Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Istniejące metody in vitro do badania migracji MSC obejmują protokoły Transwell lub gojenie ran. Opisana tutaj metoda może być wykorzystana do śledzenia migracji MSCs do eksplantacji w czasie rzeczywistym. Jeśli chodzi o hodowlę eksplantatów, zaletą tej metody w porównaniu z innymi jest to, że pozwala ona na skrócenie czasu i kosztów, a także uproszczenie etapów eksperymentalnych.

Technika ta może być wykorzystana do obserwacji naprowadzania komórek macierzystych na cel w czasie rzeczywistym, co prowadzi do opracowania modeli o zoptymalizowanej wydajności naprowadzania. Usunięcie membrany tektorialnej jest trudne dla niedoświadczonych badaczy. W zależności od etapu rozwoju, zrozumienie właściwego czasu na usunięcie membrany tektorialnej jest ważne dla powodzenia tego protokołu.

Procedurę zademonstrują dr Jeong-Eun Park i Dr.Su Hoon Lee, profesorowie z mojego laboratorium. Rozpocznij od wysterylizowania okapu do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, włączając światło ultrafioletowe na około 30 minut. Przed użyciem spryskaj wszystkie powierzchnie 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.

Umieść narzędzia do preparowania w 70% etanolu na 10 minut, a następnie wysusz je przed użyciem. Po odcięciu głowy trzy- lub czterodniowej myszy, namocz ją w 70% etanolu i umieść pod mikroskopem szeregowym w kapturze z przepływem laminarnym. Szybko namocz tkankę w roztworze do rozwarstwiania tkanek, aby usunąć etanol.

Przetnij linię środkową czaszki ostrzem chirurgicznym, a następnie odsłoń czaszkę, ciągnąc skórę do przodu i przecinając zewnętrzny kanał słuchowy ucha. Przetnij od przedniej do tylnej części czaszki w poprzek linii oczu, a następnie otwórz czaszkę i usuń przodomózgowie, móżdżek i pień mózgu kleszczami. Za pomocą mikrokleszczy oddziel ślimak od kości skroniowej i przenieś go na szalkę Petriego zawierającą roztwór do preparowania tkanek.

Ostrożnie przeciąć całą torebkę ślimakową, pozostawiając tylko wewnętrzną tkankę miękką ślimaka. Przytrzymaj modiolus ślimaka kleszczami, a przewód ślimakowy kolejną parą kleszczy, a następnie powoli oddziel dwie tkanki. Usuń prążki, naczynia krwionośne i błonę ochronną, delikatnie je odrywając.

Umieść wysterylizowane plastikowe szkiełko nakrywkowe w nowym roztworze do preparowania tkanek, a następnie umieść narząd Cortiego na szkiełku nakrywkowym, upewniając się, że błona podstawna jest skierowana w dół. Unieruchomić tkankę, dociskając błonę Reissnera i pozostałą tkankę modiolus do szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy. Przenieś szkiełko nakrywkowe z osadzoną tkanką na środek 35-milimetrowego naczynia konfokalnego.

Umieść szklany cylinder do klonowania na szalce z eksplantatem ślimakowym umieszczonym na środku naczynia i dodaj do niego 100 mikrolitrów pożywki do hodowli eksplantatów. Umieść 5 000 mezenchymalnych komórek macierzystych lub MSC pochodzących ze szpiku kostnego oznaczonych GFP w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej na zewnątrz szklanego cylindra i umieść naczynie w inkubatorze. Po wyhodowaniu komórek zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, należy zassać całe podłoże do wnętrza i na zewnątrz cylindra i wyjąć szklany cylinder z naczynia konfokalnego.

Dodaj dwa mililitry świeżej pożywki hodowlanej do naczynia. Umieść go w nawilżonym inkubatorze, aż będzie gotowy do analizy. Użyj systemu mikroskopii konfokalnej z inkubatorem ze stopniem.

Włącz mikroskop konfokalny, światło fluorescencyjne i komputer. Ustaw warunki inkubatora stage top na 37 stopni Celsjusza i 5% atmosfery dwutlenku węgla. Umieść naczynie na próbkę w naczyniu mocującym naczynie, przykryj je pokrywką mocującą naczynie i zamknij komorę górną pokrywą grzałki.

Dostosuj powiększenie i ostrość, aby zlokalizować narząd Cortiego i MSC w polu widzenia. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu. W opcji lokalizacji wybierz obiektyw planapochromatyczny 20X lub aperturę numeryczną 0,8 i obszar kadrowania 0,5x.

W sekcji Przejęcie kliknij inteligentną konfigurację i wybierz EGFP. Otwórz zakładkę kanału w sekcji akwizycja i ustaw moc lasera na 0,2%, otworek na 44 mikrometry, wzmocnienie główne na 750 woltów, a wzmocnienie cyfrowe na 1,0. Kliknij ESID w ustawieniach obrazowania i ustaw wzmocnienie ESID na cztery, a wzmocnienie cyfrowe na 7,5.

Kliknij na kafelki i postaw stawkę, aby wyprodukować 210 płytek. Otwórz strategię ostrości i wybierz tryb ostrości. W obszarze szeregi czasowe ustaw czas trwania na 24 godziny, a interwał na 10 minut.

W obszarze Akwizycja ustaw rozmiar klatki na 512 na 512 pikseli, szybkość skanowania na osiem, kierunek na dwukierunkowy, uśrednianie na 4X, a liczbę bitów na piksel na 16. Kliknij Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć eksperyment. Dwuwymiarowa ścieżka mezenchymalnych komórek macierzystych lub MSCs była śledzona w metodzie gojenia ran przy użyciu szklanego cylindra jako bariery między MSCs a narządem Cortiego.

Kiedy narząd Cortiego został wyhodowany, fibroblasty rosły bardzo szybko na zewnątrz od zewnętrznych komórek rzęsatych w najbardziej zewnętrznej warstwie. Większość MSCs znakowanych GFP została wypchnięta przez szybko rosnące fibroblasty. Niemniej jednak niektóre przeniknęły przez warstwę fibroblastów i z powodzeniem migrowały do narządu Cortiego.

Wyniki 72-godzinnej inkubacji wykazały, że MSCs migrowały do narządu Cortiego i były zlokalizowane głównie w modiolusie i obszarze, w którym włókna nerwowe ślimaka były oddzielone od modiolus. Morfologia MSCs została zmieniona na kształt promienisty podobny do kształtu włókien nerwowych. Komórki zostały przekształcone w kształt liniowy wzdłuż linii rąbka, a nie w obszarze komórki rzęsastej.

MSCs były w stanie migrować i rosnąć w obszarze gromadzenia włókien nerwowych, przenikając przez różne warstwy komórkowe i bariery fizyczne. Gdy uszkodzenie komórek rzęsatych zostało wywołane przez 16-godzinną kurację kanamycyną, a komórki hodowano przez kolejne 72 godziny po usunięciu kanamycyny, MSCs były zlokalizowane nie tylko w modiolus, ale także w zewnętrznych komórkach rzęsatych. Unieruchomienie tkanki jest ważnym krokiem w tym protokole, do którego przyczepiony jest narząd Cortiego.

Nie odpada łatwo. Jest to trywialna, ale pomocna wskazówka dotycząca udanej hodowli eksplantatów. Metoda ta może być zaadaptowana do badania skuteczności egzosomów wydzielanych z MSCs.