Name: Funkcjonalizowana spirocykliczna synteza heterocykliczna i test cytotoksyczności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Poznaj syntezę spirocyklicznych heterocykli metodą syntezy na fazy stałej oraz ocenę cytotoksyczności z użyciem testu MTT na komórkach COS7. Badanie dostarcza cennych danych dla rozwoju leków przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu Faculty Research Council dla K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. i J.F.M. są laureatami stypendium Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. i B.M.R. są laureatami stypendiów STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Jesteśmy wdzięczni dr Matthew Berezukowi i dr Philipowi Coxowi za wskazówki dotyczące testów biologicznych.

UWAGA: Kilka substancji chemicznych i odczynników biologicznych używanych w tym protokole jest toksycznych i rakotwórczych. Przed użyciem należy zapoznać się z odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS). Przed rozpoczęciem eksperymentu należy używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (okulary ochronne zatwierdzone przez Administrację Bezpieczeństwa i Zdrowia w Pracy, odpowiednie rękawice, fartuchy laboratoryjne, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami). Ponadto należy przyjąć odpowiednie praktyki bezpieczeństwa podczas przeprowadzania syntezy i obchodzenia się z toksycznymi chemikaliami i odczynnikami (dygestoria).
1. Synteza w fazie stałej spirocyklicznych heterocykli 6 i 7
UWAGA: Synteza została oparta na wcześniej opublikowanych pracach11,12. Zaktualizowany protokół ujawnia, że katalizowane fluorkiem tetrabutyloamonu otwarcie pierścienia trójpierścieniowego heterocyklu nie było potrzebne, a tym samym jego eliminacja skraca procedurę syntezy.
<ol>
	<li>Wykonaj dodawanie furfuryloaminy przez Michaela do łącznika REM (czas trwania: 25 min setup + 24 h czasu reakcji).
	<ol>
		<li>Dodać 1 g (1 ekwiwalent [ekwiwalent]) żywicy REM, 20 ml (20 ekwiwalentów) dimetyloformamidu (DMF) i 2,4 ml furfuryloaminy do naczynia reakcyjnego w fazie stałej o pojemności 25 ml. Mieszać naczynie reakcyjne w temperaturze pokojowej przez 24 godziny po rozpoczęciu reakcji. 
		UWAGA: Upewnij się, że żywica jest dokładnie wymieszana, aby żywica nie osiadła na dnie naczynia.</li>
		<li>Przemyć żywicę DMF 1x po zakończeniu reakcji. Następnie przemyj 4x, na przemian z dichlorometanem (DCM) i metanolem. Po przemyciu dokładnie wysuszyć żywicę w naczyniu reakcyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj tandemową addycję Michaela/cykloaddycję 1,3-dipolarną (czas trwania: ustawienie 25 min + czas reakcji 48 godzin).
	<ol>
		<li>Do suchej żywicy dodać 1,48 ml (5 ekwiwalentów) trietyloaminy (TEA), 0,637 g (2 ekwiwalenty) nitroolefiny i 10 ml suchego toluenu do naczynia reakcyjnego.</li>
		<li>Następnie dodać 1,085 ml (4 ekwiwalenty) chlorku trimetylosililu (TMSCl) do naczynia reakcyjnego w dobrze wentylowanym dygestorium. 
		UWAGA: Ponieważ w wyniku tej reakcji powstaje gaz HCl, nie należy zakręcać naczynia reakcyjnego, dopóki gaz nie zostanie uwolniony pod wyciągiem.</li>
		<li>Szczelnie zakryć naczynie reakcyjne i mieszać w temperaturze pokojowej przez 48 h. 
		UWAGA: Upewnij się, że żywica dokładnie wymieszała się z odczynnikami.</li>
		<li>Użyj 5 ml metanolu, aby wygasić reakcję.</li>
		<li>Opróżnij naczynie, aby usunąć roztwór, a następnie przemyj 4x, na przemian DCM i metanolem. Po przemyciu dokładnie wysuszyć żywicę w naczyniu reakcyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić N-alkilację heterocyklu związanego z żywicą w celu wytworzenia czwartorzędowej aminy (czas trwania: 10 min ustawienie + 24 godziny czasu reakcji). 
	<ol>
		<li>Do suchej żywicy w naczyniu reakcyjnym dodać 5 ml DMF i 10 równoważników halogenku alkilu i mieszać w temperaturze pokojowej przez 24 godziny 
