Przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą HPLC-MS/MS
24 lutego 2021
Tu opisano jest precyzyjna i możliwa do powtórzenia metoda ilościowego oceny nukleozydów/nukleotydów in vivo w roślinach. Ta metoda wykorzystuje HPLC-MS/MS.
Nukleozydy i nukleotydy są centralnymi składnikami metabolicznymi we wszystkich organizmach żywych. Ich metabolizm jest niezbędny dla rozwoju komórek. To podejście zapewnia potężne narzędzie do ilościowego określania tych metabolitów.
Ta metoda pozwala na szybkie i dokładne ilościowe określenie nukleozydów i nukleotydów w roślinach. Kompletne przygotowanie próbek i analizy LC-MS/MS trwają około dwóch dni dla zestawu 10 do 20 próbek. Ta metoda może być stosowana do wszystkich roślin, a nawet innych organizmów.
Demonstrację procedury przeprowadzi Changhua Zhu, profesor nadzwyczajny z Laboratorium Chen. Aby wyhodować rośliny, upewnij się, że nasiona Arabidopsis są sterylizowane w 70% etanolu przez 10 minut i wysiewane na płytkach agarowych z połową siły składników odżywczych Murashige i Skoog. Inkubuj płytki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 48 godzin, a następnie przenieś je do kontrolowanej komory wzrostowej pod 16 godzinami światła o 22 stopniach Celsjusza i ośmiu godzinami ciemności o 20 stopniach Celsjusza.
Zbierz 100 miligramów dwutygodniowych sadzonek i zamroź je w ciekłym azocie w celu ekstrakcji metabolitów. Zmiel 100 miligramów zamrożonych tkanek roślin z siedmioma do ośmiu stalowymi kulkami w pre-chłodzonej młynku mieszającym przez pięć minut z częstotliwością 60 Hertzów. Przygotuj roztwór ekstrakcyjny, który zawiera metanol, acetonitryl i wodę w proporcji dwa do dwóch do jednego.
Resuspenduj zhomogenizowane materiały z jednym mililitritem roztworu ekstrakcyjnego. Wyśrodkuj powstałą roztwór w 12 000 XG przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przenieś 0,5 mililitra zawiesiny do nowej 1,5 mililitrowej epruwetki i zamroź ją w ciekłym azocie. Odparuj zamrożoną próbkę w zamrażarce i ponownie zawieś ją w 0,5 mililitra 5% acetonitrylu i 95% wody.
Wyśrodkuj powstałą roztwór w 4 000 XG przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zaladuj nadstan do miarki na pomiar LC-MS/MS. Przygotuj bufor octanu amonu o stężeniu 10 milimolarnym, rozpuszczając 1,5 grama octanu amonu w dwóch litrach podwójnie odjonizowanej wody.
Dostosuj pH do 9,5 za pomocą 10% amoniaku i kwasu octowego. Przygotuj dwa litry ultraczystego 100% metanolu na pomiar nukleozydów, a następnie przygotuj dwa litry ultraczystego acetonitrylu na pomiar nukleotydów. Wstrzyknij 0,02 mililitra przetworzonej ekstrakcji metabolitów każdej wcześniej przygotowanej próbki do układu HPLC z podwójnymi pompami sprzężonymi z potrójnym czworakowym spektrometrem masowym.
Aby wygenerować krzywe kalibracyjne standardowe, złącz sześć ekstrakcji próbek razem i mieszaj je, a następnie podziel je ponownie na sześć ekstrakcji, aby uzyskać każde tło. Dodaj sześć różnych stężeń każdego standardu do tych sześciu ekstrakcji odpowiednio i wstrzyknij je jedno po drugim do układu HPLC. Nagraj obszary szczytów każdego standardu w różnych stężeniach poprzez przejścia masowe.
Ten protokół został wykorzystany do zidentyfikowania i ilościowego określenia N1-metyloadenozyny, znanego zmodyfikowanego nukleozydu, w dwutygodniowych sadzonkach Arabidopsis typu dzikiego. Profil spektrometrii masowej wskazał, że jony produktowe generowane z N1-metyloadenozyny standardowej są w proporcji 150 i 133 MZ. I ten sam profil został zaobserwowany w ekstrakcji zero z Kolumbii.
Ze względu na wysoką obfitość jonu produktowego 150 MZ, do identyfikacji N1-metyloadenozyny wybrano przejście masowe 282,1 do 150. Czas zatrzymania docelowemu szczycie wynosił 7,05 minut. Tak jak czas zatrzymania standardu N1-metyloadenozyny.
Seria stężeń standardów N1-metyloadenozyny została dodana do sześciu ekstrakcji próbek. Próbki standardowe zostały wstrzyknięte do LC-MS/MS, a zwiększone obszary szczytów N1-metyloadenozyny zostały wykreślone względem nominalnych stężeń standardów. Sześć równych ekstrakcji tła jest ważnych dla uzyskania dokładnej i powtarzalnej krzywej kalibracyjnej do ilościowego określenia.
Nasza metoda może być zastosowana do badania ścieżek metabolicznych u roślin. Porównując profile metabolitów między typem dzikiego a mutantami bez funkcji, można wykreślić przepływ metaboliczny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje precyzyjną i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania nukleozydów i nukleotydów w roślinach z wykorzystaniem HPLC-MS/MS. Metoda ta umożliwia szybką i dokładną analizę, dzięki czemu znajduje zastosowanie w badaniach nad różnymi organizmami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Metabolizm roślin
- Chemia analityczna
- Biochemia
Wprowadzenie
- Nukleozydy i nukleotydy są niezbędne dla rozwoju komórkowego.
- Dokładne ilościowe oznaczenie tych metabolitów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia procesów metabolicznych.
- Istniejące metody mogą charakteryzować się niewystarczającą precyzją lub powtarzalnością.
- Niniejsze badanie rozwiązuje te problemy poprzez zastosowanie solidnego podejścia analitycznego.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody ilościowego oznaczania nukleozydów i nukleotydów w próbkach roślinnych.
- Pogłębienie wiedzy na temat metabolizmu roślin.
- Dostarczenie narzędzia możliwego do zastosowania w szerokim zakresie organizmów.
Zastosowane metody
- Procedury wstępnego przygotowania próbek.
- Analiza przy użyciu HPLC-MS/MS.
- Przetwarzanie od 10 do 20 próbek w ciągu dwóch dni.
- Zastosowanie metody w odniesieniu do różnych gatunków roślin.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia szybkie i dokładne oznaczanie ilościowe.
- Jest ona powtarzalna dla różnych próbek.
- Wyniki wykazują możliwość zastosowania metody w przypadku wielu organizmów.
- Uzyskano istotne informacje na temat metabolizmu nukleozydów i nukleotydów.
Wnioski
- Ta metoda stanowi znaczący postęp w analizie metabolitów roślinnych.
- Może ona ułatwić dalsze badania nad szlakami metabolicznymi.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć jej zastosowanie na inne systemy biologiczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe pomiary nukleozydów i nukleotydów w systemach roślinnych są kluczowe dla wyjaśnienia szlaków metabolicznych i wsparcia walidacji celów w początkowej fazie odkryć. Ten schemat HPLC-MS/MS zapewnia powtarzalną, bezwzględną kwantyfikację, umożliwiając pewne porównywanie stanów metabolicznych pomiędzy genotypami lub warunkami doświadczalnymi. Niezawodność i skalowalność tej metody sprawiają, że jest ona podstawowym narzędziem do ograniczania ryzyka mechanistycznego i badań translacyjnych w ramach projektów biofarmaceutycznych opartych na roślinach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną kwantyfikację metabolitów nukleozydów i nukleotydów w celu analizy szlaków metabolicznych.
- Wspiera walidację funkcjonalną zaburzeń genetycznych lub chemicznych w modelach roślinnych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie ilościowych odczytów metabolicznych.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celów oraz testowaniu hipotez biologicznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zestandaryzowane protokoły ekstrakcji i kwantyfikacji dla powtarzalnych analiz metabolitów.
- Generuje wyniki ilościowe odpowiednie do wysokoprzepustowego przesiewu fenotypów metabolicznych.
- Umożliwia skalowalność analiz oraz ponowne wykorzystanie platformy w różnych systemach roślinnych.
- Pozwala na rzetelną ocenę wpływu związków lub interwencji genetycznych na metabolizm nukleotydów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie profilowania metabolicznego z odkrywaniem biomarkerów istotnych dla chorób lub konkretnych cech w modelach roślinnych.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po przedkliniczną walidację interwencji metabolicznych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka poprzez ilościowe określanie modulacji szlaków.
- Poprawia możliwości prognostycznej minimalizacji ryzyka w badaniach translacyjnych nad systemami produkcji opartymi na roślinach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda HPLC-MS/MS integruje procesy od wczesnego etapu odkrywania, przez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną w ramach procesów badawczo-rozwojowych opartych na roślinach.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących funkcji szlaków metabolicznych oraz oddziaływania na cele molekularne.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary metabolitów niezbędne do opracowywania testów i kampanii przesiewowych.
- Analityka: Dostarcza wiarygodne krzywe kalibracyjne i wyniki statystyczne pozwalające na pewne porównywanie warunków.
- Badania translacyjne: Wspiera ujednolicenie biomarkerów i zachowanie ciągłości między fazą odkrywczą a fazą przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowaną, skalowalną platformę, którą można zastosować w przypadku wielu gatunków roślin i różnych schematów doświadczalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad szlakami metabolicznymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek i kwantyfikację w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie kapitałem w portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów B+R opartych na roślinach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu próbek roślin oraz obsłudze systemu LC-MS/MS.
- Wymaga dostępu do wysokiej jakości infrastruktury spektrometrii mas i chromatografii.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów ekstrakcji i kalibracji pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych gatunków roślin oraz potencjalnie innych macierzy biologicznych.
- Przepustowość jest odpowiednia dla badań o umiarkowanej skali (10–20 próbek w ramach dwudniowego cyklu).
