Name: Trójwymiarowa hodowla eksplantatów ogonowych w celu zbadania segmentacji kręgowców u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Poznaj trójwymiarową hodowlę eksplantatów ogonowych Danio rerio do badania segmentacji kręgowców. Ta metoda umożliwia obserwację na żywo dynamiki tkanek i kontrolę źródeł morfogenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy AECOM Zebrafish Core Facility i Cincinnati Children's Veterinary Services za utrzymanie ryb, Cincinnati Children's Imaging Core za pomoc techniczną, Didarowi Saparovowi za pomoc w produkcji wideo oraz Hannah Seawall za edycję rękopisu. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer R35GM140805 dla E.M.Ö. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Ten protokół obejmuje wykorzystanie żywych zarodków kręgowców młodszych niż 1 dzień po zapłodnieniu. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi Cincinnati Children's Hospital Medical Center; protokoły dotyczące zwierząt zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Protokół # 2017-0048).
1. Pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Ustaw pary danio pręgowanego w zbiornikach krzyżujących się w noc poprzedzającą dzień pobrania zarodków. W celu precyzyjnej kontroli stopnia zaawansowania rozwoju zarodka należy stosować bariery między parami godowymi.</li>
	<li>Podnieś bariery przed preferowanym czasem tarła i zbierz ikrę w ciągu 15 minut na szalce Petriego o średnicy 100 mm.
	<ol>
		<li>Oczyść zanieczyszczenia z szalki Petriego. Jeśli z jednego lęgu pobiera się więcej niż 50 zarodków, należy odpowiednio podzielić lęg na kilka szalek Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować zarodki w wodzie systemu rybnego w temperaturze 28 °C, aż osiągną 50% stadium epibolii (5 godzin po zapłodnieniu). Standaryzowane podłoże do wzrostu zarodków, takie jak E3, może być również używane zamiast wody z systemu akwariowego do kroku 3.2.
	<ol>
		<li>Usunąć niezapłodnione komórki jajowe pod stereoskopem i przenieść zarodki do inkubatora w temperaturze 23,5 °C na noc (O/N). Zarodki powinny znajdować się w stadium 8-10 somitów rano następnego dnia pobrania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie narzędzia
<ol>
	<li>Wysterylizuj ostrze noża mikrochirurgicznego, końcówki igieł (używane do preparowania tkanki) i szklaną pipetę Pasteura, mocząc w 100% etanolu (EtOH) i szkliwiąc ogniem.</li>
	<li>Użyj dwóch warstw przezroczystej taśmy (grubość ~100-120 μm) na szkiełkach mikroskopowych 25 mm x 75 mm. Wytnij skalpelem kwadratowe dołki o wymiarach ~18 mm x 18 mm na środku pokrycia taśmą każdego szkiełka.
	<ol>
		<li>Przetrzyj przygotowane komory szkiełkowe 70% EtOH. Studzienki te pomieszczą ~40 μL pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Dekorionuj zarodki za pomocą końcówki dwóch strzykawek igłowych pod stereoskopem. Przenieś zarodki na oddzielną szalkę Petriego z wodą z systemu rybnego w celu spłukania.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura przeniesiono zarodki na 6 cm szalkę Petriego zawierającą pożywkę separacyjną (pożywka do hodowli komórkowych Leibovitz-15 z L-glutaminą bez czerwieni fenolowej, 0,8 mM CaCl2 i 1× roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym). 
	UWAGA: Kontynuuj używanie wysterylizowanej szklanej pipety do wszystkich transferów zgodnie z tym krokiem.
	<ol>
		<li>Użyj szklanej szalki Petriego do procedury eksplantacji, aby uniknąć wiórów polistyrenowych podczas sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić 50 μl pożywki do wzrostu tkanek (pożywki do rozwarstwiania i 10% FBS) w komorze szkiełkowej.</li>
	<li>Ustabilizuj zarodek do sekcji pod stereoskopem za pomocą końcówki igły na przecięciu żółtka i tkanki w pobliżu tyłomózgowia.</li>
	<li>Utrzymując tkankę embrionalną stabilnie za pomocą igły, użyj noża mikrochirurgicznego z ostrzem trzymanym pod kątem 45°, aby przeciąć tkankę przednią do tyłomózgowia i oderwać żółtko od tkanki embrionalnej, zaczynając od przodu i przesuwając się w kierunku pąka ogonowego (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A). 
	UWAGA: Uważaj, aby nie stracić tkanki skórnej podczas czyszczenia żółtka. Skóra łatwo złuszcza się jako flankująca jednowarstwowa elastyczna tkanka wokół zarodka podczas sekcji, dzięki czemu jest łatwa do rozpoznania.</li>
	<li>Gdy żółtko zostanie całkowicie usunięte z ciała zarodka, odetnij boczną tkankę skórną od pąka ogonowego. Utrzymując ostatnie uformowane 3-4 somity w stanie nienaruszonym, wytnij bardziej przednią tkankę (eksplantat w pełnej osi).
	<ol>
		<li>Żółtko powinno zejść w większości nienaruszone z tej procedury. W przypadku pękniętego żółtka znaczne granulki żółtka mogą pozostać przyczepione do brzusznej powierzchni tkanki. Jeśli tak, użyj szczypieczki do rzęs, aby delikatnie usunąć pozostałe granulki żółtka. 
		UWAGA: Brak równowagi tkanek skóry po bocznych stronach eksplantatu nie pozwoliłby tkance utrzymać prostego kierunku wzrostu. Zamiast tego eksplant wygina się w stronę bardziej rozciągniętej skóry. Tę nierównowagę można skorygować pod stereoskopem poprzez rozerwanie warstwy skóry za pomocą noża mikrochirurgicznego.</li>
		<li>W przypadku eksplantatów bez skóry należy przycisnąć końcówkę warstwy skóry za pomocą igły i oderwać eksplantat tkanki nożem mikrochirurgicznym. Te eksplantaty nie wydłużają osi ciała w kulturze.</li>
		<li>Oprócz eksplantatów z pełną osią, na tym etapie można wykonać alternatywne eksplantaty. Na przykład, wypreparuj już segmentowane somity za pomocą noża mikrochirurgicznego (eksplantaty pełne PSM) lub rozetnij PSM na jego połowę przednio-tylną (pół PSM eksplantaty). Patrz sekcja 5.1 w celu uzyskania informacji na temat stosowania takich alternatywnych eksplantatów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast przenieść wypreparowany eksplant na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm, na którym zostanie przeprowadzone obrazowanie.
	<ol>
		<li>Ułóż eksplantat płasko na osi grzbietowo-brzusznej, stroną brzuszną dotykającą szkiełka nakrywkowego (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B). Delikatnie usuń nadmiar pożywki wokół eksplantatu tkanek za pomocą pipety z filtrowaną końcówką o pojemności 20 μl. 
		UWAGA: Opóźniony transfer wypreparowanych eksplantatów do szkiełka nakrywkowego powoduje deformację tkanki, ponieważ jest ona uwolniona od ograniczeń geometrycznych żółtka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybko i ostrożnie odwróć szkiełko nakrywkowe z eksplantatem nad komorą szkiełkową wypełnioną pożywką wzrostową.
	<ol>
		<li>Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków, umieść stronę kwadratowego szkiełka nakrywkowego na komorze taśmy i delikatnie zwolnij drugą stronę. Uważaj, aby na tym etapie nie przesunąć/nie zdeformować eksplantatu.</li>
		<li>Delikatnie usunąć nadmiar pożywki wykrwawiającej się z komory, naciskając komorę szkiełka na tkankę laboratoryjną. Szkiełko nakrywkowe będzie stabilnie osadzone na komorze szkiełkowej w celu obrazowania na żywo, ze względu na napięcie powierzchniowe ciekłego medium bez żadnego uszczelnienia.</li>
		<li>W przypadku długotrwałej hodowli (>6 godzin) należy użyć większej komory. W takich przypadkach można zastosować prostokątne szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm wraz z dwoma równoległymi pasami warstw taśmy na szkiełkach. Pomiędzy dwoma pasami taśmy można pozostawić szczelinę o szerokości ~1 mm, aby ułatwić dostęp powietrza do podłoża wzrostowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 3.3-3.8, aby przygotować więcej eksplantatów. Przygotowane eksplantaty wydłużają swoją oś ciała AP ze średnią prędkością ~30 μm/h i segmentują swoje somity w odstępach ~40 minut w temperaturze 25 °C (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A, Wideo 1).
	<ol>
		<li>W przypadku eksplantatów niewydłużających się, należy delikatnie docisnąć boki szkiełka przytrzymującego próbkę w kroku 3.8.2, jednocześnie odsysając nadmiar pożywki z tkanki laboratoryjnej. Alternatywnie, eksplantaty mogą być hodowane w komorach szkiełkowych z pojedynczą warstwą taśmy. Ponadto, chemiczna aktywacja powierzchni komory szkiełka kolagenem typu I spowoduje niewydłużające się eksplantaty (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B, Wideo 2).
		<ol>
			<li>Wykonaj wcześniej powlekanie komory kolagenem typu I, całkowicie pokrywając komory szkiełkowe 15-20 ml wstępnie rozcieńczonego roztworu kolagenu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. W tym protokole należy użyć okapu z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność. Na końcu ostrożnie wypłukać komory medium preparacyjnym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku zarodków w wieku powyżej 15 lat należy zamontować tkankę eksplantacyjną ogona z boku zamiast płaskiego (grzbietowo-brzusznego) mocowania (Wideo 3). Aby zapobiec drgawkom mięśni, dodaj 0,004% roztwór tricainy do pożywki hodowlanej jako środek znieczulający3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu na żywo
<ol>
	<li>Próbki obrazowe można obrazować albo na lunecie sekcyjnej do obrazowania w szerokim polu światła przechodzącego rozmiarów i okresów segmentacji somitu, albo za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego/konfokalnego/arkusza świetlnego przy użyciu transgenicznych linii reporterowych.</li>
	<li>Zrównoważyć temperaturę eksplantatów tkanek z temperaturą pokojową do obrazowania przez co najmniej 15 minut.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać bardziej precyzyjną kontrolę temperatury, użyj komercyjnego systemu kontroli temperatury zamontowanego na odwróconym mikroskopie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw interwały akwizycji obrazu na 2 - 10 minut w zależności od procesu biologicznego, który Cię interesuje. 
	UWAGA: Segmentacja somitów danio pręgowanego jest szybkim procesem, trwającym od 20 do 55 minut przy osiąganiu temperatur od 30 °C do 21,5 °C w całych zarodkach. Eksplantaty będą się wydłużać i segmentować ~ 30% wolniej niż całe zarodki.
	<ol>
		<li>Zwróć uwagę, aby pozostawić wystarczające opóźnienie między zestawami akwizycji kanału, aby uniknąć możliwej fototoksyczności dla żywej tkanki. Nie wystawiaj tkanki na działanie wiązki wzbudzającej przez więcej niż połowę czasu trwania obrazowania i zmniejsz intensywność wiązki tak bardzo, jak to możliwe. 
		UWAGA: Akumulacja reaktywnych form tlenu (ROS) jest generalnie główną przyczyną fototoksyczności w żywych próbkach4. Kwas askorbinowy jako wymiatacz ROS może być uzupełniany do pożywki wzrostowej o stężeniu 4 mM w celu buforowania aktywności ROS i łagodzenia fototoksyczności. Niekorzystne skutki fototoksyczności mogą być trudne do zauważenia podczas obrazowania na żywo. Eksplantaty ogona są korzystne w tym aspekcie, ponieważ niektóre wizualne markery fototoksyczności, takie jak zatrzymanie mitotyki, zahamowany rozwój tkanek (tj. tworzenie somitów, wydłużanie ogona) i rozpadająca się tkanka, są łatwiejsze do zauważenia. Szczegółowe informacje można znaleźć w podanym pliku referencyjnym4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj zarodków z wstrzykniętym RNA w pojedynczej fazie komórkowej, aby uzyskać obrazy 4D przeznaczone do segmentacji i analizy na poziomie rozdzielczości komórkowej.
	<ol>
		<li>Użyj 300 pg RNA z transkrybowanych in vitro błon i plazmidów markerów reporterowych fluorescencji jądrowej, takich jak pCS-membrane-ceruleanFP (plazmid Addgene #53749) lub pCS-memb-mCherry (plazmid Addgene #53750) w połączeniu z pCS2+ H2B-mTagBFP2 (plazmid Addgene #99267) lub pCS2+ H2B-TagRFP-T (plazmid Addgene #99271) w iniekcjach. Przykładowy film z markerami błony komórkowej i jąder znajduje się w filmie 4. 
		UWAGA: Średnia wielkość komórki tkanki PSM wynosi około ~5 μm średnicy, z czego jądra zawierają ~3 - 4 μm. W celu prawidłowej segmentacji komórek należy zarejestrować rozmiar piksela ~0,5 μm i przekrój z ~1 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne eksplantatów ogona
UWAGA: Tkanki wyhodowane po różnych scenariuszach preparacji (wydłużające, niewydłużające, pączki ogonowe rozcięte, pół PSM itp.) jako płasko zamontowane eksplantaty ogona5 mogą być odzyskane z komór szkiełkowych w celu dalszych kwantyfikacji immunologicznych interesujących białek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowany do barwienia eksplantatów difosforylowaną kinazą regulowaną sygnałem zewnątrzkomórkowym (ppERK) jako odczyt gradientu sygnalizacji FGF.
<ol>
	<li>Po uformowaniu somitów do pożądanego etapu, ostrożnie przesuń szkiełko nakrywkowe do połowy do rogu komory szkiełka bez podnoszenia.</li>
	<li>Za pomocą ~100 μl dodatkowej pożywki preparacyjnej w szklanej pipecie Pasteura odzyskaj eksplantaty ze szkiełka i przenieś je na 64-dołkową płytkę do hodowli komórkowych. 
	UWAGA: Począwszy od tego kroku, wszystkie wymiany roztworów można wykonać pod lunetą preparacyjną z oddzielną szklaną pipetą do stałych próbek. Zapewni to, że nie stracisz tkanek eksplantacji w studzienkach ani nie przeniesiesz ich między nimi.</li>
	<li>Po przeniesieniu wszystkich eksplantatów, odessać nadmiar pożywki z dołków jeden po drugim i wlać 100 μl 4% paraformaldehydu w PBS (PFA) do każdej studzienki. 
	ostrożność: PFA jest toksycznym roztworem o działaniu rakotwórczym. Podczas obchodzenia się z nimi należy używać odpowiednich środków ochrony indywidualnej.</li>
	<li>Utrwal eksplantaty w 64-dołkowej płytce w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na shakerze.
	<ol>
		<li>Eksplantaty tkanek są bardziej wrażliwe na deformacje niż całe zarodki. Dostosuj odpowiednio prędkość wytrząsarki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalacz wypłukać trzykrotnie 150 μl PBS-Tw (0,1% Tween20 w PBS). Pierwsze pranie zbierz do specjalnego pojemnika "Odpady PFA".</li>
	<li>Odwodnić eksplantaty w 4×5 minutowych krokach, zastępując ~40 μl roztworu za każdym razem 100% metanolem (MeOH). 
	ostrożność: MeOH to toksyczna substancja chemiczna, która jest lotna i łatwopalna. Pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i używaj odpowiednich środków ochrony osobistej do obsługi.</li>
	<li>Ostatnim etapem odwodnienia jest usunięcie całego roztworu ze studzienek i zastąpienie go 100 μl MeOH. Inkubować w temperaturze -20 °C przez 15 min. 
	UWAGA: Użyj specjalnego pojemnika "Odpady MeOH", aby zebrać roztwory do kroku 5.11.</li>
	<li>Dodać 50 μl MeOH i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Nawadniaj eksplantaty w krokach co 4×5 minuty, zastępując ~40 μl roztworu za każdym razem PBS-T (0,1% Triton-X 100 w PBS). Użyj specjalnego pojemnika "Odpady MeOH" do zebrania roztworów.</li>
	<li>Ostatnim etapem nawadniania jest usunięcie całego roztworu ze studzienek i zastąpienie go 100 μl PBS-T.</li>
	<li>W celu przepuszczalności tkanek należy traktować eksplantaty 1,5% Triton-X 100 w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Próbki należy przemyć MAB-D-T (0,1% detergentu Triton-X 100 i 1% dimetylosulfotlenku (DMSO) w 150 mM NaCl 100 mM buforze kwasu maleinowego o pH 7,5) 3×5 min. 
	ostrożność: DMSO jest łatwopalny i jest toksycznym mutagenem. Podczas obchodzenia się z nimi należy używać odpowiednich środków ochrony indywidualnej.</li>
	<li>Inkubować eksplantaty w 100 μl/studzienkowy roztwór blokujący surowicę (2% płodowa surowica bydlęca w MAB-D-T) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąp cały roztwór blokujący roztworem przeciwciała pierwszorzędowego o stężeniu 50-100 μl/basenik (rozcieńczenie 1:1000 mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ppERK w bloku surowicy). Próbki O/N inkubować (>16 h) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.</li>
	<li>Przemyć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego preparatem MAB-D-T przez 5×5 min.</li>
	<li>Próbki inkubować w roztworze przeciwciał drugorzędowych (Alexa Fluor 597 kozi anty-mysi IgG2b (1:200) i Hoechst 33342 (1:5000) w MAB-D-T) O/N w temperaturze 4 °C na wytrząsarce lub przez 3 godziny w temperaturze pokojowe><j.
	UWAGA: Zaczynając od tego kroku, przykryj 64-dołkową płytkę folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło wtórnych próbek traktowanych przeciwciałami. 
	ostrożność: Hoechst 33342 jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. Podczas obchodzenia się z nimi należy używać odpowiednich środków ochrony indywidualnej.</li>
	<li>Przemyć roztwór przeciwciała wtórnego PBS-Tw przez 3×5 min.</li>
	<li>Utrwalać próbki za pomocą PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć utrwalacz PBS-Tw i wyrównać próbki w 60% glicerolu. Zamontuj eksplantaty na szkiełkach mikroskopowych z lakierem do paznokci i 60% glicerolem do obrazowania. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki barwienia immunologicznego, zobacz Rysunek 3.</li>
</ol>

<ol><li>Assheton, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAssheton%2C+R+%22Growth+in+length%3A+Embryological+Essays%22">Growth in length: Embryological Essays</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).</li>
<li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%2C+3rd+edition%22">The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition</a>. , University of Oregon Press. Oregon. (1995).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (1700003), (2017).</li>
<li>Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+fold+change+of+Fgf+signaling+encodes+positional+information+for+segmental+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish.</a> Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).</li>
<li>Dubrulle, J., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fgf8+mRNA+decay+establishes+a+gradient+that+couples+axial+elongation+to+patterning+in+the+vertebrate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo.</a> Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).</li>
<li>Diez del Corral, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+FGF+and+Retinoid+Pathways+Control+Ventral+Neural+Pattern%2C+Neuronal+Differentiation%2C+and+Segmentation+during+Body+Axis+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension.</a> Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).</li>
<li>Stern, H. M., Hauschka, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tube+and+notochord+promote+in+vitro+myogenesis+in+single+somite+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants.</a> Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).</li>
<li>Manning, A. J., Kimelman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx16+and+Msgn1+are+required+to+establish+directional+cell+migration+of+zebrafish+mesodermal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors.</a> Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

W artykule przedstawiono szczegółowy protokół techniki eksplantacji hodowli tkankowej, którą opracowaliśmy i zastosowaliśmy w ostatnim czasie5 dla zarodków danio pręgowanego. Nasza technika opiera się na poprzednich metodach eksplantacji w organizmach modelowych piskląt8 i danio pręgowanego 9,10,11. Eksplantaty ogonowe przygotowane za pomocą tego protokołu mogą przetrwać nawet >12 ...

Segmentacja metameryczna organizmów jest powszechnie występująca w przyrodzie. Powtarzalne struktury są niezbędne dla funkcjonowania organów bocznych, takich jak kręgi, mięśnie, nerwy, naczynia, kończyny lub liście w planie budowy ciała1. W wyniku takich fizjologicznych i geometrycznych ograniczeń symetrii osiowej większość typów Bilateria – takich jak pierścienice, stawonogi i strunowce – wykazuje segmentację tkanek embrionalnych (np. ektodermy, mezodermy) wzdłuż osi przednio-tylnej.
Zarodki kręgowców sekwencyjnie dzielą mezodermę paraksjalną wzdłuż głównej osi ciała na somity, charakteryzujące się gatunkowymi odstępami czasowymi, liczbą oraz rozkładem wielkości. Pomimo takiej stabilności między poszczególnymi zarodkami w obrębie jednego gatunku, segmentacja somitów jest zróżnicowana pomiędzy gatunkami kręgowców. Segmentacja zachodzi w szerokim zakresie odstępów czasowych (od 25 min u danio przebrzmiałego do 5 h u ludzi), rozmiarów (od ~20 µm w somitach ogonowych u danio przebrzmiałego do ~200 µm w somitach tułowia u myszy) oraz liczebności (od 32 u danio przebrzmiałego do ~300 u węża kukurydzianego)2. Co ciekawsze, zarodki ryb mogą rozwijać się w szerokim zakresie temperatur (od ~20,5 °C do 34 °C w przypadku danio przebrzmiałego), zachowując nienaruszone somity z prawidłowym rozkładem wielkości poprzez kompensację zarówno odstępów segmentacyjnych, jak i szybkości elongacji osiowej. Poza tymi interesującymi cechami, danio przebrzmiały pozostaje użytecznym organizmem modelowym do badania segmentacji u kręgowców ze względu na zewnętrzny, synchroniczny i przejrzysty rozwój licznych zarodków z jednego miotu, a także dostępność narzędzi genetycznych. Z punktu widzenia mikroskopii niekorzystne jest to, że zarodki ryb kostnoszkieletowych rozwijają się na masywnym, sferycznym żółtku, co powoduje rozciąganie i zaokrąglanie gastrulującej tkanki wokół niego (Ryc. 1A). W niniejszym artykule przedstawiamy metodę spłaszczonej hodowli 3-D eksplantu tkanki ogonów danio przebrzmiałego. Ten system eksplantu omija ograniczenia sferycznego kształtu masy żółtka, umożliwiając wysokorozdzielcze obrazowanie na żywo zarodków ryb w celu badania wzorca formowania somitów.
<img alt="Schemat przygotowania szkiełka nakrywkowe z embrionem; zilustrowane etapy ekstrakcji i rozmieszczenia żółtka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61981/61981fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: System eksplantacji w komorze szkiełka dla embrionów zebrafish. (A) Embriony zebrafish mają zalety w obrazowaniu na żywo, takie jak przejrzystość gastrulującej tkanki embrionalnej (kolor niebieski), jednak tkanka ta formuje się wokół masywnej, sferycznej masy żółtka (kolor żółty), co uniemożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości w bliskiej odległości od obiektywu w nienaruszonych embrionach. Eksplanty ogona można wypreparować, zaczynając od cięcia nożem mikrosurgicalnym (kolor brązowy) w tkance przedniej części somitów (kolor czerwony) i kontynuując na granicy z żółtkiem w części tylnej. (B) Wypreparowane eksplanty ogona można umieścić na szkiełku nakrywkowym (kolor jasnoniebieski) w orientacji grzbietowo-brzusznej, utrzymując tkankę nerwową (kolor jasnoszary) na górze, a strunę grzbietową (kolor ciemnoszary) na dole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61981/61981fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml Sub-Q z igłą PrecisionGlide</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>REF 309597</td><td>do dekorionacji zarodków i manipulacji</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol, Bezwodny</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>do barwienia</td></tr><tr><td>immunologicznego Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100&razy;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>do pożywek preparacyjnych Bezwodny</td></tr><tr><td>chlorek wapnia w proszku</td><td>499609 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>do pożywek preparacyjnych</td></tr> tkanek <tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel, #10 Stal nierdzewna</td><td>Integra-Miltex</td><td>MIL4-411</td><td>do przygotowania studzienek na suwaki taśmowe</td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan etylu sól metanosulfonianu (Trikaina)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td> <td>(opcjonalnie) do znieczulania tkanek starszych niż 20 somitów stadium</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td> <td>ThermoFisher</td><td>A3160601</td><td>dodatkowo do pożywek do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG2b, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat#A-21145; RRID: AB_2535781</td><td>przeciwciało drugorzędowe do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>L-15 Pożywka z L-glutaminą bez czerwieni fenolowej</td><td>GIBCO</td><td>21083-027</td><td>do podłoża do preparowania tkanek</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>179337 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Mikrochirurgiczny nóż rogówkowy 2,85 mm z kątową końcówką z podwójnym skosem</td><td>Specjalizacje chirurgiczne</td><td>72-2863</td><td>do rozwarstwiania tkanek</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty-ppERK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#M8159; RRID: AB_477245</td><td>do barwienia immunologicznego ppERK</td></tr><tr><td>Odczynnik NucRed Live 647 ReadyProbes</td><td>Invitrogen</td><td>R37106</td> <td>(opcjonalnie) do barwienia na żywo jąder komórkowych</td></tr><tr><td>Proszek paraformaldehydowy, 95%</td> <td>158127 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>do utrwalania próbek do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Roztwór do powlekania kolagenu Rat Tail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122-20</td> <td>(opcjonalnie) do chemicznej aktywacji komór ślizgowych</td></tr><tr><td>Inkubator Stage Top</td><td>Tokai Hit</td><td>Tokai-hit-STXG</td> <td>(opcjonalnie) do kontroli temperatury podczas obrazowania na żywo</td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma 3/4''</td><td>Scotch</td><td>S-9782</td><td>do przygotowania studni szkiełkowych</td></tr><tr><td>taśmowych Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Danio pręgowany: Tg( actb2:2xMCP-NLS-EGFP)</td><td>Campbell et&nbsp;al., 2015</td><td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4</td><td>transgeniczna ryba z jądrowym zlokalizowanym EGFP</td></tr><tr><td>Danio pręgowany: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)</td><td>Cooper et&nbsp;al., 2005</td><td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75</td><td>transgeniczna ryba z zlokalizowaną błoną komórkową EGFP</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa hodowla eksplantatów ogonowych w celu zbadania segmentacji kręgowców u danio pręgowanego

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Zarodki kręgowców tworzą główną oś ciała jako powtarzające się somity, prekursory kręgów, mięśni i skóry. Somity stopniowo segmentują się od mezodermy presomitycznej (PSM), gdy koniec ogona zarodka wydłuża się ku tyłowi. Somity tworzą się z regularną okresowością i skalą wielkości. Danio pręgowany jest popularnym organizmem modelowym, ponieważ jest genetycznie podatny i ma przezroczyste zarodki, które pozwalają na obrazowanie na żywo. Niemniej jednak podczas somitogenezy zarodki ryb są owijane wokół dużego, zaokrąglonego żółtka. Taka geometria ogranicza obrazowanie na żywo tkanki PSM w zarodkach danio pręgowanego, szczególnie w wyższych rozdzielczościach, które wymagają bliskiej odległości roboczej obiektywu. W tym miejscu przedstawiamy spłaszczoną metodę hodowli tkankowej 3D do obrazowania na żywo eksplantatów ogona danio pręgowanego. Eksplantaty ogonowe naśladują nienaruszone zarodki, wykazując proporcjonalne spowolnienie wydłużania osi i skracanie długości somitów rostrocaudalnych. Jesteśmy ponadto w stanie zatrzymać prędkość wydłużania osi poprzez hodowlę eksplantatów. To po raz pierwszy pozwala nam rozplątać chemiczne dane wejściowe gradientów sygnalizacyjnych od mechanistycznego wkładu wydłużenia osiowego. W przyszłych badaniach metoda ta może być połączona z konfiguracją mikroprzepływową, aby umożliwić kontrolowane w czasie perturbacje farmaceutyczne lub badania przesiewowe segmentacji kręgowców bez obaw o penetrację leków.

Niniejszy protokół umożliwia hodowlę żywych eksplantów ogona danio-ostrolepis w płaskiej geometrii. Hodowla tkankowa oferuje trzy główne zalety w porównaniu z pełnymi embrionami: 1) kontrolę szybkości wydłużania osi, 2) kontrolę nad różnymi źródłami sygnałów (morfogenów) poprzez prostą dyssekcję oraz 3) obrazowanie żywych tkanek z wysokim powiększeniem i wysoką aperturą numeryczną (NA) w bezpośredniej bliskości obiektywu.
Komory szkiełek niepoddane obróbce chemicznej umożliwiają wydłużenie osi...

Tutaj prezentujemy protokół 3-D hodowli tkankowej tylnej osi ciała danio pręgowanego, umożliwiający badanie segmentacji kręgowców na żywo. Ten model eksplantatu zapewnia kontrolę nad wydłużaniem osi, zmianą źródeł morfogenu i obrazowaniem na żywo na poziomie tkankowym w rozdzielczości subkomórkowej.

Trójwymiarowa hodowla eksplantatów ogonowych w celu zbadania segmentacji kręgowców u danio pręgowanego

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

Eksplantaty ogona zebry 3D pozwalają nam w pełni wykorzystać przezroczystość zarodków danio pręgowanego podczas rozwoju somitów i segmentacji kręgowców. Napełnij pusty zbiornik współpracujący wodą z systemu rybnego. Wyczyść sitko wodą systemową.Podnieś bariery między parami godowymi. Selektywnie przenieś parę ryb do zbiornika ze słodką wodą. Zbierz zarodki w sitku poprzez transfery wody z pustym zbiornikiem.Opłucz zebrane zarodki wodą z systemu rybnego i odwróć na szalce Petriego. Narzędzia do preparowania szkliwa etanolowego. Wykonaj dwie warstwy taśm na slajdach.Wytnij poziome boki głębokich komór. Kompletne cięcia komorowe z pionowymi bokami. Odklej taśmę od powierzchni komory.Wlej pożywkę do hodowli komórkowych do probówki. Wymieszać chlorek wapnia o stężeniu końcowym 2,8 milimolowym. Dodaj roztwór antybiotyku.Podwielokrotne pożywki preparacyjne w osobnej probówce. Uzupełnij płodową surowicę bydlęcą, aby uzyskać pożywkę do hodowli tkankowej. Odkorzyjuj zarodki za pomocą igieł.Opłucz zarodki w naczyniu słodkowodnym i zbierz je do eksplantacji. Ustabilizuj zarodek za pomocą igły i rozpocznij usuwanie jarzma. Odetnij resztki chusteczek.Przenieś eksplantaty na szkiełko nakrywkowe. Spłaszcz tkankę i odessaj nadmiar pożywki za pomocą pipety. Umieścić szkiełko nakrywkowe na podłożu wzrostowym zawierającym komorę szkiełkową.Umieść tkankę z eksplantatu na chusteczce higienicznej. Nałóż olejek immersyjny na obiektyw. Zamontuj komorę szkiełka na mikroskopie.Dostosuj kanały laserowe do akwizycji obrazu. Sprawdź limity warstwy Z próbki. Skonfiguruj obrazowanie czasowe i warstwy z.System eksplantacji ogona 3D utrzymuje integrację komórek z pąkiem ogonowym i nadmierne wydłużenie w stanie nienaruszonym, jak w przypadku całych zarodków. Możliwe jest również zatrzymanie nadmiernego wydłużenia poprzez chemiczną aktywację powierzchni kolagenem typu pierwszego. System eksplantatów ogona zebry pręgowanego 3D pozwala nam wykorzystać przezroczystość zarodków danio pręgowanego, umożliwiając nam wykonywanie obrazów mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości i bliskich obiektywowi.Poza tym pozwala nam oddzielić nadmiar wydłużenia od sygnalizacji morfogenowej, a także kontrolować źródła sygnalizacji morfogenu za pomocą prostych metod preparacji.

a-3-d-tail-explant-culture-to-study-vertebrate-segmentation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Somitogeneza to rytmiczny proces rozwojowy, który przestrzennie kształtuje oś ciała zarodków kręgowców. Wcześniej opracowaliśmy transgeniczne linie ryb danio pręgowanego, które wykorzystują fluorescencyjne reportery do obserwacji cyklicznych genów napędzających ten proces. Tutaj hodujemy rozproszone komórki z tych linii i obrazujemy ich oscylacje w czasie in vitro.

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych u danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, opracowaliśmy ilościowy test regeneracyjny linii bocznej, który może być zastosowany do modeli chorób u dorosłych ryb danio pręgowanego. Test polegał na rozdzielczości na poziomie 1) neuromastu i 2) poszczególnych komórek rzęsatych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

Prezentujemy protokół do uchwycenia dynamiki regeneracji płetw ogonowych larw danio pręgowanego w skali całej tkanki za pomocą stereomikroskopii opartej na jasnym polu. Technika ta umożliwia uchwycenie dynamiki regeneracji z rozdzielczością pojedynczej komórki. Metodologię tę można dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie do filmów poklatkowych.

Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Tutaj opisujemy metodę zmniejszania wielkości zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnych procesów rozwojowych. Technika ta umożliwia badanie skalowania wzorca i odporności rozwojowej na zmiany rozmiaru.

Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Eksplantaty blastodermy danio pręgowanego są generowane przez izolowanie komórek embrionalnych od endogennych centrów sygnalizacyjnych we wczesnym zarodku, tworząc stosunkowo naiwne klastry komórek, które łatwo manipulować i hodować ex vivo. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące tworzenia takich eksplantatów i demonstruje ich użyteczność, pytając o role sygnalizacji węzłowej podczas gastrulacji.

Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy skuteczny, łatwy i szybki protokół hodowli 3D do tworzenia sferoid dwóch linii komórkowych danio pręgowanego (Danio rerio): ZEM2S (zarodek) i ZFL (normalny hepatocyt).

Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego

Poznaj trójwymiarową hodowlę eksplantatów ogonowych Danio rerio do badania segmentacji kręgowców. Ta metoda umożliwia obserwację na żywo dynamiki tkanek i kontrolę źródeł morfogenów.

Trójwymiarowa hodowla eksplantatów ogonowych w celu zbadania segmentacji kręgowców u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów