Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Eksperymenty z opaską krosową i obrazowaniem wapnia są pracochłonne, czasochłonne i wymagające. Protokół ten zapewnia wygodną metodę izolacji wysokiej jakości mysich kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych, odpowiednią do eksperymentów z klamrą plastrową i jednocześnie wykonywanego obrazowania wapnia. Główną zaletą tego protokołu jest to, że możemy uzyskać kardiomiocyty przedsionkowe i komorowe od tego samego zwierzęcia.

Izolacja mysich kardiomiocytów przedsionkowych jest szczególnie trudna i stanowiła czynnik ograniczający dla poprzednich eksperymentów. Zacznij od wstępnego napełnienia aparatu Langendorffa buforem perfuzyjnym i upewnienia się, że jest wolny od powietrza. Zamocuj kaniulę aorty pod mikroskopem preparacyjnym i połącz ją z jednomililitrową strzykawką wypełnioną buforem perfuzyjnym.

Po usunięciu serca od myszy poddanej eutanazji, umieść serce w buforze perfuzyjnym o temperaturze pokojowej i jak najszybciej kaniuluj aortę igłą pod mikroskopem. Mocno przywiąż serce do igły kawałkiem jedwabiu do szycia i odłącz strzykawkę. Po kanelacji aorty należy natychmiast podłączyć kaniulowane serce do aparatu Langendorffa, unikając przedostawania się powietrza do systemu.

Perfuzję serca za pomocą buforu perfuzyjnego przez jedną minutę dokładnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i szybkości perfuzji czterech mililitrów na minutę. Przełącz się z buforu perfuzyjnego na mineralizacyjny i perfuzjuj przez dokładnie dziewięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i szybkości perfuzji czterech mililitrów na minutę. Po zakończeniu przenieś strawione serce na szalkę Petriego z wystarczającą ilością buforu trawiącego, aby było całkowicie przykryte.

Następnie ostrożnie wypreparuj przedsionki i komory pod mikroskopem. Przenieś przedsionki na szalkę Petriego z 1,5 mililitra buforu wytrawiającego, a komory na inną szalkę Petriego z trzema mililitrami buforu wytrawiającego. Ostrożnie, ale szybko rozsuń przedsionki na drobne kawałki Za pomocą kleszczy.

Rozpuść tkankę, ostrożnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, która została wcześniej przycięta w celu poszerzenia otworu końcówki. Przenieść roztwór do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dodać równoważną ilość buforu zatrzymującego, pipetując bok probówki. Przepuść wszystkie trzy mililitry roztworu przez nylonową siatkę o grubości 200 mikrometrów, aby usunąć pozostałe większe kawałki tkanki, które nie zostały w pełni strawione.

Aby przeprowadzić sekcję komorową, pokrój tkankę komorową na drobne kawałki za pomocą nożyczek preparacyjnych lub kleszczy i pipetuj w górę iw dół kolejną końcówką pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby się rozpuścić. Przenieś roztwór komórek i tkanek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj równoważną ilość buforu zatrzymującego, ostrożnie pipetując go po boku probówki, aby zakończyć reakcję. Przepuść wszystkie sześć mililitrów roztworu komórkowego i tkankowego przez nylonową siatkę o grubości 200 mikrometrów, aby usunąć większe kawałki, które nie zostały w pełni strawione.

Pozostaw zawiesiny komórek przedsionkowych i komorowych na ławce w temperaturze pokojowej na sześć minut, aby się uspokoiły. Następnie odwiruj probówki w temperaturze 5G przez dwie minuty. Wyrzuć supernatanty za pomocą plastikowej pipety Pasteura i ostrożnie ponownie zawieś granulki komórek w 10 mililitrach bezwapniowego roztworu Tyrode.

Pozostaw komórki przedsionkowe i komorowe na osiem minut w celu sedymentacji. Odwirować komórki przedsionkowe przy 5G przez jedną minutę. Następnie wyrzuć supernatanty z obu próbek komórkowych i ostrożnie ponownie zawieś granulki w 10 mililitrach roztworu Tyrode'a ze 100 mikromolowym wapniem.

Pozostaw komórki na osiem minut do sedymentacji, a następnie powtórz wirowanie komórek przedsionkowych. Wyrzucić supernatanty i ostrożnie ponownie zawiesić osady komórek w 10 mililitrach roztworu Tyrode'a z 400 mikromolami wapnia. Powtórz ten proces jeszcze raz, ponownie zawieszając komórki w roztworze Tyrode'a z jednym milimolowym wapniem.

Wszystkie komórki przedsionkowe są małe, a ich pojemność wynosi od około 35 do 100 pikofaradów. Pokazano tutaj typową komórkę z pracującego mięśnia sercowego przedsionka. Miocyty komorowe mają kształt bardziej pręcikowatych i są większe, a pojemności komórek wahają się od 100 do około 400 pikofaradów.

Przedstawiono przykłady pomiarów prądu wapniowego typu L z jednoczesnym cytozolowym stanem przejściowym wapnia z jednego miocytu przedsionkowego i jednego miocytu komorowego. Zanim spróbujesz tej techniki, upewnij się, że ćwiczysz pobieranie organów. Bardzo ważne jest, aby krok ten został wykonany szybko, a wszystkie nacięcia tkanek zostały wykonane we właściwych miejscach.

Kiedy pobieranie narządów odbywa się w powtarzalnej jakości, poświęć trochę czasu na doskonalenie kaniulacji. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu nadają się do pomiarów za pomocą zacisków krosowych. Ponadto można je nasycić barwnikami fluorescencyjnymi, co pozwala na szeroki zakres eksperymentów obrazowych.