Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Technika ta jest korzystna dla wprowadzania precyzyjnych mutacji do C. elegans poprzez edycję genomu CRISPR/Cas9 w krótkim czasie. Technika ta zapewnia wydajny i usprawniony sposób edycji genomu C.elegans, ponieważ użycie markera Co-CRISPR znacznie zwiększa prawdopodobieństwo identyfikacji pozytywnie edytowanych robaków. Upewnij się, że ćwiczysz wykonywanie mikrozastrzyków i wstrzykujesz oba ramiona gonad jak największej liczby robaków, aby zwiększyć szanse na uzyskanie pożądanych zmian.

Procedurę zademonstrują Amy Smith, Mary Bergwell, Danita Mathew, Ellie Smith i Carter Dierlam, którzy są studentami studiów licencjackich z mojego laboratorium. Aby przygotować młode dorosłe robaki do wstrzyknięcia, należy pobrać C.elegans w stadium L2, L3 na świeży trawnik bakteryjny na płytce MYOB i inkubować płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka należy przygotować mieszaninę do wstrzykiwań zgodnie z tabelą w sterylnych probówkach wolnych od nukleaz i wymieszać pipetując.

Inkubować mieszaninę iniekcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby zebrać kompleksy rybonukleoproteinowe przed odwirowaniem mieszanki. Następnie użyj mikroskopu preparacyjnego, aby wybrać około 30 młodych dorosłych robaków z mniej niż 10 zarodkami w macicy i wstrzyknąć oba ramiona gonad każdego robaka z kilkoma pikolitrami mieszanki iniekcyjnej na ramię. Po mikrowstrzyknięciu należy użyć aparatu regeneracyjnego, aby delikatnie wypłukać pipetą wstrzyknięte robaki z wkładki iniekcyjnej na 60-milimetrową płytkę MYOB wysianą OP50 E. coli.

Pozwól wstrzykniętym robakom zregenerować się przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec okresu rekonwalescencji użyj platynowego drucianego szpikulca, aby przenieść każdego wstrzykniętego robaka na pojedynczą 35-milimetrową płytkę agarową MYOB i pozwól robakom złożyć jaja w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach przenieś wstrzyknięte robaki na nowe, pojedyncze płytki o średnicy 35 milimetrów.

Przez trzy do czterech dni po wstrzyknięciu należy używać mikroskopu preparacyjnego do identyfikacji płytek, na których występuje potomstwo F1 wykazujące fenotypy rolkowe, na co wskazuje ciało zwierzęcia obracające się wokół jego długiej osi, gdy zwierzęta poruszają się w okrągłym wzorze, oraz fenotypy przysadziste, o czym świadczy krótsza i mocniejsza fizjologia w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi na tym samym etapie rozwoju. Przenieś od 50 do 100 robaków rolkowych F1 na ich indywidualne płytki i pozwól robakom złożyć jaja przez jeden do dwóch dni. Po jednym do dwóch dni produkcji robaka F2, przenieś każdą pojedynczą matkę rolki F1 z numerowanej płytki do odpowiadającej jej numerowanej probówki PCR zawierającej 2,5 mikrolitra buforu do lizy uzupełnionego rozcieńczeniem 1:100 20 miligramów na mililitr proteinazy K. Zamroź probówki w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza na 20 minut przed lizą robaków w termocyklerze, zgodnie ze wskazaniami.

Pod koniec cyklu dodaj 12,5 mikrolitra mieszanki 2X PCR zawierającej trifosforany deoksynukleozydów, polimerazę DNA, chlorek magnezu i barwnik ładujący, jeden mikrolitr 10-mikromolowego startera do przodu, jeden mikrolitr 10-mikromolowego startera wstecznego i wystarczającą ilość sterylnej wody, aby doprowadzić mieszaninę reakcyjną do 25 mikrolitrów na każdą próbkę robaka poddanego lizie. Następnie uruchom próbki na termocyklerze zgodnie ze wskazaniami. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem zmian o długości mniejszej niż 50 par zasad, przenieś 10 mikrolitrów każdej reakcji PCR do nowej probówki i dodaj pięć mikrolitrów głównej mieszanki trawienia restrykcyjnego do każdej probówki.

Inkubuj reakcje trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji podgrzej i aktywuj trawienie za pomocą 10-15 minutowej inkubacji w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie załaduj całą reakcję z każdej probówki do pojedynczego dołka z 1% do 2% żelu agarozowego i uruchom żel z prędkością 110 miliamperów, aż zostanie osiągnięta odpowiednia separacja pasm

Pod koniec cyklu wizualizuj żele agarozowe w świetle UV, aby wykryć rozmiary prążków DNA. Pozytywnie edytowane robaki będą wyświetlać dodatkowe pasmo DNA w oczekiwanym rozmiarze dzięki edycji przy użyciu szablonu naprawczego, przenoszącego miejsce restrykcji w pożądanym locus w genomie robaka. Wybierz od ośmiu do 12 dziko wyglądających, nietoczących się robaków F2 z odpowiednich pozytywnie edytowanych płytek ślimakowych F1 i pozwól robakom złożyć jaja i wydać potomstwo przez jeden do dwóch dni.

Następnie zidentyfikuj homozygotyczne linie robaków, jak pokazano dla pozytywnie edytowanych robaków i przeanalizuj wyniki sekwencjonowania za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji, aby potwierdzić obecność edycji zgodnie ze standardowymi protokołami. Można tu zaobserwować genomowe DNA oraz zaprojektowane RNA CRISPR i matrycę naprawczą dla genu rbm-3.2 C.elegans. W tej reprezentatywnej analizie stwierdzono, że siedem z 73 robaków F1 jest pozytywnych dla edycji.

Nieedytowane robaki wykazywały pojedynczy fragment DNA z 445 par zasad podczas trawienia EcoRI, podczas gdy robaki niosące przedwczesny kodon stop w genie rbm-3.2 wykazywały dwa fragmenty na 265 i 166 parach zasad po trawieniu EcoRI. Heterozygotyczne edytowane robaki wykazywały trzy fragmenty po trawieniu EcoRI. Stwierdzono, że sześć z 12 robaków F2 ze zidentyfikowanych dodatnich heterozygot F1 jest homozygotycznych pod względem interesującej ich edycji.

Genomowe DNA zidentyfikowanej homozygotycznej edytowanej linii robaka można następnie wykorzystać do wywołania reakcji sekwencjonowania DNA, która potwierdziła obecność edycji w stanie homozygotycznym. Należy upewnić się, że odczynniki do edycji i startery przesiewowe są prawidłowo zaprojektowane, a mieszanka iniekcyjna jest odpowiednio przygotowana. Kluczowe znaczenie ma również dokładna mikroiniekcja.

Zgodnie z tą procedurą, w stosownych przypadkach, można przeprowadzić walidację fenotypową edycji oraz analizę ekspresji genów i białek w celu zweryfikowania dokładności edycji genomu.