Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Scharakteryzowanie struktury białka jest niezbędne do zrozumienia jego funkcji. Spektrometria mas stała się potężnym narzędziem do tego celu, szczególnie w przypadku układów białkowych, które są trudne do zbadania tradycyjnymi metodami. Aby zbadać strukturę białka według specyfikacji masy, w roztworze przeprowadza się określone reakcje chemiczne, które kodują informacje strukturalne białka w jego masie.

Jednym ze szczególnie skutecznych podejść jest użycie odczynników, które kowalencyjnie modyfikują, rozwiązując łańcuchy boczne dostępnych aminokwasów. Reakcje te prowadzą do wzrostu masy, który może być zlokalizowany z rozdzielczością poziomu pozostałości w połączeniu z trawieniem proteolitycznym i tandemową spektrometrią mas. Tutaj opisaliśmy protokoły związane ze stosowaniem pirowęglanu dietylu lub DEPC jako odczynnika do znakowania kowalencyjnego wraz z wykrywaniem specyfikacji masy.

DEPC jest wysoce elektrofilową cząsteczką zdolną do znakowania do 30% reszt w przeciętnym białku, zapewniając w ten sposób doskonałą rozdzielczość strukturalną. DEPC jest z powodzeniem stosowany w połączeniu ze specyfikacją masy w celu uzyskania informacji strukturalnych dla wielu różnych białek. Zacznij od przygotowania buforowanego roztworu interesującego Cię białka o stężeniu w zakresie kilkudziesięciu mikromolowców.

Powszechnie używamy 10-milimolowego bufora MOPS o pH 7,4. Alternatywnie, istniejący roztwór białkowy może być wymieniony buforem na MOPS lub inny bufor, jeśli oryginalna próbka zawiera bufor zawierający nukleofilowe grupy funkcyjne. Konieczne jest, aby bufor nie zawierał nukleofilowych grup funkcyjnych, ponieważ będą one zakłócać reakcję białka DEPC.

W innej mikroprobówce przygotuj roztwór podstawowy 100 milimolowego DEPC w suchym acetonitrylu. Przygotowanie roztworu podstawowego w suchym acetonitrylu jest konieczne, aby zapobiec hydrolizie DEPC. W nowej mikroprobówce przygotować roztwór jednego molowego imidazolu w wodzie klasy HPLC.

W nowej mikroprobówce wymieszaj bufor MOPS i roztwór białek. Do białka i buforu dodać porcję roztworu podstawowego DEPC, upewniając się, że jest prawidłowo wymieszany, przed umieszczeniem mieszaniny reakcyjnej w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną minutę. Objętość użytego roztworu podstawowego DEPC powinna być wybrana na podstawie pożądanego końcowego współczynnika stężenia białka DEPC.

Nie ma jednego zestawu stężeń DEPC i białek, które będą działać z każdym białkiem, chociaż optymalne stężenie DEPC można oszacować na podstawie liczby dostępnych w rozpuszczalniku reszt histydyny i lizyny obecnych w białku. Należy zauważyć, że objętość dodanego acetonitrylu, która jest w rzeczywistości objętością dodanego roztworu DEPC, nie powinna przekraczać 1% całkowitej objętości reakcji, aby uniknąć zaburzeń struktury białka podczas reakcji. Czas reakcji ostatecznie zależy od użytkownika, chociaż jednominutowa reakcja w przykładowych warunkach minimalizuje nadmierne znakowanie białka i hydrolizę DEPC.

Po upływie jednej minuty wygasić reakcję, dodając imidazol w celu usunięcia pozostałej części na przereagowanym DEPC. Upewnij się, że końcowe stężenie imidazolu jest 50 razy większe niż stężenie DEPC. Aby zidentyfikować pozostałości, które zostały zmodyfikowane przez DEPC, białko musi zostać proteolitycznie strawione na fragmenty peptydów.

Do trawienia wybierz warunki, które są podatne na białko będące przedmiotem zainteresowania. Typowe etapy, które są tutaj opisane, obejmują rozwijanie białka, a następnie redukcję i alkilowanie wiązań dwusiarczkowych, aby poprawić wydajność trawienia. Z naszego doświadczenia wynika, że rozłożenie białka za pomocą denaturantu i podgrzanie przed trawieniem poprawia efektywność trawienia.

Podczas rozkładania białka należy porównać roztwory TCEP i jodoacetamidu w odpowiednim buforze trawiennym. TCEP powinien być stosowany jako środek redukujący zamiast ditiotreitolu lub DTT, ponieważ DTT może reagować z pozostałościami modyfikowanymi DEPC. Alkilowanie otrzymanych plików po redukcji jest niezbędne, aby uniknąć kodowania etykiet, w którym wolne pliki i białko reagują ze zmodyfikowanymi aminokwasami.

Po zakończeniu etapu rozwijania zredukuj wiązania dwusiarczkowe, dodając TCEP do mieszaniny reakcyjnej i pozwól jej reagować przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po redukcji dodaj jodoacetamid do mieszaniny reakcyjnej, pozwól mu reagować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Osiąga się to poprzez umieszczenie mieszaniny reakcyjnej w pudełku.

