Name: Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów skórnych w mioblasty i miotubki przy użyciu wektorów wirusowych. Ta technika umożliwia szybkie badanie mechanizmów chorób nerwowo-mięśniowych i testowanie terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Vincentowi Mouly za podzielenie się swoją wiedzą na temat tego modelu w przeszłości. Prace te były wspierane przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (R01 NS043264 (K.M.F. i R.B.W.)), amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N. i N.W.). N.W. otrzymał wsparcie stypendialne od Ohio State University/Nationwide Children's Hospital Muscle Group oraz Fundacja Philippe'a. Prace te były również wspierane przez wewnętrzne fundusze uznaniowe, a część prac nad pomijaniem eksonu 2 była również wspierana przez CureDuchenne (K.M.F.) i Association Francaise Contre Les Myopathies. Numer IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 oraz IBCSC#: IBS00000123.

<ol><li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+down-regulates+the+myogenic+regulatory+factors+in+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts.</a> Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).</li>
<li>Pantic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+versatile+immortal+muscle+cell+models+from+healthy+and+myotonic+dystrophy+type+1+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts.</a> Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).</li>
<li>Thorley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+characteristics+are+preserved+in+hTERT%2Fcdk4+human+myogenic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines.</a> Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).</li>
<li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%3A+Validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+duchen%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen.</a> Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).</li>
<li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-skipping+advances+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy.</a> Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).</li>
<li>Hwang, J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+exon-skipping+therapies+using+antisense+oligonucleotides+and+genome+editing+for+the+treatment+of+various+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies.</a> Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Skipping+of+Single+Exon+Duplications+in+DMD+Patient-Derived+Cell+Lines+Using+an+Antisense+Oligonucleotide+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).</li>
<li>De Angelis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+snRNA+molecules+carrying+antisense+sequences+against+the+splice+junctions+of+exon+51+of+the+dystrophin+pre-mRNA+induce+exon+skipping+and+restoration+of+a+dystrophin+synthesis+in+%CE%9448-50+DMD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).</li>
<li>Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+alteration+of+pre-mRNA+splicing+patterns+by+modified+U7+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+from+a+DMD+exon+5+IRES+results+in+a+functional+dystrophin+isoform+that+attenuates+dystrophinopathy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice.</a> Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).</li>
<li>Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+oxidative+phosphorylation+of+immortalization+with+the+telomerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene.</a> Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).</li>
<li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
</ol>

Nationwide Children's Hospital udzielił Audentes Therapeutics licencji na opisany tutaj program pomijania eksonu 2. K.M.F. i N.W. otrzymały opłaty licencyjne w wyniku tej licencji.

Aby uzyskać linie komórkowe FM o dobrej jakości, niektóre kroki są krytyczne. Im szybciej zostanie przeprowadzona biopsja skóry, tym większe są szanse na uzyskanie zdrowych fibroblastów. Istotna jest również liczba pasaży kultur fibroblastów. Komórki pierwotne mają ograniczoną zdolność proliferacyjną i po wielu przejściach wchodzą w starzenie replikacyjne. Dlatego lepiej jest mieć zapas fibroblastów o niskiej liczbie pasażów i przekształcać komórki jak najwcześniejszym pasażem. 
Kolejnym ważny...

Modele komórkowe uzyskane bezpośrednio z tkanek ludzkich są przydatne do modelowania wielu ludzkich zaburzeń genetycznych, z tą zaletą, że mają oryginalny kontekst genomiczny i, w wielu przypadkach, odtwarzają te same molekularne i komórkowe cechy charakterystyczne, które obserwuje się u pacjentów. W dziedzinie zaburzeń nerwowo-mięśniowych biopsje mięśni były doskonałym źródłem ludzkich mioblastów i pomogły w wyjaśnieniu mechanizmów patologicznych. Ponadto są ważnym narzędziem do testowania in vivo leków i terapii genowych. Z jednej strony wyprowadzenie mioblastów z fragmentów mięśni jest stosunkowo łatwe. Z drugiej strony, hodowla i utrzymanie pierwotnych mioblastów są wyzwaniem ze względu na ich ograniczone tempo proliferacji i replikacyjne starzenie się in vitro1. Alternatywą dla tych ograniczeń jest unieśmiertelnienie mioblastów z insercją genów ludzkiej telomerazy (hTERT) i/lub kinazy zależnej od cykliny 4 (CDK4) 2,3, z zachowaniem cech mięśni szkieletowych4. Niemniej jednak uzyskanie pierwotnych mioblastów jest nadal zależne od biopsji mięśni, zabiegu chirurgicznego niekorzystnego dla pacjentów, którzy w wielu przypadkach mają mięśnie w zaawansowanym zwyrodnieniu. Tak więc mięśnie tych pacjentów składają się ze znacznej części tkanki zwłóknieniowej i/lub tłuszczowej i dają mniej komórek mięśniowych, co wymaga oczyszczenia komórek przed unieśmiertelnieniem.
W przeciwieństwie do biopsji mięśni, biopsje skóry są bardziej dostępne i mniej szkodliwe dla pacjentów. Pierwotne fibroblasty mogą pochodzić z fragmentów skóry in vitro. Chociaż fibroblasty nie są przede wszystkim dotknięte mutacjami powodującymi zaburzenia nerwowo-mięśniowe, mogą być transróżnicowane w mioblasty. Można to osiągnąć poprzez wprowadzenie genu Myod, miogennego regulatorowego czynnika transkrypcyjnego5. W tym manuskrypcie opisujemy protokół otrzymywania transzróżnicowanych mioblastów, od ustanowienia kultur fibroblastów do uzyskania zróżnicowanych miotub (reprezentatywne podsumowanie metody przedstawiono w <silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Przedkliniczne testowanie strategii terapeutycznych zależy od modeli komórkowych i zwierzęcych zawierających mutacje podobne do mutacji występujących u ludzkich pacjentów. Chociaż rozwój modeli zwierzęcych stał się bardziej realny dzięki postępowi technologii edycji genów, takich jak CRISPR/Cas96, nadal jest to trudne i kosztowne. W związku z tym linie komórkowe pochodzące od pacjentów są dostępną opcją do posiadania modeli, obejmujących szerokie spektrum mutacji chorób, takich jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD). Obdukcja i tworzenie modeli komórkowych mają kluczowe znaczenie dla rozwoju spersonalizowanych terapii takich patologii.
Wśród spersonalizowanych terapii, które zostały zbadane, strategie pomijania eksonów są jedną z najbardziej obiecujących dla różnych dystrofii mięśniowych7,8. Strategia ta polega na wytwarzaniu krótszego, ale funkcjonalnego białka. Odbywa się to poprzez ukrycie definicji eksonu w spliceosomie, a tym samym wykluczenie zmutowanego eksonu z końcowego przekaźnika. Jest to bardzo obiecująca technologia, która została zatwierdzona przez FDA dla DMD. W związku z tym w niniejszym protokole opisujemy również metody transfekcji mioblastów za pomocą dwóch różnych technologii związanych z pomijaniem eksonów: oligonukleotydów antysensownych (AON) i wirusa związanego z adenowirusem U7snRNA (AAV). Transfekcja AON jest dobrym narzędziem do wstępnego badania przesiewowego kilku sekwencji zaprojektowanych w celu promowania pomijania eksonów9. Jednak aktywność AON-ów jest przejściowa. Aby uzyskać trwałą ekspresję sekwencji antysensownych, zbadaliśmy również małe jądrowe RNA (snRNA) w połączeniu z AAV, umożliwiając lokalizację jądra i włączenie do maszynerii splicingu10. U7 to snRNA biorący udział w przetwarzaniu mRNA histonów, który można zaprojektować tak, aby wiązał białka, które przekierują go do spliceosomu i dostarczą sekwencje antysensowne11. Zastosowanie zmodyfikowanych snRNA U7 w połączeniu z wektorami AAV pokonuje ograniczenia AON, co skutkuje ciągłą ekspresją AONs i lepszą transdukcją tkanek będących przedmiotem zainteresowania12. W tym protokole używamy komórek pochodzących od pacjentów z DMD, aby zilustrować strategię pomijania eksonów.

<table><tbody><tr><td>Naczynie 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA, czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>20X Bufor transferowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris-acetate SDS Bufor biegowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>3-8% Tris-Acetate żel</td><td>Thermo Fisher</td><td>EA0378BOX</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kolba</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-Antymikotyczny 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anty-miozyna łańcuch ciężki, przeciwciało sarkomerowe</td><td>Badania rozwojowe Hybridom Bank</td><td>MF20 supernatant</td><td>Rozcieńczenie 1:50</td></tr><tr><td>Przeciwutleniacz</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>Test białka BCA</td><td>Thermo Fisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3571</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Millipore Sigma</td><td>300410250MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Suplement GlutaMAX o wysokiej zawartości glukozy, Pirogronian</td><td>Thermo Fisher</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>zestaw DNAzy I (250U)</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek doksycykliny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2653-5</td><td></td></tr><tr><td>Dup2 ludzkie startery</td><td>Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'Rv_5</td>' <td>CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'Dystrofina</td><td></td></tr> <tr><td>przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysza, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Halt Koktajl inhibitorów proteazy 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Thermo Fisher 10687010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD kozia anty-królicza IgG (H+L)</td><td>Li-Cor</td><td>926-68071</td><td>Rozcieńczenie 1:5000</td></tr><tr><td>System prowadnic komorowych Lab-Tek II CC2</td><td>Thermo Fisher</td><td>15852</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>Bioworld</td><td>105700201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR matryca</td><td>membranowa Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania</td><td>Thermo Fisher</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa 0,45 i mikro; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Normalna kontrola surowicy koziej</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>Li-Cor</td><td>927-40003</td><td>Bufor blokujący do Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana surowica Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0172</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor fosfatazy</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32957</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Revert 700 Total Protein Stain do normalizacji Western Blot</td><td>Li-Cor</td><td>926-11021</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid zestaw</td><td>Thermo Fisher</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrator-25</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele</td><td>Aspen Surgical</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>Medium do różnicowania komórek mięśni szkieletowych</td><td>Promocell</td><td>C23061</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek mięśni szkieletowych</td><td>Promocell</td><td>C23060</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik</td> <td>TRIzolThermo Fisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka niskotemperaturowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>7402</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield anti blaknięcie podłoże</td><td>montażowe Vector Labs</td><td>H1000</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Badania zarówno nad patofizjologią, jak i celami terapeutycznymi w dystrofiach mięśniowych były utrudnione przez ograniczoną zdolność proliferacyjną ludzkich mioblastów. Stworzono kilka modeli mysich, ale albo nie reprezentują one tak naprawdę ludzkiej fizjopatologii choroby, albo nie są reprezentatywne dla szerokiego spektrum mutacji występujących u ludzi. Unieśmiertelnienie ludzkich mioblastów pierwotnych jest alternatywą dla tego ograniczenia; Jednak nadal jest to zależne od biopsji mięśni, które są inwazyjne i nie są łatwo dostępne. W przeciwieństwie do tego, biopsje skóry są łatwiejsze do uzyskania i mniej inwazyjne dla pacjentów. Fibroblasty pochodzące z biopsji skóry mogą być unieśmiertelnione i transróżnicowane w mioblasty, stanowiąc źródło komórek o doskonałym potencjale miogennym. Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodę przeprogramowania fibroblastów na linię miogenną. Fibroblasty są transdukowane za pomocą dwóch lentiwirusów: hTERT w celu unieśmiertelnienia pierwotnej kultury i indukowanego przez tet MYOD, który po dodaniu doksycykliny indukuje przekształcenie fibroblastów w mioblasty, a następnie dojrzałe miotuby, które wyrażają późne markery różnicowania. Ten protokół szybkiej transdyferencjacji stanowi potężne narzędzie do badania mechanizmów patologicznych i badania innowacyjnych genowych lub farmakologicznych terapii biologicznych zaburzeń nerwowo-mięśniowych.

