Name: Modulacja molekularna przez specyficzne shRNA dostarczane przez lentiwirusa w neuronach zestresowanych retikulum endoplazmatycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj technikę shRNA dostarczanego przez lentiwirusa do badania stresu retikulum endoplazmatycznego w neuronach korowych. Ta metoda pozwala analizować rolę kalcyneuryny i CHOP w neurodegeneracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Gonzalo Quasollo za jego nieocenioną pomoc w obrazowaniu oraz dr Andrei Pellegrini za wsparcie techniczne w hodowli komórek.
Badania te były wspierane przez granty od: National Institute of Health, USA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 between UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) oraz z Narodowej Agencji Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentyna (ANPCyT, PICT 2017 #0618).

Procedury na zwierzętach są wykonywane zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Przewodnika Narodowego Instytutu Zdrowia dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych. Zgody na przeprowadzenie badania udziela Komisja ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki (CICUAL) INIMEC-CONICET-UNC (uchwały nr 014/2017 B i 006/2017 A).
1. Pierwotne hodowle neuronów korowych szczurów
<ol>
	<li>Znieczulenie ciężarnych szczurów E18 Wistar w komorze CO2 mieszaniną 80% CO2 / 20% O2 przez 60 s ekspozycji, a następnie poświęcenie, a następnie zwichnięcie kręgów szyjnych.</li>
	<li>Wykonaj następujące czynności w okapie z przepływem laminarnym. Ekstrahuj encefalon z zarodków za pomocą kleszczy w stylu # 3 i prostych, ostrych małych nożyczek sprężynowych (tabela materiałów) do roztworu Hanksa w naczyniach do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Wypreparuj tkankę pod 20-krotnym szkłem powiększającym, używając dwóch kleszczy z cienką końcówką w stylu #5, oddzielających korę czołową od opon mózgowych. Przenieś korę czołową do stożkowej rurki o pojemności 15 ml i inkubuj tkankę z 3-4 ml trypsyny-EDTA (0,25%) przez 15 minut, w temperaturze 37 °C w celu trawienia chemicznego.</li>
	<li>Po strawieniu rozcieńczyć go 3-4 ml zmodyfikowanej pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco oraz 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Następnie umyj go 3 razy roztworem soli Hanks bez Ca2+/Mg2+ i 0,1% glukozy przez odwirowanie (3000 g przez 5 min).</li>
	<li>Mechanicznie zdysocjuj tkankę 10 razy, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki o pojemności 1000 μl, w DMEM plus 10% FCS (tabela materiałów). Następnie odwirować homogenat o stężeniu 100 x g przez 1 minutę, zebrać supernatant i uzupełnić pozostałą objętość do 1000 μl.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową należy roztoczyć na szalkach do hodowli komórkowych o gęstości 520 komórek/mm2 z 2 ml DMEM zawierającego 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% dodatku niezbędnych aminokwasów (patrz tabela materiałów). Następnie inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO2 przez 2 godziny.
	<ol>
		<li>Usuwanie materii organicznej i powlekanie poli-L-lizyną szalek z kultur komórkowych
		<ol>
			<li>Usuń materię organiczną, umieszczając materiał szklany w komorze reakcyjnej i dodaj 96% alkoholu etylowego, aby prawie pokryć materiał. Następnie dodawaj 68% (w/v) kwasu azotowego kropla po kropli, aż zaczną pojawiać się brązowo-zielonkawe bąbelki. Gdy to nastąpi, częściowo przykryj pojemnik i pozwól reakcji kontynuować, aż wybuch ustanie. 
			UWAGA: Usuń materię organiczną pod kabiną ekstrakcji gazu, aby uniknąć narażenia na szkodliwe gazy.</li>
			<li>Przed pokryciem poli-L-lizyną przepłucz okulary sterylną wodą Mili-Q około dziesięć razy. Następnie inkubować szklanki i szalki hodowlane z 0,1 μg/μl poli-L-lizyny przez 4 godziny przed ich użyciem. Po inkubacji przepłukać okulary sterylną wodą Mili-Q około dziesięć razy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby umożliwić różnicowanie komórek nerwowych, zmień pożywkę na pożywkę neurobazalną bez surowicy, z suplementem bez surowicy (tabela materiałów). Przechowywać kultury w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do czasu poddania działaniu substancji chemicznej.</li>
</ol>
2. Produkcja lentiwirusa
UWAGA: Oligonukleotydy zawierające sekwencje ukierunkowane na 3'UTR izoformy CN-Aα lub CHOP oraz z sekwencjami nieukierunkowanymi (scrambles) są wymienione w Tabeli 1.
<ol>
	<li>Do wyżarzania wymieszaj dwa jednoniciowe oligonukleotydy z komplementarnymi sekwencjami w równych ilościach molowych, używając buforu do wyżarzania (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Ogrzewać w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, a następnie powoli schładzać, przenosząc próbki z bloku grzewczego lub łaźni wodnej na stół o temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć otrzymany produkt [krótki RNA spinki do włosów (shRNA) ze spoistymi końcami] do końcowego stężenia 0,5 μM, podzielić je na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Sklonuj wstawkę shRNA do wektora lentiwirusowego pLKO.3G, z GFP jako zielonym markerem fluorescencyjnym. W tym celu należy strawić 1 μg wektora z enzymami restrykcyjnymi EcoRI i PacI, mieszając w sterylnej probówce: 2 μL 10x buforu enzymu restrykcyjnego (100 mM bis-Tris propan-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl2, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej), 1 μL z 1 μg/μL pLKO.3G, 0,5 μl 10 U/μL ECoRI, 0,5 μl PacI (10 U/μL) i 16 μL sterylnej wody jonizowanej.
	<ol>
		<li>Delikatnie wymieszać, pipetując. Inkubować reakcję przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Trawienie przez noc jest na ogół niepotrzebne i może powodować degradację DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu podwiązania wymieszać strawiony wektor i wprowadzić w stosunku molowym 3:1 i inkubować go z ligazą T4 i buforem ligazy (dostarczonym przez producenta) przez noc w temperaturze 16 °C. 
	UWAGA: W tym momencie reakcja podwiązania może być przechowywana w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.</li>
	<li>Przekształć komórki właściwe DH5α (tabela materiałów) lub inny odpowiedni szczep E. coli z reakcją ligacji w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Wymieszać kompetentną E. coli z całkowitą objętością reakcji ligacji i schłodzić na lodzie przez 15 minut, umieścić w łaźni o temperaturze 42 °C na 2 minuty, a następnie ponownie schłodzić na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Przenieść całkowitą objętość poddaną szokowi termicznemu do probówki o pojemności 15 ml i uzupełnić objętość do 1000 μl płynnym podłożem Luria-Bertani (LB), które wcześniej utrzymywało się w temperaturze 37 °C. Wstrząsać bakteriami przez 90 minut w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 330 obr./min.</li>
		<li>Odwirować je przy 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić 900 μl supernatantu. Użyć pozostałego supernatantu do ponownego zawieszenia osadu. Zawiesinę bakterii rozprowadzić równomiernie na stałej płytce LB z ampicyliną (100 μg/ml).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie sprawdzić rozwój bakterii. W tym momencie bakterie mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 4-5 dni.</li>
		<li>Wybierz pojedynczą kolonię do przeniesienia do probówki o pojemności 50 ml z 10 ml płynnej pożywki LB i ampicyliną (100 μg/ml). Wstrząśnij bakteriami w temperaturze 37 °C przy około 330 obr./min.</li>
		<li>Odwirować kulturę w celu osadzenia bakterii w temperaturze 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i zakonserwować osad bakteryjny. Można go przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania DNA z osadu bakteryjnego zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Obliczyć stężenie DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i mnożąc przez współczynnik rozcieńczenia, stosując następującą zależność: A260 z 1,0 = 50 μg/ml czystego dwuniciowego (ds) DNA.</li>
</ol>
3. Zakażenie lentiwirusem
UWAGA: Wykonaj procedurę generowania lentiwirusa w okapie z przepływem laminarnym klasy II.
<ol>
	<li>24 godziny przed transfekcją wysiewać 1-5 × 106 komórek HEK 293 na szalki hodowlane o średnicy 100 mm w 8 ml pożywki wzrostowej i inkubować je w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Wymieszaj 14 μg wektora pKLO.3G ze specyficzną wkładką, 10,5 μg plazmidu pakującego psPAX i 3,5 μg plazmidu otoczkowego pMD2.G (tabela materiałów). Rozcieńczyć 45 μl odczynnika do transfekcji plazmidu (tabela materiałów) w 700 μl zredukowanej pożywki surowicy (tabela materiałów) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie połącz mieszaninę DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji plazmidu, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W międzyczasie zmień na świeży DMEM pożywkę z naczynia hodowlanego kultur komórkowych HEK 293 (70% zlewających się w czasie transfekcji). Następnie kropla po kropli dodawaj całą objętość roztworu DNA. Delikatnie kołysz naczyniem. Nie ma potrzeby dodawania/zmiany pożywki po transfekcji.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin-72 godzin, aby umożliwić shRNA osiągnięcie optymalnej transdukcji sprawdzanej przez fluorescencję GFP przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Następnie zebrać pożywkę z lentiwirusem i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant wirusa za pomocą membrany nylonowej 0,45 μm. Podwielokrotność przepływu w 1 ml. Następnie odwirować przy 17 000 x g przez 4 godziny. Odrzucić supernatant i zachować osad. Pozostawić niewidoczne granulki do wyschnięcia, a po wysuszeniu przechowywać w temperaturze -80 °C.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić miareczkowanie wirusa za pomocą cytometrii strumieniowej. Wysiewać 4 x 105 komórek HEK 293 na płytkach 24-dołkowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Następnie ponownie zawieś cząsteczki wirusa w 200 μl pożywki hodowlanej DMEM (tabela materiałów) i dodaj 0,05, 0,02 i 0,005 μl do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować infekcję wirusową przez 72 godziny, usunąć pożywkę i trypsynizować (0,05% trypsyny, 1 ml) przez 3 min. Dodać 1 ml DMEM w 10% roztworze FCS i wirować przy 500 x g przez 5 min. Wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć osad PBS.</li>
		<li>Zawiesić osad za pomocą 100 μl PBS i utrwalić komórki za pomocą 100 μl 2% paraformaldehydu (PFA) w PBS. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru strumieniowego i określ procentową zawartość komórek fluorescencyjnych GFP. Zbierz te dane, aby obliczyć miareczkowanie wirusa przy użyciu następującego wzoru: 
		Miareczkowanie wirusowe 
		<img alt="Równanie1" src="/files/ftp_upload/61974/61974eq01.jpg"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pierwotne hodowle neuronów poddane akumulacji gangliozydów GM2 i immunocytochemii przy użyciu przeciwciała anty-MAP2
<ol>
	<li>Zainfekować pierwotne kultury neuronów korowych (15 dni in vitro) specyficznymi oligonukleotydami shRNA ukierunkowanymi na 3' UTR CN-Aα lub CHOP i inkubować je w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 dzień. 
	UWAGA: Pierwotne hodowle neuronów korowych trwające 7-8 dni in vitro mogą być również stosowane, jeśli komórki wykazują wysoki wzrost neurytów.
	<ol>
		<li>Przygotować 500 μM roztwór podstawowy gangliozydu GM2 w etanolu i poddać go sonikacji przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać roztwór podstawowy GM2 do pożywki z szalkami hodowlanymi o końcowym stężeniu 2 μM. Pozostawić do inkubacji w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 16, 24 i 48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj niektórych kultur do przygotowania homogenatu komórkowego do analizy western blot (specyfikacja przeciwciał znajduje się w Tabeli materiałów).</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami 1.4 i 1.5, a następnie utrwal komórki 4% PFA i 120 mM sacharozy w PBS przez 20 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przemyj je PBS. Wykonaj tę procedurę na membranie antypoślizgowej w mokrej komorze. Następnie dodać roztwór permeabilizacyjny (0,2% Triton X-100 w PBS) przez 5 minut i przemyć PBS.
	<ol>
		<li>Stosować 5% BSA rozcieńczony w PBS przez 45 minut, aby umożliwić blokowanie, a następnie inkubować z przeciwciałem anty-MAP2, rozcieńczonym w stosunku 1:800 w roztworze blokującym, w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Pod koniec czasu inkubacji przemyć dwukrotnie PBS i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (tabela materiałów) przez 1 godzinę. Następnie umyć komórki PBS i zamontować okulary na szkiełkach za pomocą wodnego podłoża montażowego (tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza atrofii neurytów
<ol>
	<li>Uzyskaj obrazy za pomocą soczewki powietrznej 20x (NA 0,8) za pomocą mikroskopu odwróconego epifluorescencji wyposażonego w kamerę CCD. Analizuj obrazy za pomocą wtyczek ImageJ. W tym celu załaduj obraz do ImageJ i odejmij tło, klikając Procesowy | Odejmij tło.</li>
	<li>Kliknij na Obrazek | Dostosuj | Wprowadź próg lub wpisz następujące: Ctrl (lub Cmd) + Shift + T. Otworzy się okno, w którym można dostosować wartości minimalne, umożliwiając rozróżnienie śladów ścieżki i somy. Kliknij na obrazek binarny (neuryty i somy są koloru białego). Na tym obrazie użyj zaznaczania odręcznego, aby usunąć somy; Zaznaczony obszar SOMA ponownie zmieni kolor na.</li>
	<li>Zaznacz ślady i kliknij Edytuj | Selekcja | Utwórz zaznaczenie. Uzyskaj zwrot z inwestycji, klikając Ctrl (lub Cmd) i T zaznaczenia i zachowaj go. Otwórz oryginalny obraz, a następnie kliknij panel menedżera ROI i wybierz należący wcześniej uzyskany ROI. Następnie kliknij oryginalny obraz.</li>
	<li>Po obrysowaniu zwrotu z inwestycji na obrazie wpisz Ctrl (lub Cmd) i M (Analizuj | Środek). Otwiera się okno; Skopiuj wartość średnią (dowolne jednostki j.a.) w celu przetworzenia analizy statystycznej. 
	UWAGA: Aby uzyskać wartości w μm, kliknij Analizuj | Ustaw skalę. Pojawi się otwarte okno, w którym można ustawić wartości. Upewnij się, że dodano poprawną skalę (punkt menu Analizuj | Ustaw skalę) w zależności od charakterystyki używanego mikroskopu.</li>
</ol>

<ol><li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mammalian unfolded protein response.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).</li>
<li>Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+PERK+kinase+domain+suggests+the+mechanism+for+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).</li>
<li>Bollo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+interacts+with+PERK+and+dephosphorylates+calnexin+to+relieve+ER+stress+in+mammals+and+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs.</a> PLoS One. 5, 11925(2010).</li>
<li>Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+beta+protects+brain+after+injury+by+activating+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response.</a> Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).</li>
<li>Harding, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+stress+response+regulates+amino+acid+metabolism+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress.</a> Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).</li>
<li>Hetz, C., Saxena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+and+the+unfolded+protein+response+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration.</a> Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).</li>
<li>Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+effects+of+PERK+and+IRE1+signaling+on+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability.</a> PLoS One. 4, 4170(2009).</li>
<li>Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+atrophy+and+apoptosis+mediated+by+PERK+signaling+after+accumulation+of+GM2-ganglioside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).</li>
<li>Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglioside-enhanced+neurite+growth%3A+evidence+for+a+selective+induction+of+high-molecular-weight+MAP-2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2.</a> The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).</li>
<li>Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA+%28shRNA%29%3A+design%2C+delivery%2C+and+assessment+of+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown.</a> Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Rusnak, F., Mertz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin%3A+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcineurin: form and function.</a> Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).</li>
<li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+calcium%2C+calcineurin%2C+and+NFAT%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT.</a> Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).</li>
<li>Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP+homologous+protein+%28CHOP%29+is+crucial+for+the+induction+of+caspase-11+and+the+pathogenesis+of+lipopolysaccharide-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisujemy eksperymentalny system, który umożliwia molekularną modulację przejścia od fazy przeżycia do apoptotycznej fazy UPR w modelu komórki neuronalnej.
Do prawidłowej analizy atrofii neurytów niezbędne jest uzyskanie pierwotnych kultur neuronów z licznymi, długimi, silnie rozgałęzionymi wyrostkami 9,11. Ułatwia to badanie wydłużenia procesów neuronalnych, co pozwala na wykrycie wyraźnych różnic między terapiami. Ważne jest, aby zau...

Stres retikulum endoplazmatycznego (ER) definiuje się jako każde zaburzenie, które zagraża zdolności do fałdowania białek w organelli. Nagromadzenie niesfałdowanych białek w świetle ER aktywuje sygnał kaskady transdukcji zwany odpowiedzią niesfałdowanego białka (UPR). Ten złożony szlak sygnałowy jest koordynowany przez trzy czujniki stresu: PERK (kinaza ER podobna do kinazy białkowej RNA [PKR]) IRE1 (enzym wymagający inozytolu 1) i ATF6 (aktywowany czynnik transkrypcyjny 6). Wszystkie razem starają się przywrócić homeostazę. Ale jeśli stres utrzymuje się, UPR ostatecznie indukuje śmierć komórki przez apoptozę1.
PERK, białko transbłonowe ER, po stresie ER, prowadzi do fosforylacji eukariotycznego czynnika inicjacji-2 alfa (eIF2α), zmniejszając globalną syntezę białek, a tym samym obciążenie białkami w klasie ER<sup="xref">2. Wykazaliśmy, że kalcyneuryna A / B (CNA / B), heterodimer Ca2 + fosfataza, bezpośrednio wiąże cytozolową domenę PERK, zwiększając jej autofosforylację i znacznie zwiększając hamowanie translacji białek i żywotności komórek3,4. Co ciekawe, CNA/B występuje obficie w mózgu ssaków, wyróżniając dwie izoformy podjednostki A CN: α i β.
W warunkach długotrwałego stresu ER, szlak sygnałowy PERK jest jedyną gałęzią UPR, która pozostaje aktywna, pośrednicząc w ten sposób zarówno w odpowiedzi pro-survivalowej, jak i apoptotycznej. W fazie przewlekłej jednym z głównych dalszych zdarzeń jest indukcja czynnika transkrypcyjnego, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologous protein)5. Przewlekły stres ER jest również coraz częściej uznawany za częsty czynnik przyczyniający się do szerokiego zakresu zaburzeń patologicznych, w tym chorób neurodegeneracyjnych6. Ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób UPR może ułatwiać sygnalizację cytoprotekcyjną zamiast śmierci komórki 7. Jednak obecnie niewiele wiadomo o dokładnym mechanizmie kontrolującym przejście między tymi dwiema fazami UPR.
Ostatnio odkryliśmy, że w hodowanych neuronach gangliozyd GM2 gromadzi się w błonach ER i powoduje zubożenie wapnia w światło. To z kolei aktywuje sygnalizację PERK, która pośredniczy w atrofii neurytów i apoptozie 8. W tym badaniu nagromadzenie GM2 w hodowanych neuronach jest wykorzystywane jako model systemu komórkowego atrofii neurytów wywołanej stresem ER. W szczególności manipuluje się dwoma wyrażeniami czynnika PERK, CN-AΑ i CHOP, które przełączają przejście między wczesnymi/ochronnymi zdarzeniami a fazą przewlekłą/apoptozą. Aby to osiągnąć, odpowiednie geny są wyciszane; w ten sposób pierwotne hodowle neuronów korowych są zakażone specyficznym shRNA dostarczanym przez lentiwirusa. Analiza Western blot ujawnia znaczne obniżenie poziomów ekspresji CN-Aα i CHOP w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które są zakażone lentiwirusem przenoszącym zakodowane shRNA. Po tym zabiegu neurony są poddawane różnym czasom inkubacji egzogennego GM2, utrwalonego i wybarwionego immunologicznie przeciwciałem przeciwko białku 2 (MAP2) przeciwko mikrotubulom9. Obrazy uzyskuje się za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Całkowity wzrost neurytów jest oceniany w stosunku do całkowitej liczby komórek.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-mysz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#R37120</td><td></td></tr><tr><td>anty-CHOP</td><td>Thermo Fisher</td><td># MA1 - 250</td><td></td></tr><tr><td>anty-CN-A&alfa;</td><td>Millipore</td><td># 07-067</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GM2</td><td>Matreya</td> <td># 1961</td><td></td></tr><tr><td>anty-MAP2</td><td>Sigma Aldrich</td> <td># M2320</td><td></td></tr><tr><td>anty-&beta;-aktyna</td><td>Thermo Fisher</td> <td># PA1 - 183</td><td></td></tr><tr><td>aprotynina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#3595</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>#17504944</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Technologie życia</td><td>#11966025</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Promega</td><td>#R6011</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla cieląt płodowych (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>#16000044</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze z cienkimi końcówkami&nbsp; styl #5</td> Kleszcze <td>Dumonta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>styl #3</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 CW przeciwciało drugorzędowe</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632221</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 przeciwciało drugorzędowe</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632220</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW przeciwciało drugorzędowe</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW przeciwciało drugorzędowe</td><td>LI-COR Nauki biologiczne</td><td>#92632211</td><td></td></tr><tr><td>plazmid otoczki lentiwirusowej pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>lentiwirusowy plazmid pakujący psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>wektor lentiwirusowy pLKO.3G</td><td>Addgene</td><td>#14748</td><td></td></tr><tr><td>Hemisulfate leupeptyny</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#295358</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX & Plus Odczynnik (odczynnik do transfekcji plazmidu)</td><td>Life Technologies</td><td>#A12621</td><td></td></tr><tr><td>MISSION shRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monosialoganglioside GM2</td><td>Matreya</td><td>#1502</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>#21103049</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa 0,45 & Mikro; m</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620115</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania w podczerwieni Odyssey</td><td>LI-COR Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OneShot Top 10</td><td>Life Technology</td><td>#C404010</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (Reduced serum media)</td><td>Life Technologies</td><td>#105802</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>BioLabs</td><td>#R0547S</td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#45036</td><td></td></tr><tr><td>fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>sigma aldrich</td><td>P#2636</td><td></td></tr><tr><td>Proste, ostre, małe nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>Promega</td><td>#M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25 %</td><td>Life Technologies</td><td>#25200056</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy procesor cieczowy Vibra-Cell (VCX 130)</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard plus SV Minipreps system oczyszczania DNA</td><td>Promega</td><td>#A1330</td><td></td></tr></tbody></table>

modulacja molekularna przez specyficzne shrna dostarczane przez lentiwirusa w neuronach zestresowanych retikulum endoplazmatycznym

Molecular Modulation by Lentivirus-Delivered Specific shRNAs in Endoplasmic Reticulum Stressed Neurons

Nagromadzenie niesfałdowanych białek w retikulum endoplazmatycznym (ER), spowodowane jakimkolwiek stanem stresu, wyzwala odpowiedź na niesfałdowane białko (UPR) poprzez aktywację wyspecjalizowanych czujników. UPR próbuje najpierw przywrócić homeostazę; Ale jeśli uszkodzenie utrzymuje się, sygnalizacja indukuje apoptozę.
Istnieje coraz więcej dowodów na to, że długotrwały i nierozwiązany stres ER przyczynia się do wielu stanów patologicznych, w tym chorób neurodegeneracyjnych. Ponieważ UPR kontroluje los komórki poprzez przełączanie między procesami cytoprotrotacyjnymi i apoptotycznymi, konieczne jest zrozumienie zdarzeń definiujących to przejście, a także elementów zaangażowanych w jego modulację.
Ostatnio wykazaliśmy, że nieprawidłowa akumulacja gangliozydów GM2 powoduje wyczerpanie zawartości ER Ca2+, co z kolei aktywuje PERK (kinazę podobną do PKR), jeden z czujników UPR. Ponadto sygnalizacja PERK uczestniczy w atrofii neurytów i apoptozie indukowanej przez akumulację GM2. W związku z tym opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam molekularnie modulować ekspresję dalszych komponentów PINK, a tym samym zmieniać podatność neuronów na atrofię neurytyczną.
Przeprowadziliśmy dekautację ekspresji kalcyneuryny (cytoprotekcyjnej) i CHOP (proapoptotycznej) w hodowlach neuronów kory mózgowej szczurów. Komórki zostały zakażone specyficznym shRNA dostarczonym przez lentiwirusa, a następnie potraktowane GM2 w różnym czasie, utrwalone i wybarwione immunologicznie przeciwciałem anty-MAP2 (białko związane z mikrorurkami 2). Później obrazy komórek zarejestrowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a całkowity wzrost neurytów oceniono za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów w domenie publicznej ImageJ. Hamowanie ekspresji tych składników sygnalizacyjnych PERK wyraźnie umożliwiło przyspieszenie lub opóźnienie atrofii neurytycznej wywołanej stresem ER.
To podejście może być wykorzystane w modelach stresu ER w systemach komórkowych do oceny podatności neuronów na atrofię neurytów.

Tutaj zajmujemy się pytaniem, czy wyciszenie dwóch komponentów PERK wpływa na fazę przejściową UPR w modelu komórki stresu ER. Aby to osiągnąć, wyciszamy gen CN-Aα, a także gen CHOP za pomocą dwóch specyficznych sekwencji shRNA dla każdej (Tabela 1) w pierwotnej hodowli komórek neuronów przez 1 dzień10. Wyrażenie jest analizowane za pomocą Western blotting (Rysunek 1 i Rysunek 2). Obserwuje się wyraźne za...

W obecnym badaniu, wyrażenie dwóch dalszych komponentów sygnalizacyjnych szlaku PINK, cytoprotekcyjnej kalcyneuryny i proapoptotycznego CHOP, za pomocą specyficznych shRNA. W przeciwny sposób modulują one podatność pierwotnych neuronów korowych na atrofię neurytów po indukcji stresu retikulum endoplazmatycznego.

Modulacja molekularna przez specyficzne shRNA dostarczane przez lentiwirusa w neuronach zestresowanych retikulum endoplazmatycznym

The accumulation of unfolded proteins within the endoplasmic reticulum (ER), caused by any stress condition, triggers the unfolded protein response (UPR) ...

Podejście to może być stosowane w modelach systemów komórkowych stresu retikulum endoplazmatycznego poprzez manipulowanie ekspresją molekularną dalszych składników pary. Główną zaletą tej techniki jest usunięcie wpływu sparowanej sygnalizacji poprzez wizualizację i pomiar ścieżek neuronowych. Metoda ta może przyczynić się do zrozumienia molekularnych podstaw przejścia między ostrymi i przewlekłymi fazami stresu ER w różnych modelach chorób neurodegeneracyjnych poza gangliozydozą GM2 Na początek wypreparuj tkankę pod 20-krotnym szkłem powiększającym za pomocą dwóch kleszczy z cienką końcówką numer pięć, oddzielających korę czołową od opon mózgowych.Przenieś korę czołową do 15-mililitrowej stożkowej rurki i inkubuj tkankę z trzema do czterech mililitrami trypsyny EDTA przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu trawienia chemicznego. Następnie umyj go trzykrotnie zrównoważonym roztworem soli Hank's bez jonów wapnia i magnezu oraz 0,1% glukozy. Mechanicznie zdysocjuj tkankę 10 razy, pipetując w górę iw dół za pomocą końcówki o pojemności 1 000 mikrolitrów w DMEM plus 10% FCS.Odwirować homogenat o stężeniu 100 G przez jedną minutę, zebrać supernatant i uzupełnić pozostałą objętość w 1 000 mikrolitrów. Zawiesinę komórkową należy umieścić na szalkach do hodowli komórkowych o gęstości 520 komórek na milimetr kwadratowy z dwoma mililitrami DMEM zawierającymi 10% FCS, 1% streptomycyny penicyliny i 1% dodatku aminokwasów egzogennych. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku z 5% dwutlenkiem węgla przez dwie godziny.Aby umożliwić różnicowanie komórek nerwowych, zmień podłoże na pożywkę neurobazalną bez surowicy za pomocą suplementu bez surowicy. Utrzymuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla do czasu zabiegu. Do wyżarzania wymieszaj dwa jednoniciowe oligonukleotydy z uzupełniającymi sekwencjami w równych ilościach molowych.Podgrzewaj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Przenieść próbki z bloku grzewczego i rozcieńczyć otrzymany produkt do końcowego stężenia 0,5 mikromola. Aby sklonować shRNA, wstaw do wektora lentiwirusowego pLKO.3G, trawić jeden mikrogram wektora za pomocą enzymów restrykcyjnych EcoR1 i PAC1. Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować reakcję przez trzy do czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W celu podwiązania wymieszaj strawiony wektor i wprowadź go w stosunku molowym 3:1.Inkubuj go z ligazą T4 i buforem ligazy przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza. Następnie wymieszaj składnik E.coli z całkowitą objętością reakcji ligacji i schładzaj go na lodzie przez 15 minut. Umieść go w kąpieli o temperaturze 42 stopni Celsjusza na dwie minuty, a następnie ponownie schładzaj na lodzie przez 15 minut.Przenieś całkowitą objętość poddaną szokowi cieplnemu do 15-mililitrowej probówki i uzupełnij objętość do 1 000 mikrolitrów płynnym medium Luria-Bertani lub L-B. Potrząsaj bakteriami przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 330 obr./min. Wirówka, która spotkała się z 5 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wyrzucić 900 mikrolitrów supernatantu i użyć pozostałego supernatantu do ponownego zawieszenia osadu. Rozprowadzić zawiesinę bakterii równomiernie na stałej płytce ampicyliny L-B i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz pojedynczą kolonię, aby przenieść ją do 15-mililitrowej probówki z 10 mililitrami płynnego podłoża L-B i ampicyliny.Wstrząśnij bakteriami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy około 330 obr./min i odwiruj kulturę, aby granulować bakterie w temperaturze 5 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu należy zakonserwować osad bakteryjny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. 24 godziny przed transfekcją wysiewaj od 1 do 5 milionów komórek HEK-293 do 100-milimetrowych szalek hodowlanych.Wymieszaj 14 mikrogramów wektora pKLO. 3G ze specyficzną wkładką, 10,5 mikrograma plazmidu pakującego psPAX i 3,5 mikrograma plazmidu otoczkowego pMD2. Rozcieńczyć 45 mikrolitrów odczynnika do transfekcji plazmidu w 700 mikrolitrach pożywki o zredukowanej surowicy i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie połącz mieszaninę DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji plazmidu, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po transfekcji należy zmienić pożywkę w naczyniu hodowlanym komórek HEK-293 na świeżą pożywkę i dodawać kroplami całą objętość roztworu DNA. Delikatnie kołysz naczyniem i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 48 do 72 godzin, aby umożliwić shRNA osiągnięcie optymalnej transdukcji.Zebrać pożywkę z lentiwirusem i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przefiltrować wirusowy supernatant za pomocą nylonowej membrany o grubości 0,45 mikrometra i poddzielić jeden milimetr przepływu. Wirować przy 17 000 g przez cztery godziny.Odrzucić supernatant i zachować osad. Pozostaw niewidoczną pelety do wyschnięcia, a po wysuszeniu przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zainfekuj pierwotne kultury neuronów korowych specyficznymi oligonukleotydami shRNA, celując w trzy główne UTR kalcyneuryny A-alfa lub CHOP i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez jeden dzień.Następnie dodać roztwór podstawowy GM2 do pożywki szalki hodowlanej o końcowym stężeniu dwóch mikromoli i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 16, 24 i 48 godzin. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu i 120-milimolowej sacharozy w PBS przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umyj je PBS. Dodaj roztwór przepuszczalny przez pięć minut i przemyj PBS.Użyj 5% BSA rozcieńczonego w PBS przez 45 minut, aby umożliwić zablokowanie. Następnie inkubować z przeciwciałem anty-MAP2 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po dwukrotnym przemyciu komórek PBS pod koniec czasu inkubacji, inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę.Zamontuj okulary po umyciu komórek PBS. Po uzyskaniu obrazów za pomocą mikroskopu odwróconego epifluorescencji załaduj obraz, aby uzyskać ImageJ i odejmij tło, klikając Proces, a następnie Odejmij tło. Kliknij Obraz, Dostosuj, Próg, aby dostosować minimalne wartości, umożliwiając odróżnienie ścieżki i niektórych śladów.Usuń somy za pomocą zaznaczenia odręcznego. Wybierz Ślady i kliknij Edytuj, Zaznaczenie, Utwórz zaznaczenie. Uzyskaj zwrot z inwestycji, klikając Control i T wyboru i zachowaj go.Otwórz oryginalny obraz. Kliknij panel Menedżer zwrotu z inwestycji i wybierz początkowy zwrot z inwestycji. Następnie kliknij oryginalny obraz.Gdy ROI zostanie obrysowany na obrazie, naciśnij Control i M, aby przetworzyć analizę statystyczną. Podjęto tutaj próbę sprawdzenia, czy wyciszenie dalszych komponentów 2pERK wpływa na fazę przejściową odpowiedzi niesfałdowanego białka w modelu komórki stresu ER. Gen kalcyneuryny A-alfa i gen CHOP zostały wyciszone przez dwie specyficzne sekwencje shRNA w pierwotnej hodowli komórek neuronowych na jeden dzień.Wyrażenie jest analizowane przez Western blot. Obserwuje się wyraźne zahamowanie wzrostu kalcyneuryny A-alfa za pośrednictwem stresu ER i CHOP w komórkach knockdown. Zbadano możliwy związek stresu ER wywołanego akumulacją GM2 ze zwyrodnieniem neuronów, przeprowadzając barwienie immunologiczne MAP2 pierwotnych kultur neuronalnych.Zanik neurytów znacznie wzrasta po wywołaniu stresu ER przez inkubację GM2 w ciągu 16 do 48 godzin. Wyciszenie ekspresji kalcyneuryny A-alfa znacznie zwiększa atrofię neurytów, szczególnie po 16 godzinach akumulacji GM2 w porównaniu z grupami nieleczonymi GM2. W ten sposób knockdown kalcyneuryny A-alfa przyspieszył proces degeneracji neuronów, potwierdzając pro-przeżyciowy efekt kalcyneuryny we wczesnej fazie niesfałdowanej odpowiedzi białkowej.I odwrotnie, knockdown CHOP spowodował znacznie zmniejszony zanik neurytów w porównaniu z grupą kontrolną dokładnie po 16 do 24 godzinach. protokół komórkowy z właściwą pierwotną hodowlą komórkową i uzyskaniem 90 lub więcej procent zakażonych komórek odpowiednim lentiwirusem. Ponieważ utrata aksonu końcowego neuronalnego jest pierwszym krokiem, który określamy w naszym procesie, można to również ocenić, wykonując test.Technika ta pozwala naszej grupie i innym ocenić niektóre cząsteczki jako potencjalne narzędzia terapeutyczne.

molecular-modulation-lentivirus-delivered-specific-shrnas-endoplasmic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy technikę lentiwirusową służącą do manipulacji genetycznej i wizualizacji pojedynczego aksonu neuronu sensorycznego węchu oraz jego arboryzacji terminalnej in vivo.

Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Interferencja RNA (RNAi) posiada wiele zalet w porównaniu z nokautem genów i jest szeroko stosowana jako narzędzie w badaniach nad funkcjami genów. Wynalezienie technologii RNAi opartej na wektorach DNA umożliwiło długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów, a także zwiększyło wykonalność wyciszania genów in vivo.

Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Źródło: Tagliafierro, L., et al. Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje transdukcję lentiwirusową nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w celu ukierunkowanej modyfikacji epigenetycznej alfa-synukleiny, kluczowego białka w chorobie Parkinsona. Protokół umożliwia metylację DNA za pośrednictwem metylotransferazy,...

Transdukcja lentiwirusowa nerwowych komórek progenitorowych w celu epigenetycznej regulacji ekspresji alfa-synukleiny

Źródło: Bender, H. R., et.al. Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje ukierunkowane dostarczanie siRNA białka prionowego (PrP) do neuronów za pomocą liposomalnych kompleksów siRNA-peptyd (LSPC). Liposomy kationowe wiążą elektrostatycznie siRNA ukierunkowane na PrP, które jest dodatkowo stabilizowane przez peptyd RVG-9r do transportu za pośrednictwem receptora przez barierę krew-mózg. Po dostaniu się do mózgu...

Ukierunkowane dostarczanie siRNA do neuronów w celu wyciszenia białek prionowych za pomocą kompleksów liposomalnych

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Stereotaktyczne wstrzykiwanie lentiwirusów wyrażających cDNA lub shRNA może modulować ekspresję genów w określonych obszarach mózgu myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół łączący zastrzyki stereotaktyczne z zadaniami behawioralnymi, takimi jak Test Otwartego Pola (OFT) i Test Wymuszonego Pływania (FST).

Zastosowanie techniki iniekcji stereotaktycznej do badania wpływu genetycznego na zachowania zwierząt

Ten protokół dostarcza przepływ pracy, jak połączyć sztuczną interferencję RNA za pośrednictwem mikroRNA z optogenetyką, aby stymulować specyficznie presynaptyczne butony ze zmniejszoną ekspresją selektywnych genów w nienaruszonych obwodach neuronalnych.

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Atakie rdzeniowo-móżdżkowe poliglutaminowe są spowodowane ekspansjami CAG prowadzącymi do tworzenia białek predysponowanych do agregacji. Ten protokół opisuje produkcję wektorów, stereotaksyczne wprowadzenie oraz analizę inkluzji i utraty markerów neuronowych, zapewniając kontrolowaną platformę do badania mechanizmów i oceny ukierunkowanych terapii chorób neurodegeneracyjnych.

Choroba zwojów wzrokowych wywołana wirusem lentywirusowym jako prekliniczny model poliglutaminowyej rdzeniowo-móżdżkowej ataksji

Poznaj technikę shRNA dostarczanego przez lentiwirusa do badania stresu retikulum endoplazmatycznego w neuronach korowych. Ta metoda pozwala analizować rolę kalcyneuryny i CHOP w neurodegeneracji.

Modulacja molekularna przez specyficzne shRNA dostarczane przez lentiwirusa w neuronach zestresowanych retikulum endoplazmatycznym (Wideo) | JoVE Journal

Modulacja molekularna przez specyficzne shRNA dostarczane przez lentiwirusa w neuronach zestresowanych retikulum endoplazmatycznym

Przeglądaj więcej filmów