Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae
9 listopada 2020
Tutaj opisujemy wykorzystanie Grafix (Gradient Fixation), wirowania gradientu glicerolu w obecności środka sieciującego, do identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które przejściowo wiążą się z kompleksem spliceosomów.
Metoda utrwalania gradientowego, w której wirowanie gradientu glicerolu przeprowadza się w obecności środka sieciującego, pomaga zidentyfikować interakcje między białkami, które przejściowo wiążą się z kompleksami wielopodjednostkowymi. Zastosowanie odczynników utrwalających w gradieniu glicerolu stabilizuje wiązanie czynników sypkich, bez powstawania osadów, co pozwala na identyfikację oddziaływań określonych białek z splamionymi półkompleksami. Demonstracja protokołu końcowego pomaga początkującym użytkownikom nauczyć się informacji, które mogą być trudne do zrozumienia na podstawie samego tekstu pisanego.
W celu przygotowania całkowitego ekstraktu drożdżowego należy wyhodować komórki drożdży wyrażające jeden z czynników splicyjnych połączonych ze znacznikiem kranu i jeden litr pożywki glukozowej Y i B uzupełnionej odpowiednimi aminokwasami lub zasadami nukleinowymi. Gdy kultura osiągnie gęstość optyczną przy 600 nanometrach jednego, zbierz komórki drożdży przez odwirowanie w trzech 500-mililitrowych butelkach wirówkowych i umyj komórki dwa razy w 10 mililitrach zimnej sterylnej wody na pranie. Po drugim płukaniu ponownie zawieś komórki w jednej dziesiątej objętości komórek zimnego buforu A i zamroź 50 mikrolitrowych kropli zawiesiny komórek drożdży w ciekłym azocie.
Po zamrożeniu zmielić granulki zamrożonych komórek przez sześć cykli z częstotliwością 20 Hz przez trzy minuty w młynie kulowym, zanurzając pojemnik z zamrożonymi komórkami w ciekłym azocie pod koniec każdego cyklu. Po ostatnim cyklu umieścić probówki zawierające ekstrakty w wodzie o temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wstrząsając. Po stopieniu odwirować, aby zebrać ekstrakty.
I określić ilościowo białko, które zostały usunięte przez supernatanty metodą BCA. Następnie szybko zamroź porcje ekstraktów w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przygotować gradient glicerolu, dodaj 0,1% końcowe stężenie środka sieciującego aldehydu glutarowego do 30% roztworu glicerolu i buforu A i wymieszaj w celu homogenizacji.
Dodaj sześć mililitrów zimnego 10% glicerolu i buforu A do 12-mililitrowej probówki wirówkowej i użyj gradientowej strzykawki urządzenia głównego wyposażonej w długą igłę, aby nałożyć 30% roztwór aldehydu glutarowego glicerolu na dno probówki. Użyj gradientowego urządzenia głównego, aby utworzyć liniowy gradient glicerolu zgodnie ze specyfikacjami producenta. Ostrożnie ułóż 200 mikrolitrów 7% glicerolu i buforuj poduszkę A na górze gradientu, a następnie dodaj około dwóch miligramów ekstraktu komórkowego do górnej części probówki.
Po wytworzeniu gradientu glicerolu umieścić próbkę we wstępnie schłodzonym wirniku kubełkowym i zebrać ekstrakt przez odwirowanie. Porcję próbki z każdej 12-mililitrowej probówki na 24 500 mikrolitrów i za pomocą pompy perystaltycznej przepchnąć 40% roztwór glicerolu przez gradient od 10 do 30% od probówki do zbioru frakcji. Następnie załaduj 50 mikrolitrów każdej frakcji bezpośrednio na membrany nitrocelulozowe na plamie punktowej, a następnie dodaj bufor blokujący i użyj pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko CBP do wykrycia białka na immuno blot i odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego, jeśli to konieczne.
W przypadku braku sieciownika CWC 24 jest skoncentrowany między frakcjami piątymi i 13, co odpowiada kompleksom około 80 do 200 megadaltonów. Jednak w obecności środka sieciującego pozycja CWC 24 na gradiencie jest przesuwana do frakcji na dole gradientu odpowiadających większym kompleksom. Porównanie sedymentacji CWC 24 z sedymentacją podjednostki U5 snRNP, Prp8 i podjednostki NTC, Prp19 ujawnia, że CWC 24 jest skoncentrowany w tych samych frakcjach.
Ale ponieważ wiąże się przejściowo ze spliceosomem, jest również obecny w lżejszych frakcjach. Co ciekawe, frakcje 11 i 12 to te, w których Prp8 i 19 zaczynają się koncentrować, co sugeruje, że jest to część gradientu, w której kompleks B Act zaczyna się osadzać. Analiza Western blot frakcji 11 i 12 ujawnia, że sygnały Prp8 i 19 są rozmazami, które ledwo wchodzą do 8% żelu akrylowego, co pokazuje, że są one rzeczywiście częścią dużych kompleksów.
CWC 24 jest również obecny we frakcji 12, ale w znacznie niższym stężeniu, co jest zgodne z jego przejściowym wiązaniem z kompleksem B Act. Podsumowując, wyniki te pokazują, że aldehyd glutarowy może być stosowany jako środek sieciujący w celu ustabilizowania wiązania czynników przejściowych z podkompleksami splicingowymi. Metodę tę można zastosować do badania dowolnych dynamicznych kompleksów podjednostek motorycznych, które przejściowo wiążą się z niektórymi z ich składników, takimi jak spliceosom.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę utrwalania gradientowego, wykorzystującą wirowanie w gradiencie glicerolu z zastosowaniem czynnika sieciującego w celu identyfikacji przejściowych oddziaływań między czynnikami splicingowymi a kompleksem spliceosomu. Metoda ta stabilizuje słabe oddziaływania białkowe bez tworzenia osadów, co ułatwia badanie specyficznych interakcji białkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Wstęp
- Fiksacja gradientowa jest techniką stosowaną do badania oddziaływań białkowych.
- Pomaga ona w identyfikacji przejściowych oddziaływań w obrębie kompleksów wielopodjednostkowych.
- Zastosowanie czynników sieciujących zwiększa stabilność tych oddziaływań.
- Metoda ta jest szczególnie użyteczna w badaniu czynników splicingu.
Cel badania
- Zademonstrowanie metody fiksacji gradientowej w celu identyfikacji oddziaływań białkowych.
- Przedstawienie protokołu ułatwiającego osobom stosującym tę technikę po raz pierwszy zrozumienie tej metody.
- Ułatwienie badania czynników splicingowych u drożdży.
Zastosowane metody
- Wirowanie w gradiencie glicerolu z użyciem czynnika sieciującego.
- Przygotowanie całkowitych ekstraktów z drożdży wykazujących ekspresję czynników splicingu.
- Zbiór i przemywanie komórek drożdży.
- Zamrażanie zawiesin komórkowych do dalszych analiz.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie stabilizuje przejściowe oddziaływania białkowe.
- Zidentyfikowano specyficzne oddziaływania pomiędzy czynnikami splicingu a spliceosomem.
- Protokół jest dostępny dla badaczy, którzy nie są zaznajomieni z tą techniką.
- Prezentacja końcowego protokołu wspomaga praktyczne zrozumienie procesu.
Wnioski
- Fixacja gradientowa jest skuteczną metodą badania przejściowych oddziaływań białek.
- Technika ta może pogłębić nasze zrozumienie mechanizmów splicingu.
- Stanowi ona cenne narzędzie dla badaczy w dziedzinie biologii molekularnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Identyfikacja przejściowych oddziaływań białkowych jest kluczowa dla walidacji celów w dynamicznych kompleksach, takich jak spliceosom, gdzie słabe lub krótkotrwałe powiązania mogą zostać pominięte przy użyciu konwencjonalnych metod. Metoda Grafix (Gradient Fixation) stabilizuje te oddziaływania poprzez wirowanie w gradiencie glicerolu z zastosowaniem czynnika sieciującego, co umożliwia detekcję bez tworzenia osadów. Podejście to wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie partnerów wiązania w systemach istotnych dla chorób, zwiększając pewność prognostyczną na wczesnych etapach odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie przejściowych oddziaływań czynników splicingu, które mogą stanowić cele terapeutyczne w szlakach przetwarzania RNA.
- Wartość operacyjna: Stabilizuje słabo wiążące się białka w celu ich detekcji, redukując liczbę wyników fałszywie ujemnych w testach walidacji celu.
- Wartość naukowa: Wspiera wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie współsedymentacji czynników, takich jak CWC 24, z U5 snRNP oraz podjednostkami NTC.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje frakcjonowane kompleksy do dalszej analizy metodą dot blot, umożliwiając ilościową ocenę obecności czynników splicingowych.
- Wartość operacyjna: Generuje powtarzalne profile sedymentacji, które mogą być standaryzowane pomiędzy poszczególnymi przebiegami w celu zapewnienia spójności analizy.
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie do przesiewania poprzez izolację podkompleksów w określonych frakcjach gradientu do celowanych analiz.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych w kontekście chorób informacji na temat dynamiki spliceosomu, który jest zaangażowany w nowotwory i schorzenia neurodegeneracyjne.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez stabilizację przejściowych oddziaływań w celu przeprowadzenia dalszych analiz funkcjonalnych.
- Wartość naukowa: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie trwałych od przejściowych powiązań w obrębie maszyn makromolekularnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda Grafix wpisuje się w początkowy etap procesu odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez dotyczących oddziaływań przejściowych przed przejściem do identyfikacji związków wiodących oraz walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkryć: Weryfikacja hipotez dotyczących przejściowego wiązania czynników splicingu poprzez stabilizację oddziaływań w celu ich wykrycia w frakcjach gradientu.
- Przesiewanie: Pozyskiwanie frakcji gotowych do analizy z ustandaryzowanych gradientów glicerolu, co umożliwia odtwarzalne przesiewanie związków lub czynników.
- Analityka: Dostarczanie ilościowych danych sedymentacyjnych oraz wyników kolokalizacji (np. CWC 24 z Prp8/Prp19) w celu porównania warunków i oceny zmian w wiązaniu.
- Badania translacyjne: Powiązanie z ciągłością przedkliniczną poprzez identyfikację czynników, których przejściowe wiązanie może być modulowane w stanach chorobowych.
- Zastosowania instytucjonalne: Stworzenie wielokrotnego wykorzystania platformy do badania dowolnych dynamicznych kompleksów podjednostkowych z komponentami przejściowymi, nieograniczonej tylko do spliceosomu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez ujawnianie przejściowych interaktorów, które w przeciwnym razie zostają utracone w standardowych lizatach.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji generowania gradientów i frakcjonowania, co redukuje zmienność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wyjaśnianie niejednoznaczności mechanistycznych w wielopodjednostkowych kompleksach docelowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane sieci oddziaływań w systemach istotnych dla danej choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w lizie komórek drożdży, przygotowywaniu gradientów oraz technikach frakcjonowania.
- Zależy od dostępu do urządzeń do tworzenia gradientów, rotorów z koszyczkami oraz sprzętu do frakcjonowania.
- Wymaga standaryzacji stężenia czynnika sieciującego (np. glutaraldehydu), aby uniknąć nadmiernej stabilizacji lub wytrącania białek.
- Wymaga dostosowania metody przy zastosowaniu w systemach innych niż drożdżowe lub w przypadku alternatywnych kompleksów.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potencjalne maskowanie epitopów przez sieciowanie, co wymaga walidacji dostępności przeciwciał po fiksacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Yeast Total Extract Preparation
2:07
Glycerol Gradient Preparation
2:58
Extract Separation and Collection
3:44
Results: Representative Transient Saccharomyces Cerevisiae Spliceosome Subcomplex Interactor Detection
5:15
Conclusion
