Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji
10 kwietnia 2021
Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.
Neowaskularyzacja, czyli tworzenie nowych naczyń krwionośnych, jest procesem wysoce regulowanym zarówno w normalnych, jak i patologicznych zdarzeniach. Aby lepiej zrozumieć neowaskularyzację, ważne jest, aby zrekonstruować ten proces w naturalnym mikrośrodowisku komórkowym in vitro. Opracowaliśmy układ mikroprzepływowy i automatyczne sterowanie.
Wysoce wydajne krążenie odbywa się w celu utworzenia mikrorurek perfuzyjnych i symulacji użycia białka do rekapitulacji początkowego zdarzenia nowego unaczynienia. Mikroprzepływowy chip do kiełkowania składał się z trzech kanałów. Kanał hodowli komórek śródbłonka i kanał ciekły oddzielono szerokim centralnym kanałem hydrożelowym.
Mikroprzepływowy system sterowania składał się z pompy mikrostrzykawkowej i elektromagnetycznego zaworu zaciskowego. Chip pułapki bąbelkowej, mikroprzepływowy chip do kiełkowania, pompa mikroperystaltyczna i zbiornik pożywki hodowlanej. Dzięki układowi mikroprzepływowemu komórki śródbłonka mogą być stymulowane przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i różne rozkłady czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego jednocześnie.
Odpipetować 20 mikrolitrów 125 mikrogramów na mililitr fibronektyny do jednego portu iniekcyjnego pożywki kanału hodowli komórkowej. Wytnij końcówkę pipety, aby pasowała do portu kanału hodowli komórkowej za pomocą nożyczek. Włóż końcówkę pipety do drugiego portu iniekcyjnego pożywki w kanale hodowli komórkowej.
Następnie odpipetuj powietrze z kanału hodowli komórkowej, aby napełnić go fibronektyną. Inkubuj frytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Przed wysiewem komórek należy odpipetować 20 mikrolitrów pożywki z komórek śródbłonka do każdego portu iniekcyjnego pożywki i inkubować wióry w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Następnie odpipetuj wszystkie media we wszystkich portach wtrysku mediów. Następnie odpipetuj pięć mikrolitrów zawiesiny komórkowej do jednego portu iniekcyjnego pożywki kanału hodowli komórkowej. Następnie komórki śródbłonka szybko rozprzestrzeniają się po całym kanale pod wpływem różnicy ciśnień hydrostatycznych.
Dodaj około czterech do sześciu mikrolitrów pożywki ECM do drugiego portu, aby wyregulować ciśnienie hydrostatyczne i zatrzymać ruch komórki. Zdal chipy do inkubatora komórkowego. Następnie przewracaj chipsy co 30 minut, aż komórki śródbłonka pokryją się wokół wewnętrznej powierzchni kanału hodowli komórkowej, dwie godziny później.
Za pomocą końcówki pipety bardzo ostrożnie usunąć przyczepione komórki z portów iniekcyjnych. Następnie włóż cztery żeńskie adaptery Luer z zadziorami do portów wtrysku mediów i napełnij je nośnikiem ECM. Wyjmować chipy do inkubatora komórkowego, wymieniać pożywki ECM i adaptery Luer co 12 godzin.
Aby zmontować układ sterowania mikroprzepływowego, przygotuj dwie rurki z politetrafluoroetylenu, dwie krótkie rurki silikonowe, trzy długie rurki silikonowe, jeden żeński adapter Luer z zadziorem, jedno złącze typu Y, a następnie trzy złącza typu L. Napełnić strzykawkę 10 mililitrami podgrzanego podłoża ECM. Podłączyć rurkę z politetrafluoroetylenu do strzykawki za pomocą żeńskiego adaptera Luer z zadziorami.
Następnie podłącz drugi koniec rurki z politetrafluoroetylenu do złącza typu Y. Następnie podłącz dwie długie silikonowe rurki do pozostałych dwóch końców złącza typu Y. Używamy jednej rurki do podłączenia do zbiornika, a drugiej rurki do podłączenia do układu pułapki bąbelkowej.
Podłącz kolejną długą silikonową rurkę do zbiornika. Następnie użyj dwóch krótkich silikonowych rurek, aby połączyć wszystkie otwory wlotowe i wylotowe w górnej warstwie chipa pułapki bąbelkowej. Podłącz rurkę z politetrafluoroetylenu do tylnej części chipa.
Następnie przymocuj strzykawkę do pompy mikrostrzykawkowej. Wciśnij dwie długie silikonowe rurki do elektromagnetycznego zaworu zaciskowego. Następnie przełącz elektromagnetyczny zawór zaciskowy, aby otworzyć rurociąg między strzykawką a zbiornikiem.
Wstrzyknąć pożywkę do zbiornika za pomocą pompy mikrostrzykawkowej, aby usunąć powietrze z rurki. Następnie ponownie przełącz zawór, aby otworzyć rurociąg między strzykawką a chipem pułapki bąbelkowej. Wstrzyknij media, aby wypełnić komorę cieczy i tylną rurkę chipa pułapki bąbelkowej.
Wyjmij chipy do kiełkowania śródbłonka z inkubatora komórkowego, a następnie usuń adaptery Luer po stronie hodowli komórkowej. Włóż dwie zatyczki rurowe do portów iniekcji hydrożelu mikroprzepływowego chipa do kiełkowania. Podłącz tylną rurkę chipa pułapki bąbelkowej do jednego portu kanału hodowli komórkowej.
Włóż złącze typu T do drugiego portu i podłącz je do długiej rurki silikonowej połączonej ze zbiornikiem. Przypnij długą silikonową rurkę do mikropompy perystaltycznej. Następnie włóż filtr powietrza do zbiornika.
Następnie zmontuj mikroprzepływowy chip do kiełkowania w inkubatorze znajdującym się na górze sceny. Następnie podłącz pompę próżniową do otworów w dolnej warstwie chipa pułapki bąbelkowej za pomocą rurki TPU. Ustaw przeciwną objętość krążenia i natężenie przepływu w niestandardowym programie, który jednocześnie steruje pompą mikrostrzykawkową i elektromagnetycznym zaworem zaciskowym.
Następnie ustaw natężenie przepływu mikropompy perystaltycznej. Włączyć pompę mikrostrzykawkową. Następnie ustanawiany jest system sterowania obiegiem.
Badamy funkcję barierową niektórych mikronaczyń w naszym modelu, mierząc współczynnik przepuszczalności dyfuzyjnej dekstryny 40 kDa. Jak pokazano na rysunku, współczynnik przepuszczalności dyfuzyjnej statycznego chipa hodowlanego z wyściółką komórkową wynosi 0,1 plus minus 0,3 mikrometra na sekundę. A współczynnik przepuszczalności dyfuzyjnej pustego kanału bez wyściółki komórki wynosi 5,4 plus minus 0,7 mikrometra na sekundę.
Test kiełkowania śródbłonka wykazał, że komórki śródbłonka wykiełkowały w centralnym hydrożelu głównie po 24 godzinach hodowli statycznej, podczas gdy stopień kiełkowania znacznie zmniejszył się wraz ze wzrostem naprężenia ścinającego światło. Ilościowo, naprężenie ścinające luminalne znacznie zmniejszyło kiełkowanie śródbłonka pod względem powierzchni kiełkowania, średniej długości kiełkowania i najdłuższej długości kiełków. Dzięki naszemu systemowi naprężenie ścinające na komórkach śródbłonka można było opcjonalnie zmienić w dowolnym momencie eksperymentu, podczas gdy przepływ przezśródbłonkowy pozostawał na poziomie fizjologicznym.
Ten biomimetyczny model 3D in vitro może być bezpośrednio zastosowany do badania mechanizmu neowasularyzacji i ma potencjał jako tania platforma do badań przesiewowych leków i zastosowań toksykologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia opracowanie in vitro trójwymiarowego modelu mikrofluidycznego, który odwzorowuje początkowe etapy neowaskularyzacji w warunkach fizjologicznych. Model ten, nazwany MIEN, integruje mikrofluidyczny chip do pączkowania naczyń oraz zautomatyzowany system krążenia, aby symulować biomechaniczne i biochemiczne mikrośrodowisko komórek śródbłonka (ECs) podczas wczesnej neowaskularyzacji. Platforma ta umożliwia precyzyjną kontrolę naprężenia ścinającego w świetle naczynia, przepływu transendotelialnego oraz gradientów czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), stanowiąc cenne narzędzie do badań mechanistycznych i przesiewania leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia naczyniowa
- Inżynieria tkankowa
- Mikrofluidyka
Wstęp
- Neowaskularyzacja to proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych z istniejących naczyń, który ma kluczowe znaczenie zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i patologicznym.
- Wstępne mikrośrodowisko, w którym znajdują się ECs podczas neowaskularyzacji, różni się znacząco od warunków panujących w późniejszych etapach.
- Istniejące modele często nie odzwierciedlają dokładnie wczesnych warunków biomechanicznych i biochemicznych neowaskularyzacji.
- Istnieje zapotrzebowanie na systemy in vitro, które odtwarzają te początkowe zdarzenia na potrzeby badań mechanistycznych i translacyjnych.
Cel badania
- Opracowanie trójwymiarowego modelu in vitro, który symuluje początkowy proces neowaskularyzacji w fizