Name: Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę wykorzystania partenogenetycznych haploidalnych komórek macierzystych myszy jako zamiennika plemników do tworzenia półklonowanych embrionów. Technika ta umożliwia badanie genomicznego imprintingu w biologii rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Dr. Giulio Di Mininowi za wyprowadzenie linii phaESC oraz Dr. Remo Freimannowi za operację cytometrii przepływowej. Dziękujemy również Pani Michèle Schaffner i Panu Thomasowi M. Hennkowi za wsparcie techniczne przy transferze zarodków. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (grant 31003A_152814/1).

<ol><li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+genetic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li>
<li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice%3A+A+decision+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li>
<li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072(2020).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li>
<li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li>
<li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li>
<li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li>
<li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
<li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li>
<li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li>
<li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li>
<li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li>
<li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+genome%3A+role+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+Supplement%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li>
<li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350(2019).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Klonowanie ssaków metodą transferu jądra komórki somatycznej (SCNT) zostało zapoczątkowane w latach 90. 19,20,21. Zmiany te były następstwem badań nad klonowaniem przeprowadzonych 30 lat wcześniej na22. Znaczne opóźnienie odzwierciedla trudności w embriologii i imprintingu genomowym u ssaków. Rozwój SCNT u ssaków jest podstawą do zastosowania haESC do substytucji plemników, co zostało szczegółowo opisane w niniejszym protokole.
Synchronizacja cyklu komórkowego jest ważnym czynnikiem sukcesu SCNT23. Dotyczy to również wstrzykiwania haESC w tym protokole. Wprowadzenie genomu dawcy do biorcy wymaga dopasowania faz cyklu komórkowego, aby uniknąć pęknięcia chromosomów lub aneuploidii, które mogłyby zahamować rozwój zarodka. Częściowe klonowanie ma dodatkową złożoność polegającą na tym, że dwa genomy i cytoplast muszą być zgodne. Poprzedni raport wykazał, że wstrzyknięcie androgenowych haESC zatrzymanych w fazie M dało lepsze wskaźniki rozwoju częściowo sklonowanych zarodków niż wstrzyknięcie haESC fazy G1 do oocytów7. Ten raport sugeruje fazę M jako odpowiedni punkt synchronizacji dla częściowego klonowania. W związku z tym phaESC zostały mitotycznie zatrzymane w metafazie z demekolcyną i wstrzyknięte do ooplazmy oocytów MII, które zostały naturalnie zatrzymane w metafazie II mejozy. Co ważne, zatrzymanie fazy M można osiągnąć w mysich ESC z wysoką wydajnością, zapewniając doskonałą synchronizację między cyklami komórkowymi dawcy i biorcy.
Podczas mitozy błona jądrowa rozpada się i tworzy się wrzeciono, do którego przyczepiają się zreplikowane chromosomy. Po wstrzyknięciu M-fazowych DKO-phaESC, chromatydy siostrzane są segregowane do pseudo ciała polarnego i zygoty7 (ryc. 3E). W związku z tym pojedynczy zestaw chromosomów z DKO-phaESC przyczynia się do powstania częściowo sklonowanego zarodka. Bardzo ważne jest, aby chromatydy siostrzane chromosomów DKO-phaESC mogły być prawidłowo segregowane po wstrzyknięciu. Błona plazmatyczna nienaruszonego DKO-phaESC zapobiega segregacji do ciała pseudopolarnego. Rzeczywiście zaobserwowaliśmy rzadkie przypadki, w których błona plazmatyczna DKO-phaESC nie została przerwana, a zarodki wykazywały nienaruszone DKO-phaESC w ooplazmie po wstrzyknięciu (ryc. 3D). Z tego względu należy zachować ostrożność w celu usunięcia błony plazmatycznej DKO-phaESC za pomocą pipetowania. Podczas iniekcji równie ważne jest, aby uniknąć przerwania wrzeciona mejotycznego oocytu, co może prowadzić do defektów segregacji chromosomów i indukować aneuploidię.
U ssaków imprinting genomowy ogranicza zastosowanie phaESC jako zamiennika plemników. Partenogenetyczne haESC posiadają matczyną konfigurację odcisków genomowych, podczas gdy plemniki mają konfigurację ojcowską. W związku z tym nie doszło do powstania donoszonych młodych po wstrzyknięciu phaESC typu dzikiego w celu zastąpienia plemników. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, delecje IG- i H19-DMR są projektowane w phaESC. Modyfikacja ekspresji wdrukowanej w matczynych loci Igf2-H19 i Gtl2-Dlk1 jest wystarczająca do zmiany konfiguracji odcisków genomowych, aby umożliwić generowanie częściowo sklonowanych myszy z częstością ponad 5,1%, w oparciu o przeniesione zarodki 2-komórkowe. Obserwacje te sugerują, że celowanie w dwa wdrukowane geny przełącza genom phaESC w funkcjonalną konfigurację ojcowską, która może zastąpić plemniki u myszy. Niemniej jednak dla tej strategii wymagana jest trwała modyfikacja genetyczna phaESC. Jako alternatywną strategię można rozważyć androgenowe haESC. Androgenowe haESC pochodzą z genomu plemnika i posiadają odciski ojcowskie. Istnieją doniesienia, że androgenetyczne komórki hematogenetyczne typu dzikiego przyczyniły się do wymiany plemników w celu uzyskania donoszonych młodych z częstością od 1,3% do 1,9% przeniesionych zarodków 4,7,24. Urodzone o czasie młode uzyskano również poprzez wstrzyknięcie androgenowych haESC z delecjami IG i H19-DMR z częstością 20,2% przenoszonych zarodków dwukomórkowych24. Zwiększona skuteczność półklonowania przy użyciu zmodyfikowanych androgenowych haESC jest prawdopodobnie spowodowana tym, że odciski mogą stać się niestabilne w hodowli. Wady imprintingu są korygowane przez delecje genetyczne krytycznych DMR.
Biorąc pod uwagę trudności we wprowadzaniu modyfikacji genetycznych bezpośrednio do genomów oocytów lub plemników, hemESC są cennym narzędziem do oddzielnego manipulowania genomami rodzicielskimi. Stosowanie haESC jako substytutu plemników zapewnia niezwykłą przewagę w edycji genomu w linii rozrodczej myszy. Niedawne badanie połączyło edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 z zastosowaniem haESC do charakterystyki regionów imprintingu, które mają kluczowe znaczenie dla rozwoju embrionalnego12. W badaniu tym przeanalizowano rolę Rasgrf1-DMR w połączeniu z H19- i IG-DMR w rozwoju myszy dwumatczynych oraz funkcję 7 różnych DMR w rozwoju myszy dwuojcowskich. Metoda podstawiania plemników za hemESC stanowiła podstawę genetycznych metod przesiewowych w celu identyfikacji kluczowych aminokwasów w białku DND1 w rozwoju pierwotnych komórek rozrodczych oraz identyfikacji genów w rozwoju kości 24,25,26. Badania nad imprintingiem genomowym i genetycznymi badaniami przesiewowymi w celu zidentyfikowania kluczowych czynników rozwoju embrionalnego są znaczącymi podejściami do zastosowania haESC jako genomów gametycznych.

U ssaków gamety są jedynymi komórkami, które przekazują informacje genetyczne następnemu pokoleniu. Fuzja oocytu i plemnika tworzy diploidalną zygotę, która rozwija się w dorosłe zwierzę. Mutacje w genomach gametycznych są w ten sposób dziedziczone przez potomstwo i napędzają zmienność genetyczną w species1. Wprowadzenie mutacji w linii zarodkowej zostało zastosowane do produkcji genetycznie zmodyfikowanych zwierząt do różnych badań biologicznych, w tym do charakterystyki funkcji genów i modelowania chorób. Zarówno oocyty, jak i plemniki są terminalnie zróżnicowanymi i wysoce wyspecjalizowanymi komórkami, które przestały się namnażać. Dlatego bezpośrednia modyfikacja gamet jest technicznie trudna i opracowano specjalistyczne podejścia. Modyfikacje genetyczne można wprowadzić do linii rozrodczej myszy poprzez wstrzyknięcie genetycznie zmodyfikowanych ESC do blastocyst, gdzie integrują się z rozwijającym się zarodkiem i kolonizują linię zarodkową. Dodatkowo, genetyczna modyfikacja zygot przy użyciu metod edycji genomu, w tym systemu CRISPR/Cas9, stała się powszechnie stosowana2.
Ostatnio opisano znakomite podejście, które stosuje haESC jako substytut genomu gametycznego3,4,5,6,7,8. HaESC to linie komórek macierzystych wywodzące się z wewnętrznej masy komórkowej stadnocyst haploidalnych partenogenetycznych lub androgenetycznych i posiadają pojedynczy zestaw chromosomów4,7,9,10. Wykazano, że zarówno partenogenetyczne, jak i androgenetyczne haESC mogą przyczyniać się do genomu częściowo sklonowanych myszy po docytoplazmatycznym wstrzyknięciu do oocytów. W przeciwieństwie do innych podejść, genomy haESC mogą być bezpośrednio modyfikowane w hodowli ze względu na ich zdolność do samoodnawiania się. Wprowadzanie modyfikacji genetycznych do linii zarodkowej poprzez zastąpienie plemników hemokomórkami jest ważną metodą badań biologicznych. Daje ona możliwość oddzielnej hodowli i manipulowania genomem matki lub ojca, które pochodzą odpowiednio z partenogenetycznych lub androgenowych komórek macierzystych. HaESC mogą być następnie wykorzystywane jako zamiennik genomu gametycznego, co jest szczególnie korzystne w badaniach nad imprintingiem genomowym, ekspresją specyficzną dla alleli i procesami specyficznymi dla rodziców.
U myszy zarówno informacje genomowe matki, jak i ojca są niezbędne do prawidłowego rozwoju zarodka11. W związku z tym nie można było uzyskać donoszonych młodych, gdy wstrzyknięto partenogenetyczne hemesc (phaESC) typu dzikiego w celu zastąpienia genomu plemnika5,8. Aby przezwyciężyć blokadę rozwojową, genomowe imprinting matczynego genomu partenogenetycznych komórek macierzystych musi zostać skorygowany do konfiguracji ojcowskiej. Można to osiągnąć poprzez manipulację regionami zróżnicowanie metylowanymi (DMR). Do tej pory badano celowe delecje H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR i Rasgrf1-DMR w celu tłumienia genów wyrażanych matczyno w phaESCs3,5,8,12. Badania te wykazały, że delecje zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR są wystarczające do przekształcenia konfiguracji odcisku matczynego w ojcowską, która może zastąpić chromosomy plemników. Docytoplazmatyczne wstrzyknięcie phaESC, które przenoszą dwie delecje DMR do oocytów, dało częściowo sklonowane młode z częstością od 5,1% do 15,5% przeniesionych zarodków dwukomórkowych.
Ten protokół opiera się na zastosowaniu phaESC z delecjami zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR, które nazywamy phaESC z podwójnym nokautem (DKO-phaESC). Udostępniamy szczegółowe instrukcje dotyczące modyfikacji imprintingu genomowego w phaESC w celu ustanowienia linii DKO-phaESC, wstrzykiwania DKO-phaESC do oocytów jako substytutu genomu plemnika, hodowli częściowo sklonowanych zarodków do blastocyst oraz uzyskiwania częściowo sklonowanych myszy. Protokół ten jest punktem odniesienia dla badaczy, którzy wymagają precyzyjnej i bezpośredniej manipulacji ojcowskiego genomu i generowania częściowo sklonowanych zarodków i myszy.

<table><tbody><tr><td>1,5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haPosiew ESC</td></tr><tr><td>15 ml Probówka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>posiew haESC</td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>Termo Nauka Kultura haESC</td></tr><tr>Płytka<td>24-dołkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Płytka</td></tr><tr><td>6-dołkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>kultura haESC</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>kultura haESC</td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Kultura haESC</td><td>Merck</td><td>M6250</td></tr><tr><td>Frakcja BSA</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haKultura ESC</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC</td></tr><tr><td>Roztwór demekolcyny</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>kultura haESC</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>kultura haESC</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>kultura haESC</td></tr><tr><td>mysz DR4 Laboratorium</td><td>Jacksona</td><td>3208</td><td>haKultura ESC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haKultura ESC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haKultura ESC</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td>zamrażająca amsbio</td><td>11897</td><td>haESC kultura</td></tr><tr><td>żelatyna</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haPosiew</td></tr><tr><td>ESC Roztwór Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haPosiew ESC</td></tr><tr><td>Napromieniowany MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haPosiew ESC</td></tr><tr><td>LIF (czynnik hamujący białaczkę)</td> <td>(domowej)</td> <td>-</td><td>haKultura ESC</td></tr><tr><td>Odczynnik Lipofection</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>kultura</td></tr> <tr>haESC<td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>kultura haESC</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>hodowla haESC</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>hodowla haESC</td></tr><tr><td>piggyBac plazmid przenoszący transgen CAG-EGFP</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>hodowla haESC</td></tr><tr><td>piggyTranspozaza plazmidowa</td><td>System nauk biologicznych</td><td>PB210PA-1</td><td>hodowla</td></tr> <tr>haESC<td>pX330 plazmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC hodowla</td></tr><tr><td>plazmidu pX458</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC kultura</td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC</td></tr><tr><td>kultura polimeraza DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>etanolu</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotypowanie</td></tr><tr><td>5 ml probówka</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>5 ml Probówka z nasadką sitka komórkowego</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superowulacja</td></tr><tr><td>30-głośna igła 1/2 cala</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superowulacja</td></tr><tr><td>B6D2F1 mysz</td><td>Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superowulacja</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD zdrowie zwierząt</td><td>49451</td><td>Superowulacja</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superowulacja</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 j.m</td>. <td>Miska Superowulacja</td></tr><tr><td>10 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>4-dołkowa płytka</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>Probówka 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>Naczynie 6 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Manipulacja</td></tr> <tr>zarodkami<td>Miska z dołkiem centralnym</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>Cyfrowy bujak</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Manipulacja zarodków</td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>M16 średni</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>M2 średni</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Manipulacja zarodków</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>Szklana kapilara</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td></td><td>Stereoskop Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>Chlorek strontu</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Manipulacja zarodkami</td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Mikroiniekcja</td></tr><tr><td>Kapsułka ze szkła borokrzemianowego</td><td>Produkt naukowy</td><td>GB100T-8P</td><td>Mikroiniekcja</td></tr><tr><td>CellTram 4r Olej</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Mikroiniekcja</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td> Pipeta do <td>mikroiniekcji</td></tr><tr><td></td><td>Instrumenty biomedyczne-Mikroiniekcja</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Mikroiniekcja</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Mikroiniekcja</td></tr><tr><td>Pipeta do mikroiniekcji</td><td>Instrumenty biomedyczne-Końcówki</td><td></td> do <td>mikroiniekcji</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Mikroiniekcja</td></tr><tr><td>Ramiona mikromanipulacyjne</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td> Ściągacz do <td>mikropipet do mikroiniekcji</td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Mikroiniekcja</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Mikroiniekcja</td></tr><tr><td>PVP (poliwinylopirolidyna)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td> do mikroiniekcji <td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Mikroiniekcja</td></tr></tbody></table>

zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

W organizmach z rozmnażaniem płciowym, komórki rozrodcze są źródłem komórek totipotencjalnych, które rozwijają się w nowe osobniki. U myszy zapłodnienie oocytu przez plemnik tworzy totipotencjalną zygotę. Ostatnio w kilku publikacjach doniesiono, że haploidalne embrionalne komórki macierzyste (haESC) mogą być substytutem genomów gametycznych i przyczyniać się do powstawania zarodków, które rozwijają się w myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania partenogenetycznych haESC jako substytutu plemników do budowy zarodków poprzez docytoplazmatyczne wstrzyknięcie do oocytów. Protokół ten składa się z etapów przygotowania komórek haESC do wymiany plemników, wstrzyknięcia chromosomów haESC do oocytów oraz hodowli częściowo sklonowanych zarodków. Zarodki mogą dać płodne, częściowo sklonowane myszy po transferze zarodków. Wykorzystanie haESC jako zamiennika plemnika ułatwia edycję genomu w linii zarodkowej, badania rozwoju embrionalnego i badanie imprintingu genomowego.

Ten artykuł ma na celu pokazanie użycia partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych jako substytutu plemników do budowy półklonowanych embrionów.

Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Protokół ten fałszywie datuje modyfikację imprintingu genomowego w haploidalnych embrionalnych komórkach macierzystych myszy, jako spowodowaną przez fałszywe plemniki, umożliwiające generowanie domowych zarodków u myszy. Modyfikacja genetyczna gamet na ogół wymaga trudnych technik. Korzystając z tej metodologii, gamety rodzicielskie mogą być manipulowane w hybrydowych embrionalnych komórkach macierzystych w celu późniejszego wprowadzenia do myszy, jako opcja wymiany plemników.Ponieważ metoda ta umożliwia naszą sztuczną specyficzną modyfikację ojcowskiej gamety w zarodkach, jest ona szczególnie przydatna do badania imprintingu i kauteryzacji genomu. Tę procedurę zademonstruje Charles Etienne Dumeau, embriolog myszy z mojego laboratorium. Aby przygotować pipety podtrzymujące i mikroiniekcyjne do eksperymentu, najpierw za pomocą ściągacza do mikropipet wyciągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego o wydłużonym kształcie i stopniowym zwężaniu się.Aby przygotować pipety podtrzymujące, umieść wyciągniętą kapilarnę o średnicy zewnętrznej od 60 do 100 mikrometrów w mikrokuźni nad szklanym koralikiem na żarniku. Włącz filament i opuść kapilarę, aż zetknie się ze koralikiem. Gdy kapilara przyczepi się do koralika, wyłącz filament i cofnij kapilarę, powodując pęknięcie kapilary prostym końcem.Następnie umieść złamaną końcówkę kapilarną poziomo obok szklanego koralika na żarniku i podgrzej żarnik, aby stopić koniec, aż wewnętrzna średnica końcówki kapilarnej osiągnie średnicę od 10 do 20 mikrometrów. Następnie umieść kapilarnę nad szklanym koralikiem około jednego milimetra od końcówki i podgrzej włókno, aby umożliwić zgięcie kapilary pod kątem 20 stopni. Aby przygotować pipetę do mikroiniekcji, umieść wyciągniętą kapilarnę o średnicy zewnętrznej około sześciu mikrometrów nad szklanym koralikiem na podgrzanym włóknie i opuść kapilarę, aż zetknie się ze kulką.Po przyczepieniu kapilary wyłącz żarnik i wsuń kapilarę. Kapilara pęknie prostym końcem. Następnie przesuń kapilarnę nad szklanym koralikiem około jednego milimetra od końcówki kapilary i podgrzej włókno, aby umożliwić zgięcie kapilary pod kątem 20 stopni.Aby wykonać wstrzyknięcie docytoplazmatyczne, umieść pięć mikrolitrowych kropli roztworu PVP i 20 mikrolitrowych kropli pożywki M2 na odwróconej pokrywie 10-centymetrowego naczynia i przykryj krople olejem mineralnym. Umieść naczynie na stoliku i zainstaluj pipetę przytrzymującą na mikromanipulatorze. Za pomocą końcówki do mikropodajnika napełnij pipetę do mikroiniekcji olejem fluorowęglowym i zamontuj pipetę na siłowniku piezoelektrycznym.Obserwując przez mikroskop, opuść pipetę do mikroiniekcji do kropli roztworu PVP. Gdy pipeta jest zanurzona, należy kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby pokryć szkło PVP. Załaduj niewielką objętość roztworu PVP do pipety do mikroiniekcji.Zanurz pipety do mikroiniekcji i przytrzymywania w podłożu M2 i skup się na pipecie znajdującej się na dnie kropli. Przenieś około dwóch mikrolitrów podwójnie nokautującej zawiesiny partogenicznych komórek ES do kropli pożywki M2 i użyj pipety doustnej, aby przenieść 10 oocytów M2 do tej samej kropli. Obrócić jeden oocyt i zastosować podciśnienie przez pipetę przytrzymującą, aby przytrzymać oocyt tak, aby przestrzeń okołojajowa była skierowana w stronę pipety do mikroiniekcji, uważając, aby płytka metafazy drugiej nie znajdowała się na drodze pipety do mikroiniekcji.Narysuj jedną podwójnie nokautującą partogenną komórkę ES do końcówki pipety do mikroiniekcji i potwierdź pęknięcie błony komórkowej. Zastosuj lekkie podciśnienie do pipety do mikroiniekcji i dostarcz cztery impulsy piezoelektryczne, jednocześnie popychając końcówkę pipety do mikroiniekcji w kierunku przestrzeni okołoitelinowej, aby przebić się przez osłonkę przejrzystą. Wbić się do oocytu pipetą do mikroiniekcji, tak aby oolemma rozciągnęła się na przeciwną stronę i zastosować jeden impuls piezoelektryczny, aby przebić oolemmę, upewniając się, że oolemma rozluźnia się wzdłuż trzonu pipety do mikroiniekcji.Wstrzyknąć do ooplazmy podwójnie nokautującą partogenną komórkę ES z minimalną objętością pożywki i płynnie wyjąć pipetę do mikroiniekcji z oocytu. Uwolnij wstrzyknięty oocyt z pipety podtrzymującej i przesuń go na bok mikrokropli w celu późniejszego pobrania. Po wstrzyknięciu wszystkich oocytów przenieś oocyty do wstępnie podgrzanego naczynia ze studzienką środkową zawierającego pożywkę KSOM i inkubuj szalkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę przed aktywacją.Analiza zawartości DNA tej reprezentatywnej partogenicznej linii komórkowej ES z podwójnym nokautem, przenoszącej transgen CAG / EGFP za pomocą cytometrii przepływowej, ilustruje rozmieszczenie komórek haploidalnych i diploidalnych w fazach G0, G1, S i G2 M. Genotypowanie można przeprowadzić w celu potwierdzenia braku alleli typu dzikiego w regionach H19 i międzygenowych różnicowo metylowanych. Transgen CAG/EGFP można wprowadzić do patogennych komórek ES z podwójnym nokautem w celu zbadania ich udziału w częściowo sklonowanych zarodkach poprzez wizualizację zielonej fluorescencji pod mikroskopem.Analiza cytometrii przepływowej pokazuje dwie populacje odpowiadające fazie G2 M zatrzymane komórki haploidalne i diploidalne po leczeniu demukulcenem. Brak haploidalnego piku 1N wskazuje, że cykl spoczynku komórki był w dużej mierze zakończony. Po wstrzyknięciu ekspresja EGFP jest rzadko wykrywana w skonstruowanych częściowo sklonowanych zarodkach.gdy cytoplazma podwójnie nokautujących partogennych komórek ES rozprasza się w dużej cytoplazmie oocytu. Sześć godzin po aktywacji można zaobserwować pod mikroskopem do trzech ciał polarnych. Pierwsze i drugie ciało biegunowe oocytu i jedno ciało pseudopolarne z haploidalnego ESC.Aby zademonstrować ich kompetencje rozwojowe, częściowo sklonowane zarodki mogą być hodowane do stadium blastocytów. Co więcej, urodzone o czasie samice myszy można uzyskać z częściowo sklonowanych zarodków w stadium dwukomórkowym przeniesionych do jajowodów samic biorcy. Podczas mikroiniekcji ważne jest, aby przerwać błonę plazmatyczną haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych, ponieważ zapobiega ona segregacji chromosomów, gdy oocyt jest aktywowany.Zamiast partenogenetycznych haploidalnych komórek ES można również stosować androgenne haploidalne komórki ES, co pozwala na wybór gamety matczynej lub ojcowskiej jako zamiennika nasienia w zależności od celu badania.

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Opisano protokoły transplantacji komórek linii płciowej oraz ksenoprzeszczepów tkanki jądra. Transplantacja komórek linii płciowej prowadzi do spermatogenezy pochodzącej od dawcy w jądrach biorcy i stanowi funkcjonalny test rekonstytucji służący do identyfikacji komórek macierzystych spermatogoniów (SSCs). Ksenoprzeszczepy tkanki jądra odtwarzają rozwój jądra oraz spermatogenezę różnych gatunków dawców u myszy biorców.

Transplantacja komórek linii zarodkowej i ksenoprzeszczepy tkanki jądra u myszy

W niniejszej pracy prezentujemy nowo opracowany zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy. Dzięki zastosowaniu tego zestawu konsekwentnie poprawiono rozwój embrionów w stadium dwóchkomórkowym po rozmrożeniu plemników w 5 szczepach myszy. W okresie 1,5 roku zarchiwizowano 49 genetycznie zmodyfikowanych linii myszy poprzez krio konserwację plemników za pomocą zestawu I•Cryo, a następnie pomyślnie odzyskano je metodą IVF.

Kriokonserwacja i odzyskiwanie plemników myszy przy użyciu zestawu I·Cryo

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Tutaj prezentujemy protokół zwiększający produkcję chimer bez użycia nowego sprzętu. Prosta zmiana orientacji zarodka do wstrzyknięcia może zwiększyć liczbę produkowanych zarodków i potencjalnie skrócić czas do transmisji w linii zarodkowej.

Wstrzyknięcie masy komórkowej trans-wewnętrznej embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do wyższych wskaźników chimeryzmu

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Przedstawiona metoda manipulacji szyjką macicy może wywołać pseudociążę u myszy bez potrzeby rozmnażania samic z samcami po wazektomii. Indukcja ciąży rzekomej jest niezbędna do powodzenia niechirurgicznego transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia, które również zostały przedstawione.

Wywoływanie ciąży rzekomej u samic myszy bez konieczności wazektomii samców przed niechirurgicznym transferem zarodków lub sztucznym zapłodnieniem

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Poznaj metodę wykorzystania partenogenetycznych haploidalnych komórek macierzystych myszy jako zamiennika plemników do tworzenia półklonowanych embrionów. Technika ta umożliwia badanie genomicznego imprintingu w biologii rozrodu.

Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Przeglądaj więcej filmów