Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae

Metoda utrwalania gradientowego, w której wirowanie gradientu glicerolu przeprowadza się w obecności środka sieciującego, pomaga zidentyfikować interakcje między białkami, które przejściowo wiążą się z kompleksami wielopodjednostkowymi. Zastosowanie odczynników utrwalających w gradieniu glicerolu stabilizuje wiązanie czynników sypkich, bez powstawania osadów, co pozwala na identyfikację oddziaływań określonych białek z splamionymi półkompleksami. Demonstracja protokołu końcowego pomaga początkującym użytkownikom nauczyć się informacji, które mogą być trudne do zrozumienia na podstawie samego tekstu pisanego.

W celu przygotowania całkowitego ekstraktu drożdżowego należy wyhodować komórki drożdży wyrażające jeden z czynników splicyjnych połączonych ze znacznikiem kranu i jeden litr pożywki glukozowej Y i B uzupełnionej odpowiednimi aminokwasami lub zasadami nukleinowymi. Gdy kultura osiągnie gęstość optyczną przy 600 nanometrach jednego, zbierz komórki drożdży przez odwirowanie w trzech 500-mililitrowych butelkach wirówkowych i umyj komórki dwa razy w 10 mililitrach zimnej sterylnej wody na pranie. Po drugim płukaniu ponownie zawieś komórki w jednej dziesiątej objętości komórek zimnego buforu A i zamroź 50 mikrolitrowych kropli zawiesiny komórek drożdży w ciekłym azocie.

Po zamrożeniu zmielić granulki zamrożonych komórek przez sześć cykli z częstotliwością 20 Hz przez trzy minuty w młynie kulowym, zanurzając pojemnik z zamrożonymi komórkami w ciekłym azocie pod koniec każdego cyklu. Po ostatnim cyklu umieścić probówki zawierające ekstrakty w wodzie o temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wstrząsając. Po stopieniu odwirować, aby zebrać ekstrakty.

I określić ilościowo białko, które zostały usunięte przez supernatanty metodą BCA. Następnie szybko zamroź porcje ekstraktów w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przygotować gradient glicerolu, dodaj 0,1% końcowe stężenie środka sieciującego aldehydu glutarowego do 30% roztworu glicerolu i buforu A i wymieszaj w celu homogenizacji.

Dodaj sześć mililitrów zimnego 10% glicerolu i buforu A do 12-mililitrowej probówki wirówkowej i użyj gradientowej strzykawki urządzenia głównego wyposażonej w długą igłę, aby nałożyć 30% roztwór aldehydu glutarowego glicerolu na dno probówki. Użyj gradientowego urządzenia głównego, aby utworzyć liniowy gradient glicerolu zgodnie ze specyfikacjami producenta. Ostrożnie ułóż 200 mikrolitrów 7% glicerolu i buforuj poduszkę A na górze gradientu, a następnie dodaj około dwóch miligramów ekstraktu komórkowego do górnej części probówki.

Po wytworzeniu gradientu glicerolu umieścić próbkę we wstępnie schłodzonym wirniku kubełkowym i zebrać ekstrakt przez odwirowanie. Porcję próbki z każdej 12-mililitrowej probówki na 24 500 mikrolitrów i za pomocą pompy perystaltycznej przepchnąć 40% roztwór glicerolu przez gradient od 10 do 30% od probówki do zbioru frakcji. Następnie załaduj 50 mikrolitrów każdej frakcji bezpośrednio na membrany nitrocelulozowe na plamie punktowej, a następnie dodaj bufor blokujący i użyj pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko CBP do wykrycia białka na immuno blot i odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego, jeśli to konieczne.

W przypadku braku sieciownika CWC 24 jest skoncentrowany między frakcjami piątymi i 13, co odpowiada kompleksom około 80 do 200 megadaltonów. Jednak w obecności środka sieciującego pozycja CWC 24 na gradiencie jest przesuwana do frakcji na dole gradientu odpowiadających większym kompleksom. Porównanie sedymentacji CWC 24 z sedymentacją podjednostki U5 snRNP, Prp8 i podjednostki NTC, Prp19 ujawnia, że CWC 24 jest skoncentrowany w tych samych frakcjach.

Ale ponieważ wiąże się przejściowo ze spliceosomem, jest również obecny w lżejszych frakcjach. Co ciekawe, frakcje 11 i 12 to te, w których Prp8 i 19 zaczynają się koncentrować, co sugeruje, że jest to część gradientu, w której kompleks B Act zaczyna się osadzać. Analiza Western blot frakcji 11 i 12 ujawnia, że sygnały Prp8 i 19 są rozmazami, które ledwo wchodzą do 8% żelu akrylowego, co pokazuje, że są one rzeczywiście częścią dużych kompleksów.

CWC 24 jest również obecny we frakcji 12, ale w znacznie niższym stężeniu, co jest zgodne z jego przejściowym wiązaniem z kompleksem B Act. Podsumowując, wyniki te pokazują, że aldehyd glutarowy może być stosowany jako środek sieciujący w celu ustabilizowania wiązania czynników przejściowych z podkompleksami splicingowymi. Metodę tę można zastosować do badania dowolnych dynamicznych kompleksów podjednostek motorycznych, które przejściowo wiążą się z niektórymi z ich składników, takimi jak spliceosom.