Name: Studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności kawitacji w czasie rzeczywistym w hodowli komórkowej. Technika ta umożliwia badanie dostarczania leków i bioefektów w terapii wzmocnionej kawitacją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Radzie Badań Nauk Inżynieryjnych i Fizycznych za wsparcie tej pracy poprzez grant EP/L024012/1. VB jest również wspierany przez Radę ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (EPSRC) oraz Radę ds. Badań Medycznych (MRC) (grant EP/L016052/1). VB i AV dziękują Fundacji Clarendon za stypendia podyplomowe. AV dziękuje również Exeter College za stypendium Santander. Autorzy są wdzięczni Jamesowi Fiskowi i Davidowi Salisbury'emu za ich nieocenioną pomoc w produkcji aparatury. Wyrażają również wdzięczność za wkład dr Dario Carugo i Joshuy Owena w rozwój wcześniejszych prototypów SAT.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe etapy każdego pomiaru akustycznego zostały ujęte przez Apfela w 1981 roku76 jako "poznaj swoją ciecz, poznaj swoje pole dźwiękowe, dowiedz się, kiedy coś się dzieje". W kontekście tego protokołu obejmują one kalibrację i wyrównanie przetwornika oraz etapy przygotowania wody i obchodzenia się z pęcherzykami. Po pierwsze, ważne jest, aby hydrofon używany do kalibracji przetwornika sterującego i/lub PCD był sam w sobie dokładnie skalibrowany poprzez regularne serwisowanie zewnętrzne lub wewnętrzne porównanie z wzorcem odniesienia. Podobnie, odpowiedź zarówno przetwornika sterującego, jak i PCD musi być regularnie charakteryzowana w celu sprawdzenia jakichkolwiek zmian w mocy wyjściowej i/lub utraty czułości. Jeżeli warunki jazdy i czułość odbioru systemu nie są znane, niemożliwe będzie wywnioskowanie jakiegokolwiek znaczącego związku między warunkami narażenia, skutkami biologicznymi i emisjami akustycznymi. Bezpośrednio związane z tym należy dokładnie sprawdzić ustawienie przetworników względem siebie i komory próbki, aby upewnić się, że warunki ekspozycji w komorze są zgodne z oczekiwaniami, a objętość próbki dla PCD odpowiada obszarowi zainteresowania. Jak wskazano, temperatura i zawartość gazu w podwieszanym medium mogą mieć znaczący wpływ na końcowe wyniki, a konsystencja jest w tym względzie niezwykle ważna77,78. Podobnie, przygotowanie, charakterystyka i obchodzenie się z zawiesiną środka kawitacyjnego wymagają bardzo szczególnej uwagi, aby upewnić się, że oczekiwany rozkład wielkości i stężenie cząstek są obecne w próbce. Na przykład, jeśli stężenie pęcherzyków jest zbyt wysokie, nastąpi skuteczne ekranowanie objętości próbki przed incydentem w polu amerykańskim. Środki MB są szczególnie podatne na niszczenie i koalescencję, a dalsze wskazówki dotyczące obchodzenia się z nimi można znaleźć w Mulvana et. al. (2012)79.
Bardzo częstym problemem z detekcją sygnałów kawitacyjnych jest uzyskanie odpowiedniego SNR. Wynika to częściowo z opisanej natury samego sygnału, ale może to być również spowodowane źródłami szumu elektrycznego w układzie doświadczalnym. Sprawdzenie połączeń między elementami systemu, w szczególności tych, które obejmują kable koncentryczne, może pomóc w wyeliminowaniu niektórych z nich. Może być konieczna wymiana lub naprawa kabli koncentrycznych. Pomocne może być również identyfikowanie i usuwanie lub dezaktywowanie innego sprzętu w laboratorium, takiego jak pompy, które mogą powodować zakłócenia elektryczne. Słabe dopasowanie impedancji elektrycznej między elementami systemu może być kolejną przyczyną słabego stosunku sygnału do szumu, a także potencjalnego uszkodzenia sprzętu i powinno być dokładnie sprawdzone. Ustawienia wyzwalania w generatorze sygnału i oscyloskopie powinny być podobnie sprawdzone, aby potwierdzić, że są one odpowiednio skonfigurowane dla eksperymentu i nie powróciły do domyślnych ustawień producenta. W przypadku znacznego zniszczenia pęcherzyków podczas obsługi, w przypadku SAT2, pomocne może być podłączenie drugiej strzykawki do portu wylotowego i użycie jej do delikatnego wydobycia płynu z komory, wciągając w ten sposób zawiesinę. Może to również pomóc w wyeliminowaniu makropęcherzyków lub umożliwieniu przepływu podczas ekspozycji na USA, jeśli jest to pożądane.
Nie jest możliwe całkowite wyeliminowanie odbić akustycznych w komorze próbki, a zatem pole padające nie będzie całkowicie jednorodne w całej objętości próbki. Jak wspomniano w krokach 1.3.2 i 1.3.3, przepuszczalność okien akustycznych będzie zależna od częstotliwości, a zatem należy dokładnie rozważyć pożądaną szerokość pasma do pomiarów emisji akustycznej. W szczególności mogą wystąpić znaczne odbicia wielokrotne składowych o wyższej częstotliwości. Jest to kolejny powód, dla którego kalibracja pola w całkowicie zmontowanym systemie jest tak ważna dla zminimalizowania niepewności ciśnienia zdarzenia. Należy również wziąć pod uwagę odpowiednie bramkowanie rejestrowanych sygnałów, aby zminimalizować skutki wielokrotnych odbić. Korzystanie z komercyjnych urządzeń dla wygody i potrzeba przejrzystości akustycznej oznacza, że należy poświęcić pewną przezroczystość optyczną. Może to mieć wpływ na jakość kolejnych badań obrazowych, np. w celu oceny żywotności komórek lub wchłaniania leków. Niektóre membrany stosowane w urządzeniach komercyjnych są również porowate, a zatem dochodzi do niedoskonałej izolacji między komorą próbki a otaczającą ją łaźnią wodną. Jak wyżej, związane z tym ryzyko zanieczyszczenia można ograniczyć poprzez zastosowanie mniejszej podkomory, której zawartość można regularnie wymieniać. Urządzenia do hodowli komórkowych wskazane w tabeli materiałów są odpowiednie przede wszystkim dla monowarstw komórkowych, które mogą nie być reprezentatywne dla tkanek pod względem wszystkich efektów biologicznych za pośrednictwem US/kawitacji. Bliskość komórek do stałej powierzchni będzie również wpływać na dynamikę MB w sposób, który może nie odzwierciedlać warunków in vivo, np. promując mikrostrumieniowanie i mikroodrzuty, jak opisano we wprowadzeniu. Ograniczeniom tym można jednak zaradzić poprzez proste zastąpienie ich alternatywnymi modelami tkankowymi.
Celem zaproponowania SAT jest zapewnienie środków do poprawy odtwarzalności warunków ekspozycji akustycznej i emisji akustycznych między badaniami skutków biologicznych, w których pośredniczą Stany Zjednoczone, co miejmy nadzieję ułatwi lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw leczenia i rozwój technik monitorowania leczenia w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności. Systemy zostały zaprojektowane tak, aby były kompatybilne z dostępnymi na rynku urządzeniami do hodowli komórkowych, umożliwiając wykonywanie szerokiego zakresu testów biologicznych w zależności od interesującego zastosowania i umożliwiając przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej przepustowości, eliminując potrzebę czasochłonnych procedur dopasowywania między seriami. Miejmy nadzieję, że dzięki standaryzacji protokołów charakterystyki warunków ekspozycji i wychwytywania emisji akustycznych, zmienność zależna od systemu może zostać zmniejszona. Zakres parametrów, które należy zbadać w danym eksperymencie, będzie zależał od zastosowania (pożądany efekt biologiczny, typ komórki, głębokość tkanki docelowej w przypadku in vivo itp.) oraz charakteru stosowanego środka kawitacyjnego. Biorąc pod uwagę dużą liczbę zmiennych (częstotliwość amerykańska, amplituda ciśnienia, długość impulsu, częstotliwość powtarzania impulsów itp.), pełne zbadanie całej przestrzeni parametrów jest mało prawdopodobne. Zaletą proponowanego protokołu jest to, że umożliwia on szybkie ustalenie pewnych granic w tej przestrzeni parametrów. Na przykład umożliwia określenie minimalnego ciśnienia, przy którym generowany jest sygnał kawitacyjny, maksymalnego ciśnienia lub długości impulsu, które można zastosować, zanim nastąpi odłączenie/śmierć komórki, oraz ciśnienia, przy którym wytwarzane są harmoniczne ułamkowe lub szum szerokopasmowy. Zaleca się, aby taki zestaw pomiarów zakresu został przeprowadzony jako pierwszy krok w każdym badaniu.
Jak przedstawiono, SAT są przeznaczone do monitorowania emisji akustycznych w czasie rzeczywistym, przy czym testy biologiczne są wykonywane poza eksperymentem. Stosunkowo łatwo byłoby jednak zmodyfikować SAT tak, aby umożliwić bezpośrednią obserwację optyczną komory próbki za pomocą obiektywu mikroskopowego. To z kolei można połączyć z systemem fluorescencji i/lub mikroskopii o dużej szybkości, aby umożliwić na przykład obserwację wychwytu leku i dynamiki pęcherzyków. Wyjście PCD przedstawione obecnie pod względem napięcia wskazuje: i) rodzaje zachowania kawitacji i ich względne proporcje; ii) jak długo utrzymują się te zachowania kawitacyjne; (iii) czy obserwowane skumulowane w czasie charakterystyki narażenia są skorelowane z konkretnym efektem biologicznym; oraz iv) czy względne poziomy i zachowania zależne od czasu są zgodne z poprzednimi eksperymentami w systemie ekspozycji. Podczas gdy czułość odbioru PCD można określić ilościowo, w celu wiarygodnego scharakteryzowania emisji akustycznych pod względem energii bezwzględnej potrzebne są dodatkowe informacje przestrzenne. Można to osiągnąć poprzez zastąpienie PCD sondą matrycową w celu realizacji pasywnego mapowania akustycznego (PAM)80. Zwiększyłoby to jednak złożoność przetwarzania sygnałów oraz wymagany czas i moc obliczeniową.
Można również zastosować inne oprzyrządowanie do pomiaru oporu elektrycznego membrany lub zastosowania fizycznych metod celowania, na przykład pól magnetycznych. Możliwe byłoby również wykorzystanie trójwymiarowych struktur tkankowych, takich jak sferoidy guza, organoidy, a nawet próbki tkanek ex vivo na akustycznie "miękkich" podłożach żelowych zamiast monowarstw komórkowych do badania efektów amerykańskich i kawitacji w bardziej realistycznych środowiskach tkankowych.

Ultrasonografia (US) jest szeroko stosowana jako technika obrazowania diagnostycznego ze względu na jej bezpieczny i nieinwazyjny charakter, łatwość wdrożenia przy łóżku pacjenta oraz opłacalność1. Oprócz możliwości diagnostycznych i monitorujących, US ma znaczny potencjał w zakresie zastosowań terapeutycznych. Wczesne prace dotyczyły jego zastosowania w trombolizie, transfekcji DNA i dostarczaniu leków2,3,4 i terapeutyczne US stanowi obecnie bardzo aktywny obszar badań, z zastosowaniami obejmującymi leczenie nowotworów5,6,7, immunotherapy8,9, zakłócenie bariery krew-mózg (BBB)10,11,12, tromboliza13,14,15, oraz leczenie infekcji bakteryjnych16,17. Kluczowym zjawiskiem leżącym u podstaw tych zastosowań jest kawitacja: zarodkowanie, wzrost i oscylacja wnęk gazowych spowodowane zmianami ciśnienia płynu18,19.
Istnieje szereg mechanizmów, dzięki którym kawitacja wywołuje efekty biologiczne. Na przykład, wysoce nieliniowy charakter oscylacji pęcherzyków pod wpływem zastosowanego pola US może generować mikrostrumienie w otaczającej cieczy, które mogą zarówno zwiększyć konwekcję leku20, jak i wywierać naprężenia ścinające na tkankę w pobliżu pęcherzyków. Jest to szczególnie powszechne, gdy pęcherzyki znajdują się w pobliżu granicy, powodując niesferyczne oscylacje pęcherzyków i mogą potencjalnie sprzyjać wchłanianiu leku poprzez przenikanie wywołane ścinaniem21,22,23,24. Przy wyższych ciśnieniach obserwuje się oscylacje o większej amplitudzie i szybkie zapadanie się pęcherzyków, co powoduje bezpośrednie naprężenia mechaniczne25 i często generuje fale uderzeniowe, a w konsekwencji duże gradienty ciśnienia, które mogą zakłócać i przenikać tkanki26,27. Zapadanie się pęcherzyków w pobliżu powierzchni może również powodować powstawanie mikrodżetów cieczy o dużej prędkości28,29,30. Te mikrodżety mogą przenikać do tkanki, potencjalnie tworząc pory lub wywołując wtórne fale stresu31,32. Przenikanie błon biologicznych zarówno na poziomie tkankowym, jak i komórkowym jest różnie określane jako sonoforeza, stosowana głównie w kontekście wywołanego przez USA zwiększenia przepuszczalności skóry 33,34, oraz sonoporację, używaną głównie do opisania odwracalnej przepuszczalności błony komórkowej w wyniku tworzenia się porów błony35,36.
Absorpcja lepkości w cieczy bezpośrednio otaczającej oscylującą bańkę może wywołać znaczny efekt grzewczy37. Co więcej, wysoce nieliniowe oscylacje wytwarzają promieniowanie akustyczne o częstotliwościach wyższych niż napędzające pole amerykańskie. Prowadzi to do zwiększonej absorpcji w otaczającej tkance i dalszego podgrzewania38. Zapadaniu się pęcherzyków mogą również towarzyszyć efekty chemiczne spowodowane przejściowymi wysokimi temperaturami i ciśnieniami w rdzeniu pęcherzyka, takie jak wytwarzanie wysoce reaktywnych form i promieniowanie elektromagnetyczne, znane jako sonoluminescencja32. Efekty te zostały zbadane w celu oceny potencjalnych uszkodzeń i/lub aktywacji odpowiednich szlaków komórkowych do dostarczania39 i wykorzystane w lokalnej aktywacji leków wrażliwych na światło w podejściu znanym jako terapia sonodynamiczna40,41,42,43.
Wiele efektów biologicznych, w których pośredniczy USA, może być inicjowanych wyłącznie poprzez kontrolę parametrów pola amerykańskiego (amplituda ciśnienia, częstotliwość, długość impulsu i częstotliwość powtarzania oraz czas trwania ekspozycji), ale niezawodne generowanie kawitacji w tkance biologicznej często wymaga wysokich energii wejściowych, a zatem niesie ze sobą podwyższone ryzyko uszkodzenia. Wprowadzenie egzogennych lub sztucznych jąder kawitacji może znacznie zmniejszyć energię wejściową wymaganą do wytworzenia szerokiego zakresu efektów omówionych powyżej, a ponadto wprowadzić dodatkowe efekty, które mogą nie być możliwe w przypadku samych US. Jądra kawitacji obejmują pęcherzyki gazu26,44, kropelki cieczy45,46,47 i cząstki stałe48,49,50, przy czym jądra kawitacji w nanoskali są nowym obszarem badań pod kątem ich korzyści pod względem wydłużonego czasu krążenia, Poprawa wynaczynienia i przedłużona aktywność kawitacyjna49,51,52,53.
Najczęściej używanymi jądrami są mikropęcherzyki gazu (MBs), pierwotnie używane jako środki kontrastowe w diagnostyce obrazowej. Mają one zwykle średnicę 1-2 mikrometrów i zawierają rdzeń gazu o dużej masie cząsteczkowej o niskiej rozpuszczalności w wodzie w otaczającym podłożu. Rdzeń jest otoczony ochronną powłoką lipidową, białkową lub polimerową, najczęściej składającą się z fosfolipidów54. Po wystawieniu na działanie pola amerykańskiego, ściśliwość MB powoduje ich oscylacje objętościowe, co w konsekwencji powoduje silne rozpraszanie akustyczne, które jest odpowiedzialne za sukces MB jako środka kontrastowego. Jak wspomniano, oscylacje te prowadzą również do wyżej wymienionych efektów mechanicznych, termicznych i chemicznych, które można wykorzystać w zastosowaniach terapeutycznych. Proces powlekania MB oferuje również mechanizm kapsułkowania leków w strukturze MB oraz przyłączania leków i/lub gatunków docelowych do powierzchni MB. Technika ta ułatwia wyzwalanie uwalniania leków w celu zmniejszenia toksyczności ogólnoustrojowej55. Niedawno wykazano również, że materiał z powierzchni MB może być przenoszony do struktur biologicznych, usprawniając dostarczanie leków poprzez tzw. "sonoprinting"56,57,58.
Monitorowanie aktywności kawitacyjnej za pośrednictwem USA może dostarczyć wglądu w wynikowe efekty biologiczne zarówno in vitro, jak i in vivo i potencjalnie pozwala na dostrojenie i optymalizację tych efektów. Dwie najpowszechniej stosowane metody monitorowania aktywności kawitacyjnej to i) optyczna, która wykorzystuje ultraszybką mikroskopię wideo i jest generalnie niewykonalna in vivo; oraz ii) akustyczna, która rejestruje ponownie wypromieniowane pola dźwiękowe wytwarzane przez oscylujące i/lub zapadające się pęcherzyki. Zarówno składowe amplitudy, jak i częstotliwości sygnału akustycznego zawierają informacje o zachowaniu pęcherzyków. Wykazano, że niskie stężenia pęcherzyków przy niskich amplitudach incydentalnych w USA powodują głównie emisje harmoniczne (całkowite wielokrotności częstotliwości jazdy)59. Wraz ze wzrostem ciśnienia napędowego, widmo emisji pęcherzyków może również zawierać składowe ułamkowe znane jako subharmoniczne i ultraharmoniczne60, które wskazują na silniejsze zachowanie nieliniowe, a także szum szerokopasmowy, który wskazuje na kawitację bezwładnościową. Harmoniczne całkowite są podstawowym wskaźnikiem oscylacji pęcherzykowej, ale mogą być również spowodowane nieliniowością w dowolnym miejscu systemu eksperymentalnego, np. z powodu propagacji nieliniowej. Natomiast harmoniczne ułamkowe i szum szerokopasmowy są bardzo silnie skorelowane z dynamiką pęcherzyków.
Związek między zachowaniem pęcherzyków a wykrytymi emisjami akustycznymi może być skomplikowany przez takie czynniki, jak pole zdarzenia w USA, środowisko zarodkowania i charakterystyka ścieżki detekcji60. Niemniej jednak ważne informacje na temat zachowania pęcherzyków i ich interakcji z komórkami można uzyskać, dostrzegając trendy w częstotliwości i energii w widmie akustycznym. Dane te mogą również dostarczyć cennych informacji, które mogą być wykorzystane do stworzenia podstawy dla technik klinicznego monitorowania leczenia. Aby w pełni wykorzystać te informacje, konieczne jest opracowanie solidnych, przekładalnych i odtwarzalnych metod eksperymentalnych.
Obecnie istnieją znaczne różnice w raportowanych protokołach projektowania systemów i prowadzenia badań wspierających rozwój terapii wspomaganych kawitacją. Jeśli chodzi o aparaturę, podjęto szereg podejść projektowych. Kilka grup korzystało z komór z płytami równoległymi56,61,62,63, zbudowanych na zamówienie lub dostępnych na rynku (np. OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu i in. (2013) opracowali komorę komórkową sprzężoną z amerykańskim modułem sonikacyjnym i obrazowaniem konfokalnym w czasie rzeczywistym64, Carugo i in. (2015) wykorzystali system składający się z dostępnego na rynku naczynia do hodowli komórkowej z niestandardową pokrywą PDMS, aby umożliwić zanurzenie w kąpieli wodnej podczas ekspozycji w USA65, a Pereno i in. (2018) wykorzystali urządzenie składające się z warstwowych rezonatorów akustycznych, które pozwalają na jednoczesną charakterystykę optyczną i akustyczną Dynamika bąbelków i interakcje między komórkami bąbelkowymi<klasa SUP="xref">66. Stosowanie niestandardowych i specyficznych dla aplikacji projektów komplikuje charakterystykę pola w USA i innych warunków narażenia środowiskowego, co utrudnia porównania między badaniami. Na przykład, istnieje znaczna zmienność w amerykańskich parametrach zidentyfikowanych dla osiągnięcia udanej sonoporacji, które obejmują częstotliwości środkowe w zakresie od 0,02 do 15 MHz, cykle pracy wahające się od 1% do fali ciągłej oraz ciśnienie rozrzedzające w zakresie od 0,1 do 20 MPa23,64,67,68,69,70 (Tabela 1). Podobnie znaczne są różnice w składowych widmowych (harmoniczne, podharmoniczne itp.), które zostały zidentyfikowane jako związane z określonymi efektami biologicznymi.
Celem tej pracy jest zatem dostarczenie łatwego do odtworzenia systemu projektowania i implementacji ram do badania in vitro komórkowych efektów biologicznych wywołanych kawitacją, ze szczególnym uwzględnieniem możliwości monitorowania kawitacji.

<table><tbody><tr><td>Absorber</td><td>Precision Acoustics</td><td>APTFlex F28 panel</td><td>o standardowej grubości 1,0 cm</td></tr><tr><td>Wzmacniacz (moc)</td><td>E& I Sp. z o.o.</td><td>Wzmacniacz mocy 1040L</td><td>400W do napędzania źródła ultradźwięków</td></tr><tr><td>Wzmacniacz (pre)</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR445A</td><td>Wielostopniowy przedwzmacniacz o stałym wzmocnieniu dla sygnałów PCD</td></tr><tr><td>Grzałka akwariowa</td><td>Aquael</td><td>Ultra 50W</td><td>Różne modele dla różnych rozmiarów zbiorników.</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>TiePie Engineering</td><td>HS5-110-XM</td><td>Opcja rozszerzonej pamięci: 32 mln punktów na kanał</td></tr><tr><td>Hydrofon</td><td>Precyzyjna akustyka</td><td>FOH</td><td>Wrażliwy obszar o średnicy 0,01 mm minimalizuje efekty kierunkowości</td></tr><tr><td>Mikropęcherzyki</td><td>Bracco</td><td>SonoVue</td><td>Zatwierdzone przez FDA mikropęcherzyki</td></tr><tr><td>Lustro PCD (SAT3)</td><td>Olympus NDT</td><td>F-102</td><td>Odbicie</td></tr> <tr><td>wiązki 90 stopniPrzetwornik PCD</td><td>Olympus NDT</td><td>V320-SU</td><td>Przetwornik zanurzeniowy, wodoodporny PCD 7,5 MHz</td></tr><tr><td></td><td>Olympus NDT</td><td>BCU-58-1 W</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (pokrywa komory SAT2)</td> <td>Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Zobacz Carugo i in. (2015), aby uzyskać wskazówki dotyczące przygotowania</td></tr><tr><td>Pręt polimerowy (uszczelka SAT2)</td><td>Zeus</td><td>Monofilament</td><td></td>PTFE</tr><tr><td>Zatyczka gumowa (pokrywa/uszczelka SAT3)</td><td>VWR</td><td>391-2101</td><td>Średnica dolna 6 mm, średnica górna 8 mm, czerwona</td></tr><tr><td>Generator sygnału</td><td>Agilent</td><td>33250</td><td>Generator przebiegów do źródła ultradźwięków</td></tr><tr><td>Podłoże do komory ekspozycji komórek, SAT2</td><td>Ibidi</td><td>&micro;-Dish 35mm</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do komory ekspozycji komórek, SAT3</td> Źródło ultradźwięków <td>Corning</td><td>Transwell 6,5 mm</td><td></td></tr><tr><td>(SAT3)</td><td>Sonic Concepts</td><td>H107 z otwór centralny</td><td>Zastosowanie źródła obsługującego HIFU umożliwia generowanie ciśnienia >1 MPa zarówno w ognisku, jak i przed ogniskiem, co zapewnia rozszerzony zasięg przestrzenny</td></tr></tbody></table>

studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Zainteresowanie terapeutycznymi zastosowaniami ultradźwięków jest znaczące i rośnie, z potencjalnymi celami klinicznymi od raka do choroby Alzheimera. Kawitacja - tworzenie i późniejszy ruch pęcherzyków w polu ultradźwiękowym - stanowi kluczowe zjawisko leżące u podstaw wielu z tych zabiegów. Pozostaje jednak znaczna niepewność co do szczegółowych mechanizmów działania, za pomocą których kawitacja sprzyja efektom terapeutycznym, i istnieje potrzeba opracowania wiarygodnych technik monitorowania, które można wdrożyć klinicznie. W szczególności istnieją znaczne różnice między badaniami w zakresie parametrów narażenia, o których stwierdzono, że skutecznie przynoszą efekty terapeutyczne, a odpowiadającymi im emisjami akustycznymi. Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie wytycznych projektowych i protokołu eksperymentalnego wykorzystującego powszechnie dostępne komponenty do przeprowadzania badań efektów biodynamicznych za pośrednictwem kawitacji, a także monitorowanie akustyczne w czasie rzeczywistym. Oczekuje się, że protokół umożliwi szersze włączenie monitorowania akustycznego do terapeutycznych eksperymentów ultrasonograficznych i ułatwi porównywanie warunków ekspozycji i ich korelacji z istotnymi skutkami biologicznymi w badaniach nad warunkami ekspozycji.

Rysunek 4 przedstawia przykłady odpowiedzi PCD w dziedzinie czasu i częstotliwości, ilustrując trzy odmienne zachowania kawitacyjne. Wszystkie dane zostały zebrane na urządzeniu SAT3 przy użyciu mikrobąbelek (MBs) SonoVue rozcieńczonych 5-krotnie w PBS, z końcową koncentracją ~2*107 MBs/ml. Temperatura dla wszystkich przykładów w tej sekcji wynosiła 19 ± 1 °C. Źródło US było pobudzane impulsem o czasie trwania 2,0 ms przy częstotliwości 0,5 MHz, aby uzyskać szczytowe ujemne ciśnienia padające wynoszące 0,20 (Rysunek 4A i 4B), 0,30 (Rysunek 4C i 4D) oraz 0,70 MPa (Rysunek 4E i 4F). Rejestracja sygnału rozpoczęła się 1,4 ms przed momentem t = 0, czyli startem impulsu US. Ślady wstawkowe pokazują sygnał w postaci zapisanej (kolor czerwony) oraz po zastosowaniu filtru górnoprzepustowego 2 MHz (kolor niebieski) dla okna czasowego wycentrowanego na czasie przelotu od źródła przez komorę ekspozycji komórek do detektora PCD. Niskopoziomowa odpowiedź przed tym czasem wynika z bezpośrednio odebranego promieniowania ze źródła, co jest powszechne w konfiguracjach, w których PCD znajduje się za źródłem US.
Przy najniższym ciśnieniu padania odpowiedź PCD składa się całkowicie z harmonicznych całkowitoliczbowych podstawowej częstotliwości US wynoszącej 0,5 MHz. Zwiększenie ciśnienia z 0,20 do 0,30 MPa skutkuje pojawieniem się wyraźnych ultraharmonicznych w widmie, oprócz dodatkowo podniesionych harmonicznych całkowitoliczbowych. Kształty fal w dziedzinie czasu przy tych dwóch ciśnieniach wyglądają podobnie, choć wyniki dla 0,30 MPa wykazują większą zmienność w czasie trwania impulsu. Przy najwyższym ciśnieniu amplituda kształtu fali w dziedzinie czasu wzrosła nieliniowo w stosunku do niższych ciśnień, co jest wynikiem wyraźnie podniesionego szumu szerokopasmowego widocznego w widmie. Szum ten jest powszechnie uważany za efekt kawitacji inercyjnej i w tym przykładzie odpowiada zniszczeniu MBs.
Aby dokładniej to zobrazować, odpowiedzi PCD w funkcji czasu przedstawiono na Rysunku 5. Na panelu lewym (Rysunek 5A) pokazano pełne widma przy czasie ekspozycji wynoszącym 50 s, podczas którego źródło emitowało impulsy o czasie trwania 2.0 ms co 0,20 s. Odpowiadające im całkowite, harmoniczne i szerokopasmowe moce przedstawiono na panelu prawym (Rysunek 5B). Ultradźwięki (US) włączono w t = 3,0 s, w którym momencie zaobserwowano szerokopasmowe odpowiedzi o dużej amplitudzie. Uważa się, że początkowy skok odpowiada zniszczeniu największych pęcherzyków w zawiesinie (SonoVue jest polidyspersyjne), co jest częstą obserwacją w eksperymentach kawitacyjnych z pęcherzykami posiadającymi otoczkę, a nawet w mediach niedegazowanych (np. PBS).
Po kilku sekundach odpowiedź szerokopasmowa gwałtownie zmalała, co wynikało prawdopodobnie z zniszczenia pęcherzyków, a sygnał zaczął składać się głównie z harmonicznych. Sugeruje to, że uwolniony gaz i pozostałe MB wibrują w sposób stabilny i niebezwładnościowy. W t~50s składowa szerokopasmowa spadła do poziomu pierwotnego szumu tła. Testy ekspozycyjne tego typu są zatem istotne przy próbach zrozumienia ram czasowych, w których różne efekty pęcherzykowe mogą oddziaływać na komórki w komorze.
Pęcherzyki prawdopodobnie przemieszczają się w odpowiedzi na siły radiacyjne generowane podczas ekspozycji na US, a ruch MB w obrębie pola widzenia PCD i poza nie może prowadzić do zwiększonej zmienności monitorowanego sygnału kawitacji, szczególnie w przypadku rozcieńczonych zawiesin. Dlatego obszar czuły PCD powinien obejmować jak największą część powierzchni ekspozycji komórek. Porównanie odpowiedzi skupionych i nieskupionych PCD o identycznych częstotliwościach środkowych (patrz Rysunek 2) przedstawiono na Rysunku 6, przy zastosowaniu 20-krotnego rozcieńczenia MB w normalnym PBS w SAT2. Widma uśrednione w czasie i dla próbek na panelu Rysunek 6A pokazują, że nieskupiony PCD wykazuje silniejszą odpowiedź szerokopasmową, której towarzyszy mniejsza zmienność między próbkami zarówno w przypadku mocy harmonicznych (Rysunek 6B), jak i ultraharmonicznych (Rysunek 6C).
Ważne jest uświadomienie sobie, że pożywki stosowane do hodowli komórkowych in vitro nie są odgazowane i mogą wykazywać podwyższony poziom tła w zakresie aktywności pęcherzyków. Rysunek 7 przedstawia odpowiedź w SAT2 dla PBS stosowanego w formie dostarczonej przez producenta oraz po dwóch godzinach odgazowywania w próżni, po czym nasycenie powietrzem spadło z 92% do 46%, co określono za pomocą czujnika optycznego (PreSens, Niemcy). Widma na Rysunku 7A zostały uśrednione w czasie ekspozycji i powtórzeń z pięcioma niezależnymi próbkami i wyraźnie pokazują znacznie podwyższone ultraharmoniczne w zwykłym PBS. Mocy zsumowane dla trzech harmonicznych (Rysunek 7B) mieszczą się w granicach odchylenia standardowego każdego wyniku eksperymentalnego. W przeciwieństwie do tego, sumy ultraharmonicznych na Rysunku 7C wykazują, że zwykły PBS ma poziom wyższy niemal o rząd wielkości i znacznie większą zmienność między próbkami. Przykłady te wskazują, że powszechnie stosowana pożywka kompatybilna z komórkami może wykazywać zachowania, które mogłyby zostać (błędnie) przypisane obecności MBs. Ponieważ odgazowywanie pożywki hodowlanej jest zazwyczaj niepraktyczne ze względu na negatywny wpływ na komórki i/lub stabilność czynnika kawitacyjnego, kluczowe jest przeprowadzenie odpowiednich kontroli w każdym badaniu związanym z kawitacją.
<img alt="Schemat komory ekspozycji ultradźwiękowej; obejmuje PCD, przedział komórkowy, absorber, układ optyczny." src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracje dwóch projektów systemów ekspozycji US z monitorowaniem kawitacji: SAT3 (D-F). (A) Opisany montaż SAT2 z usuniętą ścianką boczną dla przejrzystości. (B) SAT2 z nienaruszoną ścianką boczną. (C) Rozmontowany przedział ekspozycji komórek SAT2. (D) Opisany montaż SAT3. (E) SAT3 w konfiguracji normalnej (lewo) i z soczewką (prawo) w celu dopasowania szerokości wiązki przy różnych częstotliwościach. (F) Rozmontowany przedział ekspozycji komórek SAT3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<img alt="Wzory wiązki ultradźwiękowej; niefokusowana w porównaniu do sferycznie fokusowanej, wykresy odpowiedzi częstotliwościowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obliczenia konturów pola ciśnienia o połowę amplitudy dla przetworników niefokusowanych (lewo) i sferycznie fokusowanych (prawo) o średnicy 12,7 mm. Częstotliwości 2, 4 i 8 MHz są przedstawione odpowiednio jako kontury czerwone, niebieskie i zielone dla elementu PCD w początku układu współrzędnych (0,0). Zewnętrzne kontury urządzenia niefokusowanego są stosunkowo niewrażliwe na częstotliwość, ale struktura wewnętrzna jest zależna od częstotliwości. Pole sferycznie fokusowane kurczy się wraz ze wzrostem częstotliwości, ale wewnątrz konturów pola zmieniają się płynnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przetwarzania sygnałów ultradźwiękowych z konfiguracją PCD, filtra, przedwzmacniacza i generatora przebiegów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Aparatura do kondycjonowania i rejestracji sygnałów kawitacyjnych (niebieskie strzałki), wzbudzenia źródła US (czerwone linie) oraz wyzwalania akwizycji danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykresy przetwarzania sygnałów akustycznych przedstawiające napięcie w funkcji czasu oraz widma częstotliwości dla analizy szumu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Odpowiedzi PCD w dziedzinie czasu (lewo) i częstotliwości (prawo) zarejestrowane dla MB rozcieńczonych 5x w PBS. Wartości szczytowego ujemnego ciśnienia padającego wynosiły (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, przy częstotliwości 0,5 MHz. Rejestracja sygnałów rozpoczyna się 1,4 ms przed t=0, czyli początkiem impulsu ultradźwiękowego o czasie trwania 2,0 ms. (A, C, E) Sygnały w dziedzinie czasu (czerwone) przedstawiono w stałej skali pionowej, co wskazuje, jak poziom odpowiedzi zmienia się wraz z ciśnieniem padającym. Wstawki pokazują sygnał zarejestrowany (czerwony) oraz po zastosowaniu filtra górnoprzepustowego 2 MHz (niebieski) dla okna czasowego wycentrowanego na czasie przelotu od źródła, przez komorę ekspozycji komórek, do PCD. (B, D, F) Gęstości widmowe mocy szumu i sygnału obliczono odpowiednio dla t&lt;0 i t&gt;0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Spektrogram i wykres analizy mocy przedstawiający częstotliwość w funkcji czasu; dane całkowite, harmoniczne i szerokopasmowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Historie widm podczas 50-sekundowej ekspozycji zawiesiny MB rozcieńczonej 5x w PBS.(A) Pełne widma oraz (B) całkowita, harmoniczna i szerokopasmowa moc sygnału, wszystkie w funkcji czasu. Warunki wzbudzenia: 0.5 MHz, szczytowe ciśnienie ujemne 0.7 MPa, czas trwania impulsu 2.0 ms, okres powtarzania impulsów 200 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza ultradźwięków skupionych i nieskupionych; wykresy częstotliwości i czasu; gęstość widmowa mocy, harmoniczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wpływ geometrii ogniskowania PCD zarejestrowany przy 20-krotnym rozcieńczeniu mikropęcherzyków w zwykłym PBS. Warunki wzbudzenia: 1,0 MHz, szczytowe ciśnienie ujemne 0,50 MPa, czas trwania impulsu 3,0 ms, okres powtarzania impulsów 10 ms. (A) Pełne widma uśrednione w czasie ekspozycji i dla trzech niezależnych powtórzeń próbek. (B) Moc w harmonicznych 3, 4 i 5 MHz oraz (C) moc w ultraharmonicznych 2,5, 3,5 i 4,5 MHz. Grube linie przedstawiają średnie z próbek, obszary zacienione wskazują +/- 1 odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres gęstości widma mocy i analizy mocy harmonicznej; PBS, odgazowany PBS, porównanie tła." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Efekt odgazowanego medium zarejestrowany przy użyciu PBS. (A) Pełne widma uśrednione w czasie ekspozycji oraz dla pięciu niezależnych powtórzeń próbek. (B) Moc w harmonicznych 3, 4 i 5 MHz oraz (C) moc w ultraharmonicznych 2,5, 3,5 i 4,5 MHz. Grube linie reprezentują średnie z próbek, a obszary zacieniowane oznaczają +/- 1 odchylenie standardowe. Warunki wzbudzenia: 1,0 MHz, szczytowe ciśnienie ujemne 0,50 MPa, czas trwania impulsu 1,0 ms, okres powtarzania impulsów 200 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr</td>
			<td>Jednostka</td>
			<td>Minimum</td>
			<td>Maksimum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>częstotliwość</td>
			<td>MHz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ciśnienie (szczytowe ujemne)</td>
			<td>MPa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>długość impulsu</td>
			<td>cykle</td>
			<td>1</td>
			<td>CW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cykl pracy</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>CW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>czas ekspozycji</td>
			<td>s</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Podsumowanie zakresu zgłoszonych parametrów ułatwiających sonoporację in vitro.

Prezentowany protokół eksperymentalny może być wykorzystany do wykonywania pomiarów aktywności kawitacyjnej w czasie rzeczywistym w urządzeniu do hodowli komórkowej w celu umożliwienia zbadania warunków wymaganych do skutecznego dostarczania leku i/lub innych efektów biologicznych.

Studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Te zasady projektowania systemów laboratoryjnych, gromadzenia i analizy danych mogą być wykorzystane jako racjonalna podstawa do badania in vitro terapii wspomaganych kawitacją. Nasze techniki umożliwiają przeprowadzanie testów o wysokiej przepustowości przy jednoczesnym zachowaniu krytycznych atrybutów eksperymentalnych monitorowania kawitacji interwałowej, powtarzalnego ustawiania próbek i kompatybilności z powszechnie stosowanymi metodami analizy komórkowej. Terapia wzmocniona kawitacją ma wiele potencjalnych zastosowań, w tym w leczeniu chorób takich jak rak i udar mózgu.Dzięki lepszemu zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska możemy opracować lepsze terapie. Prace te zapewniają łatwe do odtworzenia ramy projektowania i wdrażania systemu, które umożliwiają badania nad szeroką gamą komórkowych efektów biologicznych wywołanych kawitacją. W tym dostarczanie leków, sonoporacja i sonodruk.Uzyskanie miarodajnych wyników wymaga zapewnienia odtwarzalności i kontrolowania wszystkich zmiennych w eksperymencie. Konieczne jest wykonanie wszystkich odpowiednich kontroli i zmierzenie hałasu elektrycznego. W celu przygotowania systemów do transfekcji akustycznej należy odgazować ciecz wypełniającą pod ciśnieniem 100 kPa przez co najmniej dwie godziny, aby zminimalizować prawdopodobieństwo kawitacji na ścieżce propagacji.Zaleca się potwierdzenie za pomocą sondy tlenu rozpuszczonego, że ciśnienie parcjalne tlenu jest poniżej 10 kPa. Napełniaj komorę testową powoli, aby zminimalizować ponowne wprowadzenie powietrza do odgazowanej cieczy i natychmiast usuń wszelkie pozostałości pęcherzyków z powierzchni przetwornika i zbiornika medium. Pozwól, aby wzmacniacz mocy źródła ultradźwięków rozgrzał się zgodnie z zaleceniami producenta, aby wzmocnienie i moc wyjściowa były stabilne w odniesieniu do czasu.I rozcieńczyć środek kawitacyjny, delikatnie i ciągle mieszając, aby uzyskać jednolitą zawiesinę bez uwięzienia makropęcherzyków lub zniszczenia środka. Podczas pracy z mikropęcherzykami należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Do przygotowania SAT2, przed rozpoczęciem eksperymentu, użyj etanolu do sterylizacji pokrywy PDM.Dociśnij wysterylizowaną pokrywkę do naczynia hodowlanego, aby utworzyć komorę komórki i załaduj 10-mililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 18 z 10 mililitrami płynu do napełniania. Włóż igłę przez jeden z otworów wypełniających PDM i powoli napełniaj komorę, przechylając, aby pęcherzyki makro mogły wydostać się przez otwarty otwór do napełniania. Po napełnieniu komory włóż pręt polimerowy o średnicy od czterech do pięciu milimetrów do otwartego otworu i ustaw zespół tak, aby otwory były poziome.Wyjąć igłę podczas wstrzykiwania dodatkowego płynu, aby powietrze nie zostało wciągnięte do komory i zamknąć otwór wlewowy innym prętem polimerowym. Sprawdź wzrokowo komorę pod kątem śladów uwięzionych makropęcherzyków i wciśnij komorę ekspozycji komórek do uchwytu komory. Rozważ wyporność cząstek w zawiesinie i to, jak ich wyporność wpłynie na ich kontakt z komórkami przy podejmowaniu decyzji o orientacji komory ekspozycji komórek.Następnie opuszczając pokrywę komory pod kątem poziomym, aby zapobiec osadzaniu się makropęcherzyków na zanurzonych częściach urządzenia, zamontuj pokrywę na górze komory. Przed wykonaniem pomiarów doświadczalnych należy pozwolić, aby zawiesina zrównoważyła się termicznie z temperaturą komory. Za pomocą termopary cienkoigłowej potwierdzić, że temperatura w komorze się ustabilizowała.Aby monitorować eksperymenty w czasie rzeczywistym, zarówno w dziedzinie czasu, jak i częstotliwości, należy rozpocząć proces zbierania danych i włączyć sygnał sterujący źródłem ultradźwięków. Użyj sondy wysokonapięciowej do monitorowania sygnału wyjściowego wzmacniacza, który napędza źródło ultradźwięków przez cały czas trwania eksperymentu, aby upewnić się, że ekspozycja przebiega zgodnie z oczekiwaniami. I upewnij się, że oscyloskop jest ustawiony tak, aby kompensować tłumienie sondy.Monitorowanie w dziedzinie czasu pasywnego detektora kawitacji ujawnia, czy sygnały są odpowiednio zwymiarowane do bieżących ustawień oprzyrządowania i czy sygnały kawitacyjne są widziane wcześniej niż oczekiwano. Monitorowanie w dziedzinie częstotliwości umożliwia analizę rodzaju zachowania pęcherzyków i może być wykorzystane do dostosowania poziomów napędu w razie potrzeby do osiągnięcia pożądanego bodźca komórkowego. W tej analizie, przy najniższym ciśnieniu padającym, odpowiedź pasywnego detektora kawitacji składała się wyłącznie z całkowitych harmonicznych o podstawowej częstotliwości ultradźwięków 0,5 MHz.Wzrost z 0,2 do 0,3 MPa spowodował wyraźne ultraharmoniczne w widmie, a także dalsze zwiększenie harmonicznych całkowitych. Formy fal w dziedzinie czasu przy tych dwóch ciśnieniach wyglądały podobnie, chociaż wyniki 0,3 MPa wykazały większą zmienność w czasie trwania impulsu. Przy najwyższym ciśnieniu amplituda formy fali w dziedzinie czasu rosła nieliniowo w stosunku do niższych ciśnień w wyniku wyraźnie podwyższonego szumu szerokopasmowego, prawdopodobnie z powodu kawitacji bezwładnościowej spowodowanej niszczeniem mikropęcherzyków.Tutaj pełne widma są pokazane w ciągu 50-sekundowego czasu ekspozycji, podczas którego źródło emitowało dwa milisekundowe impulsy co 0,2 sekundy. Jak zaobserwowano na tym wykresie, ilustrującym odpowiadające im całkowite moce harmoniczne i szerokopasmowe, wygenerowano odpowiedzi szerokopasmowe o dużej amplitudzie, przy czym początkowy skok uznano za korelujący ze zniszczeniem największych pęcherzyków. Po kilku sekundach odpowiedź szerokopasmowa gwałtownie się zmniejsza, najwyraźniej z powodu zniszczenia pęcherzyków.W tej analizie wykorzystującej rozcieńczenie mikropęcherzyków w stosunku 20 do 1 i normalnego PBS, średnie widma czasu i próbki wykazały, że nieskoncentrowany pasywny detektor kawitacji zawierał silniejszą odpowiedź szerokopasmową niż detektor ogniskowy. Towarzyszy mu zmniejszona zmienność między próbkami zarówno w mocach harmonicznych, jak i ultraharmonicznych. Efekty biologiczne wywołane kawitacją można ocenić za pomocą technik takich jak mikroskopia fluorescencyjna, cytometria przepływowa lub testy biologiczne.Umożliwia to ustalenie silnego związku między aktywnością kawitacji a efektami biologicznymi. Technika ta pozwoliła nam lepiej zidentyfikować związki między zachowaniem pęcherzyków a efektami biologicznymi, które ujawniły pewne potencjalne nowe mechanizmy leżące u podstaw dostarczania leków za pośrednictwem kawitacji.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Insonacja mikropęcherzyków jest obiecującą strategią ablacji guzów przy zredukowanej średniej mocy akustycznej, a także ukierunkowanego dostarczania leków. Celem niniejszego badania jest opracowanie strategii impulsowania ultradźwiękami o niskim cyklu pracy oraz nanonośników w celu maksymalizacji nietermicznej ablacji mikro naczyniowej i dostarczania ładunku do podskórnych glejaków C6.

Porównanie ukierunkowanego leczenia glejaków u myszy z wykorzystaniem ultradźwięków poprzez dostarczanie nanocząsteczek z lekiem oraz ablację mikro naczyniową

Celowana destrukcja mikropęcherzyków za pomocą ultradźwięków (UTMD) może być wykorzystywana do ukierunkowanego, miejscowego dostarczania cząsteczek bioaktywnych, w tym genów terapeutycznych, do organów docelowych dostępnych dla fal ultradźwiękowych, takich jak serce i wątroba1-6.

Wprowadzenie do techniki ukierunkowanego niszczenia mikropęcherzyków za pomocą ultradźwięków

Kawitacja akustyczna w cieczach poddanych działaniu ultradźwięków tworzy przejściowe ekstremalne warunki wewnątrz zapadających się pęcherzyków, które są źródłem niezwykłej reaktywności chemicznej i emisji światła, znanej jako sonoluminescencja. W obecności gazów szlachetnych powstaje plazma nierównowagowa. "Gorące" cząstki i fotony generowane przez zapadające się pęcherzyki są w stanie wzbudzić gatunki w roztworze.

Aktywacja cząsteczek, jonów i cząstek stałych za pomocą kawitacji akustycznej

Selektywne uszkodzenie ludzkich komórek białaczkowych można osiągnąć dzięki nowatorskiemu podejściu polegającemu na stosowaniu ultradźwięków o niskiej częstotliwości, zarówno z chemioterapeutycznym leczeniem białaczkowym i prawidłowymi komórkami krwiotwórczymi, jak i bez niego.

Generowanie i analiza ilościowa pulsacyjnych ultradźwięków o niskiej częstotliwości w celu określenia wrażliwości sonicznej nieleczonych i leczonych komórek nowotworowych

Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

Ten protokół demonstruje kontrolowane zarodkowanie kawitacji w fantomach żelowych, poprzez jednoczesną ekspozycję zarówno na pulsacyjne światło laserowe bliskiej podczerwieni, jak i skoncentrowane ultradźwięki o wysokiej intensywności (HIFU). Aktywność kawitacyjna może być następnie wykorzystana do poprawy obrazowania i/lub zastosowań terapeutycznych HIFU.

Kontrolowane zarodkowanie kawitacji z nanocząstek plazmonicznego złota w celu wzmocnienia zastosowań ultradźwięków o wysokiej intensywności

Bariera krew-mózg (BBB) może być tymczasowo przerwana za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół wysokoprzepustowego otwierania BBB in vivo przy użyciu modułowego systemu FUS dostępnego dla ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie ultrasonografii.

Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

Mikropęcherzyki kawitacyjne są obrazowane za pomocą szybkiej kamery podłączonej do obiektywu zmiennoogniskowego. Wyjaśniono konfigurację eksperymentalną, a analiza obrazu służy do obliczenia obszaru kawitacji. Analiza obrazu odbywa się za pomocą ImageJ.

Obrazowanie i kwantyfikacja obszaru szybko poruszających się mikropęcherzyków za pomocą szybkiej kamery i analizy obrazu

Opisujemy protokół obserwacji i analizy trajektorii toczenia się komórek na podłożach z asymetrycznym wzorem receptorów. Uzyskane dane są przydatne przy projektowaniu podłoży z wzorem receptorów do bezznakowej separacji i analizy komórek.

Badanie trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów

Wykazano, że pęsety plazmoniczne oraz nanostruktury kryształów fotonicznych zapewniają istotną poprawę wydajności i kontroli orientacji w optycznym chwytaniu mikro- i nanocząstek.

Wykorzystanie plazmonicznych i fotonicznych nanostruktur krystalicznych do usprawnionej manipulacji mikro- i nanocząsteczkami

Poznaj metodę pomiaru aktywności kawitacji w czasie rzeczywistym w hodowli komórkowej. Technika ta umożliwia badanie dostarczania leków i bioefektów w terapii wzmocnionej kawitacją.

Studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją

Przeglądaj więcej filmów