimaka pobranej od fluorescencyjnej myszy reporterowej w ciągu pięciu dni.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.

Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę obrazowania poklatkowego komórek MSC w czasie rzeczywistym w kierunku narządu Corti. Ta technika mikroskopii konfokalnej pozwala śledzić migrację komórek macierzystych i optymalizować ich efektywność docierania do uszkodzonych tkanek.

Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Przeglądaj więcej filmów