		UWAGA: Upewnij się, że odczynniki dokładnie wymieszały się z żywicą.</li>
		<li>Przemyć żywicę DMF 1x po zakończeniu reakcji. Następnie używaj naprzemiennie DCM i metanolu do mycia 4x. Po przepłukaniu wysuszyć żywicę w naczyniu reakcyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić β-eliminację czwartorzędowej aminy do rozszczepienia z nośnika polimerowego (czas trwania: 15 min setup + 24 h czasu reakcji).
	<ol>
		<li>Do suchej żywicy w naczyniu reakcyjnym dodać 3 ml DCM i 1,49 ml (odpowiednik 5) herbaty, aby odciąć heterocykl od nośnika polimerowego.</li>
		<li>Mieszać mieszaninę reakcyjną przez 24 godziny, aby zapewnić dokładne wymieszanie żywicy z roztworem. Umyć 4x, na przemian z DCM i metanolem. Zebrać elucję ze wszystkich płukanek i zagęścić przez odparowanie rotacyjne.</li>
		<li>Rozcierać metanolem w celu oczyszczenia oksymu spirocyklicznego. Żywicę należy dokładnie wysuszyć w naczyniu reakcyjnym po przepłukaniu w celu ponownego użycia w przyszłych eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test cytotoksyczności przy użyciu MTT 14
<ol>
	<li>Przygotować 20 ml roztworu MTT o stężeniu 5 mg/mL, używając sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 0,9% NaCl w wodzie) jako rozcieńczalnika. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze -20 °C. Następnie należy przygotować roztwór MTT rozcieńczony w stosunku 1:1 z kroku 2.1 w pożywce do hodowli komórkowych bez surowicy (DMEM).</li>
	<li>Przygotować po 1 ml roztworu podstawowego w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml po 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM i 0,01 μM badanych związków w dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 200 μl na dawkę roztworów roboczych badanych związków, rozcieńczając podstawowe stężenia 1:1000 w podłożu bez surowicy w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>W kapturze do hodowli tkankowej nasiona COS-7 (komórki nerkowe afrykańskiej zielonej małpy, nerka Cercopithecus aethiops) w kompletnym podłożu [DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS)] na płaskodennych, 96-dołkowych płytkach poddanych hodowli tkankowej o stężeniu 4 × 103 komórek/200 μl na studzienkę przy użyciu pipetora wielokanałowego. Komórki COS-7 zostały wybrane, ponieważ (1) są to powszechnie używane komórki do testów cytotoksyczności i (2) były już dostępne w instytucji.</li>
	<li>Inkubować komórki COS-7 przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .</li>
	<li>Odessać supernatant ze studzienek za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do pompy próżniowej. Dozować komórki trzykrotnie ze związkami badanymi, stosując roztwory robocze przygotowane w kroku 2.2 (patrz Tabela 1). Inkubować komórki zgodnie z opisem w kroku 2.4.</li>
	<li>Odessać supernatant ze studzienek. Dodaj 200 μl roztworu MTT do każdego dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 4 godziny.</li>
	<li>Delikatnie odessać supernatant ze studzienek, nie naruszając fioletowych kryształów formazanu. Dodaj 200 μl DMSO do każdego dołka, aby rozpuścić fioletowe kryształy formazanu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Zmierz absorbancję przy 590 nm14 lub 600 nm dla każdej studzienki za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek. Używaj studzienek bez komórek jako tła i uśredniaj wartość absorbancji. Uśrednioną wartość tła absorbancji należy odjąć od wartości absorbancji każdego studzienki poddanej działaniu substancji. Znormalizuj dane jako procent średniej wartości dawki zerowej (uśrednij trzy wartości dawki zerowej). Wykreśl dane na osi y: liniowa (% względnej żywotności komórki); Oś x: log (stężenie). Wykreśl każdą serię jako pojedynczą krzywą (np. dane potrójne powinny mieć 3 krzywe)</li>
</ol>