Końcowe stężenie jodoacetamidu powinno być dwukrotnie większe niż stężenie stosowane w TCEP lub 80-krotność stężenia białka lub wiązania dwusiarczkowego. Przygotuj interesujący Cię enzym, zwykle trypsynę lub chymotrypsynę zgodnie ze specyfikacją producenta. Po przygotowaniu wybranego enzymu rozpocznij trawienie i inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Stosunek białka do enzymu 10:1 z trzygodzinnym trawieniem przy użyciu unieruchomionych enzymów jest zazwyczaj dobrym wyborem dla białek znakowanych DEPC. Po roztrawieniu próbka powinna być natychmiast przeanalizowana za pomocą LC-MS/MS lub błyskawicznie zamrożona ciekłym azotem, aby zminimalizować degradację próbki i utratę etykiety. Standardowe parametry LC-MS/MS dla proteomiki oddolnej mogą być wykorzystane do identyfikacji znakowanych miejsc na fragmentach peptydu proteolitycznego.

Aby uzyskać najlepszą separację peptydów, należy zastosować fazę stacjonarną C18 w fazie odwrotnej. Z naszego doświadczenia wynika, że kapilarna LC dostarcza bardziej wiarygodnych informacji ilościowych o poziomach modyfikacji niż nano LC ze względu na większe ilości użytych próbek. Typowa faza ruchoma LC, która jest używana do oddzielania peptydów znakowanych DEPC, składa się z dwóch rozpuszczalników.

Rozpuszczalnik A to woda z 0,1% kwasem mrówkowym, a rozpuszczalnik B to acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym. Stosuje się elucję gradientową, a czas separacji można zoptymalizować w oparciu o złożoność próbki. Spektrometr masowy zdolny do wykonywania LC-MS i MS/MS w trybie online jest wymagany do identyfikacji miejsc modyfikacji DEPC na peptydach.

W naszych eksperymentach z powodzeniem wykorzystaliśmy kilka rodzajów spektrometrów masowych. Odkryliśmy, że Thermo Orbitrap Fusion zapewnia doskonałe wyniki, chociaż każdy spektrometr masowy zdolny do automatycznego wykonywania MS/MS wielu peptydów w trakcie analizy LC-MS powinien być odpowiedni. Warunki HPLC i parametry spektrometrii mas powinny być odpowiednio ustawione przed pomiarem.

Jeśli próbka została błyskawicznie zamrożona, należy ją rozmrozić tuż przed analizą. Dołożyć wszelkich starań, aby zminimalizować czas między przygotowaniem próbki a wstrzyknięciem HPLC. Załaduj i wstrzyknij strawioną znakowaną próbkę białka do systemu LC i rozpocznij akwizycję LC-MS/MS lub identyfikację miejsca etykiety DEPC i kwantyfikację obszaru piku, istnieje wiele metod.

W instrumentach Thermo Fisher może być używany excalibur lub wykrywacz proteomu. Ustaw odpowiednie parametry do identyfikacji peptydów w programie. Dodawanie DEPC i karbamidometylacja są uwzględniane jako zmienne modyfikacje wspomagające reszty lub przydzielane.

Chromatograficzne obszary pików zmodyfikowanych i niezmodyfikowanych wersji peptydów stosuje się do określenia procentowej modyfikacji poziomu pozostałości. Znakowanie DEPC z wykrywaniem stwardnienia rozsianego jest również cennym narzędziem do charakteryzowania zmian strukturalnych białek wyższego rzędu. Z naszego badania wynika, że znakowanie kowalencyjne DEPC może zidentyfikować określone regiony białka, które ulegają zmianom strukturalnym pod wpływem stresu termicznego i oksydacyjnego.

Na rysunku znaczące zmiany w procentach modyfikacji są pokazane na niebiesko dla spadku etykietowania i na czerwono dla wzrostu oznakowania, podczas gdy pozostałości bez znaczących zmian w oznakowaniu są pokazane na jasnozielono. Na przykład po tym, jak mikroglobulina beta-2 jest wystawiona na stres cieplny, wiele reszt, które ulegają znacznemu zmniejszeniu zakresu znakowania, N-koniec, seryna 28, histydyna 31, seryna 33, seryna 55, seryna 57 i lizyna 58 znajdują się bliżej niż jedna strona białka, co sugeruje, że ten region białka ulega zmianie potwierdzającej lub prawdopodobnie pośredniczy w agregacji. Po wystawieniu białka na stres oksydacyjny, różne reszty ze spadkiem znakowania, seryna 11, histydyna 13, lizyna 19, lizyna 41 i lizyna 94 z klastra w innej fazie białka, co wskazuje, że zmiana potwierdzająca wywołana utlenianiem zachodzi gdzie indziej.

Badanie to ma ważne implikacje dla terapii białkowych, które są obecnie najszybciej rozwijającym się segmentem rynku farmaceutycznego. Inne prace naszej grupy wykazały również, że specyfikacja masy znakowania kowalencyjnego DEPC może wykrywać i identyfikować miejsca potwierdzających zmian w terapii stresowanymi przeciwciałami monoklonalnymi. Jak widać, znakowanie kowalencyjne za pomocą DEPC jest proste do wdrożenia eksperymentalnego, ale może dostarczyć cennych informacji strukturalnych dla białek.

Rozdzielczość strukturalna zapewniana przez specyfikację masy znakowania DEPC jest skromna w porównaniu z technikami takimi jak krystalografia rentgenowska i NMR, ale jest podatna na prawie każde białko, niezależnie od jego wielkości lub zdolności do krystalizacji. DEPC do znakowania kowalencyjnego masy działa również z mieszaninami białek i może pracować z bardzo skomplikowanymi typami próbek, takimi jak lizat komórkowy i komórki haCat. Po obejrzeniu tego filmu jesteśmy przekonani, że etykietowanie DEPC okaże się przydatnym narzędziem do charakteryzowania struktury białek.