Modulacja molekularna przez specyficzne shRNA dostarczane przez lentiwirusa w neuronach zestresowanych retikulum endoplazmatycznym

Podejście to może być stosowane w modelach systemów komórkowych stresu retikulum endoplazmatycznego poprzez manipulowanie ekspresją molekularną dalszych składników pary. Główną zaletą tej techniki jest usunięcie wpływu sparowanej sygnalizacji poprzez wizualizację i pomiar ścieżek neuronowych. Metoda ta może przyczynić się do zrozumienia molekularnych podstaw przejścia między ostrymi i przewlekłymi fazami stresu ER w różnych modelach chorób neurodegeneracyjnych poza gangliozydozą GM2 Na początek wypreparuj tkankę pod 20-krotnym szkłem powiększającym za pomocą dwóch kleszczy z cienką końcówką numer pięć, oddzielających korę czołową od opon mózgowych.

Przenieś korę czołową do 15-mililitrowej stożkowej rurki i inkubuj tkankę z trzema do czterech mililitrami trypsyny EDTA przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu trawienia chemicznego. Następnie umyj go trzykrotnie zrównoważonym roztworem soli Hank's bez jonów wapnia i magnezu oraz 0,1% glukozy. Mechanicznie zdysocjuj tkankę 10 razy, pipetując w górę iw dół za pomocą końcówki o pojemności 1 000 mikrolitrów w DMEM plus 10% FCS.

Odwirować homogenat o stężeniu 100 G przez jedną minutę, zebrać supernatant i uzupełnić pozostałą objętość w 1 000 mikrolitrów. Zawiesinę komórkową należy umieścić na szalkach do hodowli komórkowych o gęstości 520 komórek na milimetr kwadratowy z dwoma mililitrami DMEM zawierającymi 10% FCS, 1% streptomycyny penicyliny i 1% dodatku aminokwasów egzogennych. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku z 5% dwutlenkiem węgla przez dwie godziny.

Aby umożliwić różnicowanie komórek nerwowych, zmień podłoże na pożywkę neurobazalną bez surowicy za pomocą suplementu bez surowicy. Utrzymuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla do czasu zabiegu. Do wyżarzania wymieszaj dwa jednoniciowe oligonukleotydy z uzupełniającymi sekwencjami w równych ilościach molowych.

Podgrzewaj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Przenieść próbki z bloku grzewczego i rozcieńczyć otrzymany produkt do końcowego stężenia 0,5 mikromola. Aby sklonować shRNA, wstaw do wektora lentiwirusowego pLKO.

3G, trawić jeden mikrogram wektora za pomocą enzymów restrykcyjnych EcoR1 i PAC1. Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować reakcję przez trzy do czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W celu podwiązania wymieszaj strawiony wektor i wprowadź go w stosunku molowym 3:1.

Inkubuj go z ligazą T4 i buforem ligazy przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza. Następnie wymieszaj składnik E.coli z całkowitą objętością reakcji ligacji i schładzaj go na lodzie przez 15 minut. Umieść go w kąpieli o temperaturze 42 stopni Celsjusza na dwie minuty, a następnie ponownie schładzaj na lodzie przez 15 minut.

Przenieś całkowitą objętość poddaną szokowi cieplnemu do 15-mililitrowej probówki i uzupełnij objętość do 1 000 mikrolitrów płynnym medium Luria-Bertani lub L-B. Potrząsaj bakteriami przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 330 obr./min. Wirówka, która spotkała się z 5 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wyrzucić 900 mikrolitrów supernatantu i użyć pozostałego supernatantu do ponownego zawieszenia osadu. Rozprowadzić zawiesinę bakterii równomiernie na stałej płytce ampicyliny L-B i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz pojedynczą kolonię, aby przenieść ją do 15-mililitrowej probówki z 10 mililitrami płynnego podłoża L-B i ampicyliny.

Wstrząśnij bakteriami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy około 330 obr./min i odwiruj kulturę, aby granulować bakterie w temperaturze 5 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu należy zakonserwować osad bakteryjny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. 24 godziny przed transfekcją wysiewaj od 1 do 5 milionów komórek HEK-293 do 100-milimetrowych szalek hodowlanych.

Wymieszaj 14 mikrogramów wektora pKLO. 3G ze specyficzną wkładką, 10,5 mikrograma plazmidu pakującego psPAX i 3,5 mikrograma plazmidu otoczkowego pMD2. Rozcieńczyć 45 mikrolitrów odczynnika do transfekcji plazmidu w 700 mikrolitrach pożywki o zredukowanej surowicy i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie połącz mieszaninę DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji plazmidu, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po transfekcji należy zmienić pożywkę w naczyniu hodowlanym komórek HEK-293 na świeżą pożywkę i dodawać kroplami całą objętość roztworu DNA. Delikatnie kołysz naczyniem i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 48 do 72 godzin, aby umożliwić shRNA osiągnięcie optymalnej transdukcji.

Zebrać pożywkę z lentiwirusem i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przefiltrować wirusowy supernatant za pomocą nylonowej membrany o grubości 0,45 mikrometra i poddzielić jeden milimetr przepływu. Wirować przy 17 000 g przez cztery godziny.

Odrzucić supernatant i zachować osad. Pozostaw niewidoczną pelety do wyschnięcia, a po wysuszeniu przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zainfekuj pierwotne kultury neuronów korowych specyficznymi oligonukleotydami shRNA, celując w trzy główne UTR kalcyneuryny A-alfa lub CHOP i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez jeden dzień.

Następnie dodać roztwór podstawowy GM2 do pożywki szalki hodowlanej o końcowym stężeniu dwóch mikromoli i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 16, 24 i 48 godzin. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu i 120-milimolowej sacharozy w PBS przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umyj je PBS. Dodaj roztwór przepuszczalny przez pięć minut i przemyj PBS.

Użyj 5% BSA rozcieńczonego w PBS przez 45 minut, aby umożliwić zablokowanie. Następnie inkubować z przeciwciałem anty-MAP2 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po dwukrotnym przemyciu komórek PBS pod koniec czasu inkubacji, inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę.

Zamontuj okulary po umyciu komórek PBS. Po uzyskaniu obrazów za pomocą mikroskopu odwróconego epifluorescencji załaduj obraz, aby uzyskać ImageJ i odejmij tło, klikając Proces, a następnie Odejmij tło. Kliknij Obraz, Dostosuj, Próg, aby dostosować minimalne wartości, umożliwiając odróżnienie ścieżki i niektórych śladów.

Usuń somy za pomocą zaznaczenia odręcznego. Wybierz Ślady i kliknij Edytuj, Zaznaczenie, Utwórz zaznaczenie. Uzyskaj zwrot z inwestycji, klikając Control i T wyboru i zachowaj go.

Otwórz oryginalny obraz. Kliknij panel Menedżer zwrotu z inwestycji i wybierz początkowy zwrot z inwestycji. Następnie kliknij oryginalny obraz.

Gdy ROI zostanie obrysowany na obrazie, naciśnij Control i M, aby przetworzyć analizę statystyczną. Podjęto tutaj próbę sprawdzenia, czy wyciszenie dalszych komponentów 2pERK wpływa na fazę przejściową odpowiedzi niesfałdowanego białka w modelu komórki stresu ER. Gen kalcyneuryny A-alfa i gen CHOP zostały wyciszone przez dwie specyficzne sekwencje shRNA w pierwotnej hodowli komórek neuronowych na jeden dzień.

Wyrażenie jest analizowane przez Western blot. Obserwuje się wyraźne zahamowanie wzrostu kalcyneuryny A-alfa za pośrednictwem stresu ER i CHOP w komórkach knockdown. Zbadano możliwy związek stresu ER wywołanego akumulacją GM2 ze zwyrodnieniem neuronów, przeprowadzając barwienie immunologiczne MAP2 pierwotnych kultur neuronalnych.

Zanik neurytów znacznie wzrasta po wywołaniu stresu ER przez inkubację GM2 w ciągu 16 do 48 godzin. Wyciszenie ekspresji kalcyneuryny A-alfa znacznie zwiększa atrofię neurytów, szczególnie po 16 godzinach akumulacji GM2 w porównaniu z grupami nieleczonymi GM2. W ten sposób knockdown kalcyneuryny A-alfa przyspieszył proces degeneracji neuronów, potwierdzając pro-przeżyciowy efekt kalcyneuryny we wczesnej fazie niesfałdowanej odpowiedzi białkowej.

I odwrotnie, knockdown CHOP spowodował znacznie zmniejszony zanik neurytów w porównaniu z grupą kontrolną dokładnie po 16 do 24 godzinach. protokół komórkowy z właściwą pierwotną hodowlą komórkową i uzyskaniem 90 lub więcej procent zakażonych komórek odpowiednim lentiwirusem. Ponieważ utrata aksonu końcowego neuronalnego jest pierwszym krokiem, który określamy w naszym procesie, można to również ocenić, wykonując test.

Technika ta pozwala naszej grupie i innym ocenić niektóre cząsteczki jako potencjalne narzędzia terapeutyczne.