Name: Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę znakowania kowalencyjnego dietylopirowęglanem do analizy struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas. Technika ta umożliwia identyfikację dostępnych reszt aminokwasowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony National Institutes of Health (NIH) w ramach grantu R01 GM075092. Spektrometr masowy Thermo Orbitrap Fusion wykorzystany do pozyskania części opisanych tutaj danych został pozyskany dzięki środkom z grantu National Institutes of Health S10OD010645.

1. Przygotowanie białek i odczynników
UWAGA: Niniejszy protokół zawiera przykładowy schemat znakowania białka za pomocą DEPC. Niektóre wymienione warunki i stężenia odczynników mogą różnić się w zależności od wybranego białka.
<ol>
	<li>Przygotować wszystkie roztwory reagentów w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przygotuj roztwór białka o żądanym stężeniu, zazwyczaj w zakresie od kilkunastu do kilkudziesięciu &#181;Mw 10 mM buforze kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) o pH 7,4. Alternatywnie, w przypadku gdy próbka zawiera bufor nukleofilowy, który mógłby reagować z DEPC, należy przeprowadzić wymianę buforu w istniejącym roztworze białka na 10 mM MOPS o pH 7,4. Można stosować również inne bufory (np. bufor fosforanowo-solny), pod warunkiem, że nie posiadają one nukleofilowych grup funkcyjnych.</li>
	<li>Przygotuj 10 mM roztwór DEPC w suchym acetonitrylu (ACN), odmierzając odpowiednią objętość pipetą 1.45 &#181;L roztworu stokowego DEPC o stężeniu 6,9 M do 98.55 &#181;L ACN. 
	UWAGA: Nie istnieje jeden zestaw stężeń, który będzie odpowiedni dla każdego białka, choć optymalne stężenia można oszacować na podstawie liczby reszt His i Lys23Na przykład, z 50 &#181;L z 50 &#181;M &#946;roztwór $\beta$-mikroglobuliny, poddać białko reakcji z 0.2 &#181;L z 100 mM DEPC, aby uzyskać końcowe stężenie DEPC wynoszące 200 &#181;M (równe 4-krotności stężenia białka), aby zapewnić pożądany stosunek molowy w tym ogólnym przykładzie (Tabela 1). Znakowanie DEPC to 2nd reakcja rzędu pierwszego, zatem zmiana stężenia białka lub DEPC w mieszaninie reakcyjnej spowoduje zmianę szybkości znakowania.</li>
	<li>Przygotuj 1 M roztwór imidazolu, odważając 10 mg imidazolu i rozpuszczając go w 146.9 &#181;L wody klasy HPLC.</li>
</ol>
2. Kowalencyjne znakowanie nienaruszonego białka
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę kąpieli wodnej na 37 °C i poczekaj, aż temperatura się ustabilizuje. 
	UWAGA: Stężenia i objętości odczynników dla przykładowego protokołu znakowania znajdują się w Tabeli 1.</li>
	<li>W nowej probówce do mikrocentryfugi zmieszaj bufor MOPS i roztwór białka w objętościach podanych w Tabeli 1.</li>
	<li>Do białka i buforu dodaj 0,2 µL roztworu DEPC, upewniając się, że otrzymany roztwór został odpowiednio wymieszany, a następnie umieść probówkę z mieszaniną reakcyjną w kąpieli wodnej o temperaturze 37&#160;°C na 1 minutę. 
	UWAGA: Dodana objętość ACN nie powinna przekraczać 1% całkowitej objętości reakcji, aby uniknąć zaburzenia struktury białka podczas reakcji znakowania. Czas reakcji zależy od użytkownika, choć 1-minutowa reakcja w warunkach przykładu minimalizuje nadmierne znakowanie i potencjalną hydrolizę DEPC14.</li>
	<li>Po 1 minucie wyjmij probówkę z mieszaniną reakcyjną z kąpieli wodnej i przerwij reakcję, dodając 1 µL roztworu imidazolu 1 M w celu usunięcia pozostałego, niezereagowanego DEPC. 
	UWAGA: Końcowe stężenie imidazolu w mieszaninie reakcyjnej powinno być 50-krotnie większe od stężenia DEPC w mieszaninie reakcyjnej. Zapewni to usunięcie pozostałego, niezereagowanego DEPC.</li>
</ol>
3. Przygotowanie trawienia białek do analizy LC-MS bottom-up
UWAGA: Należy dobrać warunki trawienia odpowiednie dla badanego białka. Typowe etapy obejmują rozfałdowanie białka oraz redukcję i alkilację wszelkich mostków disiarczkowych.
<ol>
	<li>Rozwiń białko, dodając do mieszaniny reakcyjnej odpowiedni odczyn rozwijający. 
	UWAGA: Powszechnie stosowane środki rozwijające to ACN, mocznik oraz chlorek guanidyny (GuHCl).</li>
	<li>Przygotuj roztwory Tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) i jodoacetamidu (IAM), odważając po 5 mg każdego z nich i rozpuszczając je w nowych probówkach do mikrocentryfugi odpowiednio w 174,4 i 270,3 µL buforu MOPS 10 mM o pH 7,4, przeznaczonych do etapów redukcji i alkilacji.</li>
	<li>Zredukuj mostki disiarczkowe, dodając 2 µL roztworu TCEP 10 mM (stężenie końcowe 2 mM w mieszaninie reakcyjnej) do mieszaniny reakcyjnej i inkubując przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Końcowe stężenie TCEP powinno być 40-krotnie wyższe od stężenia białka w przeliczeniu na jeden mostek disiarczkowy obecny w roztworze.</li>
	<li>Alkiluj zredukowane cysteiny, dodając 4 µL roztworu IAM 100 mM (stężenie końcowe 4 mM w mieszaninie reakcyjnej) i inkubując przez 30 minut w ciemności. IAM jest światłoczuły i ulega rozkładowi pod wpływem bezpośredniego światła. 
	UWAGA: Końcowe stężenie IAM w roztworze powinno być dwukrotnie wyższe od stężenia użytego dla TCEP, czyli 80-krotnością stężenia białka w przeliczeniu na jeden mostek disiarczkowy.</li>
	<li>Przetraw białko odpowiednim enzymem, takim jak trypsyna lub chymotrypsyna. W przypadku białek znakowanych DEPC zazwyczaj wystarczający jest stosunek białka do enzymu 10:1 podczas 3-godzinnego trawienia w temperaturze 37&#160;°C z użyciem enzymu unieruchomionego przy szybkości wstrząsania 300 uderzeń/min. Patrz: Dyskusja.</li>
	<li>Po trawieniu oddziel unieruchomiony enzym od przetrawionych peptydów poprzez wirowanie przy 12 0 obr./min przez 5 minut.</li>
	<li>Przeanalizuj próbkę niezwłocznie metodą LC-MS/MS lub zamroź ją gwałtownie w ciekłym azocie, aby zminimalizować degradację próbki i utratę znakowania. Próbki zamrożone gwałtownie przechowuj w temperaturze &lt; -20 °C do momentu przeprowadzenia analizy LC-MS/MS.</li>
</ol>
4. Analiza LC-MS/MS
UWAGA: Standardowe parametry LC-MS/MS dla proteomiki bottom-up mogą być wykorzystane do identyfikacji znakowanych miejsc w proteolitycznych fragmentach peptydów. Poniżej przedstawiono ogólny przykład.
<ol>
	<li>Oddziel peptydy znakowane DEPC, wykorzystując stacjonarną fazę odwróconą C18. Użyj typowej mobilnej fazy LC składającej się z dwóch rozpuszczalników: (A) woda + 0,1% kwasu mrówkowego oraz (B) ACN + 0,1% kwasu mrówkowego, stosując gradient (np. Rysunek 2), aby uzyskać najlepszą separację peptydów. 
	UWAGA: Czas separacji można zoptymalizować w zależności od złożoności próbki, a szybkość przepływu fazy mobilnej zależy od tego, czy stosowana jest kapilarna, czy nano LC.</li>
	<li>Użyj spektrometru mas zdolnego do prowadzenia analizy on-line LC-MS oraz MS/MS, aby zidentyfikować miejsca modyfikacji DEPC w peptydzie. W naszych eksperymentach z sukcesem wykorzystaliśmy kilka typów spektrometrów mas. Odpowiedni będzie każdy spektrometr mas zdolny do automatycznego przeprowadzania analizy MS/MS wielu peptydów w trakcie analizy LC-MS. Istotne parametry MS obejmują: napięcie źródła ESI = -400 V dla standardowego ESI; -20 V dla nanospray; rozdzielczość Orbitrap = 60 00; czas dynamicznej ekskluzji = 30 s; typ aktywacji MS/MS: CID, ETD lub oba; zakres skanowania masy = 200-2 0; automatyczna kontrola wzmocnienia (Automatic Gain Control) = 4,0E5 (MS1 w Orbitrap) i 5,0E4 (MS2 w liniowej pułapce jonowej kwadrupolowej).</li>
	<li>Załaduj i wstrzyknij strawioną, znakowaną próbkę białka do systemu LC i rozpocznij akwizycję LC-MS/MS. Jeśli próbka była zamrożona metodą flash-freezing, rozmroź ją przed analizą. Przekieruj eluat LC do odpadu przez pierwsze 5 minut, aby uniknąć dostania się nadmiaru soli do źródła ESI. 
	&#8203;UWAGA: Zazwyczaj stosuje się pętlę wtryskową o pojemności 5 µL, co pozwala na wstrzyknięcie do LC-MS/MS około 2,5 µg białka. Zależy to od warunków załadunku LC, aby nie zapchać wtryskiwacza próbek.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Zidentyfikuj miejsca znakowania DEPC i określ ilościowo pola piku peptydów, korzystając z odpowiedniego oprogramowania dla zastosowanego spektrometru masowego.</li>
	<li>Należy uwzględnić dodanie DEPC (72,02 Da) oraz karbamidometylowanie (57,02 Da) jako modyfikacje zmienne. Dodatkowe parametry wyszukiwania dla analizy MS/MS są następujące: maksymalna liczba pominiętych cięć = 3; typy jonów fragmentacyjnych = b i y; tolerancja m/z prekursora = 10 ppm (wartość ta powinna być wyższa w przypadku użycia spektrometru mas z pułapką jonową typu kwadrupol); tolerancja m/z fragmentu = 0,5 Da (wartość ta powinna być niższa w przypadku użycia spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości do skanowania jonów produktów); ładunek prekursora = 1-4. 
	UWAGA: Różne algorytmy przeszukiwania baz danych stosują różne systemy punktacji, a wiele z nich może mieć trudności z identyfikacją peptydów zmodyfikowanych DEPC, ponieważ poziom modyfikacji może być niski. W celu zidentyfikowania większej liczby znakowanych peptydów konieczna może być korekta progu punktowego. W takim przypadku należy przeprowadzić ręczną analizę danych MS/MS w celu weryfikacji peptydów o niskiej punktacji. Produkt hydrolizy znacznika DEPC nie jest uwzględniany w przeszukiwaniu danych, ponieważ hydrolizowany DEPC nie wykazuje już reaktywności wobec nukleofilowych łańcuchów bocznych.</li>
	<li>Wyznacz procenty modyfikacji na poziomie poszczególnych reszt, wykorzystując pola pików chromatograficznych zmodyfikowanych i niemodyfikowanych wersji peptydów. 
	UWAGA: Należy wziąć pod uwagę każdy peptyd zawierający interesującą nas zmodyfikowaną resztę, a wszystkie uwzględnione stany ładunku muszą być obecne we wszystkich mierzonych próbkach. Peptydy wykazujące różną wydajność jonizacji i eluujące w różnym czasie sprawiają, że wartość ta jest miarą względną, a nie bezwzględną modyfikacji konkretnego miejsca. 
	<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/61983/61983eq01.jpg" /> 
	gdzie Ai,z reprezentuje powierzchnię piku dowolnego peptydu (i), który zawiera interesującą nas pozostałość, i uwzględnia wszystkie wykryte stany ładunku (z).</li>
	<li>Należy określić, czy zmiana w znakowaniu pomiędzy próbką kontrolną a doświadczalną jest istotna, stosując ocenę statystyczną. Typowo wykonuje się trzy pomiary powtórne dla każdej próbki, a najczęściej wykorzystywanym narzędziem są testy t z 95% lub 99% przedziałem ufności.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kroki krytyczne Należy wziąć pod uwagę kilka punktów dotyczących projektowania eksperymentów, aby zapewnić wiarygodne wyniki etykietowania. Po pierwsze, aby zmaksymalizować znakowanie białek, konieczne jest unikanie z silnie nukleofilowymi grupami (np. Tris), ponieważ mogą one reagować z DEPC i zmniejszać zakres znakowania. Można sobie również wyobrazić, że takie mogą reagować z oznakowanymi pozostałościami, powodując usunięcie etykiety, a tym samym utratę informacji strukturalnych. Zalecamy MOPS jako bufor...

Białka są niezbędnymi biomolekułami w praktycznie każdym procesie fizjologicznym. Różnorodność funkcji pełnionych przez białka jest możliwa ze względu na struktury, które przyjmują, oraz interakcje, jakie mają z innymi biomolekułami. Aby zrozumieć funkcję białek na głębszym poziomie, potrzebne są narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które wyjaśnią te ważne cechy strukturalne i interakcje. Tradycyjnie, krystalografia rentgenowska, kriogeniczna mikroskopia elektronowa i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) dostarczyły pożądanych szczegółów na poziomie atomowym, aby ujawnić strukturę białka. Jednak wiele układów białkowych nie może być zbadanych za pomocą tych technik ze względu na słabe zachowanie krystalizacji, ograniczoną dostępność białek, nadmierną niejednorodność próbki lub ograniczenia masy cząsteczkowej. W związku z tym pojawiły się nowsze metody analizy, które przezwyciężają te ograniczenia. Jedną z pojawiających się technik, które mogą dostarczyć informacji o strukturze białek, jest spektrometria mas.
Spektrometria mas (MS) mierzy stosunek masy do ładunku cząsteczki (m/z), więc informacje strukturalne wyższego rzędu białka muszą być uzyskane poprzez zakodowanie pożądanej informacji strukturalnej w masie białka. Opracowano kilka podejść do kodowania tych informacji, w tym wymianę wodorowo-deuterową (HDX)1,2,3,4, chemiczne sieciowanie (XL)5,6, oraz etykietowanie kowalencyjne (CL)7,8,9, 10. W HDX wodory amidowe w szkielecie są wymieniane przez nieco masywniejsze deutery w tempie zależnym od dostępności rozpuszczalnika i stopnia wiązania H. Zakres HDX można zlokalizować poprzez szybkie trawienie białka na fragmenty peptydu przed oddzieleniem i pomiarem tych fragmentów za pomocą spektrometru mas lub przez dysocjację białka w eksperymencie odgórnym. Określenie kursu wymiany dostarcza dalszych informacji na temat dynamiki białek. HDX okazał się cennym narzędziem do charakteryzowania struktury białek pomimo wyzwań związanych z wymianą wsteczną i potrzebą specjalistycznego sprzętu w celu maksymalizacji odtwarzalności. W XL-MS białka reagują z odczynnikami dwufunkcyjnymi, które kowalencyjnie łączą sąsiednie łańcuchy boczne reszt w danym białku lub między dwoma białkami. W ten sposób XL-MS może zapewnić ograniczenia odległości, które można wykorzystać do scharakteryzowania struktury białka. Regiony białka, które są usieciowane, można zidentyfikować za pomocą trawienia proteolitycznego, a następnie analizy metodą chromatografii cieczowej (LC)-MS. Chociaż XL-MS jest wszechstronnym narzędziem, które było używane do badania różnych kompleksów białkowych, w tym wewnątrz komórek, identyfikacja produktów XL jest trudna i wymaga specjalistycznego oprogramowania.
CL-MS pojawił się ostatnio jako komplementarne, a czasem alternatywne narzędzie oparte na MS do badania struktury i interakcji białek. W CL-MS białko lub kompleks białkowy jest kowalencyjnie modyfikowany za pomocą odczynnika jednofunkcyjnego, który może reagować z łańcuchami bocznymi wystawionymi na działanie rozpuszczalnika (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Porównując zakresy modyfikacji białka lub kompleksu białkowego w różnych warunkach, można ujawnić zmiany konformacji, miejsca wiązania i interfejsy białko-białko. Po reakcji CL informacje specyficzne dla miejsca, często na poziomie pojedynczego aminokwasu, można uzyskać za pomocą typowych procesów proteomiki typu bottom-up, w których białka są trawione proteolitycznie, fragmenty peptydowe są rozdzielane przez LC, a zmodyfikowane miejsca są identyfikowane za pomocą tandem MS (MS/MS). Bogata historia chemii biokoniugatów sprawiła, że dostępnych jest wiele odczynników do eksperymentów CL-MS. Odczynniki CL dzielą się na dwie ogólne kategorie: (i) specyficzne i (ii) niespecyficzne. Określone odczynniki reagują z pojedynczą grupą funkcyjną (np. wolne aminy)8,10 i są łatwe do wdrożenia, ale zwykle dostarczają ograniczonych informacji strukturalnych. Odczynniki niespecyficzne reagują z szeroką gamą łańcuchów bocznych, ale często wymagają specjalistycznego sprzętu, takiego jak lasery lub źródła synchrotronowe, do wytworzenia tych wysoce reaktywnych gatunków. Rodniki hydroksylowe są najczęściej stosowanym odczynnikiem niespecyficznym, który został zastosowany w eksperymentach z śladem rodników hydroksylowych (HRF)7,11,12,13 eksperymentach w celu zbadania szerokiego zakresu białek i kompleksów białkowych w różnych warunkach.
Nasza grupa badawcza z powodzeniem wykorzystała inny stosunkowo niespecyficzny odczynnik o nazwie dietylopirowęglan (DEPC) do badania struktury i interakcji białek w kontekście eksperymentów CL-MS14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC oferuje prostotę specyficznych odczynników do znakowania (tj. do przeprowadzenia reakcji nie jest potrzebny specjalistyczny sprzęt), jednocześnie reagując z maksymalnie 30% aminokwasów w przeciętnym białku. Jako wysoce elektrofilowy odczynnik, DEPC jest zdolny do reagowania z N-końcem i nukleofilowymi łańcuchami bocznymi reszt cysteiny, histydyny, lizyny, tyrozyny, seryny i treoniny. Zazwyczaj generowany jest pojedynczy produkt tych reakcji, co powoduje wzrost masy o 72,02 Da. Ten pojedynczy rodzaj produktu kontrastuje z nawet 55 różnymi produktami, które mogą być wytwarzane, gdy białka reagują z rodnikami hydroksylowymi7. Tak prosta chemia ułatwia identyfikację oznakowanych miejsc.
Tutaj udostępniamy protokoły do badania struktury i interakcji białek opartych na DEPC. Opisano szczegóły związane z przygotowaniem odczynników, reakcjami z białkiem DEPC, warunkami trawienia białek, parametrami LC-MS i MS/MS oraz analizą danych. Pokazujemy również użyteczność znakowania DEPC, podając przykładowe wyniki interakcji białko-metal, białko-ligand i białko-białko, a także białek ulegających zmianom strukturalnym po podgrzaniu.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3448</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego</td><td>Millipore Sigma</td><td>M9381</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap RSLC C18 Kolumna</td><td>Thermo Scientific</td><td>164537</td><td>300 &mu; m x 15 cm, C18, 2 &mu; m, 100 A</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-1</td><td></td></tr><tr><td>Dietylopirowęglan</td><td>Milipor Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Unieruchomiona chymotrypsyna</td><td>ProteoChem</td><td>g4105</td><td></td></tr><tr><td>Unieruchomiona trypsyna, TPCK Poddane obróbce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20230</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Millipore Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-karboksyetylo)fosfina</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4706</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Scharakteryzowanie struktury wyższego rzędu białka jest niezbędne do zrozumienia jego funkcji. Spektrometria mas (MS) stała się potężnym narzędziem do tego celu, szczególnie w przypadku układów białkowych, które są trudne do zbadania tradycyjnymi metodami. Aby zbadać strukturę białka za pomocą stwardnienia rozsianego, w roztworze przeprowadza się określone reakcje chemiczne, które kodują informacje strukturalne białka w jego masie. Jednym ze szczególnie skutecznych podejść jest użycie odczynników, które kowalencyjnie modyfikują łańcuchy boczne aminokwasów dostępnych w rozpuszczalniku. Reakcje te prowadzą do wzrostu masy, który może być zlokalizowany z rozdzielczością na poziomie pozostałości w połączeniu z trawieniem proteolitycznym i tandemową spektrometrią mas. W tym miejscu opisujemy protokoły związane ze stosowaniem dietylopirowęglanu (DEPC) jako odczynnika do znakowania kowalencyjnego wraz z wykrywaniem stwardnienia rozsianego. DEPC jest wysoce elektrofilową cząsteczką zdolną do znakowania do 30% reszt w przeciętnym białku, zapewniając w ten sposób doskonałą rozdzielczość strukturalną. DEPC jest z powodzeniem stosowany w połączeniu ze stwardnieniem rozsianym w celu uzyskania informacji strukturalnych dla małych białek jednodomenowych, takich jak β2-mikroglobulina, do dużych białek wielodomenowych, takich jak przeciwciała monoklonalne.

Identyfikacja miejsc modyfikacji DEPC i procentów modyfikacji 
Przyrost masy wynikający z znakowania kowalencyjnego można zmierzyć na poziomie (a) białka w całości oraz (b) peptydów8,9. Na poziomie białka w całości, rozkład gatunków białek z różną liczbą znaczników można uzyskać bezpośrednio z analizy lub LC-MS próbek białek poddanych znakowaniu. Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje strukturalne (tj. dane o znakowaniu w konkretnych miejscach)...

Opisano eksperymentalne procedury znakowania kowalencyjnego na bazie dietylopirowęglanów z detekcją spektrometryczną mas. Wodorowęglan dietylu jest po prostu mieszany z białkiem lub kompleksem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania, co prowadzi do modyfikacji reszt aminokwasowych dostępnych w rozpuszczalniku. Zmodyfikowane pozostałości można zidentyfikować po mineralizacji proteolitycznej i analizie metodą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas.

Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Scharakteryzowanie struktury białka jest niezbędne do zrozumienia jego funkcji. Spektrometria mas stała się potężnym narzędziem do tego celu, szczególnie w przypadku układów białkowych, które są trudne do zbadania tradycyjnymi metodami. Aby zbadać strukturę białka według specyfikacji masy, w roztworze przeprowadza się określone reakcje chemiczne, które kodują informacje strukturalne białka w jego masie.Jednym ze szczególnie skutecznych podejść jest użycie odczynników, które kowalencyjnie modyfikują, rozwiązując łańcuchy boczne dostępnych aminokwasów. Reakcje te prowadzą do wzrostu masy, który może być zlokalizowany z rozdzielczością poziomu pozostałości w połączeniu z trawieniem proteolitycznym i tandemową spektrometrią mas. Tutaj opisaliśmy protokoły związane ze stosowaniem pirowęglanu dietylu lub DEPC jako odczynnika do znakowania kowalencyjnego wraz z wykrywaniem specyfikacji masy.DEPC jest wysoce elektrofilową cząsteczką zdolną do znakowania do 30% reszt w przeciętnym białku, zapewniając w ten sposób doskonałą rozdzielczość strukturalną. DEPC jest z powodzeniem stosowany w połączeniu ze specyfikacją masy w celu uzyskania informacji strukturalnych dla wielu różnych białek. Zacznij od przygotowania buforowanego roztworu interesującego Cię białka o stężeniu w zakresie kilkudziesięciu mikromolowców.Powszechnie używamy 10-milimolowego bufora MOPS o pH 7,4. Alternatywnie, istniejący roztwór białkowy może być wymieniony buforem na MOPS lub inny bufor, jeśli oryginalna próbka zawiera bufor zawierający nukleofilowe grupy funkcyjne. Konieczne jest, aby bufor nie zawierał nukleofilowych grup funkcyjnych, ponieważ będą one zakłócać reakcję białka DEPC.W innej mikroprobówce przygotuj roztwór podstawowy 100 milimolowego DEPC w suchym acetonitrylu. Przygotowanie roztworu podstawowego w suchym acetonitrylu jest konieczne, aby zapobiec hydrolizie DEPC. W nowej mikroprobówce przygotować roztwór jednego molowego imidazolu w wodzie klasy HPLC.W nowej mikroprobówce wymieszaj bufor MOPS i roztwór białek. Do białka i buforu dodać porcję roztworu podstawowego DEPC, upewniając się, że jest prawidłowo wymieszany, przed umieszczeniem mieszaniny reakcyjnej w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną minutę. Objętość użytego roztworu podstawowego DEPC powinna być wybrana na podstawie pożądanego końcowego współczynnika stężenia białka DEPC.Nie ma jednego zestawu stężeń DEPC i białek, które będą działać z każdym białkiem, chociaż optymalne stężenie DEPC można oszacować na podstawie liczby dostępnych w rozpuszczalniku reszt histydyny i lizyny obecnych w białku. Należy zauważyć, że objętość dodanego acetonitrylu, która jest w rzeczywistości objętością dodanego roztworu DEPC, nie powinna przekraczać 1% całkowitej objętości reakcji, aby uniknąć zaburzeń struktury białka podczas reakcji. Czas reakcji ostatecznie zależy od użytkownika, chociaż jednominutowa reakcja w przykładowych warunkach minimalizuje nadmierne znakowanie białka i hydrolizę DEPC.Po upływie jednej minuty wygasić reakcję, dodając imidazol w celu usunięcia pozostałej części na przereagowanym DEPC. Upewnij się, że końcowe stężenie imidazolu jest 50 razy większe niż stężenie DEPC. Aby zidentyfikować pozostałości, które zostały zmodyfikowane przez DEPC, białko musi zostać proteolitycznie strawione na fragmenty peptydów.Do trawienia wybierz warunki, które są podatne na białko będące przedmiotem zainteresowania. Typowe etapy, które są tutaj opisane, obejmują rozwijanie białka, a następnie redukcję i alkilowanie wiązań dwusiarczkowych, aby poprawić wydajność trawienia. Z naszego doświadczenia wynika, że rozłożenie białka za pomocą denaturantu i podgrzanie przed trawieniem poprawia efektywność trawienia.Podczas rozkładania białka należy porównać roztwory TCEP i jodoacetamidu w odpowiednim buforze trawiennym. TCEP powinien być stosowany jako środek redukujący zamiast ditiotreitolu lub DTT, ponieważ DTT może reagować z pozostałościami modyfikowanymi DEPC. Alkilowanie otrzymanych plików po redukcji jest niezbędne, aby uniknąć kodowania etykiet, w którym wolne pliki i białko reagują ze zmodyfikowanymi aminokwasami.Po zakończeniu etapu rozwijania zredukuj wiązania dwusiarczkowe, dodając TCEP do mieszaniny reakcyjnej i pozwól jej reagować przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po redukcji dodaj jodoacetamid do mieszaniny reakcyjnej, pozwól mu reagować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Osiąga się to poprzez umieszczenie mieszaniny reakcyjnej w pudełku.Końcowe stężenie jodoacetamidu powinno być dwukrotnie większe niż stężenie stosowane w TCEP lub 80-krotność stężenia białka lub wiązania dwusiarczkowego. Przygotuj interesujący Cię enzym, zwykle trypsynę lub chymotrypsynę zgodnie ze specyfikacją producenta. Po przygotowaniu wybranego enzymu rozpocznij trawienie i inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Stosunek białka do enzymu 10:1 z trzygodzinnym trawieniem przy użyciu unieruchomionych enzymów jest zazwyczaj dobrym wyborem dla białek znakowanych DEPC. Po roztrawieniu próbka powinna być natychmiast przeanalizowana za pomocą LC-MS/MS lub błyskawicznie zamrożona ciekłym azotem, aby zminimalizować degradację próbki i utratę etykiety. Standardowe parametry LC-MS/MS dla proteomiki oddolnej mogą być wykorzystane do identyfikacji znakowanych miejsc na fragmentach peptydu proteolitycznego.Aby uzyskać najlepszą separację peptydów, należy zastosować fazę stacjonarną C18 w fazie odwrotnej. Z naszego doświadczenia wynika, że kapilarna LC dostarcza bardziej wiarygodnych informacji ilościowych o poziomach modyfikacji niż nano LC ze względu na większe ilości użytych próbek. Typowa faza ruchoma LC, która jest używana do oddzielania peptydów znakowanych DEPC, składa się z dwóch rozpuszczalników.Rozpuszczalnik A to woda z 0,1% kwasem mrówkowym, a rozpuszczalnik B to acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym. Stosuje się elucję gradientową, a czas separacji można zoptymalizować w oparciu o złożoność próbki. Spektrometr masowy zdolny do wykonywania LC-MS i MS/MS w trybie online jest wymagany do identyfikacji miejsc modyfikacji DEPC na peptydach.W naszych eksperymentach z powodzeniem wykorzystaliśmy kilka rodzajów spektrometrów masowych. Odkryliśmy, że Thermo Orbitrap Fusion zapewnia doskonałe wyniki, chociaż każdy spektrometr masowy zdolny do automatycznego wykonywania MS/MS wielu peptydów w trakcie analizy LC-MS powinien być odpowiedni. Warunki HPLC i parametry spektrometrii mas powinny być odpowiednio ustawione przed pomiarem.Jeśli próbka została błyskawicznie zamrożona, należy ją rozmrozić tuż przed analizą. Dołożyć wszelkich starań, aby zminimalizować czas między przygotowaniem próbki a wstrzyknięciem HPLC. Załaduj i wstrzyknij strawioną znakowaną próbkę białka do systemu LC i rozpocznij akwizycję LC-MS/MS lub identyfikację miejsca etykiety DEPC i kwantyfikację obszaru piku, istnieje wiele metod.W instrumentach Thermo Fisher może być używany excalibur lub wykrywacz proteomu. Ustaw odpowiednie parametry do identyfikacji peptydów w programie. Dodawanie DEPC i karbamidometylacja są uwzględniane jako zmienne modyfikacje wspomagające reszty lub przydzielane.Chromatograficzne obszary pików zmodyfikowanych i niezmodyfikowanych wersji peptydów stosuje się do określenia procentowej modyfikacji poziomu pozostałości. Znakowanie DEPC z wykrywaniem stwardnienia rozsianego jest również cennym narzędziem do charakteryzowania zmian strukturalnych białek wyższego rzędu. Z naszego badania wynika, że znakowanie kowalencyjne DEPC może zidentyfikować określone regiony białka, które ulegają zmianom strukturalnym pod wpływem stresu termicznego i oksydacyjnego.Na rysunku znaczące zmiany w procentach modyfikacji są pokazane na niebiesko dla spadku etykietowania i na czerwono dla wzrostu oznakowania, podczas gdy pozostałości bez znaczących zmian w oznakowaniu są pokazane na jasnozielono. Na przykład po tym, jak mikroglobulina beta-2 jest wystawiona na stres cieplny, wiele reszt, które ulegają znacznemu zmniejszeniu zakresu znakowania, N-koniec, seryna 28, histydyna 31, seryna 33, seryna 55, seryna 57 i lizyna 58 znajdują się bliżej niż jedna strona białka, co sugeruje, że ten region białka ulega zmianie potwierdzającej lub prawdopodobnie pośredniczy w agregacji. Po wystawieniu białka na stres oksydacyjny, różne reszty ze spadkiem znakowania, seryna 11, histydyna 13, lizyna 19, lizyna 41 i lizyna 94 z klastra w innej fazie białka, co wskazuje, że zmiana potwierdzająca wywołana utlenianiem zachodzi gdzie indziej.Badanie to ma ważne implikacje dla terapii białkowych, które są obecnie najszybciej rozwijającym się segmentem rynku farmaceutycznego. Inne prace naszej grupy wykazały również, że specyfikacja masy znakowania kowalencyjnego DEPC może wykrywać i identyfikować miejsca potwierdzających zmian w terapii stresowanymi przeciwciałami monoklonalnymi. Jak widać, znakowanie kowalencyjne za pomocą DEPC jest proste do wdrożenia eksperymentalnego, ale może dostarczyć cennych informacji strukturalnych dla białek.Rozdzielczość strukturalna zapewniana przez specyfikację masy znakowania DEPC jest skromna w porównaniu z technikami takimi jak krystalografia rentgenowska i NMR, ale jest podatna na prawie każde białko, niezależnie od jego wielkości lub zdolności do krystalizacji. DEPC do znakowania kowalencyjnego masy działa również z mieszaninami białek i może pracować z bardzo skomplikowanymi typami próbek, takimi jak lizat komórkowy i komórki haCat. Po obejrzeniu tego filmu jesteśmy przekonani, że etykietowanie DEPC okaże się przydatnym narzędziem do charakteryzowania struktury białek.

covalent-labeling-with-diethylpyrocarbonate-for-studying-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Ten artykuł opisuje tworzenie wysoce uporządkowanych struktur opartych na peptydach poprzez spontaniczny proces samoorganizacji. Metoda wykorzystuje dostępne na rynku peptydy i powszechnie stosowany sprzęt laboratoryjny. Technika ta może być stosowana do wielu różnych peptydów i może prowadzić do odkrycia nowych zespołów opartych na peptydach.

Tworzenie uporządkowanych struktur biomolekularnych przez samoorganizację krótkich peptydów

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Poznaj metodę znakowania kowalencyjnego dietylopirowęglanem do analizy struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas. Technika ta umożliwia identyfikację dostępnych reszt aminokwasowych.

Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów