Zachowanie płodności poprzez witryfikację oocytów: perspektywy kliniczne i laboratoryjne

Witryfikacja oocytów i procedury rozgrzewania są niezbędne do zachowania płodności. Postępowanie zgodnie z tym protokołem, jak pokazano, pozwala użytkownikowi zmaksymalizować skuteczność tych procedur. Zachowanie płodności w celu witryfikacji oocytów jest obecnie uznanym i etycznie akceptowalnym podejściem.

Pozwala to na osiągnięcie skutecznych i spójnych wyników klinicznych oraz przezwyciężenie ograniczeń moralnych i prawnych związanych z krioprezerwacją zarodków. Aby osiągnąć biegłość w procesie witryfikacji, ważne jest zapoznanie się ze wszystkimi krytycznymi punktami protokołu, zwracając szczególną uwagę na czas ekspozycji próbek na działanie krioprotektantów. W ciągu 38 godzin od pobrania i bezpośrednio po denudacji oznacz wszystkie plastikowe materiały imieniem i nazwiskiem pacjenta, identyfikatorem oraz rodzajem roztworu i poproś świadka o potwierdzenie danych pacjenta na urządzeniu kriogenicznym.

Gdy wszystkie zapasy zostaną oznaczone, ostrożnie odwróć każdą fiolkę oocytów kilka razy, aby wymieszać i umieścić 30 mikrolitrową kroplę pożywki buforowej HEPES uzupełnioną albuminą surowicy ludzkiej i 30 mikrolitrową sąsiednią kroplę roztworu równoważącego na szalce Petriego. Za pomocą pipety do striptizu umieść oocyty w pierwszej kropli i utwórz mostek pożywki do 30 mikrolitrów kropli roztworu równoważącego, aby uzyskać stopniowy wzrost stężenia krioprotektantów. Po trzech minutach dodaj drugą 30 mikrolitrową kroplę roztworu równoważącego do płytki i użyj pipety, aby utworzyć średni most między kroplami roztworu.

Podczas gdy oocyty się równoważą, dodaj jedną 30 mikrolitrową kroplę roztworu równoważącego dla każdego urządzenia kriogenicznego, które ma być użyte na płytce. Po trzech minutach przenieś oocyty do czystego roztworu równowagi na sześć do dziewięciu minut, aby oocyty powróciły do początkowego rozmiaru. Kiedy oocyty wyzdrowieją, przygotuj centralne naczynie do zapłodnienia in vitro zawierające jeden mililitr roztworu witryfikacyjnego.

Przenieś oocyty do naczynia w jak najmniejszej ilości pożywki i ostrożnie przesuwaj je, aby usunąć nadmiar roztworu równoważącego. Na około 10 sekund przed zakończeniem inkubacji umieść pod mikroskopem urządzenie kriogeniczne oznaczone informacjami o pacjencie i wyreguluj ostrość na końcówce urządzenia kriologicznego. Umieść oocyty na urządzeniu kriogenicznym obok końcówki w minimalnej ilości roztworu do witryfikacji i odsuń pipetę od oocytów, aby usunąć nadmiar roztworu do witryfikacji, pozostawiając oocyty pokryte cienką warstwą pożywki.

Szybko zanurz urządzenie kriogeniczne w ciekłym azocie i szybko potrząśnij urządzeniem, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z jego powierzchni. Trzymając pęsetą nasadkę ochronną urządzenia kriogenicznego, napełnij nasadkę ciekłym azotem przed włożeniem urządzenia do nasadki, trzymając paski propylenu w ciekłym azocie. Następnie przechowuj kriourządzenie w wizotubie z opisanymi informacjami o pacjencie i zaktualizuj kartę laboratoryjną.

W celu ogrzania oocytów ostrożnie odwróć każdą fiolkę z roztworem do rozmrażania, rozcieńczania i mycia podgrzanym do temperatury pokojowej i dodaj jeden mililitr roztworu do rozmrażania do centralnej studzienki szalki Petriego na co najmniej godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oznacz wszystkie plastikowe materiały imieniem i nazwiskiem pacjenta oraz numerem identyfikacyjnym oraz rodzajem roztworu, a następnie poproś świadka o potwierdzenie danych pacjenta na urządzeniu do krioterapii. Dla każdego urządzenia, które ma być ogrzane, dodać 200 mikrolitrów roztworu rozcieńczającego do pierwszego dołka płytki sześciodołkowej i dodać równą objętość roztworu myjącego do drugiego i trzeciego dołka płytki.

Dodaj PBS do obszaru na zewnątrz studzienek, aby zapobiec parowaniu roztworu. Umieść naczynie z roztworem do rozmrażania pod mikroskopem stereoskopowym i ustaw ostrość na środku naczynia. Ostrożnie przekręć, aby zdjąć nasadkę ochronną urządzenia kriogenicznego, trzymając paski propylenu w ciekłym azocie i przenieś urządzenie kriogeniczne z ciekłego azotu do roztworu do rozmrażania tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć ryzyka dewitryfikacji.

Po minucie skup się na końcówce urządzenia kriogenicznego, aby zlokalizować oocyty i ostatecznie użyj pipety do zdzierania, aby delikatnie uwolnić oocyty z urządzenia. Za pomocą pipety do strippera o średnicy 170 mikronów przenieś oocyty i niewielką objętość roztworu do rozmrażania do roztworu rozcieńczającego w pierwszym dołku z sześciodołkową płytką. Po trzech minutach przenieś oocyty do pierwszej studzienki roztworu myjącego na pięć minut.

Pod koniec inkubacji przenieść oocyty do drugiego dołka roztworu płuczącego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie przenieść oocyty do odpowiedniej objętości wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej IVF na jedną godzinę i zaktualizować kartę laboratoryjną. W ciągu 12 lat 285 kobiet poddano co najmniej jednemu pobraniu komórek jajowych, co wiązało się z witryfikacją całej kohorty pobranych dojrzałych komórek jajowych. Większość z tych kobiet przeszła pojedynczą operację pobrania.

35 z nich zostało poddanych wielokrotnemu odzyskiwaniu. Powody poddania się pobraniu oocytów w celu witryfikacji komórek jajowych zostały ogólnie scharakteryzowane jako medyczne inne niż rak, rak, niemedyczne i inne. Pacjenci z medycznym powodem witryfikacji komórek jajowych i pacjenci poddawani zachowaniu płodności z powodu raka byli młodsi i wykazywali wyższą liczbę pęcherzyków antralnych niż pacjenci z przyczyn niemedycznych lub innych.

Ponieważ jednak średnie tempo dojrzewania było nieco niższe u pacjentek z przyczyn medycznych, średnia liczba oocytów zeszklonych była podobna w obu grupach. Około połowa pacjentów z powodów medycznych innych niż rak i większość pacjentów z innymi przyczynami do witryfikacji jaj faktycznie wróciła na ocieplenie. I odwrotnie, bardzo niewielu pacjentów, którzy przeszli proces zachowania płodności z powodu raka lub z przyczyn niemedycznych, wykorzystało swoje zeszklone oocyty do zapłodnienia in vitro.

Pomimo różnic w czasie, jaki upłynął między witryfikacją a ociepleniem, wskaźnik przeżycia oocytów był podobny między grupami pacjentów, co potwierdza skuteczność i bezpieczeństwo protokołów witryfikacji i ogrzewania oocytów. Co więcej, wskaźnik przeżycia był niezależny od doświadczenia operatora witryfikacji i podgrzewania. Najważniejszymi krokami, które mogą mieć wpływ na spójność wyników, są te związane z ociepleniem.

Dlatego bardzo ważne jest, aby dokładnie kontrolować objętość i temperaturę roztworów do rozmrażania. Kriokonserwacja tkanek jajnikowych jest jedyną obecnie badaną strategią jako opcja dla pacjentek przed okresem dojrzewania. Podejście to, choć obiecujące, ma istotne ograniczenia, które ograniczają jego zastosowanie.