Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Protokół ten fałszywie datuje modyfikację imprintingu genomowego w haploidalnych embrionalnych komórkach macierzystych myszy, jako spowodowaną przez fałszywe plemniki, umożliwiające generowanie domowych zarodków u myszy. Modyfikacja genetyczna gamet na ogół wymaga trudnych technik. Korzystając z tej metodologii, gamety rodzicielskie mogą być manipulowane w hybrydowych embrionalnych komórkach macierzystych w celu późniejszego wprowadzenia do myszy, jako opcja wymiany plemników.

Ponieważ metoda ta umożliwia naszą sztuczną specyficzną modyfikację ojcowskiej gamety w zarodkach, jest ona szczególnie przydatna do badania imprintingu i kauteryzacji genomu. Tę procedurę zademonstruje Charles Etienne Dumeau, embriolog myszy z mojego laboratorium. Aby przygotować pipety podtrzymujące i mikroiniekcyjne do eksperymentu, najpierw za pomocą ściągacza do mikropipet wyciągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego o wydłużonym kształcie i stopniowym zwężaniu się.

Aby przygotować pipety podtrzymujące, umieść wyciągniętą kapilarnę o średnicy zewnętrznej od 60 do 100 mikrometrów w mikrokuźni nad szklanym koralikiem na żarniku. Włącz filament i opuść kapilarę, aż zetknie się ze koralikiem. Gdy kapilara przyczepi się do koralika, wyłącz filament i cofnij kapilarę, powodując pęknięcie kapilary prostym końcem.

Następnie umieść złamaną końcówkę kapilarną poziomo obok szklanego koralika na żarniku i podgrzej żarnik, aby stopić koniec, aż wewnętrzna średnica końcówki kapilarnej osiągnie średnicę od 10 do 20 mikrometrów. Następnie umieść kapilarnę nad szklanym koralikiem około jednego milimetra od końcówki i podgrzej włókno, aby umożliwić zgięcie kapilary pod kątem 20 stopni. Aby przygotować pipetę do mikroiniekcji, umieść wyciągniętą kapilarnę o średnicy zewnętrznej około sześciu mikrometrów nad szklanym koralikiem na podgrzanym włóknie i opuść kapilarę, aż zetknie się ze kulką.

Po przyczepieniu kapilary wyłącz żarnik i wsuń kapilarę. Kapilara pęknie prostym końcem. Następnie przesuń kapilarnę nad szklanym koralikiem około jednego milimetra od końcówki kapilary i podgrzej włókno, aby umożliwić zgięcie kapilary pod kątem 20 stopni.

Aby wykonać wstrzyknięcie docytoplazmatyczne, umieść pięć mikrolitrowych kropli roztworu PVP i 20 mikrolitrowych kropli pożywki M2 na odwróconej pokrywie 10-centymetrowego naczynia i przykryj krople olejem mineralnym. Umieść naczynie na stoliku i zainstaluj pipetę przytrzymującą na mikromanipulatorze. Za pomocą końcówki do mikropodajnika napełnij pipetę do mikroiniekcji olejem fluorowęglowym i zamontuj pipetę na siłowniku piezoelektrycznym.

Obserwując przez mikroskop, opuść pipetę do mikroiniekcji do kropli roztworu PVP. Gdy pipeta jest zanurzona, należy kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby pokryć szkło PVP. Załaduj niewielką objętość roztworu PVP do pipety do mikroiniekcji.

Zanurz pipety do mikroiniekcji i przytrzymywania w podłożu M2 i skup się na pipecie znajdującej się na dnie kropli. Przenieś około dwóch mikrolitrów podwójnie nokautującej zawiesiny partogenicznych komórek ES do kropli pożywki M2 i użyj pipety doustnej, aby przenieść 10 oocytów M2 do tej samej kropli. Obrócić jeden oocyt i zastosować podciśnienie przez pipetę przytrzymującą, aby przytrzymać oocyt tak, aby przestrzeń okołojajowa była skierowana w stronę pipety do mikroiniekcji, uważając, aby płytka metafazy drugiej nie znajdowała się na drodze pipety do mikroiniekcji.

Narysuj jedną podwójnie nokautującą partogenną komórkę ES do końcówki pipety do mikroiniekcji i potwierdź pęknięcie błony komórkowej. Zastosuj lekkie podciśnienie do pipety do mikroiniekcji i dostarcz cztery impulsy piezoelektryczne, jednocześnie popychając końcówkę pipety do mikroiniekcji w kierunku przestrzeni okołoitelinowej, aby przebić się przez osłonkę przejrzystą. Wbić się do oocytu pipetą do mikroiniekcji, tak aby oolemma rozciągnęła się na przeciwną stronę i zastosować jeden impuls piezoelektryczny, aby przebić oolemmę, upewniając się, że oolemma rozluźnia się wzdłuż trzonu pipety do mikroiniekcji.

Wstrzyknąć do ooplazmy podwójnie nokautującą partogenną komórkę ES z minimalną objętością pożywki i płynnie wyjąć pipetę do mikroiniekcji z oocytu. Uwolnij wstrzyknięty oocyt z pipety podtrzymującej i przesuń go na bok mikrokropli w celu późniejszego pobrania. Po wstrzyknięciu wszystkich oocytów przenieś oocyty do wstępnie podgrzanego naczynia ze studzienką środkową zawierającego pożywkę KSOM i inkubuj szalkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę przed aktywacją.

Analiza zawartości DNA tej reprezentatywnej partogenicznej linii komórkowej ES z podwójnym nokautem, przenoszącej transgen CAG / EGFP za pomocą cytometrii przepływowej, ilustruje rozmieszczenie komórek haploidalnych i diploidalnych w fazach G0, G1, S i G2 M. Genotypowanie można przeprowadzić w celu potwierdzenia braku alleli typu dzikiego w regionach H19 i międzygenowych różnicowo metylowanych. Transgen CAG/EGFP można wprowadzić do patogennych komórek ES z podwójnym nokautem w celu zbadania ich udziału w częściowo sklonowanych zarodkach poprzez wizualizację zielonej fluorescencji pod mikroskopem.

Analiza cytometrii przepływowej pokazuje dwie populacje odpowiadające fazie G2 M zatrzymane komórki haploidalne i diploidalne po leczeniu demukulcenem. Brak haploidalnego piku 1N wskazuje, że cykl spoczynku komórki był w dużej mierze zakończony. Po wstrzyknięciu ekspresja EGFP jest rzadko wykrywana w skonstruowanych częściowo sklonowanych zarodkach.

gdy cytoplazma podwójnie nokautujących partogennych komórek ES rozprasza się w dużej cytoplazmie oocytu. Sześć godzin po aktywacji można zaobserwować pod mikroskopem do trzech ciał polarnych. Pierwsze i drugie ciało biegunowe oocytu i jedno ciało pseudopolarne z haploidalnego ESC.

Aby zademonstrować ich kompetencje rozwojowe, częściowo sklonowane zarodki mogą być hodowane do stadium blastocytów. Co więcej, urodzone o czasie samice myszy można uzyskać z częściowo sklonowanych zarodków w stadium dwukomórkowym przeniesionych do jajowodów samic biorcy. Podczas mikroiniekcji ważne jest, aby przerwać błonę plazmatyczną haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych, ponieważ zapobiega ona segregacji chromosomów, gdy oocyt jest aktywowany.

Zamiast partenogenetycznych haploidalnych komórek ES można również stosować androgenne haploidalne komórki ES, co pozwala na wybór gamety matczynej lub ojcowskiej jako zamiennika nasienia w zależności od celu badania.