Name: Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Naucz się izolować wysokiej jakości mysie miocyty przedsionkowe i komorowe metodą Langendorffa. Protokół umożliwia jednoczesne pomiary prądu wapniowego typu L i transjentów wapniowych w badaniach arytmogenności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG; Program Kliniczny Naukowiec w Medycynie Naczyniowej (PRIME), MA 2186/14-1 dla P. Tomsitsa i D. Schüttlera; VO1568/3-1, IRTG1816 i SFB1002 projekt A13 dla N. Voigta), Niemiecka Fundacja Badawcza w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości (EXC 2067/1- 390729940 do N. Voigta), Niemieckie Centrum Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym (DZHK; 81X2600255 do S. Claussa i N. Voigta; 81Z0600206 do S. Kääb), Fundacja Corona (S199/10079/2019 do S. Clauss), ERA-NET ds. Chorób Sercowo-Naczyniowych (ERA-CVD; 01KL1910 do S. Clauss), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Claussowi) oraz Fundacji Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 N. Voigtowi). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w przygotowaniu manuskryptu.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Dolnosaksońską Komisję Etyki Badań na Zwierzętach (LAVES, AZ-18/2900) i przeprowadzono zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt.
1. Przygotowania wstępne
<ol>
	<li>Przygotować 1 L 10-krotnego buforu perfuzyjnego (Tabela 1), 500 mL 1-krotnego buforu perfuzyjnego (Tabela 2), 50 mL buforu trawiennego (Tabela 3), 10 mL buforu zatrzymującego (Tabela 4), 1 L roztworu Tyrode'a (Tabela 5), po 10 mL każdego z roztworów do stopniowania stężenia wapnia (roztwór Tyrode'a z glukozą i odpowiednią ilością wapnia, zgodnie z oznaczeniem), 1 L roztworu 4-AP (Tabela 5), 100 mL roztworu do pipetowania (Tabela 6) oraz 5 mL kwasu pluronicznego zgodnie z podanymi recepturami. 
	UWAGA: Roztwory do kąpieli (roztwór Tyrode'a i roztwór 4-AP) można przygotować wcześniej (bez glukozy) i przechowywać w temperaturze +4 °C; glukozę dodaje się w dniu eksperymentu. Roztwór do pipetowania można przechowywać w temperaturze -20 °C; w dniu eksperymentu dodaje się wskaźnik wapnia, a roztwór przechowuje się następnie na lodzie do czasu użycia. 10-krotny bufor perfuzyjny można przechowywać w temperaturze pokojowej; 1-krotny bufor perfuzyjny, bufor trawienny i bufor zatrzymujący należy przygotować na świeżo w dniu eksperymentu.</li>
	<li>Włączyć łaźnię wodną oraz pompę perystaltyczną.</li>
	<li>Wypełnić wcześniej aparat Langendorffa buforem perfuzyjnym; upewnić się, że układ jest wolny od pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przygotować kaniulę aortalną, mocując ją pod mikroskopem sekcyjnym, podłączyć strzykawkę 1 mL wypełnioną buforem perfuzyjnym i usunąć powietrze poprzez przemycie kaniuli. 
	UWAGA: Niezwykle ważne jest unikanie obecności powietrza w systemie perfuzyjnym, ponieważ bezpośrednio wpływa to na perfuzję wieńcową, a tym samym na efektywność trawienia. Jeśli to konieczne, do układu można dodać pułapkę powietrzną, aby bezpiecznie zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przygotować płytki Petri z odpowiednią ilością buforu perfuzyjnego do pobierania organów i mikroskopii (bufor powinien całkowicie pokrywać organ; kilka mililitrów – w zależności od rozmiaru użytej płytki Petri – powinno być wystarczające).</li>
	<li>Przygotować 3 płytki Petri z buforem trawiennym do dysocjacji tkanki i mikroskopii; bufor powinien pokrywać organ podczas sekcji pod mikroskopem w danej płytce Petri, ilość zależy od rozmiaru płytki. Do dysocjacji użyć 3 mL dla tkanki komór oraz 1,5 mL dla tkanki przedsionków.</li>
</ol>
2. Pobranie narządów
<ol>
	<li>Wstrzyknąć myszy 0,1 mL heparyny (1 000 U/mL) d.o. za pomocą strzykawki 1 mL z kaniulą 27 G i odczekać 5-10 min.</li>
	<li>Umieścić mysz w komorze indukcyjnej wraz z niewielkim fragmentem tkaniny nasączonej około 500 µL izofluranu. Zwierzę nie powinno mieć kontaktu z tkaniną. Aby tego uniknąć, można użyć plastikowej kasety do zatapiania biopsji do przykrycia tkaniny. Po pełnym znieczuleniu zwierzęcia sprawdzić odruch cofania łapy po uciśnięciu i w momencie jego zaniku szybko uśmiercić mysz poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.</li>
	<li>Położyć mysz na plecach na platformie (np. na styropianie przykrytym ręcznikiem papierowym) i unieruchomić łapy za pomocą kaniul, aby utrzymać zwierzę w pozycji.</li>
	<li>Usunąć futro i skórę pokrywającą klatkę piersiową oraz część brzucha, wykonując czyste cięcie od dołka nadmostkowego w kierunku symfizy, a następnie otworzyć jamę brzuszną tuż pod wyrostkiem mieczowatym za pomocą nożyczek, uważając, aby nie uszkodzić żadnego narządu. Unieść mostek pęsetą chirurgiczną i przeciąć przeponę nożyczkami wzdłuż krawędzi żeber, następnie przeciąć żebra w linii pachowej przyśrodkowej i usunąć klatkę piersiową, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć osierdzie za pomocą pęsety tępym końcem i szybko wyciąć serce, unosząc je pęsetą od dołu i przecinając duże naczynia jednym cięciem nożyczek.</li>
	<li>Umieścić serce w buforze perfuzyjnym o temperaturze pokojowej i jak najszybciej przeprowadzić kaniulację aorty za pomocą igły o tępym końcu pod mikroskopem. 
	UWAGA: Usunąć wszelką tkankę płucną i tłuszczową przylegającą do narządu, nie poświęcając na to zbyt wiele czasu. Podczas kaniulacji należy upewnić się, że koniec igły nie przechodzi przez zastawkę aortalną, ponieważ uniemożliwi to dopływ buforów do tętnic wieńcowych, co pogorszy wyniki.</li>
	<li>Mocno przywiązać serce do igły fragmentem nici jedwabnej i odłączyć od strzykawki. 
	UWAGA: Cała procedura od momentu pobrania serca (przecięcia dużych naczyń) do przyszycia aorty do igły powinna trwać jak najkrócej. Zaleca się, aby czas od usunięcia serca do rozpoczęcia perfuzji nie przekraczał 90-180 s.</li>
</ol>
3. Trawienie enzymatyczne
<ol>
	<li>Po kaniulacji aorty niezwłocznie podłącz kaniulowane serce do aparatu Langendorffa, unikając dostania się powietrza do układu. 
	UWAGA: Pomocne może być pozostawienie wiszącej kropli buforu perfuzyjnego na spodzie aparatu Langendorffa oraz kropli buforu perfuzyjnego na czubku igły, aby zapobiec przedostaniu się powietrza do układu.</li>
	<li>Prowadź perfuzję serca buforem perfuzyjnym przez 1 min w temperaturze dokładnie 37 °C i przy szybkości perfuzji dokładnie 4 mL/min. 
	UWAGA: Aby uzyskać temperaturę 37 °C na końcówce igły perfuzyjnej, temperaturę kąpieli wodnej należy ustawić nieco wyżej, na około 40 °C. Powinno być to regularnie sprawdzane poprzez pomiar temperatury na końcówce perfuzyjnej.</li>
	<li>Przełącz perfuzję na bufor do trawienia i prowadź ją przez dokładnie 9 min w temperaturze dokładnie 37 °C i przy szybkości perfuzji dokładnie 4 mL/min.</li>
	<li>Przenieś strawione serce do szalki Petriego z wystarczającą ilością buforu do trawienia, aby było ono całkowicie przykryte. Następnie ostrożnie wypreparuj przedsionki i komory pod mikroskopem.</li>
	<li>Przenieś przedsionki do szalki Petriego z 1,5 mL buforu do trawienia, a komory do drugiej szalki Petriego z 3 mL buforu do trawienia.</li>
	<li>Preparowanie przedsionków
	<ol>
		<li>Ostrożnie, lecz bez zbędnej zwłoki, rozdziel przedsionki na bardzo małe fragmenty za pomocą pęsetytępej.</li>
		<li>Rozpuść tkankę, ostrożnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety 1 000 µL, która została wcześniej przycięta w celu poszerzenia otworu.</li>
		<li>Przenieś roztwór do probówki wirówkowej 15 mL i dodaj równą ilość buforu zatrzymującego (1,5 mL), ostrożnie pipetując po ściance probówki, aby zakończyć reakcję.</li>
		<li>Ostrożnie przefiltruj całe 3 mL zawiesiny komórkowo-tkankowej przez nylonową siatkę o rozmiarze oczek 200 µm, aby usunąć pozostałe większe fragmenty tkanki, które nie zostały w pełni strawione. 
		UWAGA: Prawidłowe trawienie nie powinno pozostawiać niemal żadnych stałych grudek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparowanie komór
	<ol>
		<li>Szybko posiekaj tkankę komór na bardzo małe fragmenty za pomocą nożyczek do sekcji, a następnie pipetuj w górę i w dół do rozpuszczenia. Do pipetowania użyj innej końcówki 1 000 µL, którą można skrócić w celu poszerzenia otworu.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórkowo-tkankową do probówki wirówkowej 15 mL i dodaj równą ilość buforu zatrzymującego (3 mL), ostrożnie pipetując po ściance probówki, aby zakończyć reakcję.</li>
		<li>Ostrożnie przefiltruj całe 6 mL zawiesiny komórkowo-tkankowej przez nylonową siatkę o rozmiarze oczek 200 µm, aby usunąć większe fragmenty tkanki, które nie zostały w pełni strawione. 
		UWAGA: Prawidłowe trawienie nie powinno pozostawiać niemal żadnych stałych grudek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw obie probówki (zawiesinę komórek przedsionkowych i komorowych) na blacie w temperaturze pokojowej przez 6 min w celu osadzenia.</li>
	<li>Wirować obie probówki 15 mL przy 5 x g przez 2 min.</li>
</ol>
4. Ponowne wprowadzenie wapnia
UWAGA: Poniższe kroki są identyczne dla komórek przedsionkowych i komórkowych (chyba że zaznaczono inaczej) i są wykonywane w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Usunąć nadosad za pomocą plastikowej pipety Pasteura i ostrożnie resuspendować osad w 10 mL bezwapniowego roztworu Tyrode'a.</li>
	<li>Pozostawić komórki na 8 min w celu sedymentacji.</li>
	<li>Wirować z prędkością 5 x g przez 1 min (tylko w przypadku komórek przedsionków; dla komórek komór serca wystarczająca jest sama sedymentacja).</li>
	<li>Usunąć nadosad i ostrożnie resuspendować osad w 10 mL roztworu Tyrode'a o stężeniu wapnia 100 µM.</li>
	<li>Pozostawić komórki na 8 min w celu sedymentacji.</li>
	<li>Wirować z prędkością 5 x g przez 1 min (tylko w przypadku komórek przedsionków; dla komórek komór serca wystarczająca jest sama sedymentacja).</li>
	<li>Usunąć nadosad i ostrożnie resuspendować osad w 10 mL roztworu Tyrode'a o stężeniu wapnia 400 µM.</li>
	<li>Pozostawić komórki na 8 min w celu sedymentacji.</li>
	<li>Wirować z prędkością 5 x g przez 1 min (tylko w przypadku komórek przedsionków; dla komórek komór serca wystarczająca jest sama sedymentacja).</li>
	<li>Usunąć nadosad i ostrożnie resuspendować osad w 1 mL (przedsionki) / 5 mL (komory) roztworu Tyrode'a o stężeniu wapnia 1 mM.</li>
</ol>
5. Obciążanie miocytów fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia Fluo-3 AM
UWAGA: Ze względu na światłoczułość fluorescencyjnego wskaźnika wapnia, następne kroki należy przeprowadzać w warunkach ochrony przed światłem (np. poprzez owinięcie probówek folią aluminiową).
