Studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją
9 kwietnia 2021
Prezentowany protokół eksperymentalny może być wykorzystany do wykonywania pomiarów aktywności kawitacyjnej w czasie rzeczywistym w urządzeniu do hodowli komórkowej w celu umożliwienia zbadania warunków wymaganych do skutecznego dostarczania leku i/lub innych efektów biologicznych.
Te zasady projektowania systemów laboratoryjnych, gromadzenia i analizy danych mogą być wykorzystane jako racjonalna podstawa do badania in vitro terapii wspomaganych kawitacją. Nasze techniki umożliwiają przeprowadzanie testów o wysokiej przepustowości przy jednoczesnym zachowaniu krytycznych atrybutów eksperymentalnych monitorowania kawitacji interwałowej, powtarzalnego ustawiania próbek i kompatybilności z powszechnie stosowanymi metodami analizy komórkowej. Terapia wzmocniona kawitacją ma wiele potencjalnych zastosowań, w tym w leczeniu chorób takich jak rak i udar mózgu.
Dzięki lepszemu zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska możemy opracować lepsze terapie. Prace te zapewniają łatwe do odtworzenia ramy projektowania i wdrażania systemu, które umożliwiają badania nad szeroką gamą komórkowych efektów biologicznych wywołanych kawitacją. W tym dostarczanie leków, sonoporacja i sonodruk.
Uzyskanie miarodajnych wyników wymaga zapewnienia odtwarzalności i kontrolowania wszystkich zmiennych w eksperymencie. Konieczne jest wykonanie wszystkich odpowiednich kontroli i zmierzenie hałasu elektrycznego. W celu przygotowania systemów do transfekcji akustycznej należy odgazować ciecz wypełniającą pod ciśnieniem 100 kPa przez co najmniej dwie godziny, aby zminimalizować prawdopodobieństwo kawitacji na ścieżce propagacji.
Zaleca się potwierdzenie za pomocą sondy tlenu rozpuszczonego, że ciśnienie parcjalne tlenu jest poniżej 10 kPa. Napełniaj komorę testową powoli, aby zminimalizować ponowne wprowadzenie powietrza do odgazowanej cieczy i natychmiast usuń wszelkie pozostałości pęcherzyków z powierzchni przetwornika i zbiornika medium. Pozwól, aby wzmacniacz mocy źródła ultradźwięków rozgrzał się zgodnie z zaleceniami producenta, aby wzmocnienie i moc wyjściowa były stabilne w odniesieniu do czasu.
I rozcieńczyć środek kawitacyjny, delikatnie i ciągle mieszając, aby uzyskać jednolitą zawiesinę bez uwięzienia makropęcherzyków lub zniszczenia środka. Podczas pracy z mikropęcherzykami należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Do przygotowania SAT2, przed rozpoczęciem eksperymentu, użyj etanolu do sterylizacji pokrywy PDM.
Dociśnij wysterylizowaną pokrywkę do naczynia hodowlanego, aby utworzyć komorę komórki i załaduj 10-mililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 18 z 10 mililitrami płynu do napełniania. Włóż igłę przez jeden z otworów wypełniających PDM i powoli napełniaj komorę, przechylając, aby pęcherzyki makro mogły wydostać się przez otwarty otwór do napełniania. Po napełnieniu komory włóż pręt polimerowy o średnicy od czterech do pięciu milimetrów do otwartego otworu i ustaw zespół tak, aby otwory były poziome.
Wyjąć igłę podczas wstrzykiwania dodatkowego płynu, aby powietrze nie zostało wciągnięte do komory i zamknąć otwór wlewowy innym prętem polimerowym. Sprawdź wzrokowo komorę pod kątem śladów uwięzionych makropęcherzyków i wciśnij komorę ekspozycji komórek do uchwytu komory. Rozważ wyporność cząstek w zawiesinie i to, jak ich wyporność wpłynie na ich kontakt z komórkami przy podejmowaniu decyzji o orientacji komory ekspozycji komórek.
Następnie opuszczając pokrywę komory pod kątem poziomym, aby zapobiec osadzaniu się makropęcherzyków na zanurzonych częściach urządzenia, zamontuj pokrywę na górze komory. Przed wykonaniem pomiarów doświadczalnych należy pozwolić, aby zawiesina zrównoważyła się termicznie z temperaturą komory. Za pomocą termopary cienkoigłowej potwierdzić, że temperatura w komorze się ustabilizowała.
Aby monitorować eksperymenty w czasie rzeczywistym, zarówno w dziedzinie czasu, jak i częstotliwości, należy rozpocząć proces zbierania danych i włączyć sygnał sterujący źródłem ultradźwięków. Użyj sondy wysokonapięciowej do monitorowania sygnału wyjściowego wzmacniacza, który napędza źródło ultradźwięków przez cały czas trwania eksperymentu, aby upewnić się, że ekspozycja przebiega zgodnie z oczekiwaniami. I upewnij się, że oscyloskop jest ustawiony tak, aby kompensować tłumienie sondy.
Monitorowanie w dziedzinie czasu pasywnego detektora kawitacji ujawnia, czy sygnały są odpowiednio zwymiarowane do bieżących ustawień oprzyrządowania i czy sygnały kawitacyjne są widziane wcześniej niż oczekiwano. Monitorowanie w dziedzinie częstotliwości umożliwia analizę rodzaju zachowania pęcherzyków i może być wykorzystane do dostosowania poziomów napędu w razie potrzeby do osiągnięcia pożądanego bodźca komórkowego. W tej analizie, przy najniższym ciśnieniu padającym, odpowiedź pasywnego detektora kawitacji składała się wyłącznie z całkowitych harmonicznych o podstawowej częstotliwości ultradźwięków 0,5 MHz.
Wzrost z 0,2 do 0,3 MPa spowodował wyraźne ultraharmoniczne w widmie, a także dalsze zwiększenie harmonicznych całkowitych. Formy fal w dziedzinie czasu przy tych dwóch ciśnieniach wyglądały podobnie, chociaż wyniki 0,3 MPa wykazały większą zmienność w czasie trwania impulsu. Przy najwyższym ciśnieniu amplituda formy fali w dziedzinie czasu rosła nieliniowo w stosunku do niższych ciśnień w wyniku wyraźnie podwyższonego szumu szerokopasmowego, prawdopodobnie z powodu kawitacji bezwładnościowej spowodowanej niszczeniem mikropęcherzyków.
Tutaj pełne widma są pokazane w ciągu 50-sekundowego czasu ekspozycji, podczas którego źródło emitowało dwa milisekundowe impulsy co 0,2 sekundy. Jak zaobserwowano na tym wykresie, ilustrującym odpowiadające im całkowite moce harmoniczne i szerokopasmowe, wygenerowano odpowiedzi szerokopasmowe o dużej amplitudzie, przy czym początkowy skok uznano za korelujący ze zniszczeniem największych pęcherzyków. Po kilku sekundach odpowiedź szerokopasmowa gwałtownie się zmniejsza, najwyraźniej z powodu zniszczenia pęcherzyków.
W tej analizie wykorzystującej rozcieńczenie mikropęcherzyków w stosunku 20 do 1 i normalnego PBS, średnie widma czasu i próbki wykazały, że nieskoncentrowany pasywny detektor kawitacji zawierał silniejszą odpowiedź szerokopasmową niż detektor ogniskowy. Towarzyszy mu zmniejszona zmienność między próbkami zarówno w mocach harmonicznych, jak i ultraharmonicznych. Efekty biologiczne wywołane kawitacją można ocenić za pomocą technik takich jak mikroskopia fluorescencyjna, cytometria przepływowa lub testy biologiczne.
Umożliwia to ustalenie silnego związku między aktywnością kawitacji a efektami biologicznymi. Technika ta pozwoliła nam lepiej zidentyfikować związki między zachowaniem pęcherzyków a efektami biologicznymi, które ujawniły pewne potencjalne nowe mechanizmy leżące u podstaw dostarczania leków za pośrednictwem kawitacji.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół dotyczący pomiarów aktywności kawitacji w czasie rzeczywistym w urządzeniu do hodowli komórek, ułatwiając badania nad dostarczaniem leków i efektami biologicznymi.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Terapia kawitacji
Tło
- Terapie wzmocnione kawitacją mają potencjalne zastosowania w leczeniu chorób takich jak rak i udar.
- Rozumienie mechanizmów kawitacji może prowadzić do ulepszonych strategii terapeutycznych.
- Badanie podkreśla reproduktywalność i kontrolę zmiennych eksperymentalnych.
- Techniki obejmują monitorowanie szumów elektrycznych i zapewnienie właściwej przygotowania systemów.
Cel badania
- Opracowanie reproduktywalnego systemu do badania efektów kawitacji na komórkach.
- Zbadanie zastosowań takich jak dostarczanie leków, sonoporation i sonoprinting.
- Ustanowienie związku między aktywnością kawitacji a efektami biologicznymi.
Stosowane metody
- Przygotowanie systemów do transfekcji akustycznej z degazowanymi płynami.
- Monitorowanie kawitacji w czasie rzeczywistym za pomocą pasywnych detektorów kawitacji.
- Zbieranie danych w domenach czasu i częstotliwości w celu analizy zachowania bąbelków.
- Ocena efektów biologicznych za pomocą technik takich jak mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa.
Główne wyniki
- Monitorowanie ujawniło odrębne zachowania bąbelków przy różnych ciśnieniach.
- Wyższe ciśnienia prowadziły do zwiększonego szumu szerokopasmowego i zniszczenia bąbelków.
- Odpowiedzi pasywnych detektorów kawitacji wskazywały na silniejsze sygnały w konfiguracjach nieskupionych.
- Ustanowiono mocny związek między aktywnością kawitacji a efektami biologicznymi.
Wnioski
- Badanie dostarcza ram dla badania efektów kawitacji na komórkach.
- Wyniki mogą wpłynąć na rozwój ulepszonych podejść terapeutycznych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystywać te wyniki do eksploracji dodatkowych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Cavitation enhanced therapy represents a mechanistic approach to improving drug delivery and cellular bioeffects through controlled ultrasound-induced bubble dynamics. Establishing reproducible experimental frameworks with real-time acoustic monitoring enables predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for oncology and neurological indications. This supports early discovery workflows by linking physical stimuli to measurable biological outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating cavitation activity with drug delivery and sonoporation efficiency.
- Operational Value: Enables pathway clarification through real-time monitoring of bubble behavior under controlled exposure conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing dose-response relationships between acoustic parameters and biological effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for high-throughput testing with interval cavitation monitoring and repeatable sample alignment.
- Operational Value: Addresses assay standardization through degassing protocols, bubble handling procedures, and thermal equilibration requirements.
- Scalability: Highlights platform reuse via compatible cellular analysis methods such as fluorescence microscopy and flow cytometry.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase cavitation mechanisms to preclinical validation through established relationships between bubble dynamics and cellular responses.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying bioeffects across pressure gradients and identifying thresholds for inertial cavitation.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by elucidating how micro bubble destruction contributes to broadband noise and therapeutic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by providing quantitative, reproducible cavitation metrics that inform mechanistic understanding and screening readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via real-time passive cavitation detection in time and frequency domains.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized preparation, bubble suspension uniformity, and compatibility with common cellular analysis techniques.
- Analytics: Enables condition comparison via harmonic and broadband power measurements that reflect bubble behavior and inertial cavitation thresholds.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by establishing robust relationships between cavitation activity and assessable bioeffects using fluorescence microscopy and flow cytometry.
- Enterprise Reuse: Positions the system as a reusable capability for studying diverse cavitation-induced effects across drug delivery, sonoporation, and sonoprinting applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in ultrasound-mediated mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through controlled degassing, bubble handling, and thermal equilibration protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative acoustic-biological effect correlations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ultrasound physics, bubble dynamics, and acoustic monitoring techniques.
- Needs instrumentation including high-voltage probes, oscilloscopes with probe compensation, passive cavitation detectors, and temperature monitoring tools.
- Demands cross-team standardization of degassing procedures, bubble preparation, and chamber assembly to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations for different cell types, cavitation agents, and exposure chamber orientations based on particle buoyancy.
- Includes practical limitations such as macro bubble entrapment risks, ultrasound source warm-up requirements, and the need for residual bubble clearance from surfaces.
