Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

Protokół łączy specyficzną dla wieku izolację spontanicznych mieszanych kultur pochodzących z nerwowych komórek macierzystych zawierających różnicujące się komórki prekursorowe oligodendrocytów i astrocyty, testy naśladujące stany patologiczne oraz solidne odczyty o wysokiej zawartości. Cechy te umożliwiają zróżnicowane badanie mielinizacji rozwojowej i remielinizacji dorosłych w warunkach fizjologicznych i patologicznych oraz w mikrośrodowisku uwzględniającym udział astrocytów. W celu izolacji nerwowych komórek macierzystych od 13,5 dnia embrionalnego do 14,5 dnia przodomózgowia płodu, umieść głowy zarodków na czystej szalce Petriego z lodowatym PBS i użyj kleszczy, aby usunąć skórę z czaszki w powiększeniu.

Gdy mózg jest widoczny i oczyszczony ze skóry, użyj kleszczy, aby wycisnąć mózg z czaszki i usunąć móżdżek. Użyj kleszczy, aby usunąć opony mózgowe i umieść izolowaną tkankę w nieenzymatycznym buforze dysocjacyjnym. Po wyizolowaniu całej tkanki mózgowej należy pobrać dwie do trzech próbek w 150 mikrolitrach nieenzymatycznego buforu dysocjacyjnego na 1,5 mililitrowej probówki i inkubować probówki przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym wytrząsaniem.

Pod koniec inkubacji dodać 850 mikrolitrów standardowej pożywki do każdej probówki i pipety mieszać, aż zawiesina będzie wolna od grudek. Jeżeli niezdysocjowana tkanka jest nadal widoczna, należy odstawić próbki na dwie minuty, aby tkanki mogły osiąść na dnie probówek. Po zakończeniu dysocjacji płytki komórek o gęstości od 10 do 50 komórek na mikrolitr w 10 do 30 mililitrach stężenia podłoża neurosfery w kolbie T25 lub T45 i umieścić kolbę w inkubatorze hodowli komórkowej w pozycji pionowej, aby zapobiec przyczepianiu się komórek.

od 2,5-miesięcznych dorosłych myszy umieść mózgi od czterech do pięciu dorosłych myszy w 50-mililitrowej probówce lodowatego HBSS i umieść jeden mózg, brzuszną stroną do dołu, w kierunku rostralno-ogonowym na sterylnej kolbie pokrytej folią aluminiową wypełnionej minus 20 stopni Celsjusza - zimną wodą przez noc. Użyj żyletki, aby usunąć opuszki węchowe i wyciąć dwa do trzech plastrów koronalnych o grubości jednego milimetra od kory do skrzyżowania optycznego. Umieść plastry na zimnej powierzchni w pozycji brzuszno-grzbietowej i zidentyfikuj ciało modzelowate i dwie boczne komory.

Za pomocą powiększenia wyizoluj ściany komór bocznych, uważając, aby nie obejmowały kawałków ciała modzelowatego, i umieść izolowaną tkankę w pięciu do 10 mililitrach enzymatycznego buforu dysocjacyjnego na 15-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji należy pipetować tkanki co najmniej 50 razy, a następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 10 minut. Pod koniec inkubacji zneutralizować trypsynę pięcioma mililitrami standardowej pożywki hodowlanej i przefiltrować zawiesinę tkankową przez filtr o średnicy 70 mikronów.

Odwirować przefiltrowany roztwór przez pięć minut w temperaturze 400 razy g i ponownie zawiesić osad w roztworze sacharozy do drugiego odwirowania. Pod koniec wirowania ponownie zawiesić osad w roztworze do przemywania albuminy surowicy bydlęcej w celu ponownego odwirowania, a następnie ponownie zawiesić osad w standardowej pożywce hodowlanej do liczenia i umieścić komórki w pionowej kolbie T-25 lub T-45. W celu pierwotnego różnicowania neurosfery należy dodawać podstawowe czynniki wzrostu fibroblastów i śródbłonka do hodowli nerwowych komórek macierzystych co dwa dni.

Kiedy neurosfery osiągną średnicę od 100 do 500 mikronów, przechodzą komórki przez mechaniczną dysocjację zgodnie ze standardowymi protokołami. W celu różnicowania oligosfery należy co dwa dni traktować komórki podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów w czynniku płytkowym AA. Gdy oligosfery osiągną średnicę od 100 do 150 mikronów, należy je rozdzielić przez dysocjację mechaniczną zgodnie ze standardowymi protokołami i umieścić zawiesinę komórek o gęstości 3000 komórek na centymetr kwadratowy na płytkach pokrytych poli-DL-ornityną laminą.

Po trzech dniach zastąp supernatant każdej kultury taką samą objętością pożywki różnicującej oligodendrocyty. Aby przeprowadzić indukcję bloku różnicowania za pośrednictwem stanu zapalnego, po dysocjacji neurosfer i podczas produkcji oligosfery, dodaj mieszankę cytokin będących przedmiotem zainteresowania do pożywki hodowlanej. Aby wywołać śmierć komórki pozbawioną tlenu i glukozy, dwa dni po wysianiu do płytek wielodołkowych, przenieś supernatant z każdej kultury do indywidualnych dołków płytki wielodołkowej.

Dodać połowę objętości pożywki OGD do studzienek i przenieść kultury do hermetycznej komory hipoksji nasyconej 95% azotem i 5% dwutlenkiem węgla. Umieścić komorę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po trzech godzinach zastąp pożywkę w komorach pożywką odłożoną na bok z wielodołkowej płytki hodowlanej.

Po sprawdzeniu jakości barwienia komórek, w menu Akwizycja oprogramowania do badań przesiewowych o wysokiej zawartości wybierz Stały czas ekspozycji i Mini skanowanie, a następnie wybierz 10 pól na studzienkę i dwie studzienki na warunki eksperymentalne, aby umożliwić ustawienie parametrów analizy w podzbiorze pól dla całej płytki. Postępuj zgodnie z przepływem pracy krok po kroku, aby opracować cały algorytm. Wybierz opcję Przetwarzaj obraz dla każdego kanału i kliknij opcję Usuwanie tła, aby wybrać żądany poziom sygnału.

Aby zidentyfikować i wybrać jądra przez barwienie jądrowe, kliknij Zidentyfikuj obiekt podstawowy, dostosuj próg, aby zidentyfikować pojedyncze jądra, a następnie kliknij Sprawdź poprawność obiektów pierwotnych, aby ustawić progi na podstawie obszarów i położenia obiektu. Kliknij opcję Identyfikuj punkty dla każdego kanału odpowiadające określonym znacznikom pochodzenia i ustaw szerokość pierścienia na trzy, a odległość na zero, aby umożliwić identyfikację fluorescencji cytoplazmatycznej. Wybierz opcję Poziomy odniesienia w procedurze roboczej, aby utworzyć analizę i umożliwić automatyczne zliczanie skondensowanych jąder na podstawie wielkości jądra i intensywności barwienia jądrowego oraz określonych komórek markerowo-dodatnich na podstawie fluorescencji cytoplazmatycznej zidentyfikowanej przez pierścień, a następnie kliknij przycisk Odtwórz.

Podczas pierwszej fazy hodowli nerwowe komórki macierzyste utrzymują ekspresję w gnieździe. Większość komórek jest również NG2-dodatnia. Komórki CNPazo-dodatnie odpowiadające stadium preoligodendrocytów są wykrywalne od trzech do sześciu dni po indukcji różnicowania za pośrednictwem T3, podczas gdy dojrzałe oligodendrocyty MBP-dodatnie pojawiają się w znacznym odsetku po sześciu do 12 dniach in vitro.

Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości umożliwia wykrycie pojedynczych komórek w kulturze poprzez barwienie jądrowe i analizę intensywności fluorescencji. Skład kultury pod koniec fazy różnicowania różni się w zależności od tego, czy kultury są pochodzenia płodowego, czy dorosłego, przy czym kultury płodowe są bardziej wrażliwe na różnicowanie za pośrednictwem T3 i osiągają wyższy odsetek dojrzałych oligodendrocytów. Należy zauważyć, że gdy komórki prekursorowe oligodendrocytów pochodzące z nerwowych komórek macierzystych są wysiewane w dużej gęstości, agregują się, a replikujące się astrocyty szybko wytwarzają zlewającą się warstwę komórkową, uniemożliwiając obserwację charakterystycznego kształtu pajęczej sieci dojrzałych oligodendrocytów.

Blokowanie różnicowania za pośrednictwem stanu zapalnego indukuje silny spadek przed- i dojrzałych oligodendrocytów, co wykrywa się za pomocą barwienia CNPazą i MBP zarówno w hodowlach płodowych, jak i dorosłych. Wzrost liczby komórek prekursorowych oligodendrocytów występuje również w dorosłych kulturach traktowanych cytokinami. Podczas gdy komórki prekursorowe oligodendrocytów płodu i dorosłych wykazują to samo narażenie na cytokiny zapalne, tylko kultury pochodzące od płodu są wrażliwe na toksyczność związaną z deprywacją tlenu i glukozy.

Metoda może być stosowana w przypadku dowolnego rodzaju komórek prekursorowych oligodendrocytów, procesu zakłócającego różnicowanie i dojrzewanie, w celu przetestowania nowych strategii mających na celu zwalczanie chorób wpływających na mielinizację lub remielinizację