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy Fluo-3 AM, dodając 44 µL 20% pluronic F-127 w bezwodnym DMSO do 50 µg Fluo-3AM (można przechowywać w -20 °C w ciemności).</li>
	<li>Dodać 10 µL roztworu zapasowego Fluo-3 AM do 1 mL zawiesiny komórkowej i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Wirować przy 5 x g przez 1 min.</li>
	<li>Usunąć nadsącz za pomocą plastikowej pipety Pasteura i resuspendować osad w odpowiedniej ilości roztworu kąpielowego, aby uzyskać właściwe stężenie robocze (1-5 mL roztworu kąpielowego, zależnie od gęstości komórek).</li>
	<li>Pozostawić na 30 min w celu deestryfikacji przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
</ol>
6. Jednoczesne pomiary metodą patch-clamp oraz epifluorescencyjne pomiary przejściowych stężeń Ca2+, zgodnie z wcześniejszym opisem16
UWAGA: Pomiary metodą patch-clamp nie są tematem niniejszego artykułu; zainteresowanego czytelnika odsyłamy do głównych publikacji zawierających szczegółowe opisy tej metody17,18,19,20,21,22. Niemniej jednak, dla lepszego ogólnego zrozumienia, przedstawiono podsumowanie protokołu pomiaru prądów wapniowych typu L wraz z indukowanymi prądem przejściami wapniowymi.
<ol>
	<li>Przenieś miocyty do komory pomiarowej i poddaj je superfuzji roztworem kąpielowym w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zablokuj prądy potasowe, dodając do roztworu kąpielowego 4-aminopirydynę oraz chlorek baru, zgodnie z Tabelą 5.</li>
	<li>Upewnij się, że borokrzemianowe mikroelektrody mają oporność końcówki wynoszącą 2-5 MΩ i są wypełnione roztworem do pipet (Tabela 6).</li>
	<li>Skonfiguruj pomiary w sposób umożliwiający jednoczesną rejestrację sygnałów elektrycznych i epifluorescencji. W celu pomiaru prądu Ca2+ typu L stosuje się tryb clamp napięciowy (voltage clamp) z protokołem utrzymującym potencjał komórki na poziomie -80 mV, rampą impulsową 600 ms do -40 mV w celu inaktywacji szybkiego prądu Na+, a następnie impulsem testowym 100 ms do +10 mV przy częstotliwości 0,5 Hz (Rysunek 2).</li>
	<li>Użyj wzbudzenia przy 488 nm i detekcji światła emitowanego przy &lt;520 nm, a następnie przekształć wynik na [Ca2+]I, przyjmując, że 
	<img alt="Wzór na równowagę statyczną: \([Ca^{2+}]_i = k_d \left(\frac{F}{F_{max} - F}\right)\)." src="/files/ftp_upload/61964/61964equ01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	Gdzie kd = stała dysocjacji Fluo-3 (864 nM), F = fluorescencja Fluo-3; Fmax = fluorescencja nasycona Ca2+ uzyskana na końcu każdego eksperymentu19.</li>
</ol>

<ol><li>Camm, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation%3A+the+Task+force+for+the+management+of+atrial+fibrillation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Europace%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).</li>
<li>Chugh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+epidemiology+of+atrial+fibrillation%3A+a+global+burden+of+disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study.</a> Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).</li>
<li>Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bell+tolls+%3A+Refining+risk+assessment+for+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death.</a> Current Cardiology Reports. 21 (9), 106(2019).</li>
<li>Kirchhof, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2016+ESC+Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation+developed+in+collaboration+with+EACTS%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS.</a> European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).</li>
<li>Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antiarrhythmic+drugs+for+treatment+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation.</a> Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).</li>
<li>Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+safety+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cardiac safety assays.</a> Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).</li>
<li>Schüttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li>
<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+arrhythmia%3A+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li>
<li>Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolating+atrial+cells+from+large+mammals+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).</li>
