Name: Zachowanie płodności poprzez witryfikację oocytów: perspektywy kliniczne i laboratoryjne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę witryfikacji oocytów w celu zachowania płodności, obejmującą protokoły mrożenia i odmrażania. Technika ta zapewnia skuteczne i powtarzalne wyniki kliniczne, omijając ograniczenia etyczne związane z kriokonserwacją embrionów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Trening i poradnictwo kliniczne
UWAGA: W przypadku pacjentów wymagających zachowania płodności z powodów onkologicznych, upewnij się, że nie ma listy oczekujących na umówienie się na konsultację, a termin wizyty jest zapewniony tak szybko, jak to możliwe.
<ol>
	<li>Zapoznaj się z historią medyczną i dotychczasową dokumentacją oraz oceń ogólny stan zdrowia pacjenta.</li>
	<li>Zapisz wszystkie informacje (w tym zgodę onkologa na poddanie się stymulacji jajników w przypadku pacjentek z rakiem) w relacyjnej bazie danych.</li>
	<li>Udziel pacjentowi konkretnego poradnictwa na temat wykonalności zabiegu. Wyjaśnij etapy procedury (stymulacja jajników, pobranie komórek jajowych, witryfikacja komórek jajowych) i poinformuj ją o realnych szansach powodzenia (głównie zależnych od wieku matki i oczekiwanej liczby komórek jajowych MII w momencie pobrania komórek jajowych), a także o kosztach i ograniczeniach zabiegu.</li>
	<li>Wykonaj USG przezpochwowe, aby uzyskać informacje na temat rezerwy jajnikowej (tj. AFC) i ocenić dostępność jajników do pobrania komórek jajowych.</li>
	<li>Zamów badania krwi w celu oceny grupy krwi i czynnika Rh, badania przesiewowe krzepnięcia (morfologia krwi, protrombina, tromboplastyna, fibrynogen, białko C, białko S, antytrombina III, homocysteina) oraz choroby zakaźne (wirusowe zapalenie wątroby typu B, zapalenie wątroby typu C, HIV, Laboratorium Badań nad Chorobami Wenerycznymi/Test hemaglutynacji Treponema pallidum). 
	UWAGA: W przypadku pacjentów korzystających z programu zachowania płodności z niepilnych powodów medycznych, bardziej kompleksowa ocena może obejmować podstawowy hormon folikulotropowy (FSH), hormon luteinizujący (LH), estradiol, AMH, badanie piersi, test Papanicolaou, genetyczne badanie przesiewowe krzepnięcia (czynnik V z Lejdy i protrombina) oraz badanie przesiewowe TORCH (toksoplazmoza, różyczka, wirus cytomegalii).</li>
	<li>Poproś o ocenę kardiologiczną (elektrokardiogram).</li>
	<li>Poleć poradnictwo psychologiczne.</li>
</ol>
2. Kontrolowane protokoły stymulacji jajników dla zachowania płodności
UWAGA: Gdy czas dostępny do rozpoczęcia leczenia raka jest ograniczony, zaleca się protokół random-start (tj. rozpoczęcie stymulacji jajników w dowolnym momencie cyklu miesiączkowego) dla stymulacji jajników u pacjentek onkologicznych, które są kandydatkami do zachowania płodności. W programie zachowania płodności z niepilnych powodów medycznych lub społecznych preferowana jest konwencjonalna stymulacja rozpoczynająca się we wczesnej fazie pęcherzykowej, a stymulacja jajników rozpoczyna się w oparciu o cykl menstruacyjny. Metody kontrolowanej stymulacji jajników (COS) powinny być wykonywane zgodnie z najnowszymi wytycznymi Europejskiego Towarzystwa Rozrodu Człowieka i Embriologii (ESHRE)24.

