Zapis elektrokortykograficzny obszarów kory mózgowej manipulowanych za pomocą wirusa związanego z adenowirusem skierowanym przeciwko kofilinie u myszy

Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji roli określonych indywidualnych celów molekularnych w regulacji aktywności elektrokortykograficznej podczas różnych stanów Vigilin. Wśród korzyści płynących ze stosowania wirusa związanego z adenowirusem jest możliwość precyzyjnego celowania w dany obszar mózgu i określony typ komórek. Protokół zademonstruje Julien Dufort-Gervais, pracownik naukowy mojego zespołu.

Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch szczypania palców u znieczulonej 12-tygodniowej myszy, użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby zgolić włosy od tyłu uszu do przodu głowy między oczami. Dodaj obfitą kroplę maści okulistycznej do każdego oka, aby zapobiec odwodnieniu i użyj nauszników, aby ostrożnie przymocować głowę myszy do aparatu stereotaktycznego. Delikatnie wyciągnij język z ust, aby uniknąć uduszenia.

Przymocuj nos myszy do aparatu i użyj 70% etanolu do sterylizacji odsłoniętej skóry na głowie. Trzymając skórę bardzo cienkimi kleszczami Graefe, użyj nożyczek do tkanek, aby przeciąć skórę od podstawy uszu do poziomu oczu i umieść dwa zaciski chirurgiczne po każdej stronie nacięcia, aby rozciągnąć skórę i odsłonić czaszkę. Unikając szwów mózgowych, użyj końcówki nożyczek, aby podrapać powierzchnię czaszki, aby usunąć okostną i utworzyć nakładające się smugi w dwóch lub więcej kierunkach.

Użyj 70% etanolu, aby usunąć fragmenty kości i zdezynfekować czaszkę. Za pomocą wcześniej przygotowanej kaniuli przymocowanej do ramienia stereotaktycznego, zidentyfikuj położenie bregmy i lambdy oraz zanotuj współrzędne stereotaktyczne każdego z nich. Użyj ramienia stereotaktycznego i długopisu, aby zaznaczyć położenie kaniuli na czaszce 1,5 milimetra w prawo do linii środkowej i 1,5 milimetra przed bregmą.

Za pomocą wiertła o średnicy 0,7 milimetra ostrożnie przekłuć czaszkę w zaznaczonym miejscu prostopadłym do powierzchni czaszki i wyrównanym z osią pionową i umyć czaszkę sterylną bawełnianą końcówką nasączoną 10% roztworem jodu powidagonu, a następnie cofnąć tłok strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów o jeden mikrolitr, aby naładować kaniulę pęcherzykiem powietrza o pojemności jednego mikrolitra. Następnie wymieszaj interesującą Cię mieszaninę AAV powolnym pipetowaniem i dodaj 1,7 mikrolitra mieszaniny do sterylnej szalki Petriego. Za pomocą tej strzykawki załaduj 1,5 mikrolitra roztworu do kaniuli i zaznacz położenie pęcherzyka powietrza na podłączonej rurce PE50.

Wyrównaj kaniulę pionowo z otworem w czaszce tak, aby kaniula sięgała górnej krawędzi kości i zaznacz współrzędną Z powierzchni czaszki. Powoli opuść kaniulę, aż końcówka osiągnie 1,5 milimetra poniżej powierzchni czaszki i warstwy piątej kory ruchowej, a następnie uruchom pompę strzykawkową przy natężeniu przepływu 0,025 mikrolitra na minutę, aby dostarczyć jeden mikrolitr AAV w ciągu 40 minut. Użyj pęcherzyka powietrza w rurce, aby śledzić wstrzyknięcie, dokonując w razie potrzeby wszelkich regulacji.

Po dostarczeniu całej objętości wirusa, pozostaw kaniulę na miejscu na pięć minut, aby zapewnić wystarczającą dyfuzję i uniknąć przepływu wstecznego, a następnie powoli i ostrożnie podnieś ramię stereotaktyczne w celu usunięcia kaniuli z kory. Do implantacji elektrod użyj prostych kleszczy Kelly'ego, aby powoli wkręcić jedną elektrodę elektrokortykograficzną z prostym złotym drutem w pionową oś otworu, do którego wstrzyknięto AAV, pozostawiając co najmniej 2,5 milimetra na zewnątrz czaszki, aby zminimalizować uszkodzenie opony twardej i kory mózgowej. Za pomocą pisaka zaznaczyć położenie elektrody odniesienia 2,6 milimetra w prawo do linii środkowej i 0,7 milimetra za linią środkową oraz położenie tylnej elektrody elektrodowej w odległości 1,5 milimetra w prawo od linii środkowej i 1,5 milimetra przed linią środkową oraz położenie trzech konserwacyjnych na lewej półkuli bez określonych współrzędnych, ale jak najdalej od siebie i od elektrod elektrokortykograficznych.

Za pomocą wiertła ostrożnie przekłuć czaszkę prostopadle do powierzchni czaszki w zaznaczonych miejscach pozostałych elektrod i, a następnie umyć przekłutą czaszkę 10% roztworem jodu powidonu. Zablokuj otwory małymi zwiniętymi kawałkami delikatnej chusteczki przed zainstalowaniem, aby zapobiec krwawieniu i zanieczyszczeniu, a następnie użyj prostych kleszczyków Kelly'ego, aby włożyć do wywierconych otworów pod tym samym kątem, pod jakim otwory zostały przebite. Umieść kilka małych kropel cementu dentystycznego na środku pierścieniowatej przestrzeni wewnątrz i użyj bardzo cienkich kleszczyków Graefe, aby unieść skórę powyżej mięśni szyi.

Używając kleszczyków Dumonta numer pięć, przytrzymaj zakrzywioną kończynę jednej elektrody elektromiograficznej i włóż ją około jednego do dwóch milimetrów w mięśnie. Umieść zakrzywioną stronę i punkt składania elektrody w cemencie dentystycznym i włóż drugą elektrodę elektromiograficzną w ten sam sposób. Po zakryciu oczu zwierzęcia należy przyłożyć światło przez trzy do pięciu minut, aby zestalić cement i użyć dodatkowego cementu dentystycznego, aby pokryć podstawę elektrod elektrokortykograficznych i kotwiące, aby utworzyć kontur w kształcie korony.

Po zastosowaniu kolejnych trzech do pięciu minut światła wypełnij środek montażu cementem akrylowym i usuń zaciski chirurgiczne. Użyj syntetycznego wchłanialnego szwu monofilamentowego, aby zamknąć skórę z przodu iz tyłu montażu, tak aby czaszka nie była odsłonięta, i użyj zakrzywionych kleszczyków, aby przytrzymać złącze nad montażem, aby ostrożnie wyrównać złote druty elektrod ze stykami złącza, a następnie szybko każdą końcówkę elektrody do jednego odpowiedniego pinu złącza. Po wyjęciu myszki z ramy, pustą przestrzeń pomiędzy łącznikiem a głowicą należy zakryć cementem akrylowym.

A po zważeniu umieść mysz w czystej klatce z pokrywką bez siateczki na poduszce grzewczej. Dwa tygodnie po operacji podłącz myszy do nagrywających, a co najmniej tydzień później rejestruj sygnały elektrokortykograficzne i elektromiograficzne przez 24 godziny lub dłużej. Pomyślne zakażenie potwierdza zabarwienie HA neuronów w korze ruchowej otaczającej miejsce wstrzyknięcia, co wskazuje na obecność kofiliny S3D HA. Barwienie markerem neuronu pobudzającego CaMKII alfa wskazuje na wyraźną koekspresję kofiliny S3D HA i CaMKII alfa w dużym powiększeniu.

Logarytmicznie przekształcone względne widma mocy dla czuwania, snu wolnofalowego i snu paradoksalnego pokazują specyficzne dla stanu różnice w aktywności spektralnej pod wpływem inaktywacji kofiliny. Połączenie zapisu elektrokortykograficznego i manipulacji precyzyjnymi celami molekularnymi za pośrednictwem AAV ma również zastosowanie w wielu regionach mózgu oraz w innych poddziedzinach neuronauki, takich jak badania nad padaczką lub pamięcią oprócz snu.