Sferoidy serca jako bioinżynieryjne tkanki serca in vitro do badania patofizjologii ludzkiego serca

Jednym z głównych wyzwań związanych z inżynierią ludzkiej tkanki serca jest jej unaczynienie. Nasze laboratorium opracowało model in vitro ludzkiego serca poprzez kokulturę komórek znalezionych in vivo. Należą do nich miocyty serca, fibroblasty serca i komórki śródbłonka serca.

Wszystkie razem komórki te umożliwiają rekapitulację mikrośrodowiska ludzkiego serca, w tym jego składników molekularnych, komórkowych i pozakomórkowych. Używamy ich w naszym laboratorium do testowania różnych leków pod kątem esejów o toksyczności leków. Należą do nich doksorubicyna, dobrze znany lek kardiotoksyczny, który wpływa na ludzkie serca nawet wiele lat po leczeniu.

Oddzielnie hodujemy fibroblasty serca, komórki śródbłonka i miocyty przed utworzeniem sferoid. W celu wyhodowania kardiomiocytów pobieramy fiolkę z minus 80 stopni i podgrzewamy ją w temperaturze 37 stopni przez cztery minuty w łaźni wodnej. Następnie spryskujemy fiolkę kriogeniczną 70% etanolem i przenosimy ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego.

Delikatnie zbieramy zawiesinę komórkową i przenosimy ją do 15-mililitrowej rurki Falcon. Zbieramy jeden mililitr wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego, raz przepłukaliśmy fiolkę kriogeniczną, a następnie dodajemy ją do 50-mililitrowej probówki Falcon, po jednej kropli na raz co cztery sekundy. Dodając podłoże galwaniczne, delikatnie potrząśnij probówką Falcon.

Za pomocą pipety do komórek zbierz siedem mililitrów podłoża galwanicznego i delikatnie dodaj je do 15-mililitrowej probówki Falcon. Po dodaniu ostatniej objętości pożywki galwanicznej do probówki Falcon, przenieś zawiesinę komórek do kolb tkankowych kodowanych fibronektyną. Na koniec przenieś komórki do inkubatora.

Po dwóch dniach pobieramy kolby tkankowe z inkubatora i sprawdzamy zbieg komórek pod mikroskopem. W tym momencie przenosimy kolbę do szafy bezpieczeństwa biologicznego i usuwamy podłoże galwaniczne. Delikatnie płuczemy komórki tym samym podłożem galwanicznym z kolby tkankowej cztery lub pięć razy.

Zastępujemy je świeżą pożywką pielęgnacyjną i przenosimy do inkubatora na jeden do dwóch dodatkowych dni. W dniu, w którym tworzymy wisielce z kultur, zbieramy wszystkie trzy typy komórek z inkubatora. Rozdrabniamy komórki, usuwając pożywkę.

Spłukujemy je trzema mililitrami PBS. I na koniec dodajemy chipsy do komórek. Kolby są następnie przenoszone do inkubatora i inkubowane przez maksymalnie pięć minut.

Aby wygenerować sferoidy serca, hodujemy wspólnie 20 000 komórek na zwisającą kroplę. Należą do nich 10 000 kardiomiocytów, tysiąc fibroblastów serca i 5 000 komórek wewnętrznych serca. Są one hodowane wspólnie w wiszących płytkach 384-dołkowych.

Są one powlekane za pomocą naszego systemu obsługi cieczy. Dodajemy również PBS na bocznych ściankach wiszących płytek, aby zapobiec wysychaniu kultur w inkubatorze. Ostrożnie przesunąć wiszącą płytkę kroplową zawierającą komórki do inkubatora.

Od trzech do czterech dni uformuje się sferoida. Zbieramy wiszącą płytkę kroplową z inkubatora i sprawdzamy, czy w każdej studzience tworzą się sferoidy. Jak pokazano na tych zdjęciach, mamy zestaw sferoid w środku każdej studni.

Po uformowaniu zbieramy sferoidy i zatapiamy je w żelach kolagenowych. Końcówka pipety jest nacięta od wewnątrz, aby zapobiec uszkodzeniom sferoidalnym. Sferoidy są zbierane i przenoszone do 50-mililitrowej rurki Falcon, gdzie są ściągane razem.

Odkręcamy zawiesinę sferoidalną o masie 300 G przez pięć minut, aby oddzielić je od podłoża. Do obrazowania sferoid używamy ciemnościennych 96-dołkowych płytek, pożywka jest usuwana lub zastępowana żelem kolagenowym w probówce Falcon. Wodorotlenek sodu jest dodawany do zawiesiny żelu sferoidalnego przed posiewem w ciemnej płytce ściennej.

Do każdej studzienki dodaje się 100 mikrolitrów zawiesiny sferoidalnej i inkubuje przez 30 minut w temperaturze 37 stopni. Leki, w tym doksorubicynę i inne środki, dodaje się do płytki sferoidalnej i inkubuje przez 24 godziny. Następnego dnia przygotowaliśmy roztwór zawierający homodimer wapnia AM i etydyny, oznaczając odpowiednio żywe pod komórkami.

Ten roztwór przygotowuje się przez dodanie dziesięciocentówki do tej płyty filtracyjnej. Sferoidy są następnie inkubowane w temperaturze 37 stopni przez godzinę. Używamy czytnika płytek do pomiaru fluorescencji wapnia AM i ich homodimeru etydyny w płytce.

Pomiary te są następnie wykorzystywane przez nasze oprogramowanie do przeprowadzenia analizy statystycznej. Mierzymy aktywność skurczową sferoid leczonych różnymi lekami za pomocą jonowego układu optycznego. Sferoidy są przenoszone na stolik między dwiema elektrodami.

Pozwala to zarówno kontrolować, jak i mierzyć aktywność skurczową za pomocą potencjału pola. W ten sposób możemy testować różne napięcia i zakresy częstotliwości, aby stymulować sferoidy. Sferoida w tym czasie jest obrazowana i używana do tych pomiarów.

Sferoidy, które nie otrzymały doksorubicyny, będą mogły konstruować się po stymulacji elektrycznej. Wręcz przeciwnie, sferoidy leczone doksorubicyną nie będą się kurczyć. Aby zobrazować formę sieci komórek śródbłonka w każdej sferoidzie, utrwaliliśmy je 4% roztworem paraformaldehydu na godzinę w temperaturze pokojowej.

Przenieśliśmy płytkę do shakera, który umożliwia delikatne przenikanie roztworu przez żel. PFA usuwa się i trzykrotnie przepłukuje roztworem PBS zawierającym 0,01% tlenku sodu. Przeprowadziliśmy oczywiście mobilizację poprzez dodanie 0,02% roztworu Triton X w PVSA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Roztwór blokujący zawiera 3% BSA w PBC, który jest następnie dodawany do płytki na godzinę w temperaturze pokojowej. Roztwór zawierający pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko CD 31. Marker śródbłonka dodaje się do płytki, którą następnie inkubuje się przez noc w temperaturze czterech stopni.

Następnego dnia usuwa się pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i trzykrotnie przepłukuje się płytkę roztworem PBS zawierającym 0,01% tlenku sodu. Drugorzędowy roztwór przeciwciała zawierający również barwnik sześciokątny dodaje się do płytki, którą następnie inkubuje się przez noc w temperaturze czterech stopni. Na koniec usuwa się drugi roztwór przeciwciała i trzykrotnie przepłukuje się płytkę roztworem PBS zawierającym 0,01% tlenku sodu.

Po pozostaniu z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, płytkę można zobrazować za pomocą naszego mikroskopu konfokalnego. Właściwa sieć naczyniowa ma kluczowe znaczenie dla przeżycia i funkcjonowania komórek serca. Sferoidy serca prezentują sieć komórek śródbłonka, która lepiej podsumowuje tę obecną w ludzkim sercu w porównaniu z jednowarstwowymi kulturami komórek serca.

Biorąc pod uwagę ich unikalne cechy, sferoidy serca stanowią zaawansowane narzędzia do badań in vitro w badaniach sercowo-naczyniowych.