<ol>
	<li>Dostosuj COS do charakterystyki pacjentki i markerów rezerwy jajnikowej, głównie wieku matki, FSH, AMH i AFC.</li>
	<li>COS należy rozpocząć w 5 dniu cyklu miesiączkowego przy użyciu rekombinowanego lub moczowego FSH w stałej dawce 150-300 j.m./dobę (protokół antagonistyczny). 
	UWAGA: W określonej populacji pacjentek z niedoborem LH lub słabą-nieoptymalną odpowiedzią, można podać dodatkowe LH 75/150 IU/dobę w zależności od odpowiedzi jajników, poziomu LH i oceny ginekologa.</li>
	<li>U pacjentów z chorobami wrażliwymi na estrogeny należy włączyć gonadotropiny związane z inhibitorami aromatazy (letrozolem) od 1 dnia stymulacji do 7 dnia po pobraniu komórek jajowych.</li>
	<li>Podawaj stałą dawkę gonadotropin przez 4 dni.</li>
	<li>Monitoruj wzrost pęcherzyków w 5 dniu, a następnie co 2-3 dni; w końcu dostosuj dawkę gonadotropiny.</li>
	<li>Gdy co najmniej 3 pęcherzyki osiągną średnicę 17-18 mm, należy podać wyzwalacz do końcowego dojrzewania oocytów za pomocą pojedynczego podskórnego bolusa agonisty GnRH w dawce 0,5 ml.</li>
</ol>
3. Pobieranie oocytów
<ol>
	<li>Przygotowanie do pobrania komórek jajowych
	<ol>
		<li>Aby uzyskać informacje o wymaganych materiałach, zapoznaj się ze Tabelą materiałów i przygotuj obuwie i strój laboratoryjny, chirurgiczną maskę na twarz, osłonę włosów, rękawiczki chirurgiczne, trwały nietoksyczny marker, pęsetę, sterylne małe gazy, wziernik jednorazowy lub wielokrotnego użytku, sprzęt do chirurgii pochwy i środek do dezynfekcji powierzchni. Zapewnij dostępność sprzętu do resuscytacji, leków znieczulających do odwrócenia, zestawu przygotowanego do leczenia wstrząsu anafilaktycznego oraz tlenu na sali operacyjnej.</li>
		<li>Wykonaj procedurę pobrania komórek jajowych zgodnie z zaleceniami Grupy Roboczej ESHRE ds. Ultradźwięków w technologiach wspomaganego rozrodu (ART)25.
		<ol>
			<li>Podać sedację lub znieczulenie ogólne oraz antybiotyki w profilaktyce. 
			UWAGA: W tym protokole głęboką sedację osiągnięto poprzez podanie propofolu (którego dawka jest dostosowywana w zależności od masy ciała pacjenta) i 50-100 μg fentanylu, 1000 mg paracetamolu i wspomaganej wentylacji maski tlenem.</li>
			<li>Pobrać oocyty za pomocą jednostki aspiracyjnej składającej się z pompy próżniowej, rurki pobranej podłączonej do igły o pojedynczym prześwicie 17 G i rurki do pobierania oocytów. Podczas pobierania nie należy przekraczać ciśnienia ~120 mmHg, aby uniknąć ryzyka uszkodzenia oocytów, takiego jak oderwanie komórek wzgórka lub pęknięcie osłonki przejrzystej.</li>
			<li>Skalibrować temperaturę powierzchni roboczej, aby zapewnić 37 °C w pożywce hodowlanej. Podczas całego zabiegu należy zminimalizować narażenie oocytów nawet na przejściową temperaturę, która może wpływać na ich kompetencje rozwojowe.</li>
			<li>Po zakończeniu pobierania komórek jajowych obserwuj pacjentkę przez 3-4 godziny przed wypisem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sala operacyjna
	<ol>
		<li>Przed wejściem na salę operacyjną zidentyfikuj pacjentkę i potwierdź czas wyzwolenia owulacji.</li>
		<li>Pacjentka powinna położyć się na stole operacyjnym w pozycji ginekologicznej.</li>
		<li>Oczyść pochwę/szyjkę macicy przed pobraniem komórek jajowych, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne.</li>
		<li>Wykonaj wstępne USG przezpochwowe, aby ocenić położenie jajników i anatomiczne relacje z różnymi narządami i naczyniami krwionośnymi.</li>
		<li>Pod kontrolą USG wprowadź jednostrumieniową igłę przez ścianę pochwy i do pęcherzyka jajnikowego, uważając, aby nie uszkodzić narządów lub naczyń krwionośnych znajdujących się między ścianą pochwy a jajnikiem.</li>
		<li>Rozpocznij aspirację od najbliższego pęcherzyka i przejdź do najbardziej dystalnych.</li>
		<li>Nakłuć wszystkie pęcherzyki o średnicy większej niż 11-12 mm, wykonując "ruchy skręcające" igły w celu zassania całego płynu pęcherzykowego, który jest następnie uwalniany do sterylnej rurki (okrągłe dno 14 ml) podgrzanej w grzejniku bloku sali operacyjnej.</li>
		<li>Natychmiast po pobraniu należy zapieczętować i oznaczyć probówkę szczegółami dotyczącymi tożsamości pacjenta.</li>
		<li>Upewnij się, że pielęgniarka przyniesie probówkę do laboratorium, gdzie zostanie ona natychmiast przebadana na obecność kompleksów wzgórek-oocytów (COC).</li>
		<li>Poinstruuj embriologów, aby poinformowali lekarza o całkowitej liczbie pobranych COC.</li>
		<li>Po zakończeniu procedury dla pierwszego jajnika, przepłucz igłę czystym medium i kontynuuj z drugim jajnikiem, stosując tę samą procedurę.</li>
		<li>Po pobraniu komórek jajowych należy ocenić krwawienie z jajników lub naczyń krwionośnych parametrium i wolnego płynu w woreczku Douglas. 
		UWAGA: Aby zautomatyzować i poprawić skuteczność śledzenia gamet i zarodków na poziomie klinicznym, w center26 wdrożono elektroniczny system obserwacji (EWS). Niemniej jednak protokół ten nie wspomina o EWS, aby zapewnić odtwarzalność protokołu w każdym laboratorium IVF. Należy jednak wziąć pod uwagę, że wszystkie etapy procedury wymagają obecności drugiego operatora (tj. świadka), aby zapewnić identyfikowalność gamet i zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Laboratorium in vitro
<ol>
	<li>Dzień przed zabiegiem pobrania komórek jajowych
	<ol>
		<li>Przygotuj probówki do pobierania komórek jajowych (patrz Tabela materiałów).
		<ol>
			<li>Dozować 1 ml pożywki IVF (patrz Tabela materiałów) do każdej probówki do pobierania oocytów (okrągłe dno, 5 ml) i przykryć 0,2 ml oleju mineralnego (patrz Tabela materiałów) do hodowli zarodków. 
			UWAGA: Liczba jajowodów zostanie określona zgodnie z liczbą pęcherzyków, które mają zostać pobrane. Każda probówka może zawierać do 4 COC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uszczelnij probówki nakrętką (pierwszy zatrzask). Oznaczyć probówki szczegółowymi informacjami na temat rodzaju pożywki i daty przygotowania. Inkubować probówki przez noc w temperaturze 37 °C w kontrolowanej atmosferze (6% CO2, 5 % 02).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu pobrania komórek jajowych
	<ol>
		<li>Rozgrzej plastikowe zapasy w temperaturze 37 °C (sterylne naczynia do hodowli i pipety Pasteura).</li>
		<li>Poproś pacjentki o potwierdzenie swojej tożsamości (imię i nazwisko oraz data urodzenia) oraz czasu wyzwalania owulacji. Na karcie laboratoryjnej należy odnotować, że procedura identyfikacji (ID) została zakończona i że czas wyzwolenia owulacji został potwierdzony.</li>
		<li>Wyjmij probówki do pobierania oocytów z inkubatora (tuż przed rozpoczęciem zabiegu) i dociśnij nakrętkę, aby zapewnić szczelne zamknięcie. Oznacz probówki do pobierania komórek jajowych informacjami o pacjencie. Umieścić probówki do pobierania oocytów w podgrzewaczu bloku o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zbadaj płyn pęcherzykowy w podgrzanych sterylnych szalkach hodowlanych i zidentyfikuj COC. Po zidentyfikowaniu jednego lub więcej COC należy je dwukrotnie przepłukać w dwóch kroplach pożywki, aby usunąć płyn pęcherzykowy i zanieczyszczenie krwi.</li>
		<li>Przenieś COC do probówek do pobrania oocytów i opisz liczbę COC na probówce. Poluzować nakrętki probówek z pożywką i niezwłocznie inkubować je w temperaturze 37 °C w atmosferze 6% CO2 i 5 %O2 .</li>
		<li>Powtórz kroki od 7 do 9 w zależności od liczby pobranych komórek jajowych. Zaktualizuj arkusz laboratoryjny. 
		UWAGA: Upewnij się, że świadek sprawdzi, czy wszystkie bloki do podgrzewania rurki (w tym te na sali operacyjnej) są puste i podpisze zamknięcie procedury na karcie laboratoryjnej.</li>
		<li>Wytrzyj etap roboczy po zakończeniu zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Denudacja oocytów
<ol>
	<li>Rozgrzej pożywkę z buforem kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i hialuronidazę (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem.</li>
	<li>Przygotować 4-dołkową płytkę IVF (patrz Tabela Materiałów) z 0,6 ml/studzienkę wstępnie podgrzanego buforowanego pożywką HEPES (uzupełnioną 5% albuminą surowicy ludzkiej [HSA]) pokrytą 0,3 ml oleju mineralnego do hodowli zarodków i ogrzewać w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Oznacz płytkę do denudacji oocytów szczegółami dotyczącymi tożsamości pacjenta.</li>
	<li>Bezpośrednio przed rozpoczęciem zabiegu należy dodać hialuronidazę do pierwszego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie około 20 IU/ml.</li>
	<li>Umieść ograniczoną liczbę COC (do 6) w pierwszym dołku zawierającym enzym w celu rozproszenia komórek wzgórka.</li>
	<li>Aby usprawnić enzymatyczne usuwanie wzgórków i komórek koronowych, należy przeprowadzić usuwanie komórek wzgórka poprzez wielokrotne pipetowanie oocytów za pomocą pipety Pasteura o średnicy wewnętrznej około 250 μm przez okres do 30 s. Po zaobserwowaniu początkowej dysocjacji komórek należy przenieść oocyty do drugiego dołka zawierającego tylko pożywkę buforowaną przez HEPES, uważając, aby przenieść minimalną ilość enzymu.</li>
	<li>Przeprowadzić dalszą denudację w celu usunięcia komórek koronowych za pomocą pipet do denudacji o zmniejszających się średnicach wewnętrznych (170-145 μm). Używaj niższych średnic (135 μm) tylko wtedy, gdy jest to absolutnie konieczne.</li>
	<li>Ostrożnie umyj ogołocone oocyty, aby wypłukać enzym.</li>
	<li>Po denudacji zbadaj oocyty pod odwróconym mikroskopem, aby ocenić ich integralność i etap dojrzewania. Oddziel oocyty MII od niedojrzałych (pęcherzyk rozrodczy i metafaza-I).</li>
	<li>Przenieś oocyty MII do obszaru witryfikacji, aby natychmiast przeprowadzić krioprezerwację. Zaktualizuj kartę laboratoryjną.</li>
</ol>
6. Witryfikacja oocytów
UWAGA: Najlepiej przeprowadzić witryfikację oocytów w ciągu 38 godzin od pobrania oocytów i natychmiast po denudacji. Opisana tutaj procedura witryfikacji musi być wykonywana w temperaturze pokojowej (RT) i przy użyciu pipety z paskiem o średnicy wewnętrznej 170 μm, aby nie uszkodzić oocytów podczas manipulacji.
<ol>
	<li>Na około 30 minut przed zabiegiem doprowadzić roztwór równoważący (ES) i roztwór do witryfikacji (VS) do temperatury RT (25-27 °C).</li>
	<li>Prawidłowo oznacz kriourządzenia imieniem i nazwiskiem oraz identyfikatorem pacjenta, identyfikatorem zabiegu, datą zamrożenia, liczbą oocytów i kodem kriobarowym.</li>
	<li>Napełnij jednorazowy stojak chłodzący do góry świeżym ciekłym azotem i rozpocznij proces sterylizacji.</li>
	<li>Oznacz płytkę do witryfikacji (patrz Tabela materiałów) imieniem i nazwiskiem pacjenta oraz jego identyfikatorem. Poproś świadka o sprawdzenie prawidłowego identyfikatora kriourządzeń.</li>
	<li>Ostrożnie odwrócić każdą fiolkę dwa razy, aby wymieszać jej zawartość przed użyciem i przygotować pokrywkę szalki Petriego o średnicy 6 mm z jedną kroplą 30 μl pożywki buforowanej HEPES (z 5% HSA) i jedną sąsiednią kroplą 30 μl ES. 
	UWAGA: Umieść krople tuż przed użyciem, aby ograniczyć parowanie medium.</li>
	<li>Za pomocą pipety do strippera o średnicy 170 μm umieść oocyty (do 9) w pierwszej kropli z najmniejszą możliwą objętością pożywki. Za pomocą pipety do striptizu utwórz most pożywki między kroplą nr 1 i nr 2, aby uzyskać stopniowy wzrost stężenia CPA (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A).</li>
	<li>Inkubuj oocyty w pierwszej kropli przez 3 minuty. Dodać trzecią kroplę 30 μl ES (nr 3). Po 3 minutach przenieś oocyty do drugiej kropli ES i utwórz pożywkę między kroplami n.3 i n.2 (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1B). Inkubować oocyty w kropli nr 3 przez 3 minuty.</li>
	<li>Podczas inkubacji dodać jedną kroplę ES o pojemności 30 μl do każdego kriourządzenia, które będzie używane (jeśli 9 oocytów ma być kriorezerwowanych, umieść 3 krople ES z 3 oocytami w każdej kropli ES). Przenieś oocyty do czystego roztworu ES i pozostaw je na 6-9 minut (aż odzyskają swój początkowy rozmiar po skurczeniu) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Przygotować naczynie z dołkiem centralnym (60 x 15 mm) z 1 ml VS. Pod koniec pierwszych 6 minut przenieś oocyty do kriokonserwacji do roztworu VS, uwalniając jak najmniej pożywki. Pozostaw oocyty w VS na 1 minutę i dokładnie je umyj, przesuwając je z dołu na górę naczynia, aby usunąć nadmiar ES.</li>
	<li>Około 10 s przed końcem minuty inkubacji umieść kriourządzenie pod mikroskopem i ustaw ostrość na czarnym znaku (tj. końcówce kriourządzenia). Umieść oocyty na kriourządzeniu obok czarnego znaku z minimalną ilością VS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Odsuń pipetę od oocytów i usuń nadmiar pożywki VS (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B), tak aby oocyty pozostały pokryte cienką warstwą pożywki (<silna klasa="xfig">Figura 2C).</li>
	<li>Szybko zanurz kriourządzenie w ciekłym azocie, szybko potrząsając nim, aby usunąć pęcherzyki powietrza z jego powierzchni. Przytrzymaj nasadkę ochronną kriourządzenia pęsetą i napełnij ją ciekłym azotem; Następnie włóż do niego kriourządzenie, trzymając paski propylenu w ciekłym azocie.</li>
	<li>Przechowuj kriourządzenie w wizoprobówce uprzednio oznaczonej informacjami o pacjencie. Zaktualizuj kartę laboratoryjną.</li>
</ol>
7. Ocieplenie oocytów
<ol>
	<li>Na około 30 minut przed zabiegiem podgrzać roztwór do rozmrażania (TS), roztwór rozcieńczający (DS) i roztwór myjący (WS) do temperatury RT (25-27 °C). Ostrożnie odwrócić każdą fiolkę dwukrotnie, aby wymieszać jej zawartość. Umieścić 1 ml TS na płytce Petriego w centralnej studzience i ogrzewać ją w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem zabiegu.</li>
	<li>Oznacz wszystkie plastikowe materiały eksploatacyjne imieniem i nazwiskiem pacjenta oraz rodzajem roztworu. Poproś świadka o potwierdzenie danych pacjenta na urządzeniu kriogenicznym.</li>
	<li>Dla każdego kriourządzenia, które ma być podgrzane, należy przygotować 6-dołkową płytkę z 200 μl DS w pierwszej studzience i równą ilością WS w drugiej i trzeciej studzience (nazwanych odpowiednio WS1 i WS2). Dodaj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) lub sterylną wodę w obszarze poza studniami, aby zapobiec parowaniu.</li>
	<li>Wyjmij szalkę TS z inkubatora i umieść ją pod mikroskopem. Ustaw ostrość mikroskopu na środku szalki Petriego.</li>
	<li>Ostrożnie przekręć i zdejmij nasadkę ochronną kriourządzenia, trzymając paski propylenu w ciekłym azocie. Przenieś kriourządzenie z ciekłego azotu do TS tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć ryzyka dewitryfikacji i rozpocznij odliczanie (1 min).</li>
	<li>Zlokalizuj oocyty, skupiając się na końcówce kriourządzenia (tj. czarnym znaku). Za pomocą pipety do strippera uwolnij oocyty z kriourządzenia. 
	UWAGA: Staraj się nie odsysać oocytów z kriourządzenia; delikatnie wypuść na nich kilka nośników, aż przesuną się do TS.</li>
	<li>Za pomocą pipety do strippera o średnicy 170 μm przenieś oocyty do DS z niewielką ilością TS (aby utworzyć gradient) i pozostaw je w DS na 3 minuty. Przenieś oocyty do WS1 i pozostaw je na 5 minut. Na koniec przenieś oocyty do WS2 na 1 minutę.</li>
	<li>Przenieś oocyty do odpowiedniej, wstępnie zrównoważonej pożywki do hodowli IVF i inkubuj je przez 1 godzinę przed przystąpieniem do docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemnika (ICSI). Zaktualizuj kartę laboratoryjną.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rozważania kliniczne 
Chociaż nowe strategie, takie jak kriokonserwacja tkanki jajnika i dojrzewanie in vitro, zostały zbadane, witryfikacja oocytów po COS jest złotym standardem w zachowaniu płodności. W tym scenariuszu liczba pobranych i kriokonserwowanych oocytów powinna być zmaksymalizowana w jak najkrótszym czasie, ponieważ większość pacjentek z rakiem może odnieść korzyści wyłącznie z jednego cyklu jajnikowego, zanim będą musiały rozpocząć leczenie raka. W związku z tym ...

Opracowanie i wdrożenie skutecznego programu kriokonserwacji ludzkich oocytów było znaczącym przełomem w medycynie reprodukcyjnej. Zgodnie z najnowszymi dowodami, witryfikacja jest najskuteczniejszą strategią kriokonserwacji oocytów metafazy II (MII), ponieważ skutkuje statystycznie wyższymi wskaźnikami przeżycia w porównaniu z powolnym zamrażaniem, niezależnie od populacji pacjentów (pacjenci niepłodni lub program dawstwa oocytów)1,2,3. Niezwykłe osiągnięcia witryfikacji oocytów skłoniły Komitety Praktyki Amerykańskiego Towarzystwa Medycyny Rozrodu (ASRM) i Towarzystwa Technologii Wspomaganego Rozrodu (SART) do uznania tej techniki za najbardziej skuteczną w planowym zachowaniu płodności u kobiet po okresie dojrzewania, zarówno ze wskazań medycznych, jak i niemedycznych4,5,6. Wskazania medyczne do zachowania płodności obejmują (i) nowotwory i choroby autoimmunologiczne, które wymagają terapii7, takie jak radioterapia, chemioterapia cytotoksyczna i terapia hormonalna (której szkodliwy wpływ na rezerwę jajnikową jest związany z wiekiem matki, a także rodzajem i dawką leczenia); (ii) choroby jajników wymagające powtarzających się lub radykalnych operacji (takie jak endometrioza)8; oraz (iii) uwarunkowania genetyczne (np. łamliwość chromosomu X) lub przedwczesna niewydolność jajników. Ponadto zachowanie płodności stało się cenną opcją dla wszystkich kobiet, które nie osiągnęły swojego rodzicielskiego celu z powodów niemedycznych (znane również jako zamrożenie społeczne).
Niezależnie od wskazań do zachowania płodności i zgodnie z głównymi międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi zachowania płodności, wszyscy pacjenci chętni do witryfikacji swoich oocytów powinni otrzymać odpowiednie poradnictwo, aby być poinformowanym o ich realnej szansie na sukces, kosztach, ryzyku i ograniczeniach procedury9,10,11,12,13. Co najważniejsze, powinno być jasne, że witryfikacja kohorty oocytów MII nie gwarantuje ciąży, ale daje większą szansę powodzenia w przyszłym leczeniu zapłodnieniem in vitro (IVF), jeśli to konieczne14. W związku z tym wiek kobiety w momencie witryfikacji oocytów jest z pewnością najważniejszym czynnikiem ograniczającym15, ponieważ zaawansowany wiek matki (AMA; >35 lat) jest główną przyczyną niepłodności kobiet16. Oprócz postępującego zmniejszania się rezerwy jajnikowej, AMA wiąże się z upośledzeniem kompetencji oocytów z powodu wadliwych szlaków fizjologicznych, takich jak metabolizm, regulacja epigenetyczna, punkty kontrolne cyklu komórkowego i segregacja mejotyczna17. Dlatego rozsądna liczba jaj do witryfikacji zależy głównie od wieku matki. U kobiet w wieku poniżej 36 lat wymagane jest co najmniej 8-10 oocytów MII, 18, aby zmaksymalizować szansę na sukces. Ogólnie rzecz biorąc, im większa liczba witryfikowanych oocytów, tym większe prawdopodobieństwo sukcesu. Dlatego dostosowanie stymulacji jajników do markerów rezerwy jajnikowej, takich jak poziom hormonu anty-Müllerowskiego (AMH) lub liczba pęcherzyków antralnych (AFC), ma kluczowe znaczenie dla pełnego wykorzystania rezerwy jajnikowej w jak najkrótszym czasie.
Bezpieczeństwo całej procedury jest drugą kluczową kwestią przy rekrutacji pacjentów do zachowania płodności. Klinicyści powinni stosować najlepsze strategie w celu zminimalizowania ryzyka i zapobiegania (i) zespołowi hiperstymulacji jajników (OHSS) poprzez stosowanie bezpiecznych metod, takich jak protokół antagonistyczny hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH), a następnie agonista GnRH trigger19 oraz (ii) odległe, ale możliwe, ryzyko krwawienia z otrzewnej, uszkodzenia struktur miednicy (moczowod, jelita, wyrostek robaczkowy, nerwy) lub infekcji miednicy mniejszej podczas pobierania oocytów. Wreszcie, (iii) tradycyjne schematy stymulacji są związane z suprafizjologicznym estradiolem w surowicy i dlatego nie są zalecane w chorobach wrażliwych na estrogeny, takich jak rak piersi. Protokoły obejmujące inhibitory aromatazy (takie jak letrozol lub tamoksyfen) są bardziej odpowiednie w takich przypadkach20,21. W warunkach laboratoryjnych najbardziej rozpowszechnionym protokołem witryfikacji oocytów jest nadal ten po raz pierwszy opisany przez Kuwayamę i współpracowników2,23, który składa się z etapowej procedury obejmującej stopniowe dodawanie krioprotektantów (CPA). W pierwszej fazie (równowaga/odwodnienie) oocyty są poddawane ekspozycji w roztworze CPA zawierającym 7,5% v/v glikolu etylenowego i 7,5% v/v dimetylosulfotlenku (DMSO), natomiast w drugiej fazie oocyty przenosi się do roztworu witryfikacyjnego z 15% v/v glikolu etylenowego i 15% v/v DMSO oraz 0,5 mol/l sacharozy. Po krótkiej inkubacji w pożywce witryfikacyjnej oocyty można umieścić w specjalnie zaprojektowanych, otwartych kriourządzeniach, a na koniec zanurzyć w ciekłym azocie w temperaturze -196 °C w celu przechowywania do czasu użycia.
Tutaj cała kliniczna i laboratoryjna analiza leczenia zachowania płodności została opisana poprzez (i) nakreślenie zaleceń dotyczących obiektywnego i opartego na dowodach poradnictwa, (ii) skupienie się na opłacalności procedury oraz (iii) opisanie najbardziej odpowiednich strategii pełnego wykorzystania rezerwy jajnikowej i maksymalizacji liczby oocytów pobranych w jak najkrótszym czasie. Ocena rezerwy jajnikowej, definicja idealnego protokołu stymulacji, a także procedury pobierania, denudacji i witryfikacji komórek jajowych zostaną szczegółowo opisane wraz z podejściami mającymi na celu maksymalizację ich skuteczności, wydajności i bezpieczeństwa. Ponieważ w literaturze istnieją inne protokoły lub adaptacje tego protokołu, reprezentatywne wyniki i omawiane sekcje tego manuskryptu mają zastosowanie tylko do tej procedury.

<table><tbody><tr><td>Collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>IVF TECH</td> Markery laboratoryjne Sigma Aldrich <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td>IVF TECH</td><td></td><td>Grade A</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>Termometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka Cieplejszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inkubator trójgazowy</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5M-PE</td><td>02/CO2</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Kucharz</td><td>K-MAR-5200</td><td></td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSCM (Continuos single culture complete) średni</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90165</td><td>Pożywka do hodowli IVF uzupełniona</td></tr><tr><td>olejem mineralnym HSA do hodowli zarodków</td> Igła do aspiracji komórek jajowych <td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>(pojedynczy prześwit)</td><td>Cook</td><td>K-OSN-1730-B-60</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie Primaria</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>Corning Primaria Standardowe naczynie do hodowli komórkowych w stylu 100x20 mm</td></tr><tr><td>Rurki z okrągłym dnem</td><td>Sokół</td><td>352001</td><td>Falcon 14ml Polistyrenowa probówka z okrągłym dnem i zatrzaskiem</td></tr><tr><td>Probówki z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352003</td><td>Probówki do pobierania oocytów / Falcon 5ml 12x75 Probówka polipropylenowa z okrągłym dnem i zatrzaskiem</td></tr><tr><td>Gumowa żarówka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z111589-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura ze sterylnego szkła</td><td>Hunter Scientific</td><td>PPB150-100PL</td><td>Pipeta Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE</td></tr><tr><td>Denudation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkubator</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>Flexipet regulowany zestaw uchwytów</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td>Uchwyt do ściągania izolacji&nbsp; Gilson</td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>66003</td><td>p20</td></tr><tr><td>k-System Inkubator</td><td>Coopersurgical</td><td>G210Invicell</td><td></td></tr><tr><td>Markery laboratoryjne</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaptur z przepływem laminarnym</td><td>IVF TECH</td><td></td><td>Grade A przepływ powietrza</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopur epTIPS Rack</td><td>Eppendorf</td><td>30075331</td><td>Mikropipety epTIPS Biopur 2-200 &micro; l</td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej</td><td>thermoFisher Scietific</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90101</td><td>80 IU / ml enzymu hialuronidazy w buforowanym przez HEPES</td></tr><tr><td>naczyniu do hodowli HTF IVF (60 x 15 mm)</td> <td>Corning</td><td>353802</td><td>Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standardowe naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Naczynie IVF 4-dołkowa płytka z przesuwaną pokrywką</td><td>ThermoFisher Scietific</td><td>176740</td><td>Naczynia wielościenne 4 dołki (Nunc)</td></tr><tr><td>IVF Naczynie jednodołkowe</td><td>Falcon</td><td>353653</td><td>Falcon 60 x 15 mm Olej mineralny IVF z dotyczką centralną</td></tr> do <tr><td>hodowli zarodków</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany HTF Medium</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>Hepes-Buffered</td></tr><tr><td>Gumowa żarówka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z111589-12EA</td><td>1 ml do pipety pasteura</td></tr><tr><td>Sterylne szkło Pipety Pasteura</td><td>Hunter Scientific</td><td>PPB150-100PL</td><td>Pipeta Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE</td></tr><tr><td>końcówki do zdejmowania izolacji (140 &mikro; m)</td> <td>Cook</td><td>K-FPIP-1140-10BS-6</td><td>PIPETY FLEXIPETS PER DENUDING</td></tr><tr><td>końcówki do pipet do zdejmowania izolacji (130 i mikro; m )</td> <td>Cook</td><td>K-FPIP-1130-10BS-7</td><td>PIPETY FLEXIPETS NA DENUDING</td></tr><tr><td>końcówki do pipet do zdejmowania izolacji (170 &mikro; m)</td> <td>Cook</td><td>K-FPIP-1170-10BS-5</td><td>PIPETY FLEXIPETS NA DENUDING</td></tr><<tr><td>mocny>Witryfikacja</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczny timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regulowany zestaw uchwytów Flexipet</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td>Stripper&nbsp; uchwyt</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>p200</td></tr><tr><td>Markery laboratoryjne</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaptur z przepływem laminarnym</td><td>IVF TECH</td><td></td><td>Klasa A</td></tr><tr><td>przepływ powietrza Pojemnik ze stali nierdzewnej do stojaka chłodzącego</td><td>Kitazato</td><td></td><td>Pojemnik na ciekły azot do witryfikacji</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopur epTIPS Stojak</td><td>Eppendorf</td><td>30075331</td><td>Mikropipety epTIPS Biopur 2-200 &micro; L</td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli IVF (60 x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>353802</td><td>Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standardowe naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Naczynie IVF 6-dołkowe</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-SW02</td><td>OOSAFE&nbsp; NACZYNIE 6-DOŁKOWE Z UCHWYTEM NA SŁOMKĘ</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane HTF Medium</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>HEPES-Buforowane średnie</td></tr><tr><td>końcówki do pipet do zdejmowania izolacji (170 &mikro; m)</td> <td>Cook</td><td>K-FPIP-1170-10BS-5</td><td>PIPETY FLEXIPETS NA ZESTAW DO ZAMRAŻANIA</td></tr><tr><td>WITRYFIKACJI</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90133-so</td><td>2 fiolki ES (roztwór do równoważenia, 2 x 1 ml) i 2 fiolki VS (roztwór do witryfikacji, 2 x 1 ml)</td></tr><tr><td>Vitrifit</td><td>Coopersurgical Origio</td><td>42782001A</td><td>VitriFit&nbsp; Box</td></tr><tr><td>warming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczny timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexipet regulowany zestaw uchwytów</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td>Stripper&nbsp; uchwyt</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>p200</td></tr><tr><td>Inkubator k-System</td><td>Coopersurgical</td><td>G210Markery laboratoryjne Invicell</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaptur z przepływem laminarnym</td><td>IVF TECH</td><td></td><td>Przepływ powietrza klasy A</td></tr><tr><td>Pojemnik ze stali nierdzewnej do stojaka chłodzącego</td><td>Kitazato</td><td></td><td>Pojemnik na ciekły azot do witryfikacji</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopur epTIPS Stojak</td><td>Eppendorf</td><td>30075331</td><td>Mikropipety epTIPS Biopur 2-200 &micro; L</td></tr><tr><td>Pożywka CSCM (Continuos single culture complete)</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90165</td><td>Pożywka do hodowli in vitro uzupełniona naczyniem do</td></tr><tr><td>hodowli IVF HSA (60 x 15 mm)</td><td>Corning</td><td></td><td>353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standardowe naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Naczynie IVF 4-dołkowa płytka z przesuwaną pokrywką</td><td>ThermoFisher Scietific</td><td>176740</td><td>Naczynia wielofunkcyjne 4 dołki (Nunc)</td></tr><tr><td>Miska IVF 6-dołkowy</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-SW02</td><td>OOSAFE&reg; &nbsp; NACZYNIE 6-DOŁKOWE Z UCHWYTEM NA SŁOMKĘ</td></tr><tr><td>Olej mineralny do hodowli zarodków</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>SAkońcówki do pipet (300 i mikro; m)</td> <td>Cook</td><td>K-FPIP-1300-10BS-5</td><td>PIPETY FLEXIPETS NA OGOŁOCENIE</td></tr><tr><td>Zestaw do rozmrażania witryfikacji</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90137-so</td><td>4 fiolki TS (roztwór do rozmrażania, 4 x 2 ml) + 1 fiolka DS (roztwór do rozcieńczania, 1 x 2 ml) + 1 fiolka WS (roztwór do mycia, 1 x 2 ml)</td></tr></tbody></table>

zachowanie płodności poprzez witryfikację oocytów: perspektywy kliniczne i laboratoryjne

Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives

Zachowanie kobiecej płodności jest kluczowe w wielofunkcyjnym systemie opieki zdrowotnej, który dba o przyszłą jakość życia pacjentów. Kriokonserwacja oocytów jest uznawana przez kilka międzynarodowych towarzystw naukowych za złoty standard zachowania płodności u kobiet po okresie dojrzewania, zarówno ze wskazań medycznych, jak i niemedycznych. Głównymi wskazaniami medycznymi są choroby onkologiczne, choroby ginekologiczne, takie jak ciężka endometrioza, choroby ogólnoustrojowe upośledzające rezerwę jajnikową oraz uwarunkowania genetyczne związane z przedwczesną menopauzą. Niniejszy artykuł opisuje całość klinicznych i laboratoryjnych badań nad leczeniem zachowania płodności, przedstawiając zalecenia dotyczące obiektywnego i opartego na dowodach poradnictwa. Ponadto skoncentrowano się na skuteczności procedury i opisano najwłaściwsze strategie, aby w pełni wykorzystać rezerwę jajnikową i zmaksymalizować liczbę pobranych komórek jajowych w jak najkrótszym czasie. Ocena rezerwy jajnikowej, definicja idealnego protokołu stymulacji, a także procedury pobierania, denudacji i witryfikacji oocytów zostały szczegółowo opisane wraz z podejściami mającymi na celu maksymalizację ich skuteczności, wydajności i bezpieczeństwa.

Przegląd programu zachowania płodności w ośrodku
W okresie 12 lat (2008-2020) 285 kobiet przeszło co najmniej jeden zabieg pobrania oocytów, obejmujący witryfikację całej grupy zebranych dojrzałych komórek jajowych. Większość z tych kobiet (n=250) przeszła pojedyncze pobranie, a 35 przeszło wielokrotne pobrania. Przyczyny przeprowadzenia pobrania oocytów w celu witryfikacji podzielono na 4 kategorie: medyczne (z wyłączeniem nowotworów), nowotworowe, niemedyczne oraz inne. Wśró...

Kriokonserwacja oocytów jest uznawana przez kilka międzynarodowych towarzystw naukowych za złoty standard zachowania płodności u kobiet po okresie dojrzewania. Odpowiednie strategie kliniczne i laboratoryjne zapewniają maksymalną skuteczność, efektywność i bezpieczeństwo zabiegów zachowujących płodność.

Zachowanie płodności poprzez witryfikację oocytów: perspektywy kliniczne i laboratoryjne

Preserving female fertility is crucial in a multifunctional healthcare system that takes care of patients' future quality of life. Oocyte cryopreservation ...

Witryfikacja oocytów i procedury rozgrzewania są niezbędne do zachowania płodności. Postępowanie zgodnie z tym protokołem, jak pokazano, pozwala użytkownikowi zmaksymalizować skuteczność tych procedur. Zachowanie płodności w celu witryfikacji oocytów jest obecnie uznanym i etycznie akceptowalnym podejściem.Pozwala to na osiągnięcie skutecznych i spójnych wyników klinicznych oraz przezwyciężenie ograniczeń moralnych i prawnych związanych z krioprezerwacją zarodków. Aby osiągnąć biegłość w procesie witryfikacji, ważne jest zapoznanie się ze wszystkimi krytycznymi punktami protokołu, zwracając szczególną uwagę na czas ekspozycji próbek na działanie krioprotektantów. W ciągu 38 godzin od pobrania i bezpośrednio po denudacji oznacz wszystkie plastikowe materiały imieniem i nazwiskiem pacjenta, identyfikatorem oraz rodzajem roztworu i poproś świadka o potwierdzenie danych pacjenta na urządzeniu kriogenicznym.Gdy wszystkie zapasy zostaną oznaczone, ostrożnie odwróć każdą fiolkę oocytów kilka razy, aby wymieszać i umieścić 30 mikrolitrową kroplę pożywki buforowej HEPES uzupełnioną albuminą surowicy ludzkiej i 30 mikrolitrową sąsiednią kroplę roztworu równoważącego na szalce Petriego. Za pomocą pipety do striptizu umieść oocyty w pierwszej kropli i utwórz mostek pożywki do 30 mikrolitrów kropli roztworu równoważącego, aby uzyskać stopniowy wzrost stężenia krioprotektantów. Po trzech minutach dodaj drugą 30 mikrolitrową kroplę roztworu równoważącego do płytki i użyj pipety, aby utworzyć średni most między kroplami roztworu.Podczas gdy oocyty się równoważą, dodaj jedną 30 mikrolitrową kroplę roztworu równoważącego dla każdego urządzenia kriogenicznego, które ma być użyte na płytce. Po trzech minutach przenieś oocyty do czystego roztworu równowagi na sześć do dziewięciu minut, aby oocyty powróciły do początkowego rozmiaru. Kiedy oocyty wyzdrowieją, przygotuj centralne naczynie do zapłodnienia in vitro zawierające jeden mililitr roztworu witryfikacyjnego.Przenieś oocyty do naczynia w jak najmniejszej ilości pożywki i ostrożnie przesuwaj je, aby usunąć nadmiar roztworu równoważącego. Na około 10 sekund przed zakończeniem inkubacji umieść pod mikroskopem urządzenie kriogeniczne oznaczone informacjami o pacjencie i wyreguluj ostrość na końcówce urządzenia kriologicznego. Umieść oocyty na urządzeniu kriogenicznym obok końcówki w minimalnej ilości roztworu do witryfikacji i odsuń pipetę od oocytów, aby usunąć nadmiar roztworu do witryfikacji, pozostawiając oocyty pokryte cienką warstwą pożywki.Szybko zanurz urządzenie kriogeniczne w ciekłym azocie i szybko potrząśnij urządzeniem, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z jego powierzchni. Trzymając pęsetą nasadkę ochronną urządzenia kriogenicznego, napełnij nasadkę ciekłym azotem przed włożeniem urządzenia do nasadki, trzymając paski propylenu w ciekłym azocie. Następnie przechowuj kriourządzenie w wizotubie z opisanymi informacjami o pacjencie i zaktualizuj kartę laboratoryjną.W celu ogrzania oocytów ostrożnie odwróć każdą fiolkę z roztworem do rozmrażania, rozcieńczania i mycia podgrzanym do temperatury pokojowej i dodaj jeden mililitr roztworu do rozmrażania do centralnej studzienki szalki Petriego na co najmniej godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oznacz wszystkie plastikowe materiały imieniem i nazwiskiem pacjenta oraz numerem identyfikacyjnym oraz rodzajem roztworu, a następnie poproś świadka o potwierdzenie danych pacjenta na urządzeniu do krioterapii. Dla każdego urządzenia, które ma być ogrzane, dodać 200 mikrolitrów roztworu rozcieńczającego do pierwszego dołka płytki sześciodołkowej i dodać równą objętość roztworu myjącego do drugiego i trzeciego dołka płytki.Dodaj PBS do obszaru na zewnątrz studzienek, aby zapobiec parowaniu roztworu. Umieść naczynie z roztworem do rozmrażania pod mikroskopem stereoskopowym i ustaw ostrość na środku naczynia. Ostrożnie przekręć, aby zdjąć nasadkę ochronną urządzenia kriogenicznego, trzymając paski propylenu w ciekłym azocie i przenieś urządzenie kriogeniczne z ciekłego azotu do roztworu do rozmrażania tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć ryzyka dewitryfikacji.Po minucie skup się na końcówce urządzenia kriogenicznego, aby zlokalizować oocyty i ostatecznie użyj pipety do zdzierania, aby delikatnie uwolnić oocyty z urządzenia. Za pomocą pipety do strippera o średnicy 170 mikronów przenieś oocyty i niewielką objętość roztworu do rozmrażania do roztworu rozcieńczającego w pierwszym dołku z sześciodołkową płytką. Po trzech minutach przenieś oocyty do pierwszej studzienki roztworu myjącego na pięć minut.Pod koniec inkubacji przenieść oocyty do drugiego dołka roztworu płuczącego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie przenieść oocyty do odpowiedniej objętości wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej IVF na jedną godzinę i zaktualizować kartę laboratoryjną. W ciągu 12 lat 285 kobiet poddano co najmniej jednemu pobraniu komórek jajowych, co wiązało się z witryfikacją całej kohorty pobranych dojrzałych komórek jajowych. Większość z tych kobiet przeszła pojedynczą operację pobrania.35 z nich zostało poddanych wielokrotnemu odzyskiwaniu. Powody poddania się pobraniu oocytów w celu witryfikacji komórek jajowych zostały ogólnie scharakteryzowane jako medyczne inne niż rak, rak, niemedyczne i inne. Pacjenci z medycznym powodem witryfikacji komórek jajowych i pacjenci poddawani zachowaniu płodności z powodu raka byli młodsi i wykazywali wyższą liczbę pęcherzyków antralnych niż pacjenci z przyczyn niemedycznych lub innych.Ponieważ jednak średnie tempo dojrzewania było nieco niższe u pacjentek z przyczyn medycznych, średnia liczba oocytów zeszklonych była podobna w obu grupach. Około połowa pacjentów z powodów medycznych innych niż rak i większość pacjentów z innymi przyczynami do witryfikacji jaj faktycznie wróciła na ocieplenie. I odwrotnie, bardzo niewielu pacjentów, którzy przeszli proces zachowania płodności z powodu raka lub z przyczyn niemedycznych, wykorzystało swoje zeszklone oocyty do zapłodnienia in vitro.Pomimo różnic w czasie, jaki upłynął między witryfikacją a ociepleniem, wskaźnik przeżycia oocytów był podobny między grupami pacjentów, co potwierdza skuteczność i bezpieczeństwo protokołów witryfikacji i ogrzewania oocytów. Co więcej, wskaźnik przeżycia był niezależny od doświadczenia operatora witryfikacji i podgrzewania. Najważniejszymi krokami, które mogą mieć wpływ na spójność wyników, są te związane z ociepleniem.Dlatego bardzo ważne jest, aby dokładnie kontrolować objętość i temperaturę roztworów do rozmrażania. Kriokonserwacja tkanek jajnikowych jest jedyną obecnie badaną strategią jako opcja dla pacjentek przed okresem dojrzewania. Podejście to, choć obiecujące, ma istotne ograniczenia, które ograniczają jego zastosowanie.

fertility-preservation-through-oocyte-vitrification-clinical

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

MicroSecure Vitrification został opracowany jako niekomercyjny, aseptyczny system zamkniętych urządzeń do witryfikacji, który jest zgodny z dobrymi praktykami FDA w zakresie produkcji i obchodzenia się z tkankami. Ze względu na wycofanie z przemysłu hydrofobowych słomek zarodkowych, procedura witryfikacji została zmodyfikowana tak, aby obejmowała wewnętrzną uszczelkę przed standardową wewnętrzną zatyczką bawełnianą.

Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Ten manuskrypt opisuje protokół minimalnej objętości witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów za pomocą laboratoryjnych pożywek na komercyjnych podłożach. Obejmuje każdy etap, od izolacji oocytów od gonad ex vivo po witryfikację i ocieplenie.

Minimalna objętość witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów

Prezentujemy szczegóły procedur laboratoryjnych dla bezlekowej aktywacji in vitro (IVA) pęcherzyków jajnikowych u pacjentek z ciężką dysfunkcją jajników. Metoda ta może zwiększyć liczbę możliwych do pobrania oocytów na hiperstymulację jajników i korzystnie wpłynąć na zachowanie płodności u tych pacjentek.

Zachowanie płodności u pacjentek z ciężką dysfunkcją jajników

Protokół ma na celu dostarczenie standardowej metody witryfikacji oocytów dorosłych i młodych owiec. Obejmuje wszystkie etapy od przygotowania pożywki do dojrzewania in vitro do hodowli po ociepleniu. Oocyty są witryfikowane na etapie MII przy użyciu Cryotop, aby zapewnić minimalną niezbędną objętość.

Witryfikacja dojrzałych komórek jajowych pobranych in vitro z jajników dorosłych i przed okresem dojrzewania u owiec

Przedstawiono protokół witryfikacji tkanki jajnikowej, jako alternatywną metodę kriokonserwacji do powszechnie stosowanego protokołu powolnego zamrażania.

Witryfikacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania szklistego stanu agregacji

Protokół ten określa ustandaryzowane metody izolacji i przetwarzania płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych oraz niedojrzałych oocytów z procedur IVF, umożliwiając wysokiej jakości analizy molekularne i komórkowe. Te podejścia wspierają badania translacyjne dotyczące płodności, starzenia się reprodukcyjnego i dysfunkcji jajników, wykorzystując materiały zwykle odrzucane w opiece klinicznej.

Pobieranie ludzkiego płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych mieszków mieszkowych oraz niedojrzałych oocytów od osób poddawanych zapłodnieniu in vitro

Ten protokół jest używany do oceny przestrzennych i czasowych zmiennych chodu pacjentów neurologicznych/ortopedycznych i osób starszych za pomocą niedawno wprowadzonego systemu fotokomórek opartych na podłodze.

Kliniczna ocena parametrów chodu czasoprzestrzennego u pacjentów i osób starszych

Opisujemy metodę perfuzji ex vivo ludzkich przeszczepów wątroby w temperaturze subnormotermicznej (21 °C).

Funkcjonalne zachowanie i regeneracja wątroby człowieka za pomocą subnormotermicznej perfuzji maszynowej

Tutaj opisujemy technikę indukcji plwociny. Protokół ten wyjaśnia również przetwarzanie plwociny w celu przeprowadzenia różnicowej liczby komórek oraz pobrania supernatantu plwociny i komórek do dalszej analizy.

Metodologia indukcji plwociny i przetwarzania laboratoryjnego

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia wewnątrztorebkowej procedury rotary-cut (IRCP), zmodyfikowanej laparoskopowej miomektomii wewnątrztorebkowej, która sprzyja zachowaniu płodności.

Wprowadzenie wewnątrztorebkowych procedur rotary-cut (IRCP): zmodyfikowane procedury histeromyomektomii ułatwiające zachowanie płodności

Poznaj metodę witryfikacji oocytów w celu zachowania płodności, obejmującą protokoły mrożenia i odmrażania. Technika ta zapewnia skuteczne i powtarzalne wyniki kliniczne, omijając ograniczenia etyczne związane z kriokonserwacją embrionów.

Zachowanie płodności poprzez witryfikację oocytów: perspektywy kliniczne i laboratoryjne

Przeglądaj więcej filmów