Name: Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj metodę gradientowej utrwalania do identyfikowania przejściowych interakcji białek z kompleksem spliceosomu Saccharomyces cerevisiae. Technika ta stabilizuje luźne wiązania białkowe bez tworzenia osadów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem FAPESP (15/06477-9).

1. Przygotowanie ekstraktu drożdżowego
<ol>
	<li>Hoduj komórki drożdży wyrażające jeden z czynników splicingowych połączonych z tagiem TAP9 w 1 l pożywki YNB-glu (na bazie azotu drożdżowego uzupełnionej 2% glukozy m/v) z odpowiednimi aminokwasami lub zasadami nukleinowymi, w tym przypadku adeniną (20 μg/ml), leucyną (30 μg/ml), tryptofanem (30 μg/ml), do OD600 = 1,0.</li>
	<li>Zebrać komórki z 1 l hodowli przez odwirowanie w trzech butelkach wirówkowych o pojemności 500 ml przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przemyć dwukrotnie 10 ml zimnej sterylnej wody.</li>
	<li>Ponownie zawiesić zebrane komórki drożdży w 1/10 objętości komórki zimnego buforu A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L-1 MgCl2, 50 mmol L-1 KCl, 5% v/v glicerolu, 0,5 mmol L-1 DTT, koktajl inhibitorów proteazy wolny od EDTA).</li>
	<li>Zamrozić małe krople zawiesiny komórkowej w ciekłym azocie. Małe krople można uzyskać, pipetując zawieszony roztwór komórek i wrzucając 50 μl bezpośrednio do ciekłego azotu. 
	UWAGA: Ciekły azot może spowodować obrażenia w kontakcie ze skórą lub oczami. Posługiwać się odpowiednim sprzętem ochronnym. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Zamrożone krople zawiesiny komórkowej można przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotuj lizaty komórek drożdży, mieląc w młynie kulowym przez sześć cykli z prędkością 20 Hz/s przez 3 min. 
	UWAGA: Po każdym cyklu zanurz pojemnik zawierający zamrożone komórki w ciekłym azocie, aby uniknąć stopienia. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Zamrożone ekstrakty można przechowywać w temperaturze -80 °C. Ekstrakty do splicingu drożdży można również przygotować przy użyciu homogenizatorów do lizy sferoplastów10 lub przy użyciu moździerza i tłuczka11,12.</li>
	<li>Rozpuść ekstrakt, umieszczając zawierające go probówki w wodzie o temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wstrząsając.</li>
	<li>Ekstrakty wirówkowe w ilości 45 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Określić ilościowo zawartość białka w oczyszczonym supernatantze metodą BCA13.</li>
	<li>Przygotować porcje ekstraktów, szybko je zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
2. Przygotowanie gradientu glicerolu
<ol>
	<li>Przygotować dwa roztwory glicerolu w buforze A, jeden zawierający 10% v/v, a drugi zawierający 30% v/v glicerolu.</li>
	<li>Dodaj środek sieciujący aldehyd glutarowy do 0,1% v/v w roztworze glicerolu 30% v/v i wymieszaj do homogenizacji. 
	UWAGA: Z aldehydem glutarowym należy obchodzić się wewnątrz dygestoria przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.</li>
	<li>Dodać 6 ml zimnego roztworu glicerolu o stężeniu 10% v/v na dno probówki wirówkowej o pojemności 12 ml (14 x 89 mm).</li>
	<li>Dodać 6 ml zimnego roztworu glicerolu o stężeniu 30% v/v uzupełnionego aldehydem glutarowym za pomocą strzykawki przymocowanej do długiej igły dostarczonej z urządzeniem Gradient Master na dnie probówki, tuż pod 10% v/v roztworem glicerolu. 
	UWAGA: Alternatywnie, 10% v/v roztwór glicerolu można ostrożnie odpipetować na wierzchu 30% v/v roztworu glicerolu/aldehydu glutarowego.</li>
	<li>Użyj urządzenia Gradient Master, aby wygenerować ciągły gradient gęstości. 
	UWAGA: W urządzeniu Gradient Master rurki umieszcza się w odpowiednim stojaku i krótko obraca, postępując zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi określania parametrów (czas/kąt/prędkość). W tej pracy użyliśmy: 2:25 min/81,5°/11 rpm.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj 200 μl 7% v/v glicerolu/buforu Poduszka A na wierzchu tuż przed dodaniem ekstraktów komórkowych. 
	UWAGA: Stężenie glicerolu w poduszce musi być niższe niż mniej stężony roztwór glicerolu użyty do utworzenia gradientu liniowego.</li>
</ol>
3. Odwirowanie ekstraktów
<ol>
	<li>Załaduj około 2 mg białka całkowitego na wierzch każdego 12 ml liniowego gradientu glicerolu 10%-30% aldehydu glutarowego z poduszką.</li>
	<li>Umieść rurki we wstępnie schłodzonym wirniku z kubełkiem obrotowym. 
	UWAGA: Z probówkami należy obchodzić się delikatnie, aby uniknąć mieszania przed ultrawirowaniem.</li>
	<li>Wirować przy 194 000 x g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Każdą probówkę o pojemności 12 ml podzielić na dwadzieścia cztery frakcje o pojemności 500 μl za pomocą dostosowanego EconoSystem lub ostrożnie pipetując. 
	UWAGA: Dostosowany system EconoSystem składa się z pompy perystaltycznej, detektora UV i kolektora frakcji podłączonego do urządzenia perforującego rurkę. Profil sedymentacji można monitorować poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm.</li>
	<li>Użyj roztworu glicerolu 40% v/v przez pompę perystaltyczną, aby przepchnąć glicerolu o gradiacji 10%-30% z rurki do kolektora frakcji. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Frakcje należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Załadować 50 μl każdej frakcji bezpośrednio na membrany nitrocelulozowe za pomocą urządzenia do robienia kropek lub plam szczelinowych. Wykryj białko za pomocą immunoblot za pomocą przeciwciała przeciwko CBP (1:6 000, w celu wykrycia części CBP znacznika TAP) i anty-króliczej IgG sprzężonej z peroksydazą chrzanową (1:15 000) jako przeciwciałem drugorzędowym.</li>
</ol>

<ol><li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417(2019).</li>
<li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409(2019).</li>
<li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li>
<li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GraFix%3A+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li>
<li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafix%3A+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li>
<li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li>
<li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p%2FCef1p%2C+novel+pre-mRNA+splicing+factors%2C+and+snRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li>
<li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li>
<li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3%27+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes & Development. 9, 855-868 (1995).</li>
<li>Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunn%2C+EA+%22Spliceosomal+Pre-mRNA+Splicing%3A+Methods+and+Protocols.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology</a>. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).</li>
<li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Analalytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li>
<li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li>
<li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mRNA+splicing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Oddziaływania białko-białko i kwasy rybonukleinowe-białko można stabilizować za pomocą środków sieciujących. Ważne jest, aby powstały kompleks był stabilny, aby wytrzymać ultrawirowanie na gradiencie glicerolu. Ponadto warunki bufora powinny zezwalać na interakcję, ale być na tyle rygorystyczne, aby uniknąć niespecyficznego powiązania. W przedstawionych tutaj eksperymentach użyliśmy roztworu buforowego już ustalonego dla reakcji splicingu in vitro15.
Szybkość i czas wir...

Splicing to bardzo dynamiczny proces, który wymaga powiązania i uwolnienia wielu czynników w skoordynowany sposób. Te czynniki splicingu obejmują między innymi białka wiążące RNA, ATPazy, helikazy, kinazy białkowe i fosfatazy, ligazy ubikwityny1,2,3; aby umożliwić przegrupowania molekularne, niektóre z tych czynników wiążą się bardzo przejściowo z podkompleksami spliceosomów, co sprawia, że izolacja i identyfikacja tych kompleksów pośrednich RNP jest bardzo trudna.
Tutaj użyliśmy metody Grafix4,5 do ustabilizowania interakcji czynnika splicingu drożdży Cwc24 z kompleksem Bact6 aby umożliwić identyfikację innych czynników związanych jednocześnie z tym podkompleksem i określić, czy ligaza ubikwityny Prp19 odgrywa jakąkolwiek rolę w wiązaniu lub uwalnianiu Cwc24 do kompleksu Nineteen (NTC) i do końca 5' intronu przed aktywacją i zachodzi pierwsza reakcja transestryfikacji. Zaletą wystawienia makrocząsteczek na rosnące stężenie środka sieciującego wzdłuż gradientu glicerolu jest to, że pozwala to uniknąć wiązań krzyżowych między kompleksami4,5, a tym samym tworzenia agregatów.
Ta metoda została użyta jako uzupełnienie testów koimmunoprecypitacji białek i pull-down, które, mimo że pozwalają na izolację dużych kompleksów, mogą nie być wiarygodne w utrzymywaniu przejściowych interakcji w dużych kompleksach dynamicznych7,8. Zastosowanie odczynników utrwalających w gradiacji glicerolu stabilizuje wiązanie takich czynników, pozwalając na potwierdzenie oddziaływań określonych białek z podkompleksami splicingowymi. Ponieważ wybrany środek sieciujący był chemicznie nieodwracalny, białka obecne w odzyskanych frakcjach analizowano metodą dot blot po odwirowaniu gradientowym.

<table><tbody><tr><td>Epitop białka wiążącego anty-kalmodulinę</td><td>Millipore</td><td>07-482</td><td></td></tr><tr><td>ECL anty-królicze IgG</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td></td></tr><tr><td>EconoSystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1-800-424-6723</td><td>Zastosowane części EconoSystem: pompa perystaltyczna, detektor UV i kolektor frakcji</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>System odzyskiwania frakcji</td><td>Beckman Coulter</td><td>270-331580</td><td>Urządzenie do perforacji rury, które było połączone z częściami EconoSystem</td></tr><tr><td>Gradient Master Model 107ip</td><td>Biocomp</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Młyn mieszający MM 200</td><td>Retsch</td><td>207460001</td><td>Młyn kulowy</td></tr><tr><td>Rotor F12-6x500Lex</td><td>Thermo Scientific</td><td>096-062375</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td> <td>Sorvall RC 6 PlusThermo Scientific</td><td>36-101-0816</td><td></td></tr><tr><td>Obrotowy wirnik kubełkowy P40ST</td><td>Ultrawirówka Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CP 80 NX</td><td>Hitachi</td><td>901069</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe (14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów saccharomyces cerevisiae

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Splicing pre-mRNA to bardzo dynamiczny proces, który obejmuje wiele molekularnych przegrupowań podkompleksów spliceosomów podczas składania, przetwarzania RNA i uwalniania złożonych składników. Wirowanie w gradionym gradieniu glicerolu zastosowano do rozdzielania kompleksów białkowych lub RNP (RiboNucleoProtein) do badań funkcjonalnych i strukturalnych. W tym miejscu opisujemy zastosowanie Grafix (Gradient Fixation), który został po raz pierwszy opracowany do oczyszczania i stabilizacji kompleksów makromolekularnych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek, w celu identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które wiążą się przejściowo z kompleksem spliceosomów. Metoda ta opiera się na odwirowaniu próbek do rosnącego stężenia odczynnika utrwalającego w celu stabilizacji kompleksów. Po odwirowaniu ekstraktów drożdżowych ogółem załadowanych gradientami glicerolu, odzyskane frakcje są analizowane za pomocą dot blot w celu identyfikacji podkompleksów spliceosomów i określenia obecności poszczególnych czynników splicingowych.

Aby przeanalizować profil sedymentacji Cwc24-TAP i określić, czy metoda Grafix była skuteczna w stabilizacji jego wiązania z subkompleksami splicingu, rozdzielono całkowite ekstrakty z drożdży wykazujących ekspresję Cwc24-TAP poprzez wirowanie w gradientach glicerolu, w obecności lub w nieobecności glutaraldehydu jako czynnika sieciującego. Próbki z dwudziestu czterech frakcji o objętości 500 μL poddano następnie analizie slot blot z użyciem przeciwciała przeciwko części CBP znacznika TAP. Wyniki pokazują, że w nieobecno...

Tutaj opisujemy wykorzystanie Grafix (Gradient Fixation), wirowania gradientu glicerolu w obecności środka sieciującego, do identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które przejściowo wiążą się z kompleksem spliceosomów.

Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Metoda utrwalania gradientowego, w której wirowanie gradientu glicerolu przeprowadza się w obecności środka sieciującego, pomaga zidentyfikować interakcje między białkami, które przejściowo wiążą się z kompleksami wielopodjednostkowymi. Zastosowanie odczynników utrwalających w gradieniu glicerolu stabilizuje wiązanie czynników sypkich, bez powstawania osadów, co pozwala na identyfikację oddziaływań określonych białek z splamionymi półkompleksami. Demonstracja protokołu końcowego pomaga początkującym użytkownikom nauczyć się informacji, które mogą być trudne do zrozumienia na podstawie samego tekstu pisanego.W celu przygotowania całkowitego ekstraktu drożdżowego należy wyhodować komórki drożdży wyrażające jeden z czynników splicyjnych połączonych ze znacznikiem kranu i jeden litr pożywki glukozowej Y i B uzupełnionej odpowiednimi aminokwasami lub zasadami nukleinowymi. Gdy kultura osiągnie gęstość optyczną przy 600 nanometrach jednego, zbierz komórki drożdży przez odwirowanie w trzech 500-mililitrowych butelkach wirówkowych i umyj komórki dwa razy w 10 mililitrach zimnej sterylnej wody na pranie. Po drugim płukaniu ponownie zawieś komórki w jednej dziesiątej objętości komórek zimnego buforu A i zamroź 50 mikrolitrowych kropli zawiesiny komórek drożdży w ciekłym azocie.Po zamrożeniu zmielić granulki zamrożonych komórek przez sześć cykli z częstotliwością 20 Hz przez trzy minuty w młynie kulowym, zanurzając pojemnik z zamrożonymi komórkami w ciekłym azocie pod koniec każdego cyklu. Po ostatnim cyklu umieścić probówki zawierające ekstrakty w wodzie o temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wstrząsając. Po stopieniu odwirować, aby zebrać ekstrakty.I określić ilościowo białko, które zostały usunięte przez supernatanty metodą BCA. Następnie szybko zamroź porcje ekstraktów w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przygotować gradient glicerolu, dodaj 0,1% końcowe stężenie środka sieciującego aldehydu glutarowego do 30% roztworu glicerolu i buforu A i wymieszaj w celu homogenizacji.Dodaj sześć mililitrów zimnego 10% glicerolu i buforu A do 12-mililitrowej probówki wirówkowej i użyj gradientowej strzykawki urządzenia głównego wyposażonej w długą igłę, aby nałożyć 30% roztwór aldehydu glutarowego glicerolu na dno probówki. Użyj gradientowego urządzenia głównego, aby utworzyć liniowy gradient glicerolu zgodnie ze specyfikacjami producenta. Ostrożnie ułóż 200 mikrolitrów 7% glicerolu i buforuj poduszkę A na górze gradientu, a następnie dodaj około dwóch miligramów ekstraktu komórkowego do górnej części probówki.Po wytworzeniu gradientu glicerolu umieścić próbkę we wstępnie schłodzonym wirniku kubełkowym i zebrać ekstrakt przez odwirowanie. Porcję próbki z każdej 12-mililitrowej probówki na 24 500 mikrolitrów i za pomocą pompy perystaltycznej przepchnąć 40% roztwór glicerolu przez gradient od 10 do 30% od probówki do zbioru frakcji. Następnie załaduj 50 mikrolitrów każdej frakcji bezpośrednio na membrany nitrocelulozowe na plamie punktowej, a następnie dodaj bufor blokujący i użyj pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko CBP do wykrycia białka na immuno blot i odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego, jeśli to konieczne.W przypadku braku sieciownika CWC 24 jest skoncentrowany między frakcjami piątymi i 13, co odpowiada kompleksom około 80 do 200 megadaltonów. Jednak w obecności środka sieciującego pozycja CWC 24 na gradiencie jest przesuwana do frakcji na dole gradientu odpowiadających większym kompleksom. Porównanie sedymentacji CWC 24 z sedymentacją podjednostki U5 snRNP, Prp8 i podjednostki NTC, Prp19 ujawnia, że CWC 24 jest skoncentrowany w tych samych frakcjach.Ale ponieważ wiąże się przejściowo ze spliceosomem, jest również obecny w lżejszych frakcjach. Co ciekawe, frakcje 11 i 12 to te, w których Prp8 i 19 zaczynają się koncentrować, co sugeruje, że jest to część gradientu, w której kompleks B Act zaczyna się osadzać. Analiza Western blot frakcji 11 i 12 ujawnia, że sygnały Prp8 i 19 są rozmazami, które ledwo wchodzą do 8% żelu akrylowego, co pokazuje, że są one rzeczywiście częścią dużych kompleksów.CWC 24 jest również obecny we frakcji 12, ale w znacznie niższym stężeniu, co jest zgodne z jego przejściowym wiązaniem z kompleksem B Act. Podsumowując, wyniki te pokazują, że aldehyd glutarowy może być stosowany jako środek sieciujący w celu ustabilizowania wiązania czynników przejściowych z podkompleksami splicingowymi. Metodę tę można zastosować do badania dowolnych dynamicznych kompleksów podjednostek motorycznych, które przejściowo wiążą się z niektórymi z ich składników, takimi jak spliceosom.

utilization-grafix-for-detection-transient-interactors-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany test hybrydowy drożdży, który wykrywa wiele białek oddziałujących z docelowym DNA. Przekształcone komórki drożdży zawierają docelową sekwencję DNA przed genem reporterowym. Dodatkowo wykazują ekspresję białek czynnika transkrypcyjnego. Kiedy białka tworzą kompleksy i wiążą się z docelowym DNA, gen reporterowy ulega ekspresji i może być wykryty enzymatycznie.

Zmodyfikowany test hybrydowy drożdży i jeden do wykrywania interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Ten artykuł opisuje eksperymentalne procedury (a) zubożenia U1 snRNP z ekstraktów jądrowych, przy jednoczesnej utracie aktywności splicingu; oraz (b) odtworzenia aktywności splicingu w ekstrakcie zubożonym w U1 przez cząstki snRNP galektyny-3 - U1 związane z kulkami kowalencyjnie sprzężonymi z przeciwciałami anty-galektyny-3.

Uzupełnienie aktywności splicingu przez kompleks galektyny-3 - U1 snRNP na kulkach

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Test ACT1-CUP1, test wzrostu miedzi, zapewnia szybki odczyt splicingu prekursorowego informacyjnego RNA (pre-mRNA) i wpływu zmutowanych czynników splicingu na funkcję spliceosomalną. To badanie zawiera protokół i podkreśla możliwe dostosowanie, aby odpowiedzieć na interesujące nas pytanie dotyczące splingu.

Testy ACT1-CUP1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę gradientowej utrwalania do identyfikowania przejściowych interakcji białek z kompleksem spliceosomu Saccharomyces cerevisiae. Technika ta stabilizuje luźne wiązania białkowe bez tworzenia osadów.

Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów