Pobieranie próbek i przetwarzanie szczotkowania nosa za pomocą cyfrowej wideomikroskopii rzęskowej o dużej prędkości – adaptacja do pandemii COVID-19
November 7th, 2020
Aby zagwarantować skuteczną i wysokiej jakości analizę funkcjonalną rzęsek w celu diagnozy PCD, niezbędna jest precyzyjna i staranna metoda pobierania i przetwarzania nabłonka oddechowego. Aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych w kierunku PCD podczas pandemii COVID-19, protokół wideomikroskopii rzęskowej został zaktualizowany w celu uwzględnienia odpowiednich środków kontroli zakażeń.
Brak opublikowanych formalnych procedur operacyjnych i standaryzacji uniemożliwia rozważenie szybkiej wideomikroskopii cyfrowej jako potwierdzającego testu diagnostycznego w kierunku pierwotnej dyskinezy rzęsek. Ponadto, aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych podczas kryzysu związanego z COVID-19, protokół wideomikroskopii rzęskowej został dostosowany w celu uwzględnienia odpowiednich środków kontroli zakażeń. Ocena czynnościowa rzęsek za pomocą cyfrowej wideomikroskopii o dużej szybkości jest bardzo czuła i specyficzna dla diagnostyki pierwotnej dyskinezy rzęsek.
W porównaniu z innymi pierwotnymi testami diagnostycznymi dyskinezy rzęsek, cyfrowa wideomikroskopia o dużej szybkości jest stosunkowo łatwa do wykonania, niedroga, a wyniki mogą być dostępne w ciągu jednego dnia. Cyfrowa wideomikroskopia o dużej szybkości ma wyższą czułość i swoistość w diagnostyce pierwotnej dyskinezy rzęsek. Obecnie tylko mikroskopia elektronowa i badania genetyczne są uznawane za testy potwierdzające pierwotną dyskinezę rzęsek, ale testy te pominą rozpoznanie pierwotnej dyskinezy rzęsek u 15 do 30% pacjentów.
Procedurę szczotkowania nosa zademonstruje Lionel Benchimol, laryngolog z mojego laboratorium. Przed pobraniem próbki z nosa poproś pacjenta o wydmuchanie nosa. Po oczyszczeniu przewodów nosowych połóż pacjenta lub usiądź wygodnie z głową opartą do tyłu.
Potrząśnij szczoteczką w dołączonym podłożu 199, aby ją zwilżyć, i umieść endoskop przy wejściu do nosa, aby uwidocznić dolną małżowinę nosową. Włóż szczoteczkę cytologiczną do nosa i przesuń szczoteczkę kilka razy do tyłu i do przodu po tylnej części małżowiny nosowej dolnej przed wycofaniem. Umieść szczotkę w tubce M199.
Przetnij drut tak, aby mógł całkowicie zmieścić się w rurze i natychmiast zamknij rurkę. Następnie umieść próbkę w hermetycznej podwójnej torbie. W ciągu dziewięciu godzin od pobrania próbki otwórz probówki z próbkami w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego i użyj kleszczyków do nosa Weil-Blakesley, aby poruszyć szczoteczką, aby usunąć zebrane paski nabłonka.
Przyklej dwustronną przekładkę do szklanego szkiełka i zdejmij zabezpieczenie z przekładki. Delikatnie potrząśnij probówką, aby rzęski rozprzestrzeniły się po całej probówce, a następnie za pomocą pipety przenieś około 60 mikrolitrów nabłonka rzęskowego ze środka rurki do przekładki. Umieść prostokątną szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 4 milimetry na przekładce, aby zamknąć komorę, i zdezynfekuj szkiełko 70% etanolem przed wyjęciem go z szafy bezpieczeństwa mikrobiologicznego.
Po zmianie rękawiczek umieść ten szkiełko na talerzu podgrzewanego pudełka i zamknij pokrywę. Dodaj olej do obiektywu zanurzeniowego w oleju i umieść pudełko na stoliku mikroskopu pionowego lub odwróconego światła. Włącz obudowę i grzałkę obiektywu, a następnie dostosuj ustawienia temperatury w pudełku i sterownikach grzałki obiektywu.
Po pięciu minutach ustaw obiektyw tak, aby dotykał końcówką soczewki szkiełka nakrywkowego. Aby zobrazować rzęskowe krawędzie układu oddechowego próbki, otwórz oprogramowanie kamery, a następnie użyj obiektywu mikroskopu, aby ręcznie zlokalizować komórki w próbce i wyświetlić je na monitorze. Sprawdź, czy obraz jest widoczny na monitorze, a następnie wyreguluj kondensor i ostrość obiektywu zgodnie z potrzebami, aby poprawić jakość obrazu.
