Name: Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj protokół stopniowego wysiewania komórek na mozaikowych rusztowaniach do badania kiełkujących naczyń krwionośnych. Ta metoda umożliwia tworzenie uporządkowanych sieci naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez fundusze z University of Michigan - Israel Partnership for Research. Autorzy chcieliby podziękować Uriemu Merdlerowi, Lior Debbi i Galii Ben David za ich wielką pomoc i wsparcie, dr Nadine Wang i dr Pilar Herrera-Fierro z Lurie Nanofabrication Facility na Uniwersytecie Michigan, a także dr Luisowi Solorio za pouczające dyskusje na temat technik fotolitografii.

<ol><li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li>
<li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2(2018).</li>
<li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li>
<li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li>
<li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li>
<li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering%3A+Beyond+Creating+Static+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11, (2012).</li>
<li>Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vasculature+Architectural+effects+on+microcapillary-like+structure+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly.</a> PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+Networks+and+Models%2C+In+vitro+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Vascularization+for+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microvascular Networks and Models, In vitro Formation.</a> Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).</li>
<li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Models+of+Vascular+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Models of Vascular Functions.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).</li>
<li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li>
<li>Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+the+vasculature+using+Organ-on-Chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), (2020).</li>
<li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+techniques+for+development+of+3D+vascularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue.</a> Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).</li>
<li>Jordahl, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Jet+Writing%3A+Functional+Microtissues+Based+on+Tessellated+Scaffold+Architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1707196(2018).</li>
<li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li>
<li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003(2018).</li>
<li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li>
<li>Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Trends+in+Information-Driven+Engineering+of+Complex+Biological+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems.</a> Advanced Materials. 31 (26), 11806898(2019).</li>
<li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Scaffold+System+for+Studying+the+Effect+of+Local+Geometry+and+Topology+on+the+Development+and+Orientation+of+Sprouting+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels.</a> Advanced Functional Materials. , 1901335(2019).</li>
<li>Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+molecular+discoveries+in+angiogenesis+and+antiangiogenic+therapies+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).</li>
<li>Gui, L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Tissue+Engineering%3A+Building+Perfusable+Vasculature+for+Implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).</li>
<li>Blache, U., Ehrbar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inspired+by+nature%3A+Hydrogels+as+versatile+tools+for+vascular+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering.</a> Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).</li>
<li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology%3A+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li>
<li>Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+SU-8+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering.+C%2C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility.</a> Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).</li>
<li>Mathew, R., Ravi Sankar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+on+Surface+Stress-Based+Miniaturized+Piezoresistive+SU-8+Polymeric+Cantilever+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano-Micro+Letters%22%5BJournal%5D)">A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors.</a> Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).</li>
<li>Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinking-based+bioprinting%3A+Examining+crosslinking+schemes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes.</a> Bioprinting. 5, 10-18 (2017).</li>
<li>Redd, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+human+microvascular+grafts+enable+rapid+vascularization+and+increase+perfusion+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-8+Photoresist%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">SU-8 Photoresist.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).</li>
<li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-Chip+Systems%3A+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li>
<li>Freiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+endothelial+and+mesenchymal+stem+cells+enhance+vascular+network+formation+on+three-dimensional+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5(2016).</li>
<li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li>
<li>Nguyen, D. -H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li>
<li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li>
<li>Rosenfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+3D+vascular+networks+is+regulated+by+tensile+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).</li>
<li>Neto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+TAZ+regulate+adherens+junction+dynamics+and+endothelial+cell+distribution+during+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development.</a> bioRxiv. , 174185(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Potrzeba bogatego układu naczyniowego w tkankach osadzonych w inżynierii ma kluczowe znaczenie dla przetrwania konstrukcji i prawidłowego funkcjonowania1. Chociaż inżynieria układu naczyniowego była przedmiotem ogromnej liczby badań, wiele pozostaje jeszcze do zbadania i zrozumienia24. W szczególności podczas odtwarzania określonej tkanki mikrokrążenie powinno zachowywać się i organizować odpowiednio12. Najczęstszym podejściem do generowania mikronac...

Dziedzina inżynierii tkankowej szybko rozwija się w kierunku wytwarzania inżynieryjnych konstrukcji, które zastępują brakujące lub uszkodzone organy i tkanki1. Jednak w pełni funkcjonalne konstrukty nie zostały jeszcze osiągnięte, częściowo dlatego, że generowanie działających sieci naczyniowych do odżywiania tkanek pozostaje wyjątkowym wyzwaniem. Bez odpowiedniego unaczynienia, zmodyfikowane tkanki są ograniczone do biernego transportu dyfuzyjnego tlenu i składników odżywczych, ograniczając maksymalną żywotną grubość tkanki do granicy dyfuzji, około 200μm2. Takie grubości nie są odpowiednie do naprawy dużych ubytków tkanek ani do pełnego wytwarzania narządów, co sprawia, że obecność funkcjonalnej sieci naczyniowej jest obowiązkową cechą dla funkcjonalnych i wszczepialnych tkanek3.
Układ naczyniowy składa się z szerokiej gamy naczyń krwionośnych, o różnych rozmiarach, fenotypach i organizacji, ściśle związanych z tkanką gospodarza. Zrozumienie zachowań, reakcji i decyzji migracyjnych podejmowanych przez rozwijające się i kiełkujące naczynia może poinstruować ich integrację w zmodyfikowanych tkankach4. Obecnie najpowszechniejszym podejściem do tworzenia sieci naczyniowych in vitro jest łączenie komórek śródbłonka (EC) z komórkami podporowymi (SC, ze zdolnością do różnicowania się w komórki ścienne), osadzonymi w trójwymiarowym mikrośrodowisku. To środowisko dostarcza chemicznych i fizycznych wskazówek, które umożliwiają komórkom przyłączanie się, namnażanie i samoorganizację w sieci naczyń krwionośnych2,5,6,7,8. Podczas wspólnej hodowli SC wydzielają białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), zapewniając jednocześnie mechaniczne wsparcie EC, które tworzą struktury kanalikowe. Co więcej, wzajemna interakcja między oboma typami komórek sprzyja tubuliogenezie, kiełkowaniu naczyń i migracji, a także dojrzewaniu i różnicowaniu SC w komórki muralu α ekspresji aktyny w mięśniach gładkich (αSMA)4. Rozwój sieci naczyń jest najczęściej badany w środowiskach 3D tworzonych przy użyciu hydrożeli, porowatych rusztowań polimerowych lub ich kombinacji. Ta ostatnia opcja zapewnia w równym stopniu środowisko przyjazne dla komórek i wymagane wsparcie mechaniczne zarówno dla komórek, jak i klasy ECM<sup="xref">9.
Wykonano wiele pracy w celu zbadania rozwoju naczyń krwionośnych, w tym kohodowli komórek na hydrożelach10, kombinacje hydrożeli i rusztowań11,12, platformy 2D i urządzenia mikroprzepływowe13. Jednak hydrożele mogą być łatwo odkształcane przez siły wywierane przez komórki14, podczas gdy systemy 2D i mikrofluidyczne nie są w stanie odtworzyć środowiska bliższego naturze, aby uzyskać bardziej ekstrapolowalną odpowiedź15,16. Zrozumienie, w jaki sposób formujące się naczynia reagują na otaczające je środowisko, może dostarczyć krytycznych informacji, które mogą pozwolić na wytworzenie środowisk inżynieryjnych z możliwością kierowania rozwojem statków w przewidywalny sposób. Zrozumienie zjawisk tworzenia naczyń krwionośnych jest szczególnie ważne, aby nadążyć za szybkim pojawianiem się technik wytwarzania w skali submikronowej, takich jak stereolitografia, litografia z projekcją cyfrową, ciągła produkcja interfejsu cieczy, pisanie strumieniowe 3D melt-electro, pisanie elektrostrumieniowe 3D oparte na rozwiązaniach i nowe techniki biodruku17,18,19,20,21. Dostosowanie kontroli tych technik mikroprodukcji do pogłębionego zrozumienia biologii naczyń krwionośnych jest kluczem do stworzenia odpowiedniego zmodyfikowanego układu krwionośnego dla tkanki docelowej.
Tutaj prezentujemy system 3D do badania reakcji nowych naczyń formujących i kiełkujących na otaczającą geometrię rusztowania, obserwując ich pochodzenie kiełków i późniejszą migrację22. Wykorzystując rusztowania 3D z mozaikową geometrią przedziałów i dwuetapową techniką wysiewu, udało nam się stworzyć wysoce zorganizowane sieci naczyniowe w przejrzysty i łatwy do analizy sposób. Geometrie teselacyjne zapewniają system o wysokiej przepustowości, w którym poszczególne jednostki zawierają naczynia, które reagują na lokalne środowisko. Korzystając z wielokolorowych ECs, prześledziliśmy początki powstawania kiełków i późniejsze wzorce migracji, skorelowane z geometrią przedziału i lokalizacją SCs22.
Chociaż proponowany protokół został przygotowany do analizy wpływu wskazówek geometrycznych na zachowanie unaczynienia, to podejście może być rozszerzone i zastosowane do wielu nowych zastosowań. Teselowane rusztowanie i łatwe do obrazowania sieci pozwalają na prostą analizę różnych interakcji EC i SC, dodawanie określonych komórek narządów i ich interakcję z sieciami naczyniowymi, wpływ leków na sieci naczyniowe i wiele innych. Proponowane przez nas wyniki systemu są bardzo wszechstronne i charakteryzują się prostą produkcją i obróbką.

<table><tbody><tr><td>Darmowe oprogramowanie Angiotool</td><td>NIH-CCR</td><td></td><td>do pobrania za darmo pod adresem https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td></tr><tr><td>Surowica albuminy bydlęcej Probumin</td><td>Millipore</td><td>82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>Komórki macierzyste miazgi zębowej</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>ECM media + zestaw pocisków</td><td>Sciencell</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Grupa Gadot</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz fibrynowy Evicel</td><td>Johnson& Johnson</td><td>EVB05IL</td><td>Dostarcza zarówno roztwory trombiny, jak i fibrynogenu (BAC2)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Goat przeciwciało anty-mysie Cy3</td><td>Jackson</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik Alexa-Fluor 488</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki mikronaczyniowe tkanki tłuszczowej</td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek fibronektyna</td><td>Sigma</td><td>F0895-5MG</td><td>Stężenie magazynowe: 1 mg / ml</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Bezpłatne pobieranie pod adresem https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Gadot-Group</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do liftingu</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>G112850</td><td>Nazwa handlowa Omnicoat</td></tr><tr><td>Low-glucose</td><td>DMEM Biological Industries</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-SMA</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu 4% w PBS</td><td>ChemCruz</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny, streptomycyny i nystatyny</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-vWF</td><td>Abcam</td><td>ab9378</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td><td></td> <td>Wafle 4 ", typ N-1-10, grubość 500-550 mikronów</td></tr><tr><td>Fotorezystor SU-8 2050</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>Y11058</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 deweloper</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Tryton-X 100</td><td>BioLab LTD</td><td>Numer katalogowy: 57836</td><td></td></tr></tbody></table>

stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Układ sercowo-naczyniowy jest kluczowym graczem w fizjologii człowieka, dostarczając pożywienia większości tkanek w ciele; naczynia są obecne w różnych rozmiarach, strukturach, fenotypach i wydajności w zależności od każdej konkretnej perfundowanej tkanki. Dziedzina inżynierii tkankowej, która ma na celu naprawę lub zastąpienie uszkodzonych lub brakujących tkanek ciała, opiera się na kontrolowanej angiogenezie w celu stworzenia prawidłowego unaczynienia w zmodyfikowanych tkankach. Bez układu naczyniowego grube konstrukty inżynieryjne nie mogą być wystarczająco odżywione, co może skutkować śmiercią komórki, słabym wszczepieniem i ostatecznie niepowodzeniem. Dlatego zrozumienie i kontrolowanie zachowania zmodyfikowanych naczyń krwionośnych jest wyjątkowym wyzwaniem w tej dziedzinie. W pracy przedstawiono wysokoprzepustowy system, który pozwala na tworzenie zorganizowanych i powtarzalnych sieci naczyń do badania zachowania statków w środowisku rusztowań 3D. Ten dwuetapowy protokół wysiewu pokazuje, że naczynia w systemie reagują na topografię rusztowania, prezentując charakterystyczne zachowania kiełkowania w zależności od geometrii komory, w której się znajdują. Uzyskane wyniki i zrozumienie z tego wysokowydajnego systemu mogą być wykorzystane w celu poinformowania o lepszych projektach biodrukowanych rusztowań 3D, w których produkcja różnych geometrii 3D nie może być szybko oceniona przy użyciu druku 3D jako podstawy dla komórkowych środowisk biologicznych. Co więcej, wiedza uzyskana dzięki temu wysokoprzepustowemu systemowi może zostać wykorzystana do poprawy szybkich badań przesiewowych leków, szybkiego rozwoju modeli kokultur oraz badania bodźców mechanicznych wpływających na tworzenie naczyń krwionośnych w celu pogłębienia wiedzy o układzie naczyniowym.

Przedstawiony protokół, wykorzystujący techniki stereolitografii, umożliwia wytwarzanie teselowanych rusztowań wykonanych z fotorezystu SU-8. Otrzymano rusztowania o zróżnicowanej geometrii komór (kwadraty, sześciokąty i koła), charakteryzujące się wysoką dokładnością i powtarzalnością cech (Rycina 1).
<img alt="Wzory równowagi statycznej: kwadrat, sześciokąt, koło. Schemat analizy strukturalnej." c...

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Nasz protokół pozwala naukowcom badać proces tworzenia się sieci naczyń krwionośnych w przejrzysty i łatwy do śledzenia sposób, otwierając drzwi do nowych badań i rzucając światło na zachowanie naczyń krwionośnych. Technika ta daje możliwość tworzenia wysoce zorganizowanych i powtarzalnych sieci naczyniowych, które reagują na otaczające środowisko. Za pomocą tego systemu można pobrać komórki śródbłonka od pacjentów cierpiących na chorobę naczyniową, co umożliwia odtworzenie choroby naczyniowej i znalezienie odpowiedniego leczenia.Proponowana metoda może zostać rozszerzona o badanie zachowania sieci naczyniowej w połączeniu z różnymi typami komórek, co pozwala na obserwację interakcji rozwijających się naczyń o określonym typie tkanki. Zacznij od zanurzenia rusztowań w 70% etanolu na co najmniej 15 minut, a następnie umyj je dwukrotnie w PBS. Wymieszaj 1,5 mikrolitra roztworu podstawowego fibronektyny z 28,5 mikrolitrami PBS na rusztowanie, które ma być wysiewane.Przygotować jedno rozcieńczenie fibronektyny do użycia na wszystkich rusztowaniach, aby uniknąć błędów w pipetowaniu. Umieść rusztowania z rzadka na powierzchni hydrofobowej i przykryj każde rusztowanie 30 mikrolitrami rozcieńczenia fibronektyny. Załóż pokrywę płytki i umieść rusztowania pokryte fibronektyną w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 100% wilgotności na minimum godzinę.Po inkubacji lekko przepłucz rusztowania w PBS, aby usunąć resztki fibronektyny. Rusztowania mogą być przechowywane w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do tygodnia. Przygotować pożywkę dla komórek śródbłonka lub EC, mieszając podłoże podstawowe z odpowiednimi składnikami zestawu pożywki, w tym roztworem antybiotyku, FBS i suplementami wzrostu komórek śródbłonka, zgodnie ze wskazaniami producenta.Wykonaj zawiesinę ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka tłuszczowego w pożywce EC o stężeniu czterech milionów komórek na mililitr. Za pomocą kleszczy umieść jedno rusztowanie pokryte fibronektyną na studzience w 24-dołkowej płytce innej niż TC. Przykryj każde rusztowanie 25 mikrolitrowymi kropelkami zawiesiny komórek, uważając, aby zawiesina nie spływała z rusztowania.Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 100% wilgotności na 60 do 90 minut. Po inkubacji napełnij każdą studzienkę 700 mikrolitrami pożywki EC. Inkubować śródbłonkowe rusztowania do momentu, gdy będzie można zaobserwować zbieg EC za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub przez trzy dni.Zmieniaj podłoże co drugi dzień. Przygotuj pożywkę DPSC, mieszając 500 mililitrów DMEM o niskiej stężeniu glukozy, 57,5 mililitrów FBS, 5,75 mililitrów aminokwasów endogennych, 5,75 mililitrów GlutaMAX i 5,75 mililitrów roztworu penicyliny, streptomycyny i nystatyny. Przenieś śródbłonkowe rusztowania na nową 24-dołkową płytkę inną niż TC.Wyrzuć wszystkie media z bieżącej płytki za pomocą pipety lub odsysania próżniowego, uważając, aby nie stosować podciśnienia bezpośrednio na rusztowaniu. Umieść jedno rusztowanie na środku każdej studzienki, a następnie osusz otaczający obszar lekkim odkurzaczem. Rozcieńczyć roztwory podstawowe trombiny i fibrynogenu PBS do końcowego stężenia odpowiednio pięciu jednostek na mililitr i 15 miligramów na mililitr.Przygotować zawiesinę o stężeniu ośmiu milionów DPSC na mililitr w rozcieńczeniu trombiny i rozprowadzić 12,5 mikrolitra zawiesiny do pojedynczych mikroprobówek na rusztowanie, które ma być wysiane. Ustaw pipetę o pojemności od pięciu do 50 mikrolitrów na 12,5 mikrolitra i napełnij ją roztworem fibrynogenu. Nie zdejmując końcówki, ustaw pipetę na 25 mikrolitrów.Materiał w końcówce powinien unieść się i pozostawić pustą objętość. Powoli naciskać przycisk tłoka, aż płyn dotrze do otworu końcówki, ale nie wycieknie. Przytrzymaj tłok w tej pozycji i umieść końcówkę w jednej z probówek mikrowirówek zawierających komórki w zawiesinie trombiny, upewniając się, że końcówka styka się z cieczą.Delikatnie zwolnić przycisk tłoka i wciągnąć zawiesinę ogniwa do końcówki. Dokładnie wymieszaj oba materiały, unikając tworzenia się pęcherzyków. Szybko dozuj zmieszane materiały na wierzch śródbłonkowego rusztowania.Powtórz poprzednie kroki dla każdego rusztowania, upewniając się, że zmieniasz końcówki między użyciami, aby uniknąć nieoczekiwanego tworzenia się żelu fibrynowego w końcówce. Załóż pokrywę płytki i inkubuj rusztowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 100% wilgotności przez 30 minut. Po inkubacji napełnij każdą studzienkę jednym mililitrem pożywki jeden do jednego DPSC i EC.Kultura przez tydzień, zmiana podłoża co drugi dzień. W różnych punktach czasowych podczas hodowli usuń pożywkę ze studzienki i zobrazuj konstrukty za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby zbadać rozwój naczyń krwionośnych lub dowolny inny interesujący parametr. Protokół ten pozwala na wytwarzanie rusztowań mozaikowych wykonanych z fotorezystu SU-8.Uzyskano rusztowania o wyraźnej geometrii przedziałów oraz bardzo dokładnych i powtarzalnych cechach. Przy tradycyjnym jednoczesnym wysiewaniu zarówno komórek śródbłonka, jak i komórek podporowych, komórki były jednorodnie rozmieszczone na rusztowaniu, co powodowało nieprzewidywalne i zdezorganizowane sieci naczyniowe. W przeciwieństwie do tego, stopniowe wysiewanie komórek skutkowało wysoce zorganizowanymi sieciami naczyniowymi.W przypadku korzystania z fluorescencyjnych komórek śródbłonka naczynia mogą być obrazowane w czasie rzeczywistym. Komórki śródbłonka wykazujące ekspresję białka czerwonej fluorescencji wyhodowano na sześciokątnych rusztowaniach i zobrazowano. Komórki podporowe dodano pierwszego dnia, a sieci naczyniowe obrazowano co drugi dzień w celu ilościowego określenia rozwoju naczyń.Dla każdego punktu czasowego wykonano szerokie zdjęcia całego rusztowania. Wzrost statków określono ilościowo jako całkowitą długość i powierzchnię statków. Wykonano obrazowanie konfokalne poklatkowe, aby umożliwić śledzenie pojedynczego naczynia przy użyciu wielokolorowych komórek śródbłonka.Trasa statku została wygenerowana na podstawie filmu poklatkowego, dzięki czemu możliwa jest obserwacja migracji statków. Dojrzewanie naczyń obserwowano dzięki obecności aktyny mięśni gładkich i komórek podporowych. W przypadku przedziałów okrągłych, sześciokątnych i kwadratowych komórki rozmnażają się i organizują w struktury.Siódmego dnia wszystkie kształty wykazywały bogatą i złożoną sieć naczyniową. Obrazy w większym powiększeniu ujawniły gęstszą aktynę mięśni gładkich i obecność komórek podporowych zlokalizowanych jednocześnie z utworzonymi naczyniami, co świadczy o rekrutacji i różnicowaniu komórek podporowych otaczających struktury naczyniowe. Technika ta może być wykorzystana do badania zachowania trójwymiarowych sieci naczyniowych pod wpływem różnych warunków, takich jak określone inhibitory komórkowe lub w obecności dodatkowych typów komórek.

stepwise-cell-seeding-on-tessellated-scaffolds-to-study-sprouting

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Opisano tutaj krok po kroku protokół do nieniszczącego i długoterminowego monitorowania procesu przebudowy naczyń krwionośnych i degradacji rusztowań w czasie rzeczywistym biodegradowalnych naczyń krwionośnych opartych na polimerowych rusztowaniach z pulsacyjną stymulacją za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

Nieniszczące monitorowanie rozwoju naczyń krwionośnych opartych na degradowalnych rusztowaniach za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Ten artykuł wymienia kroki wymagane do zasiewu linii komórek neuroblastoma na wcześniej opisanych trójwymiarowe szkieletach opartych na kolagenie, utrzymanie wzrostu komórek przez określony czas i odzyskanie szkieletów do kilku analiz wzrostu komórek i zachowania komórek oraz zastosowań wtórnych, przystosowanych do zaspokojenia szerokiego zakresu celów eksperymentalnych.

Trójwymiarowy in vitro biomimetyczny model neuroblastomu z wykorzystaniem rusztowań na bazie kolagenu

Ten protokół opisuje tworzenie samoorganizujących się naczyń krwionośnych z ludzkich pluripotencjalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Te sieci naczyń krwionośnych wykazują rozległą i połączoną sieć śródbłonka otoczoną perycytami, aktyną mięśni gładkich i ciągłą błoną podstawną.

Wytwarzanie organoidów ludzkich naczyń krwionośnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Angiogeneza kiełkowania, fundamentalna dla rozwoju i choroby, obejmuje złożone procesy molekularne i mechaniczne. Przedstawiamy wszechstronny model 2,5D ex vivo, który analizuje kiełkowanie komórek z tętnic szyjnych świń, ujawniając angiogenezę zależną od sztywności i wyraźną mechanikę komórek lidera-podążacza. Model ten pomaga w rozwijaniu strategii inżynierii tkankowej i podejść do terapii nowotworów.

Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

Poznaj protokół stopniowego wysiewania komórek na mozaikowych rusztowaniach do badania kiełkujących naczyń krwionośnych. Ta metoda umożliwia tworzenie uporządkowanych sieci naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Przeglądaj więcej filmów