Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Witam wszystkich. Nazywam się Nicolas Wein. Jestem głównym badaczem w Nationwide Children's Hospital w Columbus w stanie Ohio.

A dzisiaj pokażemy Wam film o tym, jak wykonać biopsję skóry i przekształcić ją w mioblasty i miorurkę. Jest to bardzo przydatne narzędzie do badania zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Ponadto jest to znacznie szybsza technologia w porównaniu do IPSC, ponieważ używamy dwóch różnych typów wirusów do bezpośredniej walki z tym typem komórek.

Ten film pokazuje protokół tworzenia kultur fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry, konwersji do mioblastów, a następnie zróżnicowanych miotub. Biopsja skóry jest przenoszona do hodowli komórkowej w celu uzyskania fibroblastów skóry. Do transdukcji tych fibroblastów wykorzystywane są lentiwirusy przenoszące geny hTERT i MYOD.

Po dodaniu pożywki wzrostowej mioblastów uzupełnionej doksycykliną dochodzi do ekspresji genu MYOD, indukując konwersję fibroblastów w mioblasty. Następnie pożywkę zamienia się na pożywkę różnicującą, również uzupełnioną doksycykliną. Następnie mioblasty łączą się ze sobą, tworząc wielojądrowe miotuby.

Odessać pożywkę z probówki i przepłukać biopsję 10 mililitrami, jeden x PBS w temperaturze pokojowej, trzy razy. Po trzecim praniu pozostaw PBS w tubce. Wylej PBS i biopsję skóry na naczynie o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych.

Za pomocą sterylnych skalpeli pokrój biopsję na jak najmniejsze kawałki. Za pomocą pipety przenieś pojedynczy kawałek skóry na sterylne naczynie o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych. Odessać nadmiar PBS z okolic każdego kawałka.

Uważaj, aby nie zassać samego elementu. Przykryj naczynia częściowo pokrywką i pozostaw fragmenty biopsji skóry do wyschnięcia na pięć do 20 minut. Nie pozwól, aby kawałki wyschły zbyt długo.

Gdy kawałki wyschną, przechyl naczynie pod kątem 45 stopni i powoli dodaj 12 mililitrów pożywki fibroblastowej do rogu naczynia. Opuść naczynie, ostrożnie rozprowadzając media, aby kawałki nie zostały podniesione przez media. Umieść naczynia w inkubatorze.

Wymień nośnik w ciągu pięciu do siedmiu dni, a następnie raz w tygodniu. Wysiewaj pierwotne fibroblasty przy 30% konfluencji i dwóch dołkach 12-dołkowej płytki, około 20 000 komórek na dołek, aby następnego dnia uzyskać około 50% konfluencji. W przypadku transdukcji lentiwirusowej dodaj od dwóch do 5 miliardów genomów wirusowych hTERP Puromycin Lentivirus i 400 mikrolitrów pożywki fibroblastów.

Dodaj mieszankę lentiwirusa do jednego dołka. Do drugiego dołka dodaj tylko 400 mikrolitrów pożywki fibroblastowej. Następnego dnia dodaj jeden mililitr pożywki.

Jeden lub dwa dni później przenieś komórki na płytkę z sześcioma dołkami i hoduj je, aż osiągną 60 do 70% zgrywki. Uzupełnij pożywkę fibroblastów jednym mikrogramem na mililitr Puromycyny i dodaj dwa mililitry do każdej studzienki. Utrzymuj wybrane komórki do momentu, gdy wszystkie komórki w studzience kontrolnej będą martwe przez co najmniej 12 dni, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni.

Wykres nasion H wyrażający fibroblasty przy 30% konfluencji w trzech dołkach płytki 12-dołkowej, aby następnego dnia uzyskać około 50% konfluencji. W przypadku transdukcji lentiwirusowej wymieszaj od dwóch do pięciu miliardów genomów wirusa lentiwirusa MYOD Hygromycyny B i 400 mikrolitrów pożywki fibroblastowej i dodaj do dwóch studzienek. Dodaj jeden mililitr pożywki następnego dnia.

Jeden lub dwa dni później przenieś komórki na płytkę z sześcioma dołkami i rosły, aż osiągną 60 do 70% zlewania się. Uzupełnij pożywkę wzrostową 400 mikrogramami na mililitr higromycyny B. Dodaj dwa mililitry do każdej studzienki. Utrzymuj komórki pod selekcją, aż wszystkie komórki w studzienkach kontrolnych obumrą, zwykle zajmuje to co najmniej 12 dni, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni.

Aby indukować mioblasty, hoduj fibroblasty, aż będą zlewać się w 70%. Dodaj osiem mikrogramów na mililitr doksycykliny do pożywki wzrostowej mioblastów. Zawsze używaj świeżych porcji doksycykliny i pożywki.

Pożywkę należy przygotować tuż przed jakąkolwiek zmianą podłoża. Ponadto doksycykliny nie należy zamrażać. Odessać pożywkę fibroblastów i przepłukać komórki PBS.

Dodaj 10 mililitrów uzupełnionej pożywki mioblastowej. Dwa do trzech dni później komórki są zlewające się w 90 do 95%, a ich morfologia ulegnie zmianie. Odessać pożywkę wzrostową mioblastów i spłukać powierzchnię komórki PBS.

Dodać 10 mililitrów pożywki różnicującej, która została uzupełniona o osiem mikrogramów na mililitr świeżej doksycykliny. Kontynuuj zmianę pożywki co dwa do trzech dni, aż utworzą się rurki mięśniowe. Siedem do 10 dni po zainicjowaniu różnicowania rurki mięśniowej komórki powinny być w pełni zróżnicowane, ale różni się to w zależności od linii komórkowej.

Pierwsze fibroblasty mogą pojawić się pięć dni po tym, jak fragmenty skóry zostaną umieszczone w hodowli. Na zdjęciu B fibroblasty zlewają się i są gotowe do przeniesienia do kolb o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w celu dalszej proliferacji. Ważne jest, aby zamrozić kilka fiolek z fibroblastami przy niskiej liczbie pasaży, gdy komórki pierwotne wchodzą w proces starzenia replikacyjnego.

Po ustaleniu linii komórkowych FM w celu przekształcenia fibroblastów w miotuby, fibroblasty muszą się namnażać do 70% zlewania się, jak pokazano na rysunku A. Ważne jest, aby nie przekraczać 80% konfluencji, ponieważ duża gęstość może zaburzyć różnicowanie. Po dodaniu Doksycykliny do pożywki, w ciągu dwóch do czterech dni komórki stają się mioblastami, charakteryzującymi się wydłużoną morfologią i równoległą orientacją, jak widać na rysunku B. Zróżnicowane miorurki pokazano na rysunku C. Czas fuzji i różnicowania miotub może wynosić od siedmiu do 21 dni w zależności od genotypu komórki. Komórki muszą zostać zebrane lub utrwalone przed odłączeniem.

Początek oderwania można zaobserwować na podstawie koloru i jasności krawędzi miotuby, jak wskazują strzałki na tym rysunku. Poprzez immunofluorescencję ekspresja dojrzałych białek specyficznych dla mięśni potwierdza pomyślną konwersję fibroblastów w miotuby. Na tych zdjęciach pokazane są trzy różne komórki.

Stopień zróżnicowania będzie się różnił w zależności od komórki i może, ale nie musi, być dotknięty przez mutację pierwotną, tak jak ma to miejsce w przypadku komórek na rysunkach B i C. Dalsza walidacja modelu została potwierdzona przez RNAseq. Jak pokazano na tym wykresie, w mięśniach FM wykryto ponad 12 000 genów o zróżnicowanej ekspresji w porównaniu z genami mięśni szkieletowych. Znacząca korelacja między oboma transkryptomami potwierdza, że komórki FM mają specyficzny dla mięśni profil ekspresji, co pokazuje, że są użytecznym i niezawodnym substytutem linii komórkowych pochodzących z mięśni.

Aby zilustrować przydatność tego modelu in vitro, wykorzystaliśmy jedną z najczęstszych egzonicznych duplikacji w genie DMD. Duplikacja eksonu drugiego prowadzi do zakłócenia ramki odczytu DMD, a jej pominięcie może prowadzić do przywrócenia tej ramki odczytu lub wykorzystania wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu. Terapia ta została już potwierdzona w badaniach in vivo Rysunek A, wykazaliśmy dowód koncepcji poprzez analizę RTPCR tej konkretnej zmutowanej linii komórkowej, z leczeniem i bez leczenia przez pomijanie eksonów.

Western blot na rycinie B pokazuje, że funkcjonalne białko dystrofiny ulega ekspresji w leczonych komórkach. Porównując skuteczność tej terapii z modelami in vivo, wyniki potwierdzają wiarygodność techniki różnicowania komórek i wspierają jej zastosowanie do testowania różnych terapii genowych specyficznych dla mutacji. Przed badaniami klinicznymi wymagane w celu sprawdzenia skuteczności oficjalnego wsparcia terapii w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych, w zależności od Zdolności modeli zwierzęcych i komórkowych.

Rozwój modeli zwierzęcych, choć w dzisiejszych czasach jest łatwiejszy, nie jest wykonalną opcją dla każdej konkretnej mutacji. Wytwarzanie mioblastów przez komórki IPS pochodzące z fibroblastów skóry jest alternatywą, ale jest to technika czasochłonna. Procedura ta jest więc prostą alternatywą dla generacji IPS, która pozwala na bezpośrednią konwersję fibroblastów do mioblastów.

Ułatwia dostęp do modeli komórek ludzkich, unikając bardziej inwazyjnego stosowania biopsji mięśni Podsumowując, ta bezpośrednia konwersja fibroblastów w mioblasty jest potężnym narzędziem do testowania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych w kontekście ograniczeń specyficznych.