Po zlokalizowaniu pasków nabłonka rzęskowego wybierz tylko nienaruszone, nienaruszone krawędzie nabłonka rzęskowego, które mierzą co najmniej 50 mikronów długości. Należy pamiętać, aby używać tylko normalnych krawędzi lub krawędzi z niewielkimi wypustkami do analizy funkcjonalnej rzęsek i wykluczyć krawędzie rzęskowe z głównymi wypustkami i izolowane komórki rzęskowe lub pojedyncze komórki bez kontaktu między sobą a jakimkolwiek innym typem komórek. Po wybraniu dobrej krawędzi użyj szybkości klatek kamery wynoszącej 500 klatek na sekundę, aby nagrywać bijącą krawędź rzęsek przez około dwie sekundy.
Po zarejestrowaniu co najmniej sześciu dobrych krawędzi w widoku z boku, wyjmij szkiełko z podgrzewanego pudełka i umieść szkiełko, szkiełko nakrywkowe i przekładkę w hermetycznej torbie. Następnie umieść rękawiczki i maskę w torbie, a worek umieść w odpowiednim pojemniku na niebezpieczne odpady medyczne. Aby przeanalizować częstotliwość dudnień rzęsek, otwórz nagranie w odpowiednim oprogramowaniu do analizy wideo i podziel rzęskowe krawędzie na około pięć sąsiednich obszarów o długości około 10 mikronów.
Zidentyfikuj i zwizualizuj rzęski lub grupy rzęsek przy zmniejszonej liczbie klatek na sekundę i maksymalnie dwóch pomiarach częstotliwości uderzeń rzęsek na obszar, aby uzyskać maksymalnie 10 pomiarów częstotliwości uderzeń rzęsek na krawędź. Zapisz liczbę klatek wymaganą do tego, aby grupa rzęsek ukończyła pięć cykli dudnień i użyj wzoru do obliczenia częstotliwości uderzeń rzęsek. Aby określić procentowy udział każdego wyraźnego wzorca dudnienia rzęsek w próbce, dla każdej rzęski lub grupy rzęsek, porównaj dokładną ścieżkę przebytą przez rzęski podczas pełnego cyklu dudnienia z normalnym wzorcem dudnienia rzęsek obserwowanym w cyfrowej analizie wideomikroskopowej o dużej szybkości.
Przypisz wyraźny wzorzec dudnienia rzęsek, taki jak normalny, sztywny, nieruchomy, asynchroniczny lub dyskinetyczny i okrągły, do każdej analizowanej rzęski lub grupy rzęsek. Następnie oblicz procent każdego odrębnego wzoru dudnienia rzęsek w każdej próbce. Wzór dudnienia rzęsek przypisany do próbki jest dominującym obserwowanym wzorcem dudnienia rzęsek.
Tutaj obserwujemy szczegółowe wyniki analizy funkcjonalnej rzęsek z próbek szczotkowania nosa od 14 dorosłych ochotników. Z tych 14 próbek do szczotkowania nosa zarejestrowano 242 orzęsione brzegi, a 212 spełniało określone kryteria włączenia do analizy. Uzyskano łącznie 807 pomiarów częstotliwości uderzeń rzęsek i ocen wzorca dudnienia rzęsek z analizowanych rzęsek lub grup rzęsek.
Średni wskaźnik bezruchowości był zbliżony do wcześniej podawanych wartości obserwowanych u zdrowych ochotników. Wynik dyskinezy i częstotliwość dudnień rzęsek były podobne do wcześniej podawanych wartości uzyskanych przy wyborze tylko normalnych krawędzi lub krawędzi z niewielką projekcją. Gdy używane są krawędzie o niskiej jakości, odnotowuje się niższe częstotliwości dudnień rzęsek i wyższe wyniki dyskinezy.
Krwinki i śluz nabyte w wyniku zbyt mocnego szczotkowania mogą blokować wolne bicie rzęsek lub ukrywać rzęski przed obserwatorem. I odwrotnie, jeśli szczoteczka nie naciska mocno na dolną małżowinę nosową, próbka może nie zawierać wystarczającej ilości wysokiej jakości pasków nabłonka rzęskowego. Ponadto, jeśli szczotkowanie nosa zostanie wykonane w przedniej części jamy nosowej, uzyskane zostaną tylko przejściowe nierzęskowe komórki nabłonka.
Dwa najważniejsze aspekty protokołu to jakość szczotkowania nosa oraz wybór wysokiej jakości fragmentów nabłonka, aby uniknąć pełnego pozytywnego wyniku lub niepowodzenia techniki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł omawia znaczenie precyzyjnego pobierania i przetwarzania próbek nabłonka oddechowego dla wysokiej jakości analizy funkcji rzęsek w diagnostyce pierwotnej dyskinezy rzęskowatej (PCD). Podkreśla adaptacje wprowadzone do protokołu wideomikroskopii rzęsek podczas pandemii COVID-19, aby zapewnić ciągłość usług diagnostycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Medycyna oddechowa
- Techniki diagnostyczne
Tło
- Cyfrowa wideomikroskopia wysokiej prędkości jest wrażliwą i specyficzną metodą diagnozowania PCD.
- Obecne testy potwierdzające PCD obejmują mikroskopię elektronową i testy genetyczne.
- Te testy potwierdzające mogą nie wykryć diagnozy PCD u 15 do 30% pacjentów.
- Brakuje standaryzacji w procedurach operacyjnych dla cyfrowej wideomikroskopii wysokiej prędkości.
Cel badania
- Poprawa dokładności diagnostycznej pierwotnej dyskinezy rzęskowatej.
- Adaptacja protokołów, aby zapewnić bezpieczeństwo podczas pandemii COVID-19.
- Promowanie stosowania cyfrowej wideomikroskopii wysokiej prędkości jako narzędzia diagnostycznego.
Zastosowane metody
- Wideomikroskopia wysokiej prędkości do oceny funkcji rzęsek.
- Wdrożenie środków kontroli infekcji w protokole.
- Porównanie cyfrowej wideomikroskopii wysokiej prędkości z innymi testami diagnostycznymi.
- Ocena czułości i swoistości w diagnostyce PCD.
Główne wyniki
- Cyfrowa wideomikroskopia wysokiej prędkości wykazuje wyższą czułość i swoistość w diagnostyce PCD.
- Wyniki można uzyskać w ciągu jednego dnia, co czyni ją praktyczną opcją diagnostyczną.
- Adaptacje wprowadzone podczas pandemii pozwalają na kontynuowanie usług diagnostycznych.
- Standardyzacja jest konieczna dla szerszej akceptacji tej metody jako testu potwierdzającego.
Wnioski
- Cyfrowa wideomikroskopia wysokiej prędkości jest cennym narzędziem do diagnozowania pierwotnej dyskinezy rzęskowatej.
- Środki kontroli infekcji są kluczowe dla bezpiecznych praktyk diagnostycznych podczas pandemii.
- Dalsza standaryzacja procedur jest potrzebna, aby zwiększyć niezawodność diagnostyczną.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized digital high-speed ciliary videomicroscopy enables precise functional analysis of respiratory cilia, directly impacting target validation and diagnostic confidence in rare motile ciliopathies. The protocol's adaptation for infection control ensures continuity of critical diagnostic workflows during pandemic disruptions, supporting robust translational research and portfolio risk management. Reliable ciliary beat frequency and pattern quantification underpin mechanistic de-risking and inform go/no-go decisions in respiratory disease research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of ciliary function for mechanistic target validation in respiratory disorders.
- Supports biological de-risking by distinguishing normal from dyskinetic ciliary phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in disease modeling and early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible measurement of ciliary beat frequency and pattern for assay development.
- Ensures sample quality criteria are met, improving assay reliability and downstream screening readiness.
- Delivers rapid, same-day quantitative outputs to accelerate compound evaluation cycles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional ciliary analysis with disease-relevant endpoints for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent phenotypic readouts.
- Reduces risk of false negatives in rare disease cohorts, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative ciliary function data for respiratory disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification through direct measurement of ciliary motion.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative endpoints for assay standardization and compound triage.
- Analytics: Enables statistical comparison of ciliary beat frequency and pattern across experimental conditions.
- Translational Research: Connects functional ciliary metrics to disease-relevant phenotypes for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, standardized workflow for respiratory epithelial sampling and analysis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in respiratory disease research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible ciliary function analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of respiratory disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory epithelial sampling and high-speed videomicroscopy operation.
- Demands access to specialized imaging equipment and video analysis software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample quality and analysis criteria.
- Must adapt infection control protocols for safe sample handling, especially during pandemics.
- Dependent on high-quality epithelial strips; suboptimal samples reduce diagnostic reliability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:41
Respiratory Ciliated Epithelium Sample Collection
2:35
Respiratory Ciliated Epithelium Processing and Preparation
3:55
Respiratory Ciliated Edge Selection and Recording
5:18
Ciliated Edge Analysis
6:59
Results: Representative Nasal Brush Processing Analysis
8:34
Conclusion