<li>Jansen, H. J., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+atrial+myocytes+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of atrial myocytes from adult mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59588(2019).</li>
<li>Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+culture+of+atrial+myocytes%2C+ventricular+myocytes%2C+and+non-myocytes+from+an+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61224(2020).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Report%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Report. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Köhncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).</li>
<li>Brandenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubule+junctions+activate+atrial+Ca%282%2B%29+release+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1227(2018).</li>
<li>Hofhuis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+links+excitation-contraction+coupling+to+structure+and+maintenance+of+the+cardiac+transverse-axial+tubule+system%5BTitle%5D)+AND+%22Europace%22%5BJournal%5D)">Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system.</a> Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), e50235(2013).</li>
<li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+I%28K%2CACh%29+channels+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart.</a> Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).</li>
<li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).</li>
<li>Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).</li>
<li>Fakuade, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+atrial+cytosolic+calcium+handling+contributes+to+the+development+of+postoperative+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. , (2020).</li>
<li>Chen, W., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+inflammatory+and+fibrogenic+pathways+in+heart+failure+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging.</a> Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).</li>
<li>Plačkić, J., Kockskämper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).</li>
<li>Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).</li>
<li>Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).</li>
<li>Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((With+or+without+Langendorff%3A+A+new+method+for+adult+myocyte+isolation+to+be+tested+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time.</a> Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).</li>
<li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution%2C+contraction%2C+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experiment+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+optical+action+potential+measurement+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiment%22%5BJournal%5D)">Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Visual Experiment. , e61890(2020).</li>
</ol>

W tym artykule przedstawiono łatwy i funkcjonalny sposób uzyskiwania wysokiej jakości miocytów przedsionkowych i komorowych od tej samej myszy do badań typu patch-clamp z jednoczesnym zapisem przejściowych wapnia. Jakość uzyskanych danych w dużym stopniu zależy od jakości izolacji komórki. Jak wspomniano powyżej, wiele metod izolacji mysich kardiomiocytów zostało opisanych wcześniej 9,10,11,12....

Zaburzenia rytmu serca są powszechne i stanowią obecnie jedno z głównych wyzwań związanych z opieką zdrowotną, ponieważ dotykają milionów ludzi na całym świecie. Arytmie są związane z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością1,2 i stanowią podstawową przyczynę większości nagłych zgonów sercowych3. Dotychczasowe metody leczenia poprawiły przeżywalność pacjentów, ale nadal są to głównie leczenie objawowe, a nie ukierunkowane na mechanizmy leżące u ich podstaw. W związku z tym zabiegi te mają ograniczoną skuteczność i często mogą powodować poważne skutki uboczne4,5,6. Udoskonalenie obecnych opcji leczenia wymaga wglądu w leżącą u ich podstaw patofizjologię, co stwarza potrzebę odpowiednich modeli do badań. Małe modele zwierzęce - a w szczególności modele mysie - odgrywają kluczową rolę w badaniach nad arytmią, ponieważ pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy, na przykład genetyczny wpływ na elektrofizjologię komórkową, funkcję kanałów jonowych lub obchodzenie się z wapniem7,8.
W tym celu potrzebne są izolowane kardiomiocyty przedsionkowe i komorowe o wystarczającej ilości i żywotności. Szerokie spektrum różnych podejść do izolacji w celu uzyskania miocytów przedsionków i komór zostało wcześniej opisane9,10,11,12,13, a niektóre grupy przedstawiły dane z jednoczesnych pomiarów stanów przejściowych wapnia indukowanych prądem L i prądem wapniowym z dowolnego atrial14 lub Ventricular15 mysich kardiomiocytów. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie ma dostępnych danych dotyczących pomiarów przedsionków i komór u jednego zwierzęcia. Naukowcy koncentrują się na szerokiej gamie tematów, od elektrofizjologii po proteomikę, badania funkcjonalne, takie jak kurczliwość komórek lub interakcje białek, funkcja mitochondriów lub genetyka – wszystkie wymagają izolowanych kardiomiocytów. W związku z tym wiele z opublikowanych protokołów nie zostało opracowanych specjalnie do badań z użyciem klamry krosowej, co prowadzi do ograniczonych plonów i niewystarczającej jakości komórek do badań z użyciem klamry. W związku z tym nie można przeprowadzić jednoczesnych pomiarów patch clamp i przejściowych komórek przedsionków i komór wyizolowanych od jednego zwierzęcia przy użyciu ustalonych protokołów.
Izolacja mysich - szczególnie przedsionkowych - miocytów do eksperymentów z klamrami pozostaje wyzwaniem. W artykule przedstawiono prostą i szybką metodę izolacji wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach wstecznych, która następnie umożliwia jednoczesne pomiary zarówno prądu błonowego netto, jak i indukowanych prądem stanów przejściowych wapnia od jednego zwierzęcia. W artykule omówiono protokół izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych pochodzących od myszy typu dzikiego i myszy z mutacjami genetycznymi. Protokół ten może być stosowany zarówno u samców, jak i samic myszy. Izolację miocytów, obrazy i reprezentatywne wyniki opisane poniżej uzyskano od myszy C57Bl / 6 typu dzikiego w wieku 6 (± 1) miesięcy. Niemniej jednak protokół ten jest z powodzeniem stosowany u myszy w różnym wieku, od 2 do 24 miesięcy o różnych genotypach. Rysunek 1 pokazuje ustawienie izolacji i zbliżenie kaniulowanego serca podczas perfuzji enzymów.

<table><tbody><tr><td>2,3-butanodion, monoksym</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td></td></tr>, <tr><td>kaniula 27G</td>, <td>Servoprax</td><td>L10220</td><td></td></tr>, <tr><td>4-aminopirydyna</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td></td></tr>, <tr><td>bezwodna DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D12345</td><td></td></tr>, <tr><td>kaniula aortalna</td><td>Radnoti</td><td>130163-20</td><td></td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze chirurgiczne</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650915-4</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla cieląt bydlęcych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12133C</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cyrkulacyjna łaźnia z podgrzewaną wodą</td><td>Julabo</td><td>ME</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington</td><td>LS994177</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do badań</td><td>klinicznych Kent Scientific INS600124</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-aspartat K+-sól</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1242</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Guanozyna 5&prime;-trifosforan trifos sól</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Cewka grzewcza</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Ratiopharm</td><td>25.000 IE/5ml</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td></td></tr><tr><td>komora indukcyjna</td><td>CWE włączona</td><td>13-40020</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Cp-pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>Komora serca z płaszczem</td><td>Radnoti</td><td>130160</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>MgCl x 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 x 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 x 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa (200 &mikro; m)</td> <td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>pipeta Pasteura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z331759</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petri</td><td>Thermo Fisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Kwas Pluronowy F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Probenecyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>Pompa rolkowa</td><td>Ismatec</td><td>ISM597D</td><td></td></tr><tr><td>chirurgiczna kleszcze</td><td>Nożyczki chirurgiczne Kent Scientific</td><td>INS650908-4</td><td></td></tr><tr><td>Jedwab do szycia</td> Kent <td></td><td></td> Scientific INS700540 Fine Science Tools NC9416241 <td></td></tr><tr><td>strzykawka</td><td>Merck</td><td>Z683531-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych ca2+ i prądu wapniowego typu l

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Modele myszy odgrywają kluczową rolę w badaniach nad arytmią i pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy, w tym zmienioną funkcję kanału jonowego i obsługę wapnia. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty przedsionkowe lub komorowe do wykonywania pomiarów typu patch-clamp lub do badania nieprawidłowości w obchodzeniu się z wapniem. Jednak ograniczona wydajność wysokiej jakości kardiomiocytów uzyskana za pomocą obecnych protokołów izolacji nie pozwala na oba pomiary na tej samej myszy. W artykule opisano metodę izolowania wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, w celu późniejszych jednoczesnych pomiarów stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L od jednego zwierzęcia. Uzyskuje się serca myszy, a aorta jest szybko kaniulowana w celu usunięcia krwi. Serca są następnie najpierw perfundowane roztworem bezwapniowym (37 °C) w celu dysocjacji tkanki na poziomie interkalowanych dysków, a następnie roztworem enzymu zawierającym niewielką ilość wapnia w celu zakłócenia macierzy zewnątrzkomórkowej (37 °C). Strawione serce jest następnie preparowane na przedsionki i komory. Próbki tkanek są krojone na małe kawałki i rozpuszczane przez ostrożne pipetowanie w górę i w dół. Trawienie enzymatyczne zostaje zatrzymane, a komórki są stopniowo ponownie wprowadzane do fizjologicznych stężeń wapnia. Po obciążeniu fluorescencyjnym wskaźnikiemCa2+ izolowane kardiomiocyty są przygotowywane do jednoczesnego pomiaru prądów wapnia i stanów nieustalonych. Dodatkowo omówiono pułapki izolacji i przedstawiono protokoły patch-clamp oraz reprezentatywne ślady prądów wapniowych typu L z jednoczesnymi pomiarami przejściowych wapnia w mysich miocytach przedsionkowych i komorowych izolowanych w sposób opisany powyżej.

Wydajność izolacji określa się po ponownym wprowadzeniu wapnia, przenosząc 10 µL zawiesiny komórkowej na szkiełko mikroskopowe. Za wystarczającą wydajność, powszechnie uzyskiwaną przy zastosowaniu tego protokołu, uznaje się obecność więcej niż 100 żywych, pręcikowatych, niekurczliwych komórek/10 µL w przypadku izolacji komórek przedsionkowych oraz więcej niż 1 000 żywych, pręcikowatych, niekurczliwych komórek/10 µL w przypadku izolacji komórek komorowych. Komórki przedsionkowe uzyskane za pomocą tego protokołu wykazywały...

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Eksperymenty z opaską krosową i obrazowaniem wapnia są pracochłonne, czasochłonne i wymagające. Protokół ten zapewnia wygodną metodę izolacji wysokiej jakości mysich kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych, odpowiednią do eksperymentów z klamrą plastrową i jednocześnie wykonywanego obrazowania wapnia. Główną zaletą tego protokołu jest to, że możemy uzyskać kardiomiocyty przedsionkowe i komorowe od tego samego zwierzęcia.Izolacja mysich kardiomiocytów przedsionkowych jest szczególnie trudna i stanowiła czynnik ograniczający dla poprzednich eksperymentów. Zacznij od wstępnego napełnienia aparatu Langendorffa buforem perfuzyjnym i upewnienia się, że jest wolny od powietrza. Zamocuj kaniulę aorty pod mikroskopem preparacyjnym i połącz ją z jednomililitrową strzykawką wypełnioną buforem perfuzyjnym.Po usunięciu serca od myszy poddanej eutanazji, umieść serce w buforze perfuzyjnym o temperaturze pokojowej i jak najszybciej kaniuluj aortę igłą pod mikroskopem. Mocno przywiąż serce do igły kawałkiem jedwabiu do szycia i odłącz strzykawkę. Po kanelacji aorty należy natychmiast podłączyć kaniulowane serce do aparatu Langendorffa, unikając przedostawania się powietrza do systemu.Perfuzję serca za pomocą buforu perfuzyjnego przez jedną minutę dokładnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i szybkości perfuzji czterech mililitrów na minutę. Przełącz się z buforu perfuzyjnego na mineralizacyjny i perfuzjuj przez dokładnie dziewięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i szybkości perfuzji czterech mililitrów na minutę. Po zakończeniu przenieś strawione serce na szalkę Petriego z wystarczającą ilością buforu trawiącego, aby było całkowicie przykryte.Następnie ostrożnie wypreparuj przedsionki i komory pod mikroskopem. Przenieś przedsionki na szalkę Petriego z 1,5 mililitra buforu wytrawiającego, a komory na inną szalkę Petriego z trzema mililitrami buforu wytrawiającego. Ostrożnie, ale szybko rozsuń przedsionki na drobne kawałki Za pomocą kleszczy.Rozpuść tkankę, ostrożnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, która została wcześniej przycięta w celu poszerzenia otworu końcówki. Przenieść roztwór do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dodać równoważną ilość buforu zatrzymującego, pipetując bok probówki. Przepuść wszystkie trzy mililitry roztworu przez nylonową siatkę o grubości 200 mikrometrów, aby usunąć pozostałe większe kawałki tkanki, które nie zostały w pełni strawione.Aby przeprowadzić sekcję komorową, pokrój tkankę komorową na drobne kawałki za pomocą nożyczek preparacyjnych lub kleszczy i pipetuj w górę iw dół kolejną końcówką pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby się rozpuścić. Przenieś roztwór komórek i tkanek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj równoważną ilość buforu zatrzymującego, ostrożnie pipetując go po boku probówki, aby zakończyć reakcję. Przepuść wszystkie sześć mililitrów roztworu komórkowego i tkankowego przez nylonową siatkę o grubości 200 mikrometrów, aby usunąć większe kawałki, które nie zostały w pełni strawione.Pozostaw zawiesiny komórek przedsionkowych i komorowych na ławce w temperaturze pokojowej na sześć minut, aby się uspokoiły. Następnie odwiruj probówki w temperaturze 5G przez dwie minuty. Wyrzuć supernatanty za pomocą plastikowej pipety Pasteura i ostrożnie ponownie zawieś granulki komórek w 10 mililitrach bezwapniowego roztworu Tyrode.Pozostaw komórki przedsionkowe i komorowe na osiem minut w celu sedymentacji. Odwirować komórki przedsionkowe przy 5G przez jedną minutę. Następnie wyrzuć supernatanty z obu próbek komórkowych i ostrożnie ponownie zawieś granulki w 10 mililitrach roztworu Tyrode'a ze 100 mikromolowym wapniem.Pozostaw komórki na osiem minut do sedymentacji, a następnie powtórz wirowanie komórek przedsionkowych. Wyrzucić supernatanty i ostrożnie ponownie zawiesić osady komórek w 10 mililitrach roztworu Tyrode'a z 400 mikromolami wapnia. Powtórz ten proces jeszcze raz, ponownie zawieszając komórki w roztworze Tyrode'a z jednym milimolowym wapniem.Wszystkie komórki przedsionkowe są małe, a ich pojemność wynosi od około 35 do 100 pikofaradów. Pokazano tutaj typową komórkę z pracującego mięśnia sercowego przedsionka. Miocyty komorowe mają kształt bardziej pręcikowatych i są większe, a pojemności komórek wahają się od 100 do około 400 pikofaradów.Przedstawiono przykłady pomiarów prądu wapniowego typu L z jednoczesnym cytozolowym stanem przejściowym wapnia z jednego miocytu przedsionkowego i jednego miocytu komorowego. Zanim spróbujesz tej techniki, upewnij się, że ćwiczysz pobieranie organów. Bardzo ważne jest, aby krok ten został wykonany szybko, a wszystkie nacięcia tkanek zostały wykonane we właściwych miejscach.Kiedy pobieranie narządów odbywa się w powtarzalnej jakości, poświęć trochę czasu na doskonalenie kaniulacji. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu nadają się do pomiarów za pomocą zacisków krosowych. Ponadto można je nasycić barwnikami fluorescencyjnymi, co pozwala na szeroki zakres eksperymentów obrazowych.

isolation-high-quality-murine-atrial-ventricular-myocytes-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Naucz się izolować wysokiej jakości mysie miocyty przedsionkowe i komorowe metodą Langendorffa. Protokół umożliwia jednoczesne pomiary prądu wapniowego typu L i transjentów wapniowych w badaniach arytmogenności.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca²⁺ i prądu wapniowego typu L

Przeglądaj więcej filmów