Name: Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj edycję genomu CRISPR/Cas9 w C. elegans przy użyciu markerów Co-CRISPR i kompleksów rybonukleoproteinowych. Ta metoda umożliwia szybkie wprowadzanie precyzyjnych mutacji i identyfikację edytowanych organizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze start-upowe Uniwersytetu w Tulsie (TU) oraz Letnie Stypendium Rozwoju Wydziału TU przyznane Jyoti Iyer. Chcielibyśmy podziękować Chemistry Summer Undergraduate Research Program (CSURP) oraz Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) za przyznanie stypendiów studentom zaangażowanym w to badanie. Chcielibyśmy podziękować Pani Caroline Dunn za jej pomoc techniczną. Na koniec chcielibyśmy podziękować doktorom Jordanowi Wardowi, Aimee Jaramillo-Lambert, Annie Allen, Robertowi Sheaffowi, Williamowi Potterowi i Saili Moghe za ich krytyczne komentarze na temat tego manuskryptu.

Ten protokół edycji genomu CRISPR/Cas9 został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu w Tulsie zgodnie z wytycznymi NIH. W całym tym protokole praktykowana była technika sterylna. Wszystkie etapy tego protokołu zostały przeprowadzone przy użyciu odczynników, które były wolne od nukleaz. Szczególną ostrożność podjęto w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu RNazą, np. rękawice do czyszczenia, a także miejsca pracy i sprzęt (np. pipety, zewnętrzna strona szkła itp.) roztworem odkażającym RNazę.
1. projekt crRNA
<ol>
	<li>Znajdź PAM, który umożliwia Cas9 cięcie najbliżej miejsca edycji.
	<ol>
		<li>Stanowisko PAM to 5'-NGG-3'.</li>
		<li>Pamiętaj, że PAM może znajdować się na dowolnej nici DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz 20 pz na końcu 5' PAM jako sekwencję crRNA. 
	UWAGA: Rzeczywista sekwencja crRNA, która jest syntetyzowana przez firmy komercyjne, jest dłuższa niż 20 pz, ponieważ ma dodatkową sekwencję generyczną, która jest automatycznie dodawana do docelowej sekwencji crRNA 20 pz przez firmę syntetyzującą. Jeśli chodzi o efekty niezamierzone, ostatnie badania nie wykazały niezamierzonych skutków Cas9 u C. elegans36,37,38,39,40. Co więcej, powstałe szczepy edytowane przez CRISPR są krzyżowane. W związku z tym nie jesteśmy zbytnio zaniepokojeni niecelowymi efektami zaprojektowanych crRNA. Jednak strony internetowe, w tym http://genome.sfu.ca/crispr/ i http://crispor.tefor.net/, mogą być używane do wyszukiwania i wybierania crRNA o najmniejszych efektach niedocelowych38,41. Przewiduje się, że crRNA, które kończą się literą G lub GG oraz te o zawartości GC większej niż 50%, będą bardziej wydajne19,23,42.</li>
	<li>Zamów co najmniej 10 nmol crRNA w firmie (np. IDT, Horizon Discovery itp.).
	<ol>
		<li>Po dotarciu liofilizowanego crRNA należy go przechowywać w temperaturze -30°C do dnia mikroiniekcji.</li>
		<li>W dniu wykonania mikroiniekcji należy wirować liofilizowany crRNA z maksymalną prędkością (17 000 x g) przez jedną minutę i ponownie zawiesić go w 5 mM Tris-Cl (pH 7,4), aby uzyskać 8 μg/μL zapasu crRNA.</li>
		<li>Niewykorzystany zapas crRNA przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Napraw projekt szablonu
<ol>
	<li>Pobierz oprogramowanie do manipulacji sekwencjami (np. przeglądarkę sekwencji CLC, APE, SNAPGENE, VECTOR NTI itp.). Używamy przeglądarki sekwencji CLC w wersji 8.0 (Qiagen), ponieważ jest przyjazna dla użytkownika i można ją pobrać za darmo.</li>
	<li>Wklej sekwencję docelowego DNA do przeglądarki sekwencji.</li>
	<li>Orientacja szablonu naprawy wpływa na wydajność edycji28. Aby wprowadzić sekwencję naprawczą do końca 5' PAM, zaprojektuj jednoniciową matrycę naprawczą z sekwencją DNA z tej samej nici DNA, na której znajduje się sekwencja PAM (nić protospacerowa)28. Podczas gdy w celu wstawienia sekwencji naprawczej do końca 3' PAM, zaprojektuj jednoniciową matrycę naprawczą z sekwencją DNA z nici DNA, która nie zawiera sekwencji PAM (nici dystansowej)28.</li>
	<li>Wybierz 35 par zasad sekwencji z nieprzerwaną homologią po obu stronach (na końcu 5' i 3') edycji.</li>
	<li>Zmutuj lub usuń PAM, aby zapobiec przecięciu matrycy naprawczej lub edytowanego genomowego DNA przez Cas9.
	<ol>
		<li>Jeśli mutacja PAM nie jest możliwa, wprowadź kilka cichych mutacji w pobliżu końca 5' PAM, aby zapobiec przecięciu matrycy naprawczej lub edytowanego genomowego DNA.</li>
		<li>Upewnij się, że wprowadzasz ciche mutacje PAM tylko wtedy, gdy jest on obecny w regionie egzonicznym.</li>
		<li>Sprawdź częstotliwość użycia kodonu, aby upewnić się, że zmutowany kodon jest wprowadzany z częstotliwością porównywalną z oryginalnym niezmutowanym kodonem (np. https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). W niektórych przypadkach wprowadzenie zmutowanego kodonu z podobną częstotliwością do niezmutowanego kodonu może nie być możliwe. Jednak w przypadku mutacji kilku aminokwasów nie spodziewamy się, że poziom ekspresji zmutowanego białka ulegnie znaczącej zmianie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli edycja jest mała (np. mutacja kilku zasad), wprowadź unikalne miejsce ograniczenia w pobliżu edycji przez cichą mutagenezę. Używamy http://heimanlab.com/cut2.html do znajdowania miejsc ograniczających, które mogą zostać wprowadzone przez mutagenezę cichą.
	<ol>
		<li>Sprawdź częstotliwość użycia kodonu, aby upewnić się, że zmutowany kodon jest wprowadzany z częstotliwością porównywalną z oryginalnym niezmutowanym kodonem. Jak wspomniano powyżej, nie zawsze jest to możliwe. Jednak w przypadku eksperymentów obejmujących mutacje kilku aminokwasów nie spodziewamy się, że poziom ekspresji zmutowanego białka ulegnie znaczącej zmianie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsyntetyzuj i kup liniowe jednoniciowe szablony naprawcze dla HDR jako oligonukleotydów ultramerów 4 nmol.</li>
	<li>Zawiesić liofilizowaną matrycę naprawczą oligonukleotydów w wodzie wolnej od nukleaz, aby uzyskać zapas 1 μg/μl matrycy naprawczej i przechowywać ją w temperaturze -30 °C do dalszego użycia.</li>
</ol>
3. Projekt podkładu przesiewowego
<ol>
	<li>Korzystając z przeglądarki sekwencji CLC lub innych podobnych aplikacji, zaprojektuj od 20 do 23 par zasad do przodu i do tyłu po obu stronach edycji, tak aby wytwarzały pasmo od 400 do 600 par zasad po amplifikacji PCR.
	<ol>
		<li>W przypadku większych wstawek, które mają rozmiar kilku kilozasad, zaprojektuj przednią spłonkę tak, aby znajdowała się tuż poza lewym ramieniem homologii szablonu naprawczego. Zaprojektuj odwrócony podkład tak, aby znajdował się w samym szablonie naprawy. W takim przypadku produkt PCR zostanie uzyskany tylko w przypadku pozytywnie edytowanych robaków.</li>
		<li>Aby zidentyfikować homozygotyczne robaki edytowane dla dłuższych insercji, amplifikuj cały obszar insercji, projektując startery do przodu i do tyłu, które znajdują się poza połączeniami insercji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetestuj startery i zoptymalizuj warunki PCR za pomocą genomowego DNA typu dzikiego przed użyciem starterów do genotypowania.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że po amplifikacji PCR genomowego DNA powstaje pojedyncze prążki o oczekiwanej wielkości (w stosownych przypadkach).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie młodych dorosłych robaków do wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Zebrać L2-L3 stadium C. elegans na świeży trawnik bakteryjny na płytce MYOB i inkubować w temperaturze 20 °C przez noc. 
	UWAGA: Protokół wykonania płytek MYOB znajduje się tutaj: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/</li>
	<li>W dniu mikroiniekcji należy pobrać młode dorosłe robaki z mniej niż 10 zarodkami w macicy do wstrzyknięcia.</li>
</ol>
5. Przygotowanie mieszanki iniekcyjnej
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań w tej samej kolejności, jak pokazano w Tabeli 1, w sterylnych probówkach wolnych od nukleaz. 
	UWAGA: Składniki mieszanki iniekcyjnej można zmniejszyć do uzyskania 5 μl mieszanek iniekcyjnej (zamiast 20 μl), jeśli nie przewiduje się przyszłych wstrzyknięć z tą mieszanką.</li>
	<li>Wymieszać mieszaninę do wstrzykiwań, pipetując.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę do wstrzykiwań w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu złożenia kompleksów rybonukleoproteinowych.</li>
	<li>Mieszać mieszankę do wstrzykiwań w temperaturze 4 °C przy 17 000 x g przez 5 minut.</li>
</ol>
6. Mikroiniekcja do gonady C. elegans 
<ol>
	<li>Wykonaj mikroiniekcję mieszanki iniekcyjnej CRISPR do gonady C. elegans, zgodnie z opisem w Iyer et al. 201943.
	<ol>
		<li>Wstrzyknij około 30 robaków za pomocą mieszanki iniekcyjnej CRISPR. Niewykorzystana mieszanka iniekcyjna może być ponownie użyta, przechowując ją w temperaturze 4°C przez okres około 6 miesięcy bez utraty wydajności49.</li>
		<li>Jeśli to możliwe, wstrzyknąć oba ramiona gonad. Wstrzyknięte robaki są uważane za pokolenie P0.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Odzyskiwanie i transfer iniekcji robaka
<ol>
	<li>Po mikrowstrzyknięciu należy przenieść mikrowstrzyknięte robaki P0 za pomocą kilofa do płytki agarowej MYOB o średnicy 60 mm wysianej OP50 E. coli i pozostawić je do odzyskania w temperaturze pokojowej przez około godzinę.
	<ol>
		<li>Należy pamiętać, że temperatura regeneracji będzie zależeć od genotypu wstrzykniętych robaków. Na przykład w przypadku szczepów wrażliwych na temperaturę może być konieczne odzyskiwanie robaków w innej temperaturze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą platynowego kilofa drucianego przenieść każdego wstrzykniętego robaka na pojedynczą płytkę Petriego z agarem MYOB o średnicy 35 mm i pozostawić do złożenia jaj w temperaturze 20 °C do następnego dnia.
	<ol>
		<li>Należy pamiętać, że niektóre robaki umrą w wyniku urazu spowodowanego zabiegiem mikroiniekcji. Wybieraj tylko te robaki, które są żywe i wykazują ruch.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 24 godzinach należy przenieść wstrzyknięte robaki na nowe pojedyncze płytki (1 robak na płytkę).</li>
</ol>
8. Zbieranie C. elegans do badań przesiewowych
<ol>
	<li>3 do 4 dni w temperaturze 20°C po wykonaniu wstrzyknięcia należy monitorować wszystkie płytki zawierające potomstwo wstrzykniętych robaków za pomocą mikroskopu preparacyjnego.</li>
	<li>Zidentyfikuj płytki, które mają fenotypy potomstwa F1 wykazujące fenotypy wałeczkowe (Rol) i dumpy (Dpy). Fenotyp Dpy to sytuacja, w której robaki wydają się krótsze i grubsze niż robaki kontrolne na tym samym etapie rozwoju (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10). Płytki z robakami Rol i Dpy reprezentują płytki, na których potomstwo F1 zostało pomyślnie edytowane z mutacją dpy-10 (cn64), aby było obecne odpowiednio w stanie heterozygotycznym lub homozygotycznym.</li>
	<li>Wybierz talerze z największą liczbą robaków rolkowych i przysadzistych do przesiewania.</li>
	<li>Wyodrębnij od 50 do 100 robaków F1 Rol z tych płytek na ich indywidualne płytki (1 robak na płytkę) i pozwól im złożyć jaja.
	<ol>
		<li>Pozwolić robakom F1 Rol w stadium L4 na złożenie jaj i wydanie potomstwa (F2) przez 1 do 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Liza pojedynczego robaka i PCR
<ol>
	<li>Po wytwarzaniu F2 przez 1 do 2 dni, przenieść każdą pojedynczą matkę F1 Rol do 2,5 μl buforu do lizy (Tabela 2) z rozcieńczeniem 1:100 20 mg/ml proteinazy K.</li>
	<li>Zamrażać probówki w temperaturze -30 °C przez 20 minut. Robaki mogą być przechowywane na tym etapie przez dłuższy czas do czasu dalszej analizy.</li>
	<li>Przeprowadzić lizę pojedynczego robaka na termocyklerze PCR w następujących warunkach: 60 °C przez 1 godzinę, 95 °C przez 15 minut i utrzymać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj następujące odczynniki bezpośrednio do 2,5 μl zlizowanego robaka zawierającego probówkę PCR: 12,5 μl 2x mieszanki PCR zawierającej dNTP, polimerazę DNA, MgCl2 i barwnik ładujący, 1 μL 10 μM startera do przodu, 1 μL 10 μM startera wstecznego i sterylną wodę do 22,5 μL. Całkowita objętość każdej reakcji PCR wynosi 25 μL. 
	UWAGA: W przypadku przesiewania wielu robaków F1 szybciej i wygodniej jest wykonać mieszankę wzorcową PCR do wielu reakcji i dodać 22,5 μl mieszanki głównej do każdej probówki do lizy.</li>
	<li>Ustaw reakcje PCR na termocyklerze w następujących warunkach: 95 °C przez 1 minutę, 35 cykli po 95 °C przez 15 s, 55 °C przez 15 s (optymalizuj dla każdego zestawu starterów), 72 °C przez 1 minutę (optymalizuj dla każdego docelowego DNA)44. Reakcje utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
10. Trawienie restrykcyjne i elektroforeza w żelu agarozowym
UWAGA: Trawienie restrykcyjne jest konieczne tylko podczas selekcji pod kątem małych zmian (poniżej 50 pz).
<ol>
	<li>Przenieś 10 μl DNA PCR z kroku 9 do nowej probówki.</li>
	<li>Dodać od 2 do 4 jednostek enzymu restrykcyjnego i 1x buforu enzymu restrykcyjnego (1,5 μl 10x buforu reakcyjnego) na 15 μl reakcji.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C (lub w innej temperaturze specyficznej dla enzymu) przez 2 godziny (w przypadku szybko działających enzymów możliwe jest krótsze czasy inkubacji).</li>
	<li>Podgrzewać, dezaktywować trawienie restrykcyjne poprzez ogrzewanie probówek PCR w temperaturze 65 °C (lub innej temperaturze specyficznej dla enzymu) przez 10 do 15 minut.</li>
	<li>Załaduj całą reakcję z każdej probówki PCR do pojedynczego dołka z 1%-2% żelem agarozowym i uruchom żel pod ciśnieniem 110 mA, aż do uzyskania odpowiedniej separacji pasm. 
	UWAGA: Używamy mieszanki PCR, która ma już dołączony barwnik ładujący do wizualizacji podczas pracy na żelu agarozowym. Mieszanka ta nie zakłóca reakcji trawienia restrykcyjnego i dlatego jest wygodna w użyciu do przesiewania wielu robaków jednocześnie.</li>
</ol>
11. Zidentyfikuj pozytywnie edytowane robaki
<ol>
	<li>Wizualizacja żeli agarozowych w świetle UV (dla żeli bromku etydyny), aby wykryć rozmiary prążków DNA. 
	UWAGA: Pozytywnie edytowane robaki będą wyświetlać dodatkowe pasmo DNA w oczekiwanym rozmiarze ze względu na edycję przy użyciu szablonu naprawczego przenoszącego miejsce restrykcji w pożądanym locus w genomie robaka. Oczekuje się, że robaki rolkowe F1 będą heterozygotyczne pod względem edycji i dlatego oczekuje się, że będą wykazywać trzy prążki (jeden niepocięty produkt PCR typu dzikiego i dwa mniejsze fragmenty z edytowanego pociętego produktu PCR). Chociaż rzadko, należy zauważyć, że homozygoty pojawiają się sporadycznie.</li>
	<li>Zachowaj wszystkie oryginalne, pozytywnie edytowane płyty do momentu, gdy obecność edycji zostanie zweryfikowana przez sekwencjonowanie Sangera.</li>
</ol>
12. Homozygozyjna edycja zainteresowania
<ol>
	<li>Wybierz od 8 do 12 wyglądających na dzikie robaki F2 z odpowiednich pozytywnie edytowanych płytek robaków F1 Rol i pozwól im złożyć jaja i wydać potomstwo przez 1 do 2 dni. 
	UWAGA: Ponieważ C. elegans są samozapładniającymi się hermafrodytami, jeśli edytowany allel nie wpływa na żywotność lub rozwój, odsetek oczekiwanych homozygotycznych mutantów powinien wynosić około 25%. Nietoczące się robaki F2 muszą być typu dzikiego dla locus dpy-10. Wybieranie robaków, które nie toczą się, umożliwia generowanie edytowanych robaków, które utraciły mutację dpy-10 (cn64) i mają mutację tylko w interesującym Cię genie.
	<ol>
		<li>Należy zauważyć, że gen dpy-10 jest obecny na chromosomie II. Jeśli twój gen zainteresowania jest powiązany z dpy-10, możesz nie być w stanie łatwo oddzielić mutacji dpy-10 od genu, który Cię interesuje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj kroki od 9 do 11, aby zidentyfikować homozygotyczne linie robaków.</li>
</ol>
13. Potwierdź edycję przez sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Po zidentyfikowaniu homozygotycznych robaków wykonaj lizę i PCR zgodnie z opisem w kroku 9.
	<ol>
		<li>Ustaw co najmniej 3 reakcje PCR dla każdej linii homozygotycznej, która ma zostać zsekwencjonowana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść reakcje PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.</li>
	<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru nanokropli.</li>
	<li>Wyślij próbkę z odpowiednim starterem do przodu do sekwencjonowania Sangera. Upewnij się, że starter do przodu jest zaprojektowany tak, aby był oddalony o co najmniej 50 zasad od edycji, która ma być sekwencjonowana.</li>
	<li>Przeanalizuj wyniki sekwencjonowania za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji, aby potwierdzić obecność edycji.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Użyliśmy powyższego protokołu do edycji kilku genów oprócz rbm-3.2. Nasza skuteczność edycji dla różnych loci, przewodnikowych RNA i matryc naprawczych (jednoniciowych i dwuniciowych) wahała się od 2% do 58% (dane nie pokazane). Zaobserwowana wydajność edycji jest porównywalna z poprzednio zgłaszanymi wydajnościami edycji od 2% do 70% dla tego protokołu27. Odnieśliśmy również sukces w zastosowaniu tej techniki do tworzenia delecji genów. Za pomocą dwóch crRNA zastąpiliśmy gen o długości bliskiej 6 kb sekwencją kodującą białko zielonej fluorescencji (GFP) (dane nie pokazane). W tym eksperymencie stwierdzono, że około 14% analizowanych robaków RolF 1 było dodatnich pod względem delecji genu i zastąpienia go GFP (dane nie pokazane). Wymagane są jednak dodatkowe eksperymenty w celu określenia maksymalnej długości delecji i wymiany genów, które można przeprowadzić przy użyciu tej techniki.
Ta technika może być używana do wykonywania wstawek o długości około 1,6 kb19. Niedawne badanie wykazało, że w przypadku wykonywania insercji o długości ponad 1,6 kb przy użyciu tego protokołu, wygenerowanie dwóch dwuniciowych pęknięć i użycie szablonów naprawczych z dłuższymi ramionami homologicznymi może umożliwić wstawienie znacznie większych fragmentów DNA (~10 Kb)28. Alternatywnie, można wykonać wiele rund edycji genów za pomocą tego protokołu, aby wygenerować większe edycje. Inne protokoły edycji genów CRISPR/Cas9 oparte na plazmidach C. elegans mogą być również przyjęte do eksperymentów CRISPR obejmujących insercję fragmentów DNA większych niż 1,6 kb 46,47,48.
Przed zastosowaniem tego protokołu do edycji genów konieczne jest upewnienie się, że gen będący przedmiotem zainteresowania nie jest połączony z locus dpy-10 na chromosomie II. W przypadku, gdy gen docelowy jest powiązany z dpy-10, może być problematyczne oddzielenie mutacji dpy-10 od interesującej Cię edycji. W związku z tym, w przypadku, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania jest połączony z locus dpy-10, można zastosować inne markery co-CRISPR, takie jak unc-58 (chromosom X), unc-22 lub zen-4 (chromosom IV) oraz ben-1 lub pha-1 (chromosom III), które znajdują się na różnych chromosomach 24,25,26,28. Dane z laboratorium Meyera pokazują, że mutacje ben-1 i zen-4 mogą być wykorzystywane jako skuteczne markery co-CRISPR do badań przesiewowych tą metodą28. Należy jednak zauważyć, że użycie zen-4 i pha-1 jako markerów co-CRISPR wymaga przeprowadzenia eksperymentu CRISPR na tłach zen-4 (cle10ts) lub pha-1 (e2123ts) odpowiednio typu dzikiego26,28. Co więcej, eksperymenty CRISPR z udziałem niektórych markerów co-CRISPR, takich jak ben-1, mogą wymagać przygotowania specjalnych płytek (np. płytek zawierających benzimidazol)28. Z powodzeniem użyliśmy markera co-CRISPR unc-58 do badań przesiewowych pod kątem pozytywnych edycji genu, który jest powiązany z dpy-10 przy użyciu tej metody (dane nie pokazane). Mutacja unc-58 (e665) nadaje widoczny fenotyp (paraliż), który może być skutecznie wykorzystany do badań przesiewowych w kierunku pozytywnie edytowanych robaków24. Alternatywnie, jeśli dostępny jest dostęp do mikroskopu fluorescencyjnego, znakowany fluorescencyjnie gen gtbp-1 może być również użyty jako marker co-CRISPR dla tego protokołu19.
Aby uzyskać wysoką wydajność edycji podczas korzystania z tej metody edycji genomu, miejsce edycji musi znajdować się w odległości od 10 do 30 zasad od miejsca cięcia Cas9. Jeśli miejsce edycji jest oddalone o ponad 30 baz od miejsca cięcia Cas9, wydajność edycji drastycznie spada 19,35,37. Jednak niedawne badanie przeprowadzone w laboratorium Meyera wykazało, że utworzenie dwóch dwuniciowych przerw w pewnej odległości od siebie może umożliwić wstawianie edycji daleko od miejsca cięcia Cas9 przy użyciu tego protokołu28.
W obecnym protokole szablon naprawy został zaprojektowany tak, aby wszystkie trzy wstawione kodony stop pojawiały się w tej samej ramce odczytu. Jednak alternatywną strategią tworzenia mutantów zerowych byłoby użycie uniwersalnej kasety STOP-IN o długości 43 zasad, która została opisana wcześniej50. Co ważne, ta kaseta ma kodony stop we wszystkich trzech możliwych ramkach odczytu i powoduje mutacje przesunięcia ramki. Jest to szczególnie przydatna strategia generowania mutantów zerowych, gdy w miejscu edycji wystąpi nieprawidłowa lub niekompletna naprawa.
Podsumowując, ze względu na krótki czas trwania i ostatnie postępy w tej metodzie, jest to doskonała metoda do rutynowych eksperymentów laboratoryjnych polegających na dodawaniu krótkich immunogennych znaczników epitopowych, znaczników fluorescencyjnych, dokonywaniu delecji genów, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes Technologia białka związanego z CRISPR (Cas) umożliwia efektywną edycję genomu w szerokim zakresie organizmów1,2,3,4. System CRISPR został po raz pierwszy odkryty jako część prokariotycznej przeciwwirusowej odpowiedzi immunologicznej5,6,7. System CRISPR typu II wykorzystuje endonukleazę, taką jak Cas9, transaktywujący RNA (tracrRNA) i krótki, specyficzny dla docelowego DNA 20-nukleotydowy długi przewodnik CRISPR RNA (crRNA) do rozpoznawania "NGG" Protospacer Neighbor Motif (PAM) i dokonywania dwuniciowego pęknięcia w docelowym DNA5,6,7,8,9,10,11,12. To dwuniciowe pęknięcie jest rozpoznawane jako uszkodzenie przez maszynerię naprawy komórkowego DNA. W związku z tym wygenerowane dwuniciowe pęknięcie może być naprawione przez jedną z dwóch ścieżek - i) Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub ii) Naprawa ukierunkowana na homologię (HDR)13. NHEJ jest często podatny na błędy i dlatego, gdy ten szlak jest używany do naprawy dwuniciowego pęknięcia w docelowym DNA, często powoduje inaktywujące mutacje (insercje, delecje) w genie będącym przedmiotem zainteresowania. Z drugiej strony, dostarczając egzogenną matrycę naprawczą z homologią po obu stronach pęknięcia dwuniciowego, maszyneria naprawy DNA komórkowego może zostać skierowana do użycia HDR do naprawy break13. Metoda HDR umożliwia więc precyzyjną edycję dowolnego interesującego nas miejsca.
Dla C. elegans14,15,16,17,18,19,20. Najczęściej stosowane metody edycji CRISPR/Cas9 w C. elegans obejmują zarówno protokoły oparte na klonowaniu, jak i wolne od klonowania do generowania szablonów naprawczych dla edycji CRISPR/Cas914,15,16,17,18,19,20. Protokół ten szczegółowo omawia protokół edycji CRISPR/Cas9 bez klonowania, oparty na użyciu dpy-10 jako markera co-CRISPR do badań przesiewowych. Do tej pory jedyny szczegółowy protokół edycji wideo CRISPR/Cas9 skoncentrowany na C. elegans, który istnieje, wykorzystuje marker fluorescencyjny do screeningu21. Jednak użycie markera fluorescencyjnego do badań przesiewowych wymaga dostępu do mikroskopu fluorescencyjnego, do którego dostęp może być utrudniony dla wielu laboratoriów w małych instytucjach głównie licencjackich (PUI). Zachęcające jest to, że pozytywne wyniki korelacji uzyskano w poprzednich badaniach między robakami przenoszącymi markery fluorescencyjne a obecnością edit21,22. Konieczne są jednak dodatkowe badania, aby określić ogólną skuteczność metody przesiewowej opartej na fluorescencji do edycji szerokiej gamy loci z różnymi przewodnikami RNA i matrycami naprawczymi. Wreszcie, ponieważ plazmidy kodujące te markery fluorescencyjne tworzą macierze pozachromosomalne, zmienna fluorescencja jest często wytwarzana z tych tablic, co może utrudniać identyfikację dodatnich23. W związku z tym, chociaż metoda badań przesiewowych oparta na fluorescencji może być przydatna do przyjęcia, wyżej wymienione kwestie mogą ograniczać jej zastosowanie.
Korzystanie ze znacznika co-CRISPR, który wytwarza widoczny fenotyp, znacznie zmniejsza liczbę potomstwa, które musi zostać przebadane, aby znaleźć pozytywnie edytowanego robaka23,24,25,26,27,28. Co ważne, fenotypy, które są wytwarzane przez te markery, można łatwo wykryć pod prostym mikroskopem preparacyjnym23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Marker co-CRISPR dpy-10 jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych i szeroko stosowanych markerów co-CRISPR do edycji genomu C. elegans CRISPR/Cas924,27. Dlatego w tym artykule omówimy metodę wykonywania edycji CRISPR/Cas9 u C. elegans przy użyciu bezpośredniego dostarczania kompleksów rybonukleoproteinowych z dpy-10 jako markerem co-CRISPR27,35. W tej metodzie przygotowana mieszanka do iniekcji edycyjnych składa się z dobrze scharakteryzowanego szablonu naprawczego dpy-10 crRNA i dpy-10, który pośredniczy w generowaniu obserwowalnego dominującego fenotypu "rolkowego" (Rol), który jest nadawany przez znaną heterozygotyczną mutację dpy-10 (cn64) w genie dpy-10 <klasa sup = "xref">24,27,29. Mutacja dpy-10(cn64) w stanie homozygotycznym powoduje fenotyp dumpy (Dpy), który wytwarza krótsze i grubsze robaki24,29. W fenotypie Rol pośredniczy dokładna insercja dostarczonej matrycy naprawczej dpy-10 do pojedynczej kopii genu dpy-10 za pośrednictwem HDR/Cas9. W związku z tym pojawienie się Rol C. elegans wskazuje na udane wstrzyknięcie, a także na udane zdarzenie edycyjne za pośrednictwem HDR w komórkach wstrzykniętego robaka. Ponieważ crRNA i matryca naprawcza docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania znajdują się w tej samej mieszance iniekcyjnej z matrycą naprawczą dpy-10 crRNA i dpy-10, istnieje duża szansa, że zidentyfikowane robaki Rol były również jednocześnie edytowane w docelowym genie będącym przedmiotem zainteresowania. W związku z tym robaki te są następnie sprawdzane pod kątem interesującej ich edycji za pomocą technik takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) (dla edycji większych niż 50 pz) lub przez PCR, po której następuje trawienie restrykcyjne (dla edycji mniejszych niż 50 pz).
Zalety korzystania z tej metody do edycji genomu to: i) edycje CRISPR mogą być generowane ze stosunkowo wysoką wydajnością (od 2% do 70%) przy użyciu tej metody27; (ii) matryce naprawcze i przewodnikowe RNA, które są wykorzystywane w tej metodzie, nie wymagają klonowania, co skraca czas potrzebny na ich wytworzenie; iii) poprzez składanie kompleksów rybonukleoproteinowych in vitro, stężenia złożonych kompleksów edycyjnych mogą być utrzymywane na względnie stałym poziomie, poprawiając w ten sposób odtwarzalność; iv) wykazano, że niektóre przewodnikowe RNA, które nie generują edycji, gdy są eksprymowane z plazmidów, działają w edycji genomu CRISPR/Cas9, gdy są dostarczane jako transkrybowane in vitro crRNAs27; v) dołączenie markera co-CRISPR dpy-10 umożliwia łatwe badanie przesiewowe za pomocą mikroskopu preparacyjnego i zmniejsza liczbę potomstwa, które musi zostać przebadane, aby znaleźć wynik pozytywny24,27; oraz vi) Sekwencjonowanie DNA zweryfikowane przez homozygotyczne linie robaków można uzyskać tą metodą w ciągu kilku tygodni19,27.
Opublikowano doskonałe rozdziały książek dotyczące wielu różnych metod CRISPR C. elegans14,15,16,17,18,19,20,43. Jednak obecnie brakuje demonstracji metody co-CRISPR dpy-10 w formacie wideo w warunkach laboratoryjnych. W tym artykule opisujemy i demonstrujemy proces wykorzystania metody co-CRISPR dpy-10 do edycji reprezentatywnego genu docelowego o nazwie rbm-3.2, przypuszczalnego białka wiążącego RNA (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). W szczególności szczegółowo opisujemy tutaj metodę wprowadzania trzech przedwczesnych kodonów stop w obrębie genu C. elegans rbm-3.2 za pomocą in vitro zmontowano kompleksy rybonukleoproteinowe i egzogennie dostarczono liniową jednoniciową matrycę naprawczą. Badania te zakończyły się sukcesem w wytworzeniu pierwszego szczepu C. elegans CRISPR z przedwczesnymi kodonami stop w genie rbm-3.2. Ponieważ obecnie niewiele wiadomo na temat funkcji tego genu u C. elegans, szczep ten posłuży jako użyteczne narzędzie w analizie funkcji RMB-3.2. Metoda ta może być również przyjęta do dokonywania insercji, substytucji i delecji w dowolnym locus w genomie C. elegans.

<table><tbody><tr><td>Probówki do sekwencjonowania DNA z kodami kreskowymi</td><td>Eurofins Genomics</td><td>SimpleSeq Kit Premixed</td><td>N/A</td></tr><tr><td>białko Cas9</td><td>PNA Bio</td><td>CP01</td><td>Liofilizowane białko Cas9 zawieszono w 20% glicerolu zawierającym wodę wolną od nukleaz, podano i przechowywano w temperaturze -80 & stopni; C</td></tr><tr><td>crRNA</td><td>Horizon Discovery/ GE Dharmacon</td><td>N/A</td><td>Liofilizowane crRNA zawieszono w 5 mM Tris-Cl pH 7,5, podano i przechowywano w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td>Przechowywany w temperaturze -30 stopni; C</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania Minelute PCR</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Kolumny wirowe przechowywane w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>MyTaq Redmix</td><td>Meridian Bioscience</td><td>BIO-25043</td><td>Przechowywany w temperaturze -30 & deg; C</td></tr><tr><td>Startery</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Standardowe oligonukleotydy 20 nmol zsyntetyzowano, ponownie zawieszono w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz i przechowywano w temperaturze -30 & stopni; C</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Gold Bio</td><td>P-480-SL4</td><td>przechowywana w temperaturze -30 & deg; C</td></tr><tr><td>Szablon naprawczy oligonukleotydów</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>4 nmol Oligonukleotydy ultramerów zsyntetyzowano, ponownie zawieszono w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz i przechowywano w temperaturze -30 & stopni; C</td></tr><tr><td>tracrRNA</td><td>Horizon Discovery/ GE Dharmacon</td><td>U-002005-50</td><td>Liofilizowany tracrRNA zawieszono w 5 mM Tris-Cl pH 7,5, podano na porcję i przechowywano w temperaturze -80 & stopni; Z</td></tr></tbody></table>

edycja crispr/cas9 genu rbm-3.2 c. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 co-crispr i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Bakteryjny system białek (Cas) związanych z CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Streptococcus pyogenes został wykorzystany przez naukowców do badania ważnych biologicznie istotnych problemów. Niezrównana moc metody edycji genomu CRISPR/Cas pozwala naukowcom na precyzyjną edycję dowolnego wybranego locus, ułatwiając w ten sposób lepsze zrozumienie funkcji genów. Kilka metod edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 zostało opisanych wcześniej. W tym miejscu omawiamy i demonstrujemy metodę, która wykorzystuje kompleksy rybonukleoproteinowe złożone in vitro i marker dpy-10 co-CRISPR do badań przesiewowych. W szczególności w tym artykule przechodzimy krok po kroku przez proces wprowadzania przedwczesnych kodonów stop do genu C. elegans rbm-3.2 poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię przy użyciu tej metody edycji CRISPR/Cas9. Ta stosunkowo prosta metoda edycji może być wykorzystana do badania funkcji dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania i pozwala na wygenerowanie homozygocznie edytowanych C. elegans za pomocą edycji CRISPR/Cas9 w czasie krótszym niż dwa tygodnie.

rbm-3.2 jest domniemanym białkiem wiążącym RNA, wykazującym homologię do ludzkiego wariantu tau podjednostki 2 czynnika stymulującego rozszczepianie (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). Białko RBM-3.2 zostało zidentyfikowane jako partner wiążący dla fosfatazy białkowej 1 (GSP-1) oraz jej regulatorów: inhibitora-2 (I-2SZY-2) oraz SDS-22 w poprzednim badaniu, w którym zidentyfikowano te białka jako nowe regulatory C. elegans duplikacja centrioli (dane nie przedstawiono)45Obecnie niewiele wiadomo na temat funkcji rbm-3.2 gen w C. elegans. W związku z tym, aby dalej badać biologiczną rolę C. elegans rbm-3.2 gen, ten rbm-3.2-allel nullowy rbm-3.2(ok688) pozyskano z Caenorhabditis Genetics Center (CGC). 
Niestety, oprócz obecności delecji całego rbm-3.2 gen, ten rbm-3.2(ok688) allel prowadzi również do częściowej delecji nakładającego się genu, rbm-3.1, co komplikuje analizę genetyczną. Dlatego też, aby dokładnie zbadać rolę rbm-3.2 gen w C. elegans, wykorzystaliśmy edycję CRISPR/Cas9 w celu wprowadzenia trzech przedwczesnych kodonów stop w bezpośrednim sąsiedztwie początku C. elegans rbm-3.2 region kodujący, pozostawiając nakładające się rbm-3.1 gen nienaruszony
Aby wprowadzić te przedwczesne kodony stop w gen C. elegans rbm-3.2, zaprojektowaliśmy crRNA z motywem PAM znajdującym się na przeciwległej nici (nici matrycowej) DNA (Rysunek 1A). Miejsce cięcia Cas9 znajdowało się 6 zasad od kodonu startowego ATG genu rbm-3.2. Aby wprowadzić przedwczesne kodony stop w gen rbm-3.2, zaprojektowaliśmy matrycę naprawczą o następujących pięciu głównych cechach: 1) 35 zasad nieprzerwanej homologii do sekwencji rbm-3.2 powyżej kodonu startowego rbm-3.2 (lewe ramię homologii), 2) usunięto krótki odcinek zasad zawierający motyw PAM, 3) wprowadzono miejsce restrykcyjne EcoRI bezpośrednio po kodonie startowym w celu przeprowadzenia screeningu, 4) usunięto drugi i trzeci kodon rbm-3.2 oraz wprowadzono trzy kodony stop po piątym kodonie RBM-3.2, aby przerwać translację mRNA rbm-3.2, 5) poniżej miejsca edycji dołączono 35 zasad nieprzerwanej homologii do pierwszego intronu rbm-3.2 (prawe ramię homologii) (Rysunek 1B).
Mieszaninę do iniekcji dla tego eksperymentu CRISPR przygotowano zgodnie z Tabelą I. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu złożenia kompleksów rybonukleoproteinowych. Następnie mieszaninę odwirowano i wprowadzono do przygotowanej igły do mikroiniekcji. Mikroiniekcję do gonady C. elegans wykonano zgodnie z opisem w pracy Iyer et al. 201943.
Rysunek 2 przedstawia harmonogram eksperymentalny generowania zmodyfikowanych C. elegans przy użyciu tego protokołu. Chociaż zazwyczaj wstrzykujemy materiał do 30 nicieni dla każdego eksperymentu CRISPR, niektóre laboratoria wstrzykują ich mniej (od 10 do 20) na każdy eksperyment CRISPR. Ponieważ wstrzyknięcie większej liczby nicieni zwiększa prawdopodobieństwo znalezienia pozytywnych edycji, preferujemy wstrzykiwanie większej liczby osobników. Wiele laboratoriów wybiera do przesiewania tzw. „jackpot broods” (płytki z ponad 50% potomstwa Rol i Dpy). Według naszego doświadczenia po przeprowadzeniu kilku eksperymentów CRISPR, choć „jackpot broods” zdarzają się okazjonalnie, w większości przypadków nicienie Rol wybierane do przesiewania pochodzą z wielu różnych płytek P0, z których każda zawiera zaledwie kilka potomków Rol. W tym eksperymencie nie uzyskano żadnych „jackpot broods”.
W sumie przeanalizowano pod kątem obecności edycji genomiczne DNA 73 nicieni Rol z pokolenia F1, które uzyskano od 7 wstrzykniętych nicieni P0. Sekwencje starterów przesiewowych oraz ich położenie względem kodonu startowego genu rbm-3.2 przedstawiono na Rysunku 3A. W wyniku przeprowadzonej analizy stwierdzono, że 7 z 73 nicieni F1 było pozytywnych pod kątem edycji (9,5%) (Rysunek 3B). Nicienie niepoddane edycji po trawieniu enzymem EcoRI wykazywały pojedynczy fragment DNA o długości 445 bp. Natomiast nicienie posiadające przedwczesny kodon stop w genie rbm-3.2 po trawieniu EcoRI wykazywały dwa fragmenty o długościach odpowiednio 265 bp i 166 bp. Nicienie z edycją heterozygotyczną po trawieniu EcoRI wykazywały trzy fragmenty: jeden fragment DNA typu dzikiego o długości 445 bp oraz dwa fragmenty DNA o długościach odpowiednio 265 bp i 166 bp pochodzące z edytowanej kopii genu rbm-3.2.
Aby zidentyfikować nicienie posiadające edycje homozygotyczne, przeniesiono 12 osobników F2 z wyselekcjonowanych pozytywnych heterozygot F1 na nowe, oddzielne płytki i pozwolono im na wyprodukowanie potomstwa (F3). Następnie przesiewowo badano nicienie F2 pod kątem homozygotyczności zgodnie z wcześniejszym opisem. 6 z 12 (50%) badanych osobników okazało się homozygotycznych pod kątem interesującej nas edycji (Rysunek 4A). DNA genomowe zidentyfikowanej linii nicieni z edycją homozygotyczną wykorzystano do przeprowadzenia reakcji sekwencjonowania DNA. Analiza sekwencjonowania DNA potwierdziła obecność edycji w stanie homozygotycznym (Rysunek 4B). Zasadniczo korzystne jest sekwencjonowanie wielu homozygotycznych linii nicieni, aby upewnić się, że wszystkie linie z edycją homozygotyczną wykazują ten sam fenotyp (jeśli mutacja null wywołuje specyficzny fenotyp). Ponadto może być konieczne zwalidowanie nokautów genowych za pomocą testu opartego na ekspresji, takiego jak western blotting lub RT-PCR, lub poprzez analizę fenotypową. Wynika to z faktu, że pomimo wprowadzenia przedwczesnych kodonów stop na początku genu, w dalszej części sekwencji może znajdować się alternatywny kodon ATG. Ten ATG mógłby zostać wykorzystany do zainicjowania ekspresji białka, co prowadziłoby do powstania częściowo funkcjonalnego, skróconego białka.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie </td>
			<td>Objętość do dodania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>białko Cas9 w wodzie wolnej od nukleaz z 20% glicerolem</td>
			<td>2 µg/µL</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA w 5 mM Tris-Cl pH 7,5</td>
			<td>4 µg/µL</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dpy-10 crRNA w 5 mM Tris-Cl pH 7,5</td>
			<td>8 µg/µL</td>
			<td>0.4 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rbm-3,2 crRNA w 5 mM Tris-Cl pH 7,5</td>
			<td>8 µg/µL</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dpymatryca naprawcza -10 w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz</td>
			<td>500 ng/µL</td>
			<td>0.55 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rbm-3,2 µg matrycy naprawczej w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz</td>
			<td>1 µg/µL</td>
			<td>2.2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz</td>
			<td>1 M</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterylna woda wolna od nukleaz</td>
			<td>-</td>
			<td>5.35 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Składniki mieszaniny do wstrzykiwania dla edycji CRISPR/Cas9 przy użyciu kompleksów rybonukleoproteinowych i dpy-10 jako markera co-CRISPR. Podczas przygotowywania mieszaniny do wstrzykiwania należy stosować techniki sterylne i odczynniki wolne od RNaz. Należy pamiętać, że do przygotowania mieszaniny do wstrzykiwania użyto sterylnej wody wolnej od nukleaz, niepoddanej działaniu DEPC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie</td>
			<td>Objętość do dodania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8,3</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 M</td>
			<td>250 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (lub IGEPAL CA-630)</td>
			<td>100%</td>
			<td>450  µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>100%</td>
			<td>450  µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Żelatyna</td>
			<td>2%</td>
			<td>500  µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda</td>
			<td>-</td>
			<td>92,35 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Skład buforu do lizy nicieni.Bufor do lizy nicieni można przygotować w większej ilości, poddać autoklawowaniu, przefiltrować i podzielić na aliquoty w celu długoterminowego przechowywania (UWAGA: bufor do lizy może być przechowywany przez ponad rok w temperaturze pokojowej). Bezpośrednio przed każdym użyciem należy dodać do buforu do lizy nicieni rozcieńczenie 1:100 proteinazy K o stężeniu 20 mg/mL.
<img alt="Schemat edycji genów CRISPR pokazujący nici DNA, motyw PAM, matrycę naprawczą i miejsce EcoRI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62001/62001fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat projektowania crRNA i matrycy naprawczej dla rbm-3.2 CRISPR wprowadzającego przedwczesne kodony stop. A. Schemat przedstawiający nić kodującą i matrycową genu rbm-3.2 wraz z sekwencją crRNA oraz sekwencją motywu PAM znajdującą się na nici matrycowej. B. Schemat reprezentujący różne charakterystyki matrycy naprawczej zsyntetyzowanej w celu wprowadzenia trzech przedwczesnych kodonów stop do genu rbm-3.2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62001/62001fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Oś czasu edycji genów CRISPR; mikroiniekcja, analiza potomstwa, PCR, etapy elektroforezy żelowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62001/62001fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Harmonogram eksperymentalny generowania homozygotycznie edytowanych C. elegans metodą edycji CRISPR/Cas9 z wykorzystaniem prefabrykowanych kompleksów rybonukleoproteinowych i dpy-10 jako markera co-CRISPR. Dzień po dniu przedstawiono kroki, które należy wykonać w celu wygenerowania homozygotycznie edytowanych C. elegans przy użyciu tej metody edycji CRISPR/Cas9. W skrócie, 30 nicieni poddano mikroiniekcji mieszanki edycyjnej CRISPR i rozdzielono na pojedyncze płytki MYOB wysiane z E. coli OP50. Po 24 godzinach zainfekowane nicienie P0 przeniesiono na nowe świeże płytki MYOB i pozostawiono do dalszego składania jaj. W 3. i 4. dniu po mikroiniekcji płytki sprawdzono pod kątem obecności nicieni Rol F1. Wybrano płytki z maksymalną liczbą nicieni Rol i Dpy F1, a 73 nicienie F1 Rol (zazwyczaj wybieramy od 50 do 100 nicieni F1 Rol na eksperyment CRISPR) przeniesiono pojedynczo na nowe indywidualne płytki MYOB (1 nicień na płytkę) i pozostawiono do składania jaj przez około 2 dni. W 6. dniu po mikroiniekcji przygotowano lizaty nicieni z osobników F1, które wyprodukowały potomstwo (F2), a następnie przesiewano je pod kątem obecności edycji za pomocą PCR, po którym nastąpiło trawienie restrykcyjne enzymem EcoRI i elektroforeza żelowa w agarozie. W 7. dniu 12 nicieni F2 (non-Rol, non-Dpy) przeniesiono z pozytywnych płytek na nowe indywidualne płytki i pozostawiono do produkcji potomstwa (F3). W 9. dniu nicienie F2 przesiewano pod kątem homozygotyczności edycji zgodnie z wcześniejszym opisem. W 10. dniu przeprowadzono lizę nicieni, PCR i oczyszczanie produktów PCR dla homozygotycznych nicieni F3, a stężenie DNA zmierzono za pomocą spektrofotometru NanoDrop. W 11. dniu przygotowano reakcje sekwencjonowania metodą Sangera dla próbek pozytywnych i wysłano je do sekwencjonowania DNA. W 12. dniu przeanalizowano wyniki sekwencjonowania i zweryfikowano obecność edycji za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji (np. CLC sequence viewer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62001/62001fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Primery do screeningu CRISPR; wynik elektroforezy żelowej dla analizy mutacji genu rbm-3.2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62001/62001fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Screening C. elegans pod kątem heterozygotyczności dla przedwczesnych kodonów stop w genie rbm-3.2 . Obrazy elektroforezy żelowej na agarozie dla genomowego PCR DNA C. elegans po trawieniu enzymem EcoRI. Genotypowano 73 poszczególne nicienie F1 i przeskanowano je pod kątem obecności edycji rbm-3.2 . Czerwone numery i gwiazdki oznaczają nicienie z pozytywną edycją. Wszystkie 7 zidentyfikowanych pozytywnie edytowanych osobników C. elegans było heterozygotycznymi dla edycji, ponieważ po trawieniu EcoRI wykazały one jeden fragment DNA typu dzikiego o długości 445 bp oraz dwa fragmenty DNA o długości odpowiednio 265 bp i 166 bp pochodzące z edytowanej kopii genu rbm-3.2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62001/62001fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej oraz schemat sekwencjonowania DNA przedstawiający porównanie sekwencji genomowej i homozygotycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62001/62001fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4Identyfikacja i weryfikacja edycji homozygotycznej *C. elegans* niosąc rbm-3.2 przedwczesne kodony stop. A. Przesiewowe badanie w kierunku C. elegans które są homozygotami pod względem rbm-3.2 przedwczesne kodony stop. Obrazy elektroforezy żelowej w agarozie przedstawiające C. elegans genomowe DNA trawione enzymem EcoRI. 12 poszczególnych F2 Robaki z płytek pozytywnych poddano genotypowaniu i prześwietleniu pod kątem homozygotyczności rbm-3.2 edyt. Red: nicienie z edycją homozygotyczną. 6 z 12 przebadanych F2 robaki (50%) były homozygotami pod względem rbm-3.2 przedwczesne kodony stop. W przypadku nicienia 7 nie stwierdzono produktu PCR. B. Potwierdzenie wprowadzenia przedwczesnych kodonów stop w rbm-3.2 poprzez sekwencjonowanie DNA. Schemat przedstawiający porównanie sekwencji DNA i białek w przypadku homozygot niezmodyfikowanych i zmodyfikowanych. Analiza wyników sekwencjonowania DNA z genomowego DNA nicieni o homozygotycznej modyfikacji potwierdziła obecność trzech przedwczesnych kodonów stop w rbm-3.2 gen po edycji CRISPR/Cas9. Wszystkie wynikające z edycji CRISPR/Cas9 zmiany aminokwasowe są oznaczone czerwonymi literami lub czerwonymi gwiazdkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62001/62001fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

Technika ta jest korzystna dla wprowadzania precyzyjnych mutacji do C. elegans poprzez edycję genomu CRISPR/Cas9 w krótkim czasie. Technika ta zapewnia wydajny i usprawniony sposób edycji genomu C.elegans, ponieważ użycie markera Co-CRISPR znacznie zwiększa prawdopodobieństwo identyfikacji pozytywnie edytowanych robaków. Upewnij się, że ćwiczysz wykonywanie mikrozastrzyków i wstrzykujesz oba ramiona gonad jak największej liczby robaków, aby zwiększyć szanse na uzyskanie pożądanych zmian.Procedurę zademonstrują Amy Smith, Mary Bergwell, Danita Mathew, Ellie Smith i Carter Dierlam, którzy są studentami studiów licencjackich z mojego laboratorium. Aby przygotować młode dorosłe robaki do wstrzyknięcia, należy pobrać C.elegans w stadium L2, L3 na świeży trawnik bakteryjny na płytce MYOB i inkubować płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka należy przygotować mieszaninę do wstrzykiwań zgodnie z tabelą w sterylnych probówkach wolnych od nukleaz i wymieszać pipetując.Inkubować mieszaninę iniekcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby zebrać kompleksy rybonukleoproteinowe przed odwirowaniem mieszanki. Następnie użyj mikroskopu preparacyjnego, aby wybrać około 30 młodych dorosłych robaków z mniej niż 10 zarodkami w macicy i wstrzyknąć oba ramiona gonad każdego robaka z kilkoma pikolitrami mieszanki iniekcyjnej na ramię. Po mikrowstrzyknięciu należy użyć aparatu regeneracyjnego, aby delikatnie wypłukać pipetą wstrzyknięte robaki z wkładki iniekcyjnej na 60-milimetrową płytkę MYOB wysianą OP50 E. coli.Pozwól wstrzykniętym robakom zregenerować się przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec okresu rekonwalescencji użyj platynowego drucianego szpikulca, aby przenieść każdego wstrzykniętego robaka na pojedynczą 35-milimetrową płytkę agarową MYOB i pozwól robakom złożyć jaja w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach przenieś wstrzyknięte robaki na nowe, pojedyncze płytki o średnicy 35 milimetrów.Przez trzy do czterech dni po wstrzyknięciu należy używać mikroskopu preparacyjnego do identyfikacji płytek, na których występuje potomstwo F1 wykazujące fenotypy rolkowe, na co wskazuje ciało zwierzęcia obracające się wokół jego długiej osi, gdy zwierzęta poruszają się w okrągłym wzorze, oraz fenotypy przysadziste, o czym świadczy krótsza i mocniejsza fizjologia w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi na tym samym etapie rozwoju. Przenieś od 50 do 100 robaków rolkowych F1 na ich indywidualne płytki i pozwól robakom złożyć jaja przez jeden do dwóch dni. Po jednym do dwóch dni produkcji robaka F2, przenieś każdą pojedynczą matkę rolki F1 z numerowanej płytki do odpowiadającej jej numerowanej probówki PCR zawierającej 2,5 mikrolitra buforu do lizy uzupełnionego rozcieńczeniem 1:100 20 miligramów na mililitr proteinazy K. Zamroź probówki w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza na 20 minut przed lizą robaków w termocyklerze, zgodnie ze wskazaniami.Pod koniec cyklu dodaj 12,5 mikrolitra mieszanki 2X PCR zawierającej trifosforany deoksynukleozydów, polimerazę DNA, chlorek magnezu i barwnik ładujący, jeden mikrolitr 10-mikromolowego startera do przodu, jeden mikrolitr 10-mikromolowego startera wstecznego i wystarczającą ilość sterylnej wody, aby doprowadzić mieszaninę reakcyjną do 25 mikrolitrów na każdą próbkę robaka poddanego lizie. Następnie uruchom próbki na termocyklerze zgodnie ze wskazaniami. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem zmian o długości mniejszej niż 50 par zasad, przenieś 10 mikrolitrów każdej reakcji PCR do nowej probówki i dodaj pięć mikrolitrów głównej mieszanki trawienia restrykcyjnego do każdej probówki.Inkubuj reakcje trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji podgrzej i aktywuj trawienie za pomocą 10-15 minutowej inkubacji w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie załaduj całą reakcję z każdej probówki do pojedynczego dołka z 1% do 2% żelu agarozowego i uruchom żel z prędkością 110 miliamperów, aż zostanie osiągnięta odpowiednia separacja pasm.Pod koniec cyklu wizualizuj żele agarozowe w świetle UV, aby wykryć rozmiary prążków DNA. Pozytywnie edytowane robaki będą wyświetlać dodatkowe pasmo DNA w oczekiwanym rozmiarze dzięki edycji przy użyciu szablonu naprawczego, przenoszącego miejsce restrykcji w pożądanym locus w genomie robaka. Wybierz od ośmiu do 12 dziko wyglądających, nietoczących się robaków F2 z odpowiednich pozytywnie edytowanych płytek ślimakowych F1 i pozwól robakom złożyć jaja i wydać potomstwo przez jeden do dwóch dni.Następnie zidentyfikuj homozygotyczne linie robaków, jak pokazano dla pozytywnie edytowanych robaków i przeanalizuj wyniki sekwencjonowania za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji, aby potwierdzić obecność edycji zgodnie ze standardowymi protokołami. Można tu zaobserwować genomowe DNA oraz zaprojektowane RNA CRISPR i matrycę naprawczą dla genu rbm-3.2 C.elegans. W tej reprezentatywnej analizie stwierdzono, że siedem z 73 robaków F1 jest pozytywnych dla edycji.Nieedytowane robaki wykazywały pojedynczy fragment DNA z 445 par zasad podczas trawienia EcoRI, podczas gdy robaki niosące przedwczesny kodon stop w genie rbm-3.2 wykazywały dwa fragmenty na 265 i 166 parach zasad po trawieniu EcoRI. Heterozygotyczne edytowane robaki wykazywały trzy fragmenty po trawieniu EcoRI. Stwierdzono, że sześć z 12 robaków F2 ze zidentyfikowanych dodatnich heterozygot F1 jest homozygotycznych pod względem interesującej ich edycji.Genomowe DNA zidentyfikowanej homozygotycznej edytowanej linii robaka można następnie wykorzystać do wywołania reakcji sekwencjonowania DNA, która potwierdziła obecność edycji w stanie homozygotycznym. Należy upewnić się, że odczynniki do edycji i startery przesiewowe są prawidłowo zaprojektowane, a mieszanka iniekcyjna jest odpowiednio przygotowana. Kluczowe znaczenie ma również dokładna mikroiniekcja.Zgodnie z tą procedurą, w stosownych przypadkach, można przeprowadzić walidację fenotypową edycji oraz analizę ekspresji genów i białek w celu zweryfikowania dokładności edycji genomu.

crisprcas9-editing-c-elegans-rbm-32-gene-using-dpy-10-co-crispr

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje metodę przesiewową w celu identyfikacji transgenicznych muszek Drosophila, których genom został zmodyfikowany za pomocą CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, które zrewolucjonizowało sposób, w jaki naukowcy mogą manipulować genomem organizmu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak zidentyfikować mutanty generowane przez CRISPR, w których insercja sekwencji transaktywacyjnej zastępuje pierwszy ekson genu bezgałęziowego (bnl), tworząc w ten sposób linię...

Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu: metoda identyfikacji mutantów generowanych przez CRISPR u Drosophila

Ten film opisuje mikroiniekcję, powszechną metodę tworzenia transgenicznych szczepów C. elegans. W przykładzie zobaczymy mikroiniekcję użytą do wprowadzenia kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) do edycji genów zasad CRISPR.

Mikroiniekcja gonad: metoda dostarczania związków bezpośrednio do linii rozrodczej C. elegans

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Ten artykuł opisuje budowę komórek nokautujących białko-E związanych z centromerem (CENP-E) przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i trzech strategii przesiewowych opartych na fenotypie. Wykorzystaliśmy linię komórkową z nokautem CENP-E do opracowania nowatorskiego podejścia do walidacji swoistości i toksyczności inhibitorów CENP-E, co jest przydatne przy opracowywaniu leków i badaniach biologicznych.

Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Poznaj edycję genomu CRISPR/Cas9 w C. elegans przy użyciu markerów Co-CRISPR i kompleksów rybonukleoproteinowych. Ta metoda umożliwia szybkie wprowadzanie precyzyjnych mutacji i identyfikację edytowanych organizmów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych. (Wideo) | JoVE Journal

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Przeglądaj więcej filmów