<ol><li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function%3A+a+novel+approach+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+%28MDM2+inhibitors%29+in+clinical+trials+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li>
<li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li>
<li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li>
<li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li>
<li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li>
<li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MDM2-p53+pathway+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li>
<li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li>
<li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li>
<li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li>
<li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li>
<li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+%5B4.4%5Dspirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).</li>
<li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Combinatorial+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li>
<li>MTT assay protocol. , Modified procedure from 
 .
 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Synteza związków spirocyklicznych opierała się na wcześniejszych badaniach przeprowadzonych przez to laboratorium, ale z pewnymi modyfikacjami (ryc. 1)11,12. Postęp każdego etapu reakcji był monitorowany za pomocą spektroskopii IR. Dodanie przez Michaela łącznika REM 1 z furfuryloaminą zapewnia wiązanie polimeru 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Z po...

Małocząsteczkowe hamowanie interakcji myszy z dwuminutowym homologiem 2 (MDM2) ubikwityny ubikwityny (MDM2) z p53 przywraca indukcję apoptozy komórek nowotworowych za pośrednictwem p531,2,3. MDM2 jest negatywnym regulatorem szlaku p53 i często ulega nadekspresji w komórkach nowotworowych4,5,6,7,8,9. Ostatnie badania krystalograficzne i biochemiczne wykazały, że małe cząsteczki zawierające szkielet spirocykliczny mogą skutecznie hamować interakcje MDM2-p5310. Struktura spirocykliczna (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, zacieniowany na niebiesko) jest uważany za motyw uprzywilejowany, ponieważ derywatyzacja tego sztywnego ortogonalnego systemu pierścieniowego doprowadziła do odkrycia nowych leków terapeutycznych. Dostęp do tej interesującej architektury stanowi wyzwanie przy użyciu tradycyjnych technik syntezy organicznej. Chociaż efekty terapeutyczne cząsteczek spirocyklicznych w układach biologicznych zostały już zbadane, synteza tych cząsteczek jest nadal uciążliwym procesem. Niepożądane produkty uboczne, stosowanie trudnych warunków i niebezpieczne metale przejściowe są często problematyczne.
Potencjalne wykorzystanie motywu spirocyklicznego w rozwoju leków doprowadziło do opracowania protokołu wykorzystującego syntezę fazy stałej do generowania biblioteki cząsteczek z motywem oprócz innych wymiennych grup funkcyjnych11,12. Separację produktów i reagentów między etapami można osiągnąć po prostu za pomocą łącznika REM przymocowanego do kulki żywicy i naczynia filtrującego do fazy stałej. Ograniczyłoby to liczbę kroków i potencjalnie zwiększyłoby plony. To syntetyczne podejście może doprowadzić do powstania szerokiej gamy potencjalnych kandydatów na leki. Jednak skuteczność tych cząsteczek w systemie biologicznym wymagałaby dalszych badań.
Aby określić cytotoksyczność tych związków spirocyklicznych, zastosowano test MTT13,14. Metoda ta mierzy żywotność komórek i może być stosowana do pośredniego określania cytotoksyczności komórek. Różne stężenia inhibitorów dodano do hodowanych komórek na 96-dołkowej płytce, a proporcję żywych komórek mierzono za pomocą analizy kolorymetrycznej zakresu redukcji żółtego MTT przez dehydrogenazy mitochondrialne do fioletowego związku formazanu (<silna klasa = "xfig">Figura 2). Aktywność jest najczęściej podawana jako wartość IC50 - stężenie, przy którym wzrost komórek jest zahamowany o 50% w porównaniu z nieleczoną kontrolą. W artykule opisano protokół testu MTT oraz wstępne wyniki tych nowych cząsteczek spirocyklicznych.

<table><tbody><tr><td>< SILNE>KOMÓRKI< / silne></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>komórki COS-7 (ATCC CRL-1651)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>Komórki nerkowe afrykańskiej zielonej</td></tr> <tr><td>małpy<silne>CHEMIKALIA</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-bromooktanowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152951</td><td>Halogenek alkilu</td></tr><tr><td>Allylbromek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>337528</td><td>Halomek alkilowy</td></tr><tr><td>Benzymek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td>Halogenek alkilu</td></tr><tr><td>Cisplatyna</td><td>Cayman Chemical</td><td>13119</td><td>Kontrola cytotoksyczności</td></tr><tr><td>Dichlorometan (DCM)</td> <td>Rozpuszczalnik Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Dimetyloformamid (DMF)</td><td>Rozpuszczalnik 227056 Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, z L-glutaminą</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Furfurylamina</td><td>Acros Organics</td><td>119800050</td><td>odczynnik&nbsp;</td></tr><tr><td>Jodometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td>halogenek alkilowy</td></tr><tr><td></td><td>Metanol Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>MTT ((bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu)EMD</td> <td>Millipore</td><td>Calbiochem 475989-1GM</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Żywica REM</td><td>Nova Biochem</td><td>8551010005</td><td>Nośnik polimerowy; 0,500 mmol/g Loading</td></tr><tr><td>trans-&beta;-nitrostyren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N26806</td><td>Odczynnik nitro-olefinowy</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Trietyloamina (TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td>Odczynnik do beta-eliminacji</td></tr><tr><td>Chlorek trimetylosililu (TMSCl)</td><td>Odczynnik do 386529 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>; UWAGA - bardzo niestabilny; tworzy HCl gaz</td></tr><tr><td><mocny>SZKŁO/OPRZYRZĄDOWANIE</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL naczynie reakcyjne fazy stałej</td><td>Chemglass</td><td>CG-1861-02</td><td>Szkło z filtrem</td></tr><tr><td>96 Czytnik płytek studzienkowych</td><td>Promega (Turner Biosystems)</td><td>9310-011</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>AVANCE III NMR Spektrometr</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>Instrument; 300 MHz; Rozpuszczalniki: CDCl3 i CD3OH</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nicole iS5</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Wytrząsarka nadgarstkowa</td><td>Burrell Scientific</td><td>757950819</td><td>Instrument</td></tr></tbody></table>

funkcjonalizowana spirocykliczna synteza heterocykliczna i test cytotoksyczności

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocykliczne heterocykle zostały ostatnio opisane w literaturze jako potencjalne leki do terapii raka. Synteza tych nowatorskich ortogonalnych układów pierścieniowych jest wyzwaniem. Niedawno opublikowano skuteczną metodologię syntezy tych związków, która opisywała syntezę w fazie stałej w czterech etapach, a nie jak wcześniej podawano, w pięciu etapach. Zaletą tej krótszej syntezy jest wyeliminowanie stosowania toksycznych odczynników. Stwierdzono, że żywica na bazie łącznika o niskim obciążeniu Regenerating Michael (REM) ma kluczowe znaczenie w syntezie, ponieważ wersje o wysokim obciążeniu zapobiegały dodawaniu odczynników zawierających duże łańcuchy boczne fenylowe i aromatyczne. Kolorymetryczny test bromku 3-(4′,5′-dimetylotiazol-2′-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT) zastosowano do zbadania cytotoksyczności stężeń mikromolowych tych nowych cząsteczek spirocyklicznych in vitro. MTT jest łatwo dostępny na rynku i daje stosunkowo szybkie, wiarygodne wyniki, co czyni ten test idealnym dla tych spirocyklicznych heterocykli. Badano ortogonalne struktury pierścieniowe, a także furfuryloaminę (prekursor w metodzie syntezy zawierający podobny 5-członowy motyw pierścieniowy).

Spirocykliczne oksymy 6 i 7 zsyntetyzowano przy użyciu zmodyfikowanego protokołu (Rycina 1). Addycja Michaela furfurylaminy do łącznika REM 1b doprowadziła do otrzymania polimeru związanego z żywicą 2. Postęp reakcji monitorowano za pomocą spektroskopii w podczerwieni (IR), wykrywając zanik estru α,β-nienasyconego przy 1722 cm-1 (Rycina 3). Żywica 4 z wiązaniem spirocyklicznym została otrzymana z 2 poprzez przejściowy produkt pośredni 3. Hydroliza met...

Tutaj opisujemy test biologiczny z użyciem bromku 3-(4′,5′-dimetylotiazol-2′-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) do testowania wcześniej zsyntetyzowanych oksymów spirocyklicznych.

Funkcjonalizowana spirocykliczna synteza heterocykliczna i test cytotoksyczności

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Protokół ten wykorzystuje nadającą się do recyklingu i zmodyfikowaną metodę wytwarzania związków spirocyklicznych. Test MTT pomaga odpowiedzieć na pytanie dotyczące cytotoksyczności tych nowych cząsteczek. W ramach tej techniki powstają nowe, modyfikowalne cząsteczki przy użyciu regenerującego się materiału wyjściowego.Test MTT zapewnia stosunkowo szybkie i łatwe do analizy wyniki biologiczne Rozpocznij od przeprowadzenia syntezy w fazie stałej spirocyklicznych heterocykli szóstego i siódmego, jak wykazano wcześniej. Przygotuj 20 mililitrów roztworu MTT o stężeniu pięciu miligramów na mililitr, używając sterylnego PBS jako rozcieńczalnika. Przefiltruj i przechowuj roztwór w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Następnie należy przygotować rozcieńczenie jeden do jednego roztworu MTT w DMEM. Przygotować po jednym mililitrze roztworów podstawowych w 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych z testowanymi związkami w DMSO. Przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Przygotować 200 mikrolitrów na dawkę roztworów roboczych badanych związków, rozcieńczając stężenia podstawowe. Jeden do 1000 w pożywce wolnej od surowicy. W nasionach kultur tkankowych, COS siedem komórek w kompletnym podłożu na płaskim dnie kultura tkankowa traktowana 96 dołkami o stężeniu 4 000 komórek na 200 mikrolitrów na studzienkę.Korzystanie z pipery wielokanałowej. Inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia odessać supernatant ze studzienek za pomocą szklanej pipety pastwiskowej podłączonej do pompy próżniowej.Dozować komórki w trzech egzemplarzach z badanymi związkami, używając wcześniej przygotowanych roztworów roboczych. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach odessać supernatant ze studzienek i dodać 200 mikrolitrów roztworu MTT do każdego dołka.Inkubować płytkę przez cztery godziny. Delikatnie zassać supernatant ze studzienek, nie naruszając fioletowych kryształów formazanu. Dodaj 200 mikrolitrów DMSO do każdej studzienki, aby rozpuścić kryształy.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Zmierz absorbancję dla każdej studzienki przy 590 lub 600 nanometrach za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek. Używaj studzienek bez komórek jako tła i uśredniaj wartość absorbancji.Spirocykliczne szwy gox szósty i siódmy zsyntetyzowano przy użyciu zmodyfikowanego protokołu. Postęp reakcji monitorowano poprzez wykrycie zaniku nienasyconej alfa beta Estery za pomocą spektroskopii w podczerwieni. Do określenia żywotności komórek wykorzystano test MTT.Cisplatyna, o której wiadomo, że indukuje śmierć komórki w wysokich stężeniach, służyła jako kontrola pozytywna. Zgodnie z oczekiwaniami, im wyższe stężenie cisplatyny, tym mniejsza żywotność komórek. Test MTT został następnie wykorzystany do przetestowania związków spirocyklicznych szóstego i siódmego oraz furfuryloaminy.Furfuryloamina i spirocykliczny szew gox sześć wykazywały podobną cytotoksyczność. Jednak toksyczność spirocyklicznego związku siedem była zauważalnie większa niż furfuryloaminy i szóstej. Próbując tego protokołu, należy pamiętać, że N-alkilowanie przeprowadzone przy użyciu dużych halogenków acylu zmniejsza szybkość eliminacji beta, zmniejszając w ten sposób wydajność produktu.

functionalized-spirocyclic-heterocycle-synthesis-cytotoxicity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę syntezy wrażliwych na powietrze tytanowych i wanadowych środków przeciwnowotworowych, wraz z oceną ich aktywności cytotoksycznej w stosunku do ludzkiej linii komórek rakowych za pomocą testu MTT.

Przeciwnowotworowe kompleksy metalowe: synteza i ocena cytotoksyczności za pomocą testu MTT

Opisano dwuetapową procedurę syntezy farmaceutycznie aktywnych pochodnych indolu poprzez funkcjonalizację C-H z anilinami, przy użyciu katalizy foto- i kwasowej Brønsteda.

Synteza przeciwwirusowych pochodnych tetrahydrokarbazolu metodą fotochemicznej i katalizowanej kwasem funkcjonalizacji C-H za pomocą pośrednich nadtlenków (CHIPS)

Tutaj prezentujemy protokół, aby zademonstrować skuteczną metodę syntezy spirocyklicznych heterocykli. Pięcioetapowy proces wykorzystuje syntezę w fazie stałej i regenerację strategii łącznika Michaela. Generalnie trudna do syntezy, przedstawiamy konfigurowalną metodę syntezy cząsteczek spirocyklicznych, która w inny sposób jest niedostępna dla innych nowoczesnych podejść.

Synteza oksymów spirocyklicznych w fazie stałej [4.4]

Enancjomerycznie wzbogacone szkielety bispiro[γ-butyrolakton-pirolidyn-4,4'-pirazolon] są asymetrycznie syntetyzowane przez prostą organokatalityczną reakcję cykloaddycji 1,3-dipolarnej.

Wydajna budowa lekopodobnych rusztowań bispirocyklicznych poprzez cykloaddycje organokatalityczne α-imino γ-laktonów i alkilolidenopirazlonów

Przedstawiono protokół syntezy i pomiaru właściwości fotochemicznych modułowych związków zamkniętych w klatkach z klikalnymi cząstkami.

Projektowanie, synteza i właściwości fotochemiczne klikalnych związków w klatkach

Opracowano nowe metody syntezy heterocykli zawierających azot, wykorzystujące cerkosporynę jako fotokatalizator bez użycia metalu.

Fotokatalizowane cerkosporyną [4+1]- i [4+2]-anulacje azoalkenów w łagodnych warunkach

Reakcja kondensacji Claisena-Schmidta jest ważną metodologią generowania sprzężonych z metyną bicyklicznych związków aromatycznych. Dzięki wykorzystaniu wariantu reakcji aldolowej, w którym pośredniczy zasada, można uzyskać dostęp do szeregu cząsteczek fluorescencyjnych i/lub biologicznie istotnych za pomocą ogólnie niedrogiego i prostego w obsłudze podejścia do syntezy.

Synteza zależnych od pH pirazoli, imidazolu i izoindolonu dipirynonu przy użyciu podejścia kondensacyjnego Claisena-Schmidta

Związki tiofenesulfonamidu są silnymi i specyficznymi inhibitorami regulatorów Vibrio quorum sensing LuxR/HapR, które blokują ich aktywność in vivo, zapobiegając w ten sposób transkrypcji genów zjadliwości, ruchliwości i biofilmów. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób związki te są syntetyzowane, modelowane in silico i oznaczane in vivo pod kątem aktywności przeciwko LuxR / HapR.

Synteza i test inhibitorów Vibrio Quorum Sensing

Przedstawiamy tutaj protokół strukturalnie ukierunkowanego projektowania interakcji wiązania białko-ligand między Sanglifehriną A a Cyklofiliną A/Ganoderiol-F, niezbędny w odkrywaniu nowych leków. Stabilność zespołu ligand-receptor została oceniona za pomocą symulacji dynamiki molekularnej.

Struktura-kierowana projektowanie i opracowywanie nowych inhibitorów cyklofiliny A oraz pochodnych ganoderiol-F: podejście In-Silico

Protokół ten wprowadza fluorometryczną metodologię przesiewania zoptymalizowaną do identyfikacji produktów naturalnych/inhibitorów małych cząsteczek syntezy białek. Jego praktyczność sprawia, że nadaje się zarówno do nauczania technik odkrywania leków na poziomie licencjackim, jak i do wdrażania w kampaniach chemii medycznej.

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Poznaj syntezę spirocyklicznych heterocykli metodą syntezy na fazy stałej oraz ocenę cytotoksyczności z użyciem testu MTT na komórkach COS7. Badanie dostarcza cennych danych dla rozwoju leków przeciwnowotworowych.

Funkcjonalizowana spirocykliczna synteza heterocykliczna i test cytotoksyczności

Przeglądaj więcej filmów