Niniejszy protokół pokazuje, jak prowadzić hodowle fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry oraz jak przekształcać je w mioblasty, a następnie w zróżnicowane miotuby. Tego rodzaju linia komórkowa jest niezwykle użyteczna w badaniu schorzeń nerwowo-mięśniowych oraz w testowaniu potencjalnych terapii in vitro.
Schematyczny przebieg konwersji fibroblastów przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2A przedstawia fragment skóry oraz w...

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Witam wszystkich. Nazywam się Nicolas Wein. Jestem głównym badaczem w Nationwide Children's Hospital w Columbus w stanie Ohio.A dzisiaj pokażemy Wam film o tym, jak wykonać biopsję skóry i przekształcić ją w mioblasty i miorurkę. Jest to bardzo przydatne narzędzie do badania zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Ponadto jest to znacznie szybsza technologia w porównaniu do IPSC, ponieważ używamy dwóch różnych typów wirusów do bezpośredniej walki z tym typem komórek.Ten film pokazuje protokół tworzenia kultur fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry, konwersji do mioblastów, a następnie zróżnicowanych miotub. Biopsja skóry jest przenoszona do hodowli komórkowej w celu uzyskania fibroblastów skóry. Do transdukcji tych fibroblastów wykorzystywane są lentiwirusy przenoszące geny hTERT i MYOD.Po dodaniu pożywki wzrostowej mioblastów uzupełnionej doksycykliną dochodzi do ekspresji genu MYOD, indukując konwersję fibroblastów w mioblasty. Następnie pożywkę zamienia się na pożywkę różnicującą, również uzupełnioną doksycykliną. Następnie mioblasty łączą się ze sobą, tworząc wielojądrowe miotuby.Odessać pożywkę z probówki i przepłukać biopsję 10 mililitrami, jeden x PBS w temperaturze pokojowej, trzy razy. Po trzecim praniu pozostaw PBS w tubce. Wylej PBS i biopsję skóry na naczynie o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych.Za pomocą sterylnych skalpeli pokrój biopsję na jak najmniejsze kawałki. Za pomocą pipety przenieś pojedynczy kawałek skóry na sterylne naczynie o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych. Odessać nadmiar PBS z okolic każdego kawałka.Uważaj, aby nie zassać samego elementu. Przykryj naczynia częściowo pokrywką i pozostaw fragmenty biopsji skóry do wyschnięcia na pięć do 20 minut. Nie pozwól, aby kawałki wyschły zbyt długo.Gdy kawałki wyschną, przechyl naczynie pod kątem 45 stopni i powoli dodaj 12 mililitrów pożywki fibroblastowej do rogu naczynia. Opuść naczynie, ostrożnie rozprowadzając media, aby kawałki nie zostały podniesione przez media. Umieść naczynia w inkubatorze.Wymień nośnik w ciągu pięciu do siedmiu dni, a następnie raz w tygodniu. Wysiewaj pierwotne fibroblasty przy 30% konfluencji i dwóch dołkach 12-dołkowej płytki, około 20 000 komórek na dołek, aby następnego dnia uzyskać około 50% konfluencji. W przypadku transdukcji lentiwirusowej dodaj od dwóch do 5 miliardów genomów wirusowych hTERP Puromycin Lentivirus i 400 mikrolitrów pożywki fibroblastów.Dodaj mieszankę lentiwirusa do jednego dołka. Do drugiego dołka dodaj tylko 400 mikrolitrów pożywki fibroblastowej. Następnego dnia dodaj jeden mililitr pożywki.Jeden lub dwa dni później przenieś komórki na płytkę z sześcioma dołkami i hoduj je, aż osiągną 60 do 70% zgrywki. Uzupełnij pożywkę fibroblastów jednym mikrogramem na mililitr Puromycyny i dodaj dwa mililitry do każdej studzienki. Utrzymuj wybrane komórki do momentu, gdy wszystkie komórki w studzience kontrolnej będą martwe przez co najmniej 12 dni, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni.Wykres nasion H wyrażający fibroblasty przy 30% konfluencji w trzech dołkach płytki 12-dołkowej, aby następnego dnia uzyskać około 50% konfluencji. W przypadku transdukcji lentiwirusowej wymieszaj od dwóch do pięciu miliardów genomów wirusa lentiwirusa MYOD Hygromycyny B i 400 mikrolitrów pożywki fibroblastowej i dodaj do dwóch studzienek. Dodaj jeden mililitr pożywki następnego dnia.Jeden lub dwa dni później przenieś komórki na płytkę z sześcioma dołkami i rosły, aż osiągną 60 do 70% zlewania się. Uzupełnij pożywkę wzrostową 400 mikrogramami na mililitr higromycyny B. Dodaj dwa mililitry do każdej studzienki. Utrzymuj komórki pod selekcją, aż wszystkie komórki w studzienkach kontrolnych obumrą, zwykle zajmuje to co najmniej 12 dni, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni.Aby indukować mioblasty, hoduj fibroblasty, aż będą zlewać się w 70%. Dodaj osiem mikrogramów na mililitr doksycykliny do pożywki wzrostowej mioblastów. Zawsze używaj świeżych porcji doksycykliny i pożywki.Pożywkę należy przygotować tuż przed jakąkolwiek zmianą podłoża. Ponadto doksycykliny nie należy zamrażać. Odessać pożywkę fibroblastów i przepłukać komórki PBS.Dodaj 10 mililitrów uzupełnionej pożywki mioblastowej. Dwa do trzech dni później komórki są zlewające się w 90 do 95%, a ich morfologia ulegnie zmianie. Odessać pożywkę wzrostową mioblastów i spłukać powierzchnię komórki PBS.Dodać 10 mililitrów pożywki różnicującej, która została uzupełniona o osiem mikrogramów na mililitr świeżej doksycykliny. Kontynuuj zmianę pożywki co dwa do trzech dni, aż utworzą się rurki mięśniowe. Siedem do 10 dni po zainicjowaniu różnicowania rurki mięśniowej komórki powinny być w pełni zróżnicowane, ale różni się to w zależności od linii komórkowej.Pierwsze fibroblasty mogą pojawić się pięć dni po tym, jak fragmenty skóry zostaną umieszczone w hodowli. Na zdjęciu B fibroblasty zlewają się i są gotowe do przeniesienia do kolb o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w celu dalszej proliferacji. Ważne jest, aby zamrozić kilka fiolek z fibroblastami przy niskiej liczbie pasaży, gdy komórki pierwotne wchodzą w proces starzenia replikacyjnego.Po ustaleniu linii komórkowych FM w celu przekształcenia fibroblastów w miotuby, fibroblasty muszą się namnażać do 70% zlewania się, jak pokazano na rysunku A. Ważne jest, aby nie przekraczać 80% konfluencji, ponieważ duża gęstość może zaburzyć różnicowanie. Po dodaniu Doksycykliny do pożywki, w ciągu dwóch do czterech dni komórki stają się mioblastami, charakteryzującymi się wydłużoną morfologią i równoległą orientacją, jak widać na rysunku B. Zróżnicowane miorurki pokazano na rysunku C. Czas fuzji i różnicowania miotub może wynosić od siedmiu do 21 dni w zależności od genotypu komórki. Komórki muszą zostać zebrane lub utrwalone przed odłączeniem.Początek oderwania można zaobserwować na podstawie koloru i jasności krawędzi miotuby, jak wskazują strzałki na tym rysunku. Poprzez immunofluorescencję ekspresja dojrzałych białek specyficznych dla mięśni potwierdza pomyślną konwersję fibroblastów w miotuby. Na tych zdjęciach pokazane są trzy różne komórki.Stopień zróżnicowania będzie się różnił w zależności od komórki i może, ale nie musi, być dotknięty przez mutację pierwotną, tak jak ma to miejsce w przypadku komórek na rysunkach B i C. Dalsza walidacja modelu została potwierdzona przez RNAseq. Jak pokazano na tym wykresie, w mięśniach FM wykryto ponad 12 000 genów o zróżnicowanej ekspresji w porównaniu z genami mięśni szkieletowych. Znacząca korelacja między oboma transkryptomami potwierdza, że komórki FM mają specyficzny dla mięśni profil ekspresji, co pokazuje, że są użytecznym i niezawodnym substytutem linii komórkowych pochodzących z mięśni.Aby zilustrować przydatność tego modelu in vitro, wykorzystaliśmy jedną z najczęstszych egzonicznych duplikacji w genie DMD. Duplikacja eksonu drugiego prowadzi do zakłócenia ramki odczytu DMD, a jej pominięcie może prowadzić do przywrócenia tej ramki odczytu lub wykorzystania wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu. Terapia ta została już potwierdzona w badaniach in vivo Rysunek A, wykazaliśmy dowód koncepcji poprzez analizę RTPCR tej konkretnej zmutowanej linii komórkowej, z leczeniem i bez leczenia przez pomijanie eksonów.Western blot na rycinie B pokazuje, że funkcjonalne białko dystrofiny ulega ekspresji w leczonych komórkach. Porównując skuteczność tej terapii z modelami in vivo, wyniki potwierdzają wiarygodność techniki różnicowania komórek i wspierają jej zastosowanie do testowania różnych terapii genowych specyficznych dla mutacji. Przed badaniami klinicznymi wymagane w celu sprawdzenia skuteczności oficjalnego wsparcia terapii w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych, w zależności od Zdolności modeli zwierzęcych i komórkowych.Rozwój modeli zwierzęcych, choć w dzisiejszych czasach jest łatwiejszy, nie jest wykonalną opcją dla każdej konkretnej mutacji. Wytwarzanie mioblastów przez komórki IPS pochodzące z fibroblastów skóry jest alternatywą, ale jest to technika czasochłonna. Procedura ta jest więc prostą alternatywą dla generacji IPS, która pozwala na bezpośrednią konwersję fibroblastów do mioblastów.Ułatwia dostęp do modeli komórek ludzkich, unikając bardziej inwazyjnego stosowania biopsji mięśni Podsumowując, ta bezpośrednia konwersja fibroblastów w mioblasty jest potężnym narzędziem do testowania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych w kontekście ograniczeń specyficznych.

direct-reprogramming-human-fibroblasts-into-myoblasts-to-investigate

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Opisano nieinwazyjny sposób oceny sukcesu przeszczepu mioblastów. Metoda wykorzystuje zunifikowany gen reporterowy fuzyjny złożony z genów, których ekspresję można obrazować za pomocą różnych metod obrazowania. W tym przypadku wykorzystujemy sekwencję genu reporterowego fluc do celowania w komórki za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

Ten protokół zawiera szczegółowe procedury izolacji komórek pochodzących z moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową; ich skuteczne i szybkie przeprogramowanie poprzez transdukcję wirusa Sendai.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji

Ten protokół opisuje techniki izolacji żywych komórek i pierwotnej hodowli linii komórkowych miogennych i fibroblastów z tkanki mięśniowej lub skórnej.  Opisana jest również technika unieśmiertelniania tych linii komórkowych.  Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

Tutaj prezentujemy solidną metodę przeprogramowania pierwotnych fibroblastów embrionalnych w funkcjonalne kardiomiocyty poprzez nadekspresję GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) wraz z hamowaniem sygnalizacji TGF-β. Nasz protokół generuje bicie kardiomiocytów już po 7 dniach od transdukcji z wydajnością do 60%.

Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system bezpośredniego przeprogramowania melanocytów oraz wysoce wydajny, skoncentrowany system pakowania wirusów, który zapewnia płynne bezpośrednie przeprogramowanie.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Poznaj metodę bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów skórnych w mioblasty i miotubki przy użyciu wektorów wirusowych. Ta technika umożliwia szybkie badanie mechanizmów chorób nerwowo-mięśniowych i testowanie terapii.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Przeglądaj więcej filmów