Name: Hodowle wzbogacone w stożki z siatkówki zarodków kurczaka w celu zbadania interakcji komórkowych między pręcikami a czopkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę hodowli wzbogaconych w czopki z siatkówki zarodków kurczaka do badania metabolizmu i czynników wpływających na przeżywalność komórek. Technika umożliwia identyfikację potencjalnych terapii w zwyrodnieniach siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Jacques'owi Bellalou, Lorelei Fournier, Emmanuelle Clérin, Frédéricowi Blondowi i przedsiębiorcy agricole à responsabilité limitée (EARL Morizeau Dangers, Francja) za ich nieocenioną pomoc. Prace te były wspierane przez Inserm, Uniwersytet Sorboński, Agence Nationale pour la Recherche (ANR, Labex Lifesenses), Fundację Fighting Blindness (USA) oraz IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] wspierane przez francuskie fundusze państwowe zarządzane przez ANR w ramach programu Investissements d'Avenir.

Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Pierre'a i Marii Curie oraz francuskie ministerstwo badań (Numer zezwolenia: APAFIS#1028 2015070211275177). Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie następującego zezwolenia: "Certificat d'autorisation d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9 listopada 2011 – 8 listopada 2016)".
1. Inkubacja zapłodnionych jaj
<ol>
	<li>Zbieraj cotygodniowe zapłodnione jaja (szczep I 657, czerwona etykieta), uzyskane w sposób naturalny, w przemysłowej wylęgarni.</li>
	<li>Utrzymuj zapłodnione jaja w temperaturze 17°C (ich biologiczne zero) w laboratorium po ich "złożeniu" przez kurę.</li>
	<li>Dla każdej kultury inkubować siedem zapłodnionych jaj przez 24 godziny w temperaturze 20 °C, a następnie 136 godzin w temperaturze 37 °C z przerywanym odwróceniem nachylenia jaj (postępujący ruch przez 2 godziny z jednej strony na przeciwną, cykl 4-godzinny) jaj w wilgotnej komorze.</li>
</ol>
2. Odzyskiwanie zarodków kurcząt
<ol>
	<li>Umyj powierzchnię siedmiu jaj środkiem dezynfekującym (np. Pursept A express).</li>
	<li>Aby rozbić skorupkę jajka, zrób otwór w górnej części skorupy za pomocą dużych prostych szczypiec. Następnie pokrój skorupkę, aby zdjąć kapelusz z jajka jako jajko na miękko.</li>
	<li>Delikatnie pobrać każdy zarodek ze skorupki jaja za pomocą zakrzywionych kleszczyków, a następnie przenieść go na szalkę Petriego zawierającą sterylny bufor fosforanowy z solą fizjologiczną (PBS) uprzednio podgrzaną do temperatury 37 °C. Delikatnie usunąć otoczkę otaczającą zarodki (kosmówkę lub błonę kosmówkowo-omocznikową).</li>
	<li>Sprawdź etap rozwoju każdego zarodka poprzez wizualne porównanie z Hamburger i Hamilton42.</li>
	<li>Wybierz dwa zarodki w 29etapie rozwoju (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Skrzydła zginają się w łokciach. Kołnierz wyraźnie się wyróżnia. Projekt ustawy jest bardziej widoczny niż na 28. etapie.</li>
	<li>Wyłuszczenie oczu tych wybranych zarodków i przeniesienie ich na pożywkę niezależną od CO2 (technologie Life). 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zarodek był w stadium 29, a nie w stadium 28 lub 30 (<silna klasa="xfig">Ryc. 1); Dlatego konieczne jest wysiadywanie co najmniej 7 jaj, nawet jeśli ostatecznie zostaną wykorzystane tylko dwa. Kosmówka jest bardzo cienka, więc trudna do odróżnienia, ale znajduje się bardzo blisko zarodka, więc musi zostać usunięta bez dotykania zarodka.</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie siatkówki
<ol>
	<li>Odetnij głowę i wyłuszczej wybrane zarodki za pomocą zakrzywionych kleszczy.</li>
	<li>Przenieść cztery oczy do podłoża niezależnego od CO2. Pożywka ta zawiera 0,9 mM CaCl2 i 0,65 mM MgCl2.</li>
	<li>Ustaw oko z rogówką skierowaną w dół, nerw wzrokowy skierowany w stronę eksperymentatora. Wywierć otwór w nerwie wzrokowym za pomocą dwóch prostych kleszczy.</li>
	<li>Umieść gałąź każdego kleszcza między siatkówką a nabłonkiem barwnikowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Pociągnij za każde kleszcze i obróć oko, aby odłączyć nabłonek od siatkówki. Usuń rogówkę, a następnie soczewkę i ciało szkliste.</li>
	<li>Przenieść cztery siatkówki na szalkę Petriego zawierającą pożywkę Ringera o pH 7.2, 
	UWAGA: Upewnij się, że pozostała tylko siatkówka i usuń wszelkie ślady nabłonka barwnikowego ciała szklistego i pozostałego nabłonka barwnikowego siatkówki.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zawiesiny komórek siatkówki
<ol>
	<li>Pokrój cztery siatkówki na bardzo małe kawałki za pomocą dwóch prostych szczypiec.</li>
	<li>Umyj kawałki siatkówki dwukrotnie pożywką Ringera.</li>
	<li>Po drugim przepłukaniu medium Ringera pozwól kawałkom siatkówki opaść na dno rurki i usuń medium Ringera. Kawałki siatkówki traktować przez 20 minut w temperaturze 37 °C roztworem trypsyny (0,25% w/v).</li>
	<li>Rozpuścić roztwór po 10 minutach przez kolejne odsysanie. Wyładować za pomocą pipety Pasteura i sprawdzić, czy kawałki siatkówki nie uległy dysocjacji. Zatrzymać reakcję, dodając pożywkę hodowlaną uzupełnioną 10% inaktywowaną płodową surowicą cielęcą.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę komórkową z 0,05 mg DNazy I. Oddzielić klastry komórek i DNA poprzez kolejne odsysanie i rozładowywanie za pomocą pipety Pasteura natychmiast po dodaniu DNazy.</li>
	<li>Przepłukać zawiesinę komórek siatkówki dwukrotnie chemicznie zdefiniowaną pożywką hodowlaną (CDCM): równą objętość zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco i pożywki M199 uzupełnionej 100 μg/ml kwasu linolowego/BSA, 0,86 μM insuliny, 0,07 μM transferyny, 2,0 μM progesteronu, 0,28 μM prostaglandyny, 0,29 μM Na2SeO3, 182 μM putrescyna, 3 mM tauryna, 4,7 μM cytydyna 5′-difosfocholina, 2,7 μM cytydyna 5′-difosfoetanoloamina, 0,55 μM hydrokortyzon, 0,03 μM trijodotyronina, 1 mM pirogronian sodu i 20 μM gentamycyna.</li>
</ol>
5. Wysiewanie komórek siatkówki
<ol>
	<li>Dwie czarne 96-dołkowe płytki hodowlane z przezroczystym dnem traktować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C poli-L-lizyną w temperaturze 32,25 μg/cm2.</li>
	<li>Przepłukać te płytki dwukrotnie pożywką hodowlaną M199. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml CDCM.</li>
	<li>Dodać do podwielokrotności 10 μl zawiesiny komórek, trypan, błękit w celu zabarwienia żywych komórek. Dodać próbkę zawiesiny komórek do hemocytometru (komora do liczenia komórek Malasseza).
	<ol>
		<li>Pod mikroskopem policz barwione komórki dla czterech rzędów hemocytometru (tj. 40 kwadratów), a następnie oblicz średnią liczbę komórek dla jednego rzędu. Obliczyć stężenie komórek w zawiesinie, stosując następującą metodę: liczba komórek/ml zawiesiny = średnia liczba komórek w rzędzie (10 kwadratów) x 10 całkowita liczba kwadratów hemocytometru x rozcieńczenie błękitem trypanowym x 1 000 (w celu wyrażenia wyniku w komórkach/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Doprowadzić zawiesinę komórek do dwóch stężeń (5,6 x 104 komórek/ml i 1,12 x 105 komórek/ml) odpowiadających dwóm gęstościom posiewu (1 x 105 komórek/cm2 i 2 x 105 komórek/cm2) za pomocą CDCM.</li>
	<li>Wysiewać 50 μl dwóch zawiesin komórkowych do dwóch wstępnie poddanych działaniu czarnych 96-dołkowych płytek hodowlanych. Rozprowadzić komórki w płytkach za pomocą pipety wielokanałowej od prawej do lewej strony płytki, homogenizując między każdą kolumną, tak aby rozkład komórek był jednorodny.</li>
	<li>Dodać 50 μl biblioteki cząsteczek (np. kondycjonowanych pożywek z biblioteki cDNA, patrz poniżej), które mają być przebadane przy użyciu wstępnie zdefiniowanego wzorca (Tabela 1).</li>
	<li>Inkubować płytki przez siedem dni w temperaturze 37°C w temperaturze 5% CO2 bez zmiany pożywki.</li>
</ol>
6. Liczenie żywotnych komórek
<ol>
	<li>Do każdego dołka płytki dodać 2,7 μM kalceiny AM i 0,3 mM homodimera etydyny. 
	UWAGA: Kalceina wnika w komórki, które są nieprzepuszczalne dla dużych cząsteczek jako homodimer etydyny. W cytoplazmie żywych komórek kalceina jest hydrolizowana przez endogenne esterazy, staje się fluorescencyjna poprzez emisję przy 520 nm po wzbudzeniu przy 485 nm. Homodimer etydyny wiąże się z DNA na martwych komórkach. Wiązanie DNA-homodimer etydyny powoduje emisję czerwonej fluorescencji przy 635 nm po wzbudzeniu przy 520 nm.</li>
	<li>Inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy braku światła.</li>
	<li>Odczyt fluorescencji na automatycznym czytniku płytek składającym się z odwróconego mikroskopu wyposażonego w lampę rtęciową z dwoma filtrami wzbudzenia przy 485 i 520 nm, dwoma filtrami emisji przy 520 i 635 nm, obiektywem (x10), zmotoryzowanym stolikiem sterowanym przez procesor i kamerą ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Ta platforma zliczająca jest kontrolowana przez oprogramowanie Metamorph19. Umożliwia uzyskanie obrazów fluorescencyjnych żywych komórek i martwych komórek jednocześnie w każdym dołku 96-dołkowej płytki, zaczynając od studzienek A1 w kierunku dołka A12, następnie B12 w kierunku B1, C1 w kierunku C12 i tak dalej (tabela I).</li>
	<li>Obliczyć średnią powierzchnię A pojedynczej komórki, korzystając z 18 studzienek kontroli ujemnych (tabela I).</li>
	<li>Policz komórki w każdym dołku płytki i zastosuj następujący wzór empiryczny: A x 29 / 20,7, aby zapobiec liczeniu dubletów komórek (grupy dwóch komórek). Oceń efekt ochronny czopków według cząsteczek jako stosunek średniej liczby komórek w 4 studzienkach, w których testowaliśmy cząsteczkę, do średniej liczby komórek w 18 dołkach kontroli negatywnej (patrz tabela 1 i rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Połączyć wyniki płytki wysiewanej w proporcji 1 x 105 komórek/cm2 z płytką wysiewaną w proporcjach 2 x 105 komórek/cm2, aby ocenić potencjalną ochronę (współczynnik żywotności) przez każdą przesiewaną cząsteczkę.</li>
</ol>

TL, J-AS i VF posiadają patent na zastosowanie EdCVF w leczeniu zwyrodnień siatkówki [WO2009071659 (A1). 12 czerwca 2007].

Wśród wielu parametrów, które mogą ograniczać produkcję kultury wzbogaconej w szyszki z zarodków kurcząt, pierwszym krytycznym krokiem jest dokładne określenie etapu rozwoju zarodków w wyklutych jajach. Zaobserwowano, że hodowla komórek z siatkówki zarodków w ED8 (34. stadium) wytwarza tylko 35% fotoreceptorów, a pozostałe 65% jest zbudowane z innych neuronów4. Bez względu na logistykę zastosowaną w celu uzyskania wyklutych jaj, konieczne jest precyzyjne dostrojenie temperatury i czasu inkubacji oraz dokładne zbadanie zarodków w porównaniu ze zdjęciami referencyjnymi dla wszystkich etapów rozwoju 42,45.
Pierwotnie, system hodowli wzbogacony w szyszki został opracowany przy użyciu szczepu White Leghorn4. Biały kolor jaj tego szczepu nie jest szczególnie ceniony we Francji, dlatego użyliśmy szczepu kurczaka, który produkuje brązowe jaja. Użyliśmy szczepu I 657, który powstaje przez skrzyżowanie kogutów I 66 z kurami JA575. Udało nam się odtworzyć cechy charakterystyczne pierwotnych kultur. Pokazuje to, że tło genetyczne kurczaka nie jest krytyczne dla uzyskania kultur wzbogaconych w szyszki.
Nie testowaliśmy wpływu indywidualnego usuwania suplementów w pożywce hodowlanej, ale zaobserwowaliśmy, że insulina odgrywa kluczową rolę zgodnie z wpływem insuliny na przeżycie czopków u myszy rd1 , modelu autosomalnego recesywnego RP46. Trójjodotyronina (T3) może również uczestniczyć w różnicowaniu komórek prekursorowych siatkówki zarodka kurczaka w czopki, zgodnie z rolą receptora hormonu tarczycy w losie komórek siatkówki podczas rozwoju40. W związku z tym system hodowli wzbogacony w stożki nie może być używany do identyfikacji insuliny poprzez klonowanie ekspresji46.
System hodowli wzbogacony w stożki opiera się na hodowli neuronów pierwotnych i jest znacznie bardziej odpowiedni niż metody polegające na użyciu unieśmiertelnionych komórek jako linii komórkowej 661W 24,25,26.
Opisana tutaj metoda może być modyfikowana poprzez wykonanie wcześniejszej elektroporacji plazmidowym DNA20. Przed przygotowaniem zawiesiny komórek siatkówki całą siatkówkę umieszcza się w komorze specjalnie wykonanego elektroporatora ze 120 μL 0,5 μg/μL plazmidowego DNA w 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA. Stosuje się pięć impulsów 15 V przez 50 ms każdy, oddzielonych odstępem 950 ms22. Próby dostarczenia interferującego RNA (RNAi) za pomocą retrowirusów RCAS (replication competent avian splice) do kultur wzbogaconych w czopki zakończyły się niepowodzeniem47. Wynika to z pewnością z faktu, że przy braku surowicy i w hodowlach o niskiej gęstości komórki prekursorowe siatkówki nie są replikacyjne, co jest niezbędne do namnażania się retrowirusów.
Opracowaliśmy system hodowli wzbogacony w szyszki w celu identyfikacji czynników troficznych, które sprzyjają przetrwaniu stożków za pomocą klonowania ekspresji19. Aby było to wykonalne, przeprowadziliśmy pierwszy etap przesiewania wysokiej zawartości przy użyciu kondycjonowanej pożywki z puli 100 klonów. Nawet jeśli cDNA z biblioteki ulegają ekspresji pod kontrolą silnego promotora CMV po transfekcji komórek COS-1, nie daje to gwarancji, że wszystkie białka kodowane przez poszczególne cDNA osiągną stężenie wystarczające do uzyskania dodatniego wyniku w teście żywotności. Jest to poważne ograniczenie. W tym sensie wszelkie badania przesiewowe nie są tak naprawdę wyczerpujące. Ponadto, nawet jeśli białka błoniaste nie zostały usunięte z kondycjonowanej pożywki, konfiguracja testu jest niekorzystna dla identyfikacji czynników niedyfuzyjnych. Alternatywą byłoby badanie przesiewowe poszczególnych klonów po uzyskaniu sekwencji cDNA w celu uniknięcia duplikacji w oznaczaniu wielokrotnie tego samego białka kandydującego. Zostało to zainicjowane przez sekwencjonowanie bibliotek cDNA siatkówki, których użyliśmy43. Takie podejście, choć racjonalne, ma też swoje ograniczenia. Bioinformatyczna analiza sekwencji cDNA nieodparcie narzuci, oprócz zmniejszenia redundancji, priorytetowe traktowanie niektórych klonów w oparciu o wiedzę. Nie będzie to ze szkodą, jeśli w końcu cała biblioteka zostanie prześwietlona, nawet jeśli czas potrzebny na to zostanie znacznie wydłużony. Ale niezmiennie tożsamość sekwencji będzie miała wpływ na nasz sposób patrzenia na wyniki. Nie będzie to neutralne, ponieważ interpretacja sekwencji będzie oczywiście konkurencyjna z danymi eksperymentalnymi.
Identyfikacja EdCVF pokazuje również, że selekcja o wysokiej zawartości pociąga za sobą ograniczenia techniczne. Na podstawie pierwszej rundy badań przesiewowych zidentyfikowaliśmy dwie pule o wysokiej aktywności (rysunek uzupełniający 1). Pula 0073 doprowadziła do pomyślnej identyfikacji EdCVF, podczas gdy pula 0080 nie doprowadziła do takiego ustalenia. Nie rozwiązaliśmy problemu, który mógł wynikać z utraty aktywnego klonu podczas przygotowywania podpul. Alternatywnie nie jest wykluczone, nawet jeśli nie jest to statystycznie korzystne, że wśród cDNA z puli 0080 dwa białka działały synergistycznie i ich aktywności nie można było zaobserwować jako pojedynczych klonów.
Identyfikacja cząsteczek chroniących czopki poprzez badania przesiewowe małych cząsteczek jest przyszłościowym zastosowaniem systemu hodowli wzbogaconej w stożki. Takie cząsteczki będą nieocenione w leczeniu patologii siatkówki, dla których terapia genowa nie jest najodpowiedniejszym podejściem, jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem.

Siatkówka gatunków kręgowców jest podwójna, z fotoreceptorami pręcikowymi do widzenia w słabym świetle i fotoreceptorami czopków do widzenia światła dziennego, kolorów i ostrości. Ostrość wzroku naczelnych opiera się na obszarze w środku siatkówki, zwanym dołkiem centralnym, który jest wzbogacony w czopki, ale ogólnie czopki stanowią tylko 5% wszystkich fotoreceptorów. W związku z tym analiza czopków w siatkówce naczelnych, a zwłaszcza hodowla czopków, jest technicznie trudna. Wszystkie inne gatunki ssaków nie mają dołka centralnego, a odsetek czopków jest niski u gryzoni, które są najczęściej wykorzystywane w badaniach siatkówki. Inaczej jest w przypadku gatunków ptaków, u których czopki dominują w siatkówce tych dobrze widzących gatunków ptaków. Dinozaury, które zdominowały ekosystem, gdy ssaki pojawiły się po raz pierwszy podczas ewolucji, mają filogenetyczne pochodzenie ptaków1. W wyniku takiej konkurencji między dinozaurami a wczesnymi ssakami, ssaki te prowadzą głównie nocny tryb życia, a siatkówki są zdominowane przez pręciki. Dopiero później, w trakcie ewolucji, dzienne widzenie niektórych gatunków ssaków, do których należą naczelne, stało się ewolucyjną przewagą. Niemniej jednak okres rodowy pozostaje atawizmem nocnego wąskiego gardła w ewolucji widzenia ssaków2,3.
Podczas badania różnicowania komórek siatkówki, Adler i Hatlee wykazali, że fotoreceptory reprezentują około 70% zróżnicowanych komórek siatkówki w hodowlach pochodzących od kurczaka w dniu embrionalnym (ED) 6 lub etapie 294. Ze względu na rozpowszechnienie czopków w siatkówce kurzej, hodowle komórek siatkówki z zarodków kurczaków ED6 zostały opracowane jako kultury wzbogacone w czopki5.
Znaczenie ostrości wzroku za pośrednictwem stożków dla człowieka to truizm. Osoby dotknięte chorobami genetycznymi lub starzejącymi się, które zmieniają funkcję czopków, są znacznie upośledzone. Przyczyniło się to do powstania bardzo dużej liczby badań nad dziedzicznymi zwyrodnieniami siatkówki (IRD) w celu znalezienia metod leczenia tych chorób powodujących ślepotę6,7. Pierwszy sukces, uzyskany przy użyciu rekombinowanego wektora związanego z adenowirusem (AAV) w terapii ciężkiej postaci wrodzonej ślepoty IRD Lebera (LCA), jest dowodem słuszności koncepcji terapii genowej8. Identyfikacja genów, których mutacje wywołują IRD, otwiera możliwość wyleczenia tych chorób za pomocą terapii genowej. Niemniej jednak choroby te wynikają z mutacji w ponad 200 różnych genach9. Nawet w przypadku autosomalnych recesywnych postaci IRD, kiedy ponowne wprowadzenie normalnej kopii chorobowego genu może przywrócić funkcję wzrokową, koszt ekonomiczny każdego indywidualnego rozwoju faworyzuje te najbardziej rozpowszechnione ze szkodą dla mniej powszechnych i tych, których pochodzenie genetyczne pozostaje nieznane. Fakt ten skłonił naukowców do zastanowienia się nad bardziej ogólnymi terapiami. Apoptotyczna śmierć komórek pojawiła się jako powszechny szlak i cel terapeutyczny tych chorób, które postępują poprzez degenerację fotoreceptorów, w tym dla form autosomalnych dominujących10,11. Brakuje jednak sukcesów takiego podejścia. W przypadku najczęstszej postaci IRD, barwnikowego zwyrodnienia siatkówki (RP), wspólnym szlakiem jest wtórna utrata funkcji, po której ostatecznie następuje zwyrodnienie czopków12,13. Zapobieganie utracie funkcji czopków pozwoli zachować centralne widzenie dołka niezależnie od mutacji sprawczych14.
We wczesnym stadium RP, utrata pręcików powoduje zmniejszenie ekspresji czynnika żywotności czopków pochodzących z pręcików (RdCVF), kodowanego przez gen NXNL1 podobny do nukleoredoksyny 1, który przerywa sygnalizację metaboliczną i redoks między pręcikami i czopkami15. Podanie rekombinowanego AAV kodującego dwa produkty genu NXNL1, czynnik troficzny RdCVF i enzym tioredoksyny RdCVFL, może teoretycznie zapobiec utracie widzenia stożków we wszystkich formach genetycznych RP16. Wykazaliśmy, że produkt genu NXNL1, RdCVFL, ulega ekspresji w kulturach wzbogaconych w szyszki kurczaka17 i gdzie pełni rolę ochronną18. RdCVF i gen NXNL1 zidentyfikowano za pomocą badań przesiewowych o wysokiej zawartości biblioteki cDNA siatkówki przy użyciu przeżycia komórek z hodowli wzbogaconej w stożki, jak to było readout19. Przebadaliśmy równowartość 210 000 indywidualnych klonów biblioteki, używając 8 równoległych testów dla każdego klonu. Stanowi to bardzo dużą liczbę badań wymagających łatwego dostępu do materiału biologicznego, jakim są siatkówki zarodków kurzych. Stwierdziliśmy, że stosunkowo łatwo jest uzyskać zarodki kurze raz w tygodniu, ponieważ są one powszechnie produkowane dla przemysłu rolnego dla kur niosek i kurcząt przeznaczonych do produkcji mięsa. Po starannej standaryzacji kultur wzbogaconych w stożki, system zapewnia łatwy, solidny i powtarzalny sposób testowania tysięcy cząsteczek pod kątem ich zdolności do zachowania żywotności stożków. Komórki te są również podatne na manipulacje genetyczne20, które przynoszą korzyści w badaniach nad transdukcją sygnału i analizach biochemicznych21,22,23.
Badacze siatkówki opracowali alternatywne metody wykorzystania linii komórek stożkowych 661W24,25,26. Niemniej jednak tożsamość tej linii komórkowej pozostaje kontrowersyjna27,28. Komórki o mocy 661W sklonowano z guzów siatkówki transgenicznej linii myszy, która wyraża duży antygen T SV40 pod kontrolą ludzkiego promotora białka wiążącego retinol między fotoreceptorami. Duży antygen T SV40 pośredniczy w transformacji komórkowej i nieśmiertelności. W związku z tym szlak sygnałowy zidentyfikowany za pomocą komórek o mocy 661 W musi być opisany w kontekście przekształconej i unieśmiertelnionej linii komórkowej, która pod wieloma względami różni się od czopków in situ. Pod tym względem system hodowli wzbogacony w czopki składa się z pierwotnych neuronów, czopków, które są bardziej fizjologicznie istotne.
Chociaż możliwe jest uzyskanie czystej kultury fotoreceptorów za pomocą wibratomu przekroju siatkówki myszy, bardzo niski procent czopków w zewnętrznej siatkówce gryzoni sprawia, że to podejście nie nadaje się do produkcji kultur wzbogaconych w czopki29. Siatkówka świni nie zawiera dołka centralnego, ale ma obszar zwany obszarem centralnym, który jest bardzo wzbogacony w stożki30. Wysoki odsetek czopków u gryzoni w siatkówce, takich jak Arvicanthis ansorgei i Psammomys obsesus31,32, oferuje możliwe rozwiązanie, ale wymaga hodowli tak egzotycznych gatunków. Dorosłe oczy świni, zebrane z lokalnych rzeźni, mogą być użyte do wytworzenia mieszanej kultury pręcików i czopków, które zostały użyte do badania przeżywalności fotoreceptorów33. Eleganckim rozwiązaniem jest wstępne oczyszczenie czopków z siatkówki świni za pomocą płukania lektyną aglutyniny z orzeszków ziemnych (PNA), która selektywnie wiąże się z czopkami34. Niemniej jednak metoda ta jest trudna do wdrożenia na dużą skalę ze względu na swoją złożoność.
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) oferują najbardziej obiecujące podejście do uzyskania populacji komórek fotoreceptorowych w kształcie czopków, które mogą być wykorzystane do przeszczepu siatkówki, ale które mogą być również dostosowane do hodowli wzbogaconej w stożki35,36. Ponieważ czynnik transkrypcyjny NRL jest wymagany dla fotoreceptorów pręcików37, mysz Nrl-/- ma siatkówkę zdominowaną przez czopki krótkofalowe (czopki S). Inaktywacja może być wykorzystana do wytworzenia preparatu wzbogaconego w stożek S poprzez różnicowanie człowieka od iPS38,39. Innym możliwym podejściem jest promowanie różnicowania czopków za pomocą sygnalizacji hormonów tarczycy40. Podczas gdy pojawiają się nowe metody wytwarzania kultur wzbogaconych w szyszki z ludzkich iPS, zarodki kurze stanowią obecnie sprawdzoną metodę19.
Kultura wzbogacona o stożek odegrała zasadniczą rolę w identyfikacji RdCVF przez klonowanie wyrażeń19. System ten został również z powodzeniem wykorzystany do wykazania, że RdCVF stymuluje wychwyt glukozy i jej metabolizm poprzez glikolizę tlenową22. Ponadto wykorzystano hodowlę wzbogaconą w stożki, aby potwierdzić ochronną rolę RdCVFL, drugiego produktu genu NXNL1 23. Niedawno system ten został wykorzystany do wykazania istnienia cząsteczek ochronnych wydzielanych przez barwnikowe komórki nabłonkowe siatkówki transdukowane za pomocą OTX241.

<table><tbody><tr><td>96 czarnych płytek (Przezroczysty przycisk z pokrywką Hodowla tkankowa poddana obróbce)</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Fotometria</td><td>CoolSnap&nbsp; FX HQ</td><td></td></tr><tr><td>CDPC (Cytydyna 5&-difosfocholina sól sodowa dwuwodna)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0256</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Niezależny</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Dutscher</td><td>005093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do jaj</td><td>FarmLine</td><td>M08 01 3100</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Homodimer</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>E1169</td><td></td></tr><tr><td>F&oelig; surowica bydlęca</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0880</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulina Transferine selenium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>duże szczypce proste</td><td>Dutscher</td><td>005074</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>linolowySigma-Aldrich</td><td>L8384</td><td></td></tr><tr><td>M199 średni</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Metamorph</td> Mikroskop <td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIKON</td><td>Eclipse TE2000</td><td></td></tr><tr><td>Stopień zmotoryzowany</td><td>Martzauzer</td><td>Mutlicontrol 2000</td><td></td></tr><tr><td>Przełącznik filtra optycznego</td><td>Shutter Instrument firmy</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>14190-086</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Pursept A express</td><td>Fisher</td> scientific <td>11814110</td><td></td></tr><tr><td>Putriscine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze proste</td><td>Dutscher</td><td>005092</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Trijodotyronina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25 %</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowle wzbogacone w stożki z siatkówki zarodków kurczaka w celu zbadania interakcji komórkowych między pręcikami a czopkami

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Ludzkie widzenie dzienne opiera się na funkcji fotoreceptorów czopków w centrum siatkówki, dołka centralnego. Pacjenci cierpiący na najczęstszą postać dziedzicznego zwyrodnienia siatkówki, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, tracą widzenie w nocy z powodu utraty fotoreceptorów pręcików spowodowanej mutacją, po której następuje postępująca utrata funkcji i śmierć czopków prowadząca do ślepoty. Genetycy zidentyfikowali wiele genów z mutacjami powodującymi tę chorobę, ale pierwsze zidentyfikowane mutacje kwestionowały mechanizmy wtórnego zwyrodnienia czopków i to, w jaki sposób dominująca mutacja w genie rodopsyny kodującym pigment wzrokowy wyrażany wyłącznie w pręcikach może wywołać zwyrodnienie czopków.
Ten wynik przeszczepów w genetycznym modelu choroby doprowadził do koncepcji interakcji komórkowych między pręcikami i czopkami oraz niekomórkowej autonomicznej degeneracji czopków we wszystkich genetycznych formach barwnikowego zwyrodnienia siatkówki.
Czopki stanowią 5% wszystkich fotoreceptorów u ludzi i tylko 3% u myszy, więc ich badanie jest trudne u tych gatunków, ale czopki przewyższają liczebnie pręciki u gatunków ptaków. Przystosowaliśmy płytki 96-dołkowe do hodowli prekursorów siatkówki z siatkówki zarodków kurczaków na etapie 29 ich rozwoju. W tych hodowlach pierwotnych czopki stanowią 80% komórek po różnicowaniu in vitro. Komórki ulegają degeneracji w ciągu jednego tygodnia przy braku surowicy. W tym miejscu opisujemy metody i ich standaryzację.
Ten system hodowli wzbogacony o stożki został użyty do identyfikacji czynnika żywotności stożków pochodzącego z nabłonka (EdCVF) poprzez badanie przesiewowe o wysokiej zawartości znormalizowanej biblioteki cDNA nabłonka siatkówki szczura. Rekombinowany EdCVF zapobiega degeneracji czopków.

Opisujemy tutaj, w jaki sposób system hodowli wzbogaconej o czopki może być wykorzystany do identyfikacji nowych białek chroniących czopki. Wykorzystaliśmy ten protokół do przesiewu znormalizowanej biblioteki cDNA utworzonej z naczyniówki i nabłonka pigmentowego siatkówki z 400 oczu 8-tygodniowych szczurów Long-Evans43.
Biblioteka ta zawiera 6,0 x 106 niezależnych jednostek tworzących kolonie (CFU) i posiada średnią wielkość wstawki klonowanej wynoszącą 2,1 kilobazy (kb), przy czym ponad 99% stanowią klony rekombinowane. Pule po 100 klonów z tej biblioteki zostały przejściowo transfekowane (0,1 µg plazmidowego DNA) do komórek COS-1, a po 48-godzinnej inkubacji w pożywce DMEM bez surowicy zebrano pożywkę warunkową (CM) z komórek COS-1. Membrany lub egzosomy nie były usuwane metodą ultrawirówki. Pięćdziesiąt mikrolitrów każdej pożywki CM dodano do 4 dołków dwóch płytek 96-dołkowych: jednej zasianej w zagęszczeniu 2 x 105 komórek/cm2, a drugiej w 4 x 105 komórek/cm2. Jako kontrolę negatywną wykorzystano pożywkę CM z komórek COS-1 transfekowanych pustym wektorem pcDNA3.1, służącym do konstrukcji biblioteki (Tabela 1). Łącznie oceniono 2112 zestawów po 100 klonów, co odpowiada 211 200 poszczególnym klonom, w czterech dołkach hodowlanych i dla dwóch warunków wysiewu kultur wzbogaconych w czopki. Te dwa warunki odpowiadają dwóm nieco różnym gęstościom inokulacji, co pozwala na dokładniejszą ocenę aktywności ochronnej, co łącznie daje 1 689 600 dołków hodowlanych.
Spośród 42 pul klonów o stosunku większym niż 2, pule 0080 i 0073 wykazały stosunek żywotności odpowiednio 16 i 14 razy wyższy po 7 dniach hodowli niż kontrola negatywna, pcDNA3.1 (Supplementary Figure 1). Analiza ta jest niezbędna do zidentyfikowania interesujących pul. Każda wybrana pula 100 klonów została podzielona na 16 zestawów po 10 klonów z ich zapasu glicerolowego. Subpule te zostały przygotowane i przebadane zgodnie z tą samą metodą w drugiej rundzie przesiewowej (tj. łącznie 3200 studzienek hodowlanych). Subpula 0073-09 wykazała najwyższy stosunek żywotności (Supplementary Figure 2A) i została dalej podzielona w celu uzyskania 16 pojedynczych klonów, które przebadano w trzeciej rundzie przesiewowej na kulturach wzbogaconych w czopki. Klon 0073-09-37 wyraźnie wyróżnia się na tle pozostałych, ze stosunkiem żywotności równym 2,5 (Supplementary Figure 2B). Oś y ma inną skalę, mimo że gęstość siewu była taka sama jak w Supplementary Figure 2A. Zjawisko to często obserwujemy, gdy testy są powtarzane co tydzień przez wiele miesięcy. Po analizie wyniki te potwierdziły, że klon 0073-09-37 wywiera silny i powtarzalny wpływ na przeżywalność czopków. Test powtórzono niezależnie (Figure 3A), a insert o wielkości 1,8 kb zsekwencjonowano (Figure 3B).
Analiza bioinformatyczna wykazała, że klon 0073-09-37, który nazwaliśmy czynnikiem przeżycia czopków pochodzenia nabłonkowego (epithelium-derived cone viability factor, EdCVF), zawiera trzy otwarte ramki odczytu (ORF); ta najbardziej położona w górę strumienia (ORF1) koduje 84 reszty części C-końcowej białka szczura zinc finger protein-180 (ZFP180, NP_653358) składającego się z 727 aminokwasów44. Pozostałe dwie ramki ORF (ORF2 i ORF3) są znacznie słabiej zachowane u myszy i nie występują u innych ssaków. W testach przeprowadzonych niezależnie tylko ORF1 wykazuje efekt ochronny na czopki (Rycina uzupełniająca 3). ORF1 został wytworzony jako białko fuzyjne z S-transferazą glutationową (GST) (Rycina 4A). Białko EdCVF zostało oczyszczone, a znacznik GST usunięty (Rycina 4B). EdCVF jest w stanie zapobiegać degeneracji czopków w systemie hodowli wzbogaconej o czopki (Rycina 4C).
<img alt="Etapy rozwoju embrionalnego 28-30, schemat biologii rozwoju, oznaczenia anatomiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zarodki kurczaka na 28.tym, 29.tym i 30.tym etapie rozwoju. Strzałki W: skrzydło, C: kołnierz i B: dziób. Pasek skali 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu izolacji siatkówki z etapami: otwarcie jaja, enukleacja, separacja tkanek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Disekcja siatkówki zarodka kurczaka <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący żywotność komórek: kontrola negatywna vs 0073-09-37; tekst sekwencji DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Czynnik żywotności czopków pochodzenia nabłonkowego (EdCVF), klon 0073-09-37. A. Zwiększona żywotność w hodowli wzbogaconej o czopki. B. Sekwencja klonu cDNA 0073-09-37. Podkreślona sekwencja GAATTC to miejsce restrykcyjne EcoRI wykorzystane do konstrukcji biblioteki. Dwa kodony GTG pogrubione to rzadkie miejsca inicjacji translacji EdCVF pochodzące z wektora. Analiza statystyczna przeprowadzona testem Studenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces edycji genów; sekwencja DNA, wynik elektroforezy, analiza białek; dane eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Aktywność rekombinowanego EdCVF. A. Sekwencja EdCVF w fuzji z S-transferazą glutationową (GST). B. Oczyszczone rekombinowane białko EdCVF. C. Aktywność troficzna GST-EdCVF wobec stożka w kulturze. Analiza statystyczna z użyciem testu Tukeya. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Stosunek średniej liczby komórek dla puli cDNA do kontroli negatywnej, którą było medium warunkujące komórek COS-1 transfekowanych pustym wektorem pcDNA3.1 podczas pierwszej rundy przesiewania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplemntary_File_1_12_11_2020.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Liczba żywych komórek. A. Druga runda przesiewania z podpulami puli 0073. B. Trzecia runda przesiewania z izolowanymi klonami. CN: pożywka warunkująca komórek COS-1 transfekowanych pustym wektorem pcDNA3.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_Figure_2_12_11_2020.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a> 
Rycina uzupełniająca 3: Aktywność troficzna trzech otwartych ramek odczytu wyizolowanego klonu 0073-09-37. Analiza statystyczna z użyciem testu Dunnetta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_figure_3.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>NK (komórki Natural Killers)</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>NC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>NC</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>NC</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>6</td>
			<td>NC</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>NC</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
			<td>NC</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>NC</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>NC</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>NC</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>NC</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>NC</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>17</td>
			<td>NC</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>NC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>NC</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>NC</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="13">NC kontrole negatywne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="13">pozycje 1–20 pul testowanych w czterech powtórzeniach</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Plan płytki 96-dołkowej do wysokoprzepustowego screeningu obrazowego

Opisujemy metodę uzyskiwania pierwotnych kultur fotoreceptorów czopków z siatkówki zarodków kurczaków i jej wykorzystanie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości.

Hodowle wzbogacone w stożki z siatkówki zarodków kurczaka w celu zbadania interakcji komórkowych między pręcikami a czopkami

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Metoda ta służy do badania receptorów czopków, które są niezbędne do widzenia w świetle dziennym. Zaletą tych metod jest to, że wykorzystuje się w nich zapłodnione jaja kurze, które są łatwo dostępne i są jednym z niewielu źródeł pierwotnych kultur stożków. Protokół został wykorzystany do zidentyfikowania współczynnika żywotności czopków pochodzących z pręcików, przyszłego obiecującego leczenia dziedzicznego zwyrodnienia siatkówki.Ponadto protokół wykorzystano do zbadania metabolizmu fotoreceptorów czopków. Dzięki starannemu przestrzeganiu opisanego protokołu, osoba, która specjalizuje się w pierwotnej hodowli komórek, powinna być w stanie uzyskać hodowlę wzbogaconą w stożki już po kilku próbach. Zacznij od cotygodniowego zbierania zapłodnionych jaj z przemysłowej wylęgarni.Utrzymuj zapłodnione jaja w temperaturze 17 stopni Celsjusza w laboratorium. Dla każdej kultury wysiaduj siedem zapłodnionych jaj przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza, a następnie 136 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze z przerywanym odwróceniem nachylenia. Aby odzyskać zarodki kurczaka, umyj powierzchnię jaj środkiem dezynfekującym, rozbij skorupkę jajka, robiąc otwór w górnej części skorupki dużymi prostymi szczypcami, a następnie odetnij skorupkę, aby usunąć kapelusz z jajka.Delikatnie wyekstrahuj każdy zarodek ze skorupki jajka za pomocą zakrzywionych kleszczyków i przenieś go na szalkę Petriego zawierającą sterylny PBS uprzednio podgrzany do 37 stopni Celsjusza. Ostrożnie usuń otoczkę otaczającą zarodki. Sprawdź etap rozwoju każdego zarodka przez wizualne porównanie z Hamburgerem i Hamiltonem i wybierz dwa zarodki na 29. etapie rozwoju. Wyłuszczej oczy tych wybranych zarodków i przenieś je na pożywkę niezależną od dwutlenku węgla.Pracując w środowisku niezależnym od dwutlenku węgla, ustaw czworo oczu z rogówką skierowaną w dół i nerwem wzrokowym skierowanym w stronę eksperymentatora. Wywierć otwór w nerwie wzrokowym za pomocą dwóch prostych kleszczy. Włóż gałąź każdego kleszcza między siatkówkę a nabłonek barwnikowy, a następnie pociągnij i obróć oko, aby odłączyć nabłonek od siatkówki.Usuń rogówkę, a następnie soczewkę i ciało szkliste. Przenieść cztery siatkówki na szalkę Petriego zawierającą pożywkę Ringera o pH 7,2. Pokrój cztery siatkówki na bardzo małe kawałki za pomocą dwóch prostych szczypiec i umyj kawałki dwukrotnie środkiem Ringera.Po drugim praniu pozwól, aby kawałki siatkówki opadły na dno rurki i usuń pożywkę. Traktuj kawałki siatkówki roztworem trypsyny przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 20 minutach zatrzymaj reakcję, dodając pożywkę hodowlaną uzupełnioną 10% inaktywowaną płodową surowicą cielęcą.Inkubować zawiesinę komórkową z 0,05 mg DNazy 1, a następnie natychmiast dysocjować klastry komórkowe i DNA, pipetując w górę iw dół za pomocą pipety. Przepłukać zawiesinę komórek siatkówki dwukrotnie chemicznie zdefiniowaną pożywką hodowlaną lub CDM. Dwie czarne 96-dołkowe płytki hodowlane z przezroczystym dnem traktować polilizyną przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po zakończeniu przepłukać płytki dwukrotnie pożywką hodowlaną M199. Dodać błękit trypanowy do podwielokrotności 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej, aby zabarwić żywe komórki. Następnie dodaj próbkę zawiesiny komórek do hemocytometru.Po zliczeniu komórek doprowadzić zawiesinę komórek do odpowiednich stężeń za pomocą CDM. Dodaj 50 mikrolitrów biblioteki cząsteczek do przesiewania przy użyciu wstępnie zdefiniowanego wzoru. Wysiewaj 50 mikrolitrów dwóch zawiesin komórkowych do dwóch wstępnie poddanych działaniu czarnych 96-dołkowych płytek hodowlanych.Rozprowadzić komórki w płytkach za pomocą pipety wielokanałowej od prawej do lewej strony płytki, homogenizując między każdą kolumną. Następnie inkubuj płytki przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, poniżej 5% dwutlenku węgla bez zmiany pożywki. Aby policzyć żywe komórki, dodaj 2,7 mikromolowej kalceiny AM i 0,3 milimolowego homodimeru etydyny do każdego dołka płytki.Inkubować płytki przez godzinę w temperaturze pokojowej przy braku światła. Odczyt fluorescencji na automatycznym czytniku płytek składającym się z odwróconego mikroskopu wyposażonego w lampę rtęciową z dwoma filtrami wzbudzenia o długości 485 i 520 nanometrów, dwoma filtrami emisyjnymi o długości fali 520 i 635 nanometrów oraz kamerą urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym. Protokół ten został wykorzystany do badania przesiewowego znormalizowanej biblioteki cDNA wykonanej z nabłonka barwnikowego naczyniówki i siatkówki z 400 oczu ośmiotygodniowych szczurów Long-Evans.W sumie oceniono 2 112 zestawów po 100 klonów, co odpowiada 211 200 pojedynczym klonom. Spośród 42 pul klonów o stosunku większym niż dwa, pule 0080 i 0073 miały współczynnik żywotności 16 i 14 razy wyższy niż kontrola ujemna po siedmiu dniach hodowli. Każdy wybrany ze 100 klonów został podzielony na 16 zestawów po 10 klonów z ich zapasów glicerolu.Podpula 0073-09 dała najsilniejszy współczynnik żywotności i została podzielona w celu wytworzenia 16 indywidualnych klonów, które zostały przetestowane w trzeciej rundzie badań przesiewowych na kulturach wzbogaconych w szyszki. Klon 0073-09-37 wyróżniał się współczynnikiem żywotności wynoszącym 2,5. Dalsza analiza potwierdziła, że klon ten ma silny i powtarzalny wpływ na przeżywalność stożków.Test powtórzono niezależnie i zsekwencjonowano wstawienie 1,8 kilozasad. Analiza bioinformatyczna wykazała, że klon 0073-09-37, który został nazwany Epithelium-Derived Cone Viability Factor (EdCVF), zawiera trzy otwarte ramki odczytu. W testach niezależnych tylko ORF1 wywierał działanie ochronne na stożki.ORF1 był wytwarzany jako białko S-transferazy glutationowej. Czynnik żywotności stożka wywodzący się z nabłonka został oczyszczony, a znacznik GST usunięty. Analiza aktywności troficznej wykazała, że EdCVF jest w stanie zapobiegać zwyrodnieniu stożków w systemie hodowli wzbogaconym w stożki.Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy dokładnie sprawdzić etap rozwoju zarodków, aby uzyskać kultury wzbogacone w stożki. Zgodnie z tym protokołem, komórki mogą być elektroporowane plazmidowym DNA w celu zbadania mechanizmów molekularnych wszelkich czynników przeżycia, takich jak RdCVF. Technika ta toruje drogę badaniom metabolicznym, w tym rozwojowi matematycznych modeli przeżywalności czopków.

cone-enriched-cultures-from-retina-chicken-embryos-to-study-rod-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł przedstawia metodę preparowania i inkubacji siatkówki królika oraz zapośredniczony przez cząsteczki transfer genów plazmidów kodujących GFP lub różne markery subkomórkowe do komórek zwojowych siatkówki.

Organotypowa hodowla siatkówki dorosłego królika

Przedstawimy sposób rejestracji odpowiedzi na błysk z pojedynczych czopków mysich przy użyciu elektrody ssącej.

Rejestracje metodą ssania z pojedynczych komórek fotoreceptorów czopkowych myszy

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Film demonstruje metodę hodowli pierwotnych komórek zwojowych siatkówki z zarodków danio pręgowanego. Zarodki we wczesnym stadium są poddawane sekcji w celu wyizolowania oczu, które są następnie mechanicznie dysocjowane w zawiesinę komórek zwojowych siatkówki. Ta zawiesina komórkowa jest hodowana na szkiełkach nakrywkowych pokrytych białkami adhezyjnymi, aby ułatwić rozwój aksonów.

Wytwarzanie pierwotnych kultur komórek zwojowych siatkówki z zarodków danio pręgowanego

Siatkówka nerwowa myszy w wieku 8 dni znajduje się na 4% bloku żelatyny. Po wyizolowaniu warstwy fotoreceptorów (200 μm) za pomocą wibratomu, fotoreceptory są wysiewane po dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej do hodowli. Warstwa fotoreceptorowa może być wykorzystana do analiz molekularnych, biochemicznych lub transplantacji.

Cięcie wibratomem siatkówki myszy w celu przygotowania kultur fotoreceptorowych

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Poznaj metodę hodowli wzbogaconych w czopki z siatkówki zarodków kurczaka do badania metabolizmu i czynników wpływających na przeżywalność komórek. Technika umożliwia identyfikację potencjalnych terapii w zwyrodnieniach siatkówki.

Hodowle wzbogacone w stożki z siatkówki zarodków kurczaka w celu zbadania interakcji komórkowych między pręcikami a czopkami

Przeglądaj więcej filmów