Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Nasz protokół pozwala naukowcom badać proces tworzenia się sieci naczyń krwionośnych w przejrzysty i łatwy do śledzenia sposób, otwierając drzwi do nowych badań i rzucając światło na zachowanie naczyń krwionośnych. Technika ta daje możliwość tworzenia wysoce zorganizowanych i powtarzalnych sieci naczyniowych, które reagują na otaczające środowisko. Za pomocą tego systemu można pobrać komórki śródbłonka od pacjentów cierpiących na chorobę naczyniową, co umożliwia odtworzenie choroby naczyniowej i znalezienie odpowiedniego leczenia.

Proponowana metoda może zostać rozszerzona o badanie zachowania sieci naczyniowej w połączeniu z różnymi typami komórek, co pozwala na obserwację interakcji rozwijających się naczyń o określonym typie tkanki. Zacznij od zanurzenia rusztowań w 70% etanolu na co najmniej 15 minut, a następnie umyj je dwukrotnie w PBS. Wymieszaj 1,5 mikrolitra roztworu podstawowego fibronektyny z 28,5 mikrolitrami PBS na rusztowanie, które ma być wysiewane.

Przygotować jedno rozcieńczenie fibronektyny do użycia na wszystkich rusztowaniach, aby uniknąć błędów w pipetowaniu. Umieść rusztowania z rzadka na powierzchni hydrofobowej i przykryj każde rusztowanie 30 mikrolitrami rozcieńczenia fibronektyny. Załóż pokrywę płytki i umieść rusztowania pokryte fibronektyną w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 100% wilgotności na minimum godzinę.

Po inkubacji lekko przepłucz rusztowania w PBS, aby usunąć resztki fibronektyny. Rusztowania mogą być przechowywane w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do tygodnia. Przygotować pożywkę dla komórek śródbłonka lub EC, mieszając podłoże podstawowe z odpowiednimi składnikami zestawu pożywki, w tym roztworem antybiotyku, FBS i suplementami wzrostu komórek śródbłonka, zgodnie ze wskazaniami producenta.

Wykonaj zawiesinę ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka tłuszczowego w pożywce EC o stężeniu czterech milionów komórek na mililitr. Za pomocą kleszczy umieść jedno rusztowanie pokryte fibronektyną na studzience w 24-dołkowej płytce innej niż TC. Przykryj każde rusztowanie 25 mikrolitrowymi kropelkami zawiesiny komórek, uważając, aby zawiesina nie spływała z rusztowania.

Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 100% wilgotności na 60 do 90 minut. Po inkubacji napełnij każdą studzienkę 700 mikrolitrami pożywki EC. Inkubować śródbłonkowe rusztowania do momentu, gdy będzie można zaobserwować zbieg EC za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub przez trzy dni.

Zmieniaj podłoże co drugi dzień. Przygotuj pożywkę DPSC, mieszając 500 mililitrów DMEM o niskiej stężeniu glukozy, 57,5 mililitrów FBS, 5,75 mililitrów aminokwasów endogennych, 5,75 mililitrów GlutaMAX i 5,75 mililitrów roztworu penicyliny, streptomycyny i nystatyny. Przenieś śródbłonkowe rusztowania na nową 24-dołkową płytkę inną niż TC.

Wyrzuć wszystkie media z bieżącej płytki za pomocą pipety lub odsysania próżniowego, uważając, aby nie stosować podciśnienia bezpośrednio na rusztowaniu. Umieść jedno rusztowanie na środku każdej studzienki, a następnie osusz otaczający obszar lekkim odkurzaczem. Rozcieńczyć roztwory podstawowe trombiny i fibrynogenu PBS do końcowego stężenia odpowiednio pięciu jednostek na mililitr i 15 miligramów na mililitr.

Przygotować zawiesinę o stężeniu ośmiu milionów DPSC na mililitr w rozcieńczeniu trombiny i rozprowadzić 12,5 mikrolitra zawiesiny do pojedynczych mikroprobówek na rusztowanie, które ma być wysiane. Ustaw pipetę o pojemności od pięciu do 50 mikrolitrów na 12,5 mikrolitra i napełnij ją roztworem fibrynogenu. Nie zdejmując końcówki, ustaw pipetę na 25 mikrolitrów.

Materiał w końcówce powinien unieść się i pozostawić pustą objętość. Powoli naciskać przycisk tłoka, aż płyn dotrze do otworu końcówki, ale nie wycieknie. Przytrzymaj tłok w tej pozycji i umieść końcówkę w jednej z probówek mikrowirówek zawierających komórki w zawiesinie trombiny, upewniając się, że końcówka styka się z cieczą.

Delikatnie zwolnić przycisk tłoka i wciągnąć zawiesinę ogniwa do końcówki. Dokładnie wymieszaj oba materiały, unikając tworzenia się pęcherzyków. Szybko dozuj zmieszane materiały na wierzch śródbłonkowego rusztowania.

Powtórz poprzednie kroki dla każdego rusztowania, upewniając się, że zmieniasz końcówki między użyciami, aby uniknąć nieoczekiwanego tworzenia się żelu fibrynowego w końcówce. Załóż pokrywę płytki i inkubuj rusztowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 100% wilgotności przez 30 minut. Po inkubacji napełnij każdą studzienkę jednym mililitrem pożywki jeden do jednego DPSC i EC.

Kultura przez tydzień, zmiana podłoża co drugi dzień. W różnych punktach czasowych podczas hodowli usuń pożywkę ze studzienki i zobrazuj konstrukty za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby zbadać rozwój naczyń krwionośnych lub dowolny inny interesujący parametr. Protokół ten pozwala na wytwarzanie rusztowań mozaikowych wykonanych z fotorezystu SU-8.

Uzyskano rusztowania o wyraźnej geometrii przedziałów oraz bardzo dokładnych i powtarzalnych cechach. Przy tradycyjnym jednoczesnym wysiewaniu zarówno komórek śródbłonka, jak i komórek podporowych, komórki były jednorodnie rozmieszczone na rusztowaniu, co powodowało nieprzewidywalne i zdezorganizowane sieci naczyniowe. W przeciwieństwie do tego, stopniowe wysiewanie komórek skutkowało wysoce zorganizowanymi sieciami naczyniowymi.

W przypadku korzystania z fluorescencyjnych komórek śródbłonka naczynia mogą być obrazowane w czasie rzeczywistym. Komórki śródbłonka wykazujące ekspresję białka czerwonej fluorescencji wyhodowano na sześciokątnych rusztowaniach i zobrazowano. Komórki podporowe dodano pierwszego dnia, a sieci naczyniowe obrazowano co drugi dzień w celu ilościowego określenia rozwoju naczyń.

Dla każdego punktu czasowego wykonano szerokie zdjęcia całego rusztowania. Wzrost statków określono ilościowo jako całkowitą długość i powierzchnię statków. Wykonano obrazowanie konfokalne poklatkowe, aby umożliwić śledzenie pojedynczego naczynia przy użyciu wielokolorowych komórek śródbłonka.

Trasa statku została wygenerowana na podstawie filmu poklatkowego, dzięki czemu możliwa jest obserwacja migracji statków. Dojrzewanie naczyń obserwowano dzięki obecności aktyny mięśni gładkich i komórek podporowych. W przypadku przedziałów okrągłych, sześciokątnych i kwadratowych komórki rozmnażają się i organizują w struktury.

Siódmego dnia wszystkie kształty wykazywały bogatą i złożoną sieć naczyniową. Obrazy w większym powiększeniu ujawniły gęstszą aktynę mięśni gładkich i obecność komórek podporowych zlokalizowanych jednocześnie z utworzonymi naczyniami, co świadczy o rekrutacji i różnicowaniu komórek podporowych otaczających struktury naczyniowe. Technika ta może być wykorzystana do badania zachowania trójwymiarowych sieci naczyniowych pod wpływem różnych warunków, takich jak określone inhibitory komórkowe lub w obecności dodatkowych typów komórek.