Name: Przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą HPLC-MS/MS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Naucz się precyzyjnej metody ilościowego oznaczania nukleozydów i nukleotydów w roślinach za pomocą HPLC-MS/MS. Technika ta umożliwia szybką i powtarzalną analizę metabolitów kluczowych dla rozwoju komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło było finansowo wspierane przez Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (KJQN202060), Narodowe Fundusze Nauki Przyrodniczej Chin (31900907), Fundusz Nauki Przyrodniczej Prowincji Jiangsu (BK20190528), Międzynarodowe Centrum Inżynierii Genetycznej i Biotechnologii (CRP/CHN20-04_EC) dla M.C. oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (LGZD202004) dla X.L.

1 Uprawa roślin i zbieranie materiałów
<ol>
	<li>Upewnij się, że nasiona Arabidopsis są sterylizowane w 70% etanolu przez 10 min i zasiadne na płytkach agarowych, które zostały przygotowane z połową stężenia składników odżywczych Murashige i Skoog.</li>
	<li>Inkubaować płytki zawierające nasiona Arabidopsis w ciemności w 4 °C przez 48 h, a następnie przenieść je do kontrolowanego pomieszczenia z warunkami wzrostu, w którym panuje 16 h światła o natężeniu 55 μmol m-2 s-1 w 22 °C i 8 h ciemności w 20 °C.</li>
	<li>Zbierz 100 mg dwutygodkowych sadzonek (waga świeża) i zamroź w ciekłym azocie do ekstrakcji metabolitów. 
	​UWAGA: Badacze powinni odpowiednio zakładać rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny, aby uniknąć skażenia ludzkimi tkankami podczas zbierania materiałów.</li>
</ol>
2 Ekstrakcja nukleozydów/nukleotydów
<ol>
	<li>Zmiel 100 mg mrożonych tkanek roślinnych z 7-8 stalowymi kulkami w wstępnie schłodzonym młynku mieszarki przez 5 min z częstotliwością 60 Hz.</li>
	<li>Przygotuj roztwór ekstrakcyjny, który zawiera metanolol, acetonitryl i wodę w proporcji 2:2:1.</li>
	<li>Ponownie zawieś zhomogenizowane materiały (w tym większość metabolitów, ale nie białka) w 1 ml roztworu ekstrakcyjnego.</li>
	<li>Centryfuguj wynikający roztwór przy 12 000 x g przez 15 min w 4 °C.</li>
	<li>Przenieś 0,5 ml zawiesiny do nowej 1,5 ml epruwetki i zamroź w ciekłym azocie.</li>
	<li>Wyparuj zamrożoną próbkę w zamrażalniku i ponownie zawieś w 0,1 ml 5% acetonitrylu i 95% wody.</li>
	<li>Centryfuguj wynikający roztwór (0,1 ml) przy 40 000 x g przez 10 min w 4 °C. Zaladuj surnatę do fiolki do pomiaru LC-MS/MS.</li>
</ol>
3 Pomiar LC-MS/MS
<ol>
	<li>Przygotuj 10 mM bufor octanu amonowego, rozpuszczając 1,1 g octanu amonu w 2 L podwójnie zjonizowanej wody (faza ruchoma A). Ustaw pH na 9,5 za pomocą 10% octanu i kwasu octowego.</li>
	<li>Przygotuj 2 L ultraczystego 100% metanolu (faza ruchoma B1) do pomiaru nukleozydów. Przygotuj również 2 L ultraczystego 100% acetonitrylu (faza ruchoma B2) do pomiaru nukleotydów.</li>
	<li>Wstrzyknij 0,02 ml wstępnie przygotowanej ekstrakcji metabolitów każdej próbki z kroku 2.7 do układu HPLC z dwoma pompami (LC) sprzężonym z potrójnym spektrometrem mas (MS). 
	UWAGA: Układ HPLC zawiera kolumnę C18 (50 x 4,6 mm, wielkość cząsteczki 5 μm; pracującą w 25 °C) buferowaną fazą ruchomą A i B1 (Rysunek 1A) do separacji nukleozydów i używa porowatej kolumny węglowej (PGC) (50 x 4,6 mm, wielkość cząsteczki 5 μm; pracującą w 25 °C) z fazą ruchomą A i B2 (Rysunek 1B) do separacji nukleotydów. Każda próbka była wstrzykiwana trzykrotnie dla replikacji technicznej.</li>
	<li>Zaprogramuj metodę tak, jak pokazano w Tabeli 1 dla kolumny C18 i metodę tak, jak pokazano w Tabeli 2 dla kolumny PGC. Ustaw przepływ na 0,65 ml min-1. 
	UWAGA: Przejścia masowe (Tabela 3) były monitorowane przez spektrometr mas. Warunki analizy widma masowego ośmiu nukleozydów i pięciu nukleotydów, w tym kanonicznych i zmodyfikowanych, są wymienione w Tabeli 3.</li>
	<li>Zapisz obszary szczytów każdego związku docelowego (Rysunek 1).</li>
</ol>
4 Generowanie krzywych kalibracyjnych standardowych
<ol>
	<li>Złącz sześć ekstrakcji próbek, które zostały wykonane zgodnie z opisem w sekcji 2 i przemieszaj je. Następnie podziel je na sześć ekstrakcji (takiej samej objętości) ponownie, aby uzyskać każde tło.</li>
	<li>Dodaj sześć różnych stężeń każdego standardu do tych sześciu ekstrakcji, odpowiednio, i wstrzyknij je jeden po drugim zgodnie z krokiem 3.3.</li>
	<li>Zapisz obszary szczytów każdego standardu w różnych stężeniach za pomocą przejść masowych, jak opisano w krokach 3.4 i 3.5.</li>
	<li>Narysuj krzywą sześciu punktów, wykreślając obszar szczytu względem nominalnego stężenia każdego standardu. 
	UWAGA: Obszary szczytów nukleozydów/nukleotydów zapisanych w kroku 3.5 powinny znajdować się w zakresie krzywych kalibracyjnych standardowych.</li>
	<li>Oblicz równanie prostej dla każdego związku standardowego: Y = aX + b</li>
</ol>
5 Kwantyfikacja metabolitów
<ol>
	<li>Oblicz zawartość metabolitów, używając obszaru szczytu zapisanego w kroku 3.5 i równania z kroku 4.5.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li>
<li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li>
<li>Witte, C. -P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+metabolism+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li>
<li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis%2C+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li>
<li>Chen, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li>
<li>Dahncke, K., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li>
<li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li>
<li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li>
<li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li>
<li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+nucleosides%2C+nucleobases%2C+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li>
<li>Zong, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li>
<li>Moravcová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+nucleobases%2C+nucleosides%2C+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides%2C+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li>
<li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Baccolini, C., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine%2C+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sporów interesów do ujawnienia.

Organizmy zawierają różne nukleozydy/nukleotydy, w tym kanoniczne i aberracyjne. Jednak pochodzenie i metaboliczne punkty końcowe, szczególnie zmodyfikowane nukleozydy, są nadal niejasne. Co więcej, obecne rozumienie funkcji i homeostazy metabolizmu nukleozydów/nukleotydów nadal wymaga poszerzenia i badań. Aby je zbadać, należy zastosować precyzyjną i standardową metodę identyfikacji i ilościowego oznaczania tych metabolitów. Tutaj opisano protokół wykorzystujący widmo masowe do wykrywania nukleozydów/nukleotydów. Biorąc...

Nukleozydy/nukleotydy są centralnymi składnikami metabolicznymi we wszystkich organizmach żywych, które są prekursorami kwasów nukleinowych i wielu koenzymów, takich jak nikotynamidowe adenoinowe dinukleotydy (NAD) oraz ważne w syntezie makrocząsteczek takich jak fosfolipidy, glikolipidy i polisacharydy. Strukturalnie nukleozyd zawiera nukleobazę, która może być adeniną, guaniną, uracylem, cytozyną lub tyminą oraz część cukrowa, która może być rybozą lub deoksyrybozą1,2. Nukleotydy mają do trzech grup fosforanowych wiązanych z 5-węglową pozycją cząsteczki cukrowej nukleozydów3. Metabolizm nukleotydów w roślinach jest niezbędny dla kiełkowania nasion i wzrostu liści4,5,6. Aby lepiej zrozumieć ich fizjologiczne role w rozwoju roślin, należy ustalić metody absolutnego ilościowego określania różnych nukleozydów/nukleotydów in vivo.
Jedną z najczęściej stosowanych metod pomiaru nukleozydów/nukleotydów jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) połączona z detektorem ultrafioletowo-widocznym (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. W 2013 roku, używając HPLC, Dahncke i Witte zmierzyli kilka rodzajów nukleozydów w Arabidopsis thaliana7. Zidentyfikowali zwiększoną zawartość guanozyny w mutantach z wstawką T-DNA, która cechuje się mutacją w genie deaminazy guanozynowej w porównaniu do roślin dzikich. Kolejny nukleozyd pirymidynowy, cytydyna, został również kwantifikowany u roślin za pomocą tej metody, co zaowocowało zidentyfikowaniem genu deaminazy cytydynowej4. Jednakże, oparta na detektorze UV metoda ta nie może łatwo odróżnić nukleozydów, które mają podobne widma i czasy retencjonowania, np. guanozynę lub zantozynę. Limit wykrywalności metody HPLC jest stosunkowo wysoki, dlatego często jest ona stosowana do pomiaru wysokiej zawartości nukleozydów in vivo, takich jak cytydyna, urydyna i guanozyna.
Dodatkowo, chromatografia gazowa połączona ze spektrometrią mas (GC-MS) może być również wykorzystywana do pomiaru nukleozydów. Dzięki temu Hauck i wsp. z powodzeniem zmierzyli urydynę i kwas moczową, który jest metabolitem ścieżki katabolicznej nukleozydów, w nasionach A. thaliana12. Jednakże, GC jest zwykle używana do oddzielania związków lotnych, ale nie nadaje się dla substancji termicznie nietrwałych. Dlatego chromatografia cieczowa połączona ze spektrometrią mas (LC-MS/MS) jest prawdopodobnie bardziej odpowiednią i dokładną techniką analityczną do in vivo identyfikacji, separacji i ilościowego określania nukleozydów/nukleotydów13,14. Kilka wcześniejszych badań doniosło, że kolumna HILIC może być użyta do separacji nukleozydów i nukleotydów15,16 oraz że oznaczniki wewnętrzne z oznaczeniem izotopowym były używane do ilościowego określania związków17. Jednakże, oba składniki są stosunkowo drogie, szczególnie komercyjne standardy z oznaczeniem izotopowym. Przedstawiamy tutaj ekonomicznie stosowną metodę LC-MS/MS do pomiaru nukleozydów/nukleotydów. Ta metoda została już z powodzeniem zastosowana do ilościowego określania różnych nukleozydów/nukleotydów, w tym ATP, N6-metylo-AMP, AMP, GMP, urydyny, cytydyny i pseudourydyny1,5,6,18, u roślin i Drosophila. Co więcej, metoda opisana tutaj może być również zastosowana u innych organizmów.

<table><tbody><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>adenosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251-1G</td><td></td></tr><tr><td>ammonium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73594-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01930-5G</td><td></td></tr><tr><td>CMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006-500MG</td><td></td></tr><tr><td>cytidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C122106-1G</td><td></td></tr><tr><td>GMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377-500MG</td><td></td></tr><tr><td>guanosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6752-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hypercarb column</td><td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td><td>35005-054630</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57510-5G</td><td></td></tr><tr><td>inosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125-1G</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>N1-methyladenosine</td><td>Carbosynth</td><td>NM03697</td><td></td></tr><tr><td>O6-methylguanosine</td><td>Carbosynth</td><td>NM02922</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Medium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0255.005</td><td></td></tr><tr><td>Polaris 5 C18A column</td><td>Agilent Technologies</td><td>A2000050X046</td><td></td></tr><tr><td>pseudouridine</td><td>Carbosynth</td><td>NP11297</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375-1G</td><td></td></tr><tr><td>uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą hplc-ms/ms

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Nukleozydy/nukleotydy są budulcami kwasów nukleinowych, częściami kosubstratów i koenzymów, cząsteczkami sygnałowymi komórkowymi i nośnikami energii, które biorą udział w wielu czynnościach komórkowych. Opisujemy tutaj szybką i niezawodną metodę absolutnej kwalifikacji zawartości nukleozydów/nukleotydów w roślinach. W skrócie, 100 mg homogenizowanego materiału roślinnego zostało wyekstrahowane za pomocą 1 mL buforu ekstrakcyjnego (metanol, acetonitryl i woda w proporcji 2:2:1). Później, próbka została skoncentrowana pięciokrotnie w liofilizatorze, a następnie wstrzyknięta do HPLC-MS/MS. Nukleotydy zostały rozdzielone na kolumnie porowatego węgla grafitowego (PGC), a nukleozydy na kolumnie C18. Przemiany masowe każdego nukleozydu i nukleotydu były monitorowane za pomocą spektrometrii mas. Zawartość nukleozydów i nukleotydów została zmierzona w stosunku do ich zewnętrznych standardów (ESTD). Dzięki tej metodzie, naukowcy mogą łatwo określić ilość nukleozydów/nukleotydów w różnych roślinach.

Tu pokażemy identyfikację i ilościową ocenę N1-metyloadenozyny, znanego zmodyfikowanego nukleozydu, w 2-tygodniowych sadzonkach Arabidopsis typu dzikiego (Col-0) jako przykład. Profil spektrometrii masowej wskazuje, że jony produktów generowane z N1-metyloadenozyny standardowej mają 150 m/z i 133 m/z (Rysunek 2A), a ten sam profil jest również obserwowany w ekstrakcji Col-0 (Rysunek 2B). Ze względu na wysoką...

Tu opisano jest precyzyjna i możliwa do powtórzenia metoda ilościowego oceny nukleozydów/nukleotydów in vivo w roślinach. Ta metoda wykorzystuje HPLC-MS/MS.

Przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Nukleozydy i nukleotydy są centralnymi składnikami metabolicznymi we wszystkich organizmach żywych. Ich metabolizm jest niezbędny dla rozwoju komórek. To podejście zapewnia potężne narzędzie do ilościowego określania tych metabolitów.Ta metoda pozwala na szybkie i dokładne ilościowe określenie nukleozydów i nukleotydów w roślinach. Kompletne przygotowanie próbek i analizy LC-MS/MS trwają około dwóch dni dla zestawu 10 do 20 próbek. Ta metoda może być stosowana do wszystkich roślin, a nawet innych organizmów.Demonstrację procedury przeprowadzi Changhua Zhu, profesor nadzwyczajny z Laboratorium Chen. Aby wyhodować rośliny, upewnij się, że nasiona Arabidopsis są sterylizowane w 70% etanolu przez 10 minut i wysiewane na płytkach agarowych z połową siły składników odżywczych Murashige i Skoog. Inkubuj płytki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 48 godzin, a następnie przenieś je do kontrolowanej komory wzrostowej pod 16 godzinami światła o 22 stopniach Celsjusza i ośmiu godzinami ciemności o 20 stopniach Celsjusza.Zbierz 100 miligramów dwutygodniowych sadzonek i zamroź je w ciekłym azocie w celu ekstrakcji metabolitów. Zmiel 100 miligramów zamrożonych tkanek roślin z siedmioma do ośmiu stalowymi kulkami w pre-chłodzonej młynku mieszającym przez pięć minut z częstotliwością 60 Hertzów. Przygotuj roztwór ekstrakcyjny, który zawiera metanol, acetonitryl i wodę w proporcji dwa do dwóch do jednego.Resuspenduj zhomogenizowane materiały z jednym mililitritem roztworu ekstrakcyjnego. Wyśrodkuj powstałą roztwór w 12 000 XG przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przenieś 0,5 mililitra zawiesiny do nowej 1,5 mililitrowej epruwetki i zamroź ją w ciekłym azocie. Odparuj zamrożoną próbkę w zamrażarce i ponownie zawieś ją w 0,5 mililitra 5% acetonitrylu i 95% wody.Wyśrodkuj powstałą roztwór w 4 000 XG przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zaladuj nadstan do miarki na pomiar LC-MS/MS. Przygotuj bufor octanu amonu o stężeniu 10 milimolarnym, rozpuszczając 1,5 grama octanu amonu w dwóch litrach podwójnie odjonizowanej wody.Dostosuj pH do 9,5 za pomocą 10% amoniaku i kwasu octowego. Przygotuj dwa litry ultraczystego 100% metanolu na pomiar nukleozydów, a następnie przygotuj dwa litry ultraczystego acetonitrylu na pomiar nukleotydów. Wstrzyknij 0,02 mililitra przetworzonej ekstrakcji metabolitów każdej wcześniej przygotowanej próbki do układu HPLC z podwójnymi pompami sprzężonymi z potrójnym czworakowym spektrometrem masowym.Aby wygenerować krzywe kalibracyjne standardowe, złącz sześć ekstrakcji próbek razem i mieszaj je, a następnie podziel je ponownie na sześć ekstrakcji, aby uzyskać każde tło. Dodaj sześć różnych stężeń każdego standardu do tych sześciu ekstrakcji odpowiednio i wstrzyknij je jedno po drugim do układu HPLC. Nagraj obszary szczytów każdego standardu w różnych stężeniach poprzez przejścia masowe.Ten protokół został wykorzystany do zidentyfikowania i ilościowego określenia N1-metyloadenozyny, znanego zmodyfikowanego nukleozydu, w dwutygodniowych sadzonkach Arabidopsis typu dzikiego. Profil spektrometrii masowej wskazał, że jony produktowe generowane z N1-metyloadenozyny standardowej są w proporcji 150 i 133 MZ. I ten sam profil został zaobserwowany w ekstrakcji zero z Kolumbii.Ze względu na wysoką obfitość jonu produktowego 150 MZ, do identyfikacji N1-metyloadenozyny wybrano przejście masowe 282,1 do 150. Czas zatrzymania docelowemu szczycie wynosił 7,05 minut. Tak jak czas zatrzymania standardu N1-metyloadenozyny.Seria stężeń standardów N1-metyloadenozyny została dodana do sześciu ekstrakcji próbek. Próbki standardowe zostały wstrzyknięte do LC-MS/MS, a zwiększone obszary szczytów N1-metyloadenozyny zostały wykreślone względem nominalnych stężeń standardów. Sześć równych ekstrakcji tła jest ważnych dla uzyskania dokładnej i powtarzalnej krzywej kalibracyjnej do ilościowego określenia.Nasza metoda może być zastosowana do badania ścieżek metabolicznych u roślin. Porównując profile metabolitów między typem dzikiego a mutantami bez funkcji, można wykreślić przepływ metaboliczny.

plant-sample-preparation-for-nucleosidenucleotide-content-measurement

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Chemia biomimetyczna oparta na rodnikach została zastosowana do tworzenia bibliotek niezbędnych do rozwoju biomarkerów.

Wolne rodniki w biologii chemicznej: od zachowania chemicznego do rozwoju biomarkerów

Protokół opisany tutaj ma na celu wyjaśnienie i skrócenie licznych przeszkód na drodze skomplikowanej drogi prowadzącej do zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów. W związku z tym protokół ten ułatwia zarówno syntezę tych aktywowanych elementów budulcowych, jak i ich dostępność do praktycznych zastosowań.

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

Biomasa roślinna stanowi źródło odnawialne dla wielu produktów, w tym paliwa, paszy, żywności i różnych materiałów. W artykule badamy właściwości drzewa tytoniowego (Nicotiana glauca) i topoli jako odpowiednich źródeł dla rurociągu biorafineryjnego.

Profilowanie transkryptu i metabolitów w celu oceny drzewa tytoniowego i topoli jako surowca dla przemysłu biotechnologicznego

Opisany tutaj protokół reprezentuje łatwą i powtarzalną metodę, która wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu puryn na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) hodowanych w różnych warunkach.

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego jednoetapowego oczyszczania aktywnej, nieoznakowanej, ludzkiej translokacji 10-jedenaście (TET2) 5-metylocytozynowej dioksygenazy za pomocą chromatografii jonowymiennej i jej testu opartego na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS).

Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

W tym protokole prezentujemy zoptymalizowany przepływ pracy, który łączy w sobie efektywne i szybkie przygotowanie wielu próbek. Ponadto udostępniamy przewodnik krok po kroku, jak zmniejszyć odchylenia analityczne w celu wysokoprzepustowej oceny metabolicznych badań GWAS.

Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Potranskrypcyjne modyfikacje RNA reprezentują niedostatecznie zbadaną warstwę regulacji translacji, która ostatnio została powiązana z plastycznością ośrodkowego układu nerwowego. W tym miejscu opisano przygotowanie próbki i podejście oparte na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas w celu jednoczesnej charakterystyki licznych modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach.

Charakterystyka modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach za pomocą spektrometrii mas

Naucz się precyzyjnej metody ilościowego oznaczania nukleozydów i nukleotydów w roślinach za pomocą HPLC-MS/MS. Technika ta umożliwia szybką i powtarzalną analizę metabolitów kluczowych dla rozwoju komórkowego.

Przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą HPLC-MS/MS

Przeglądaj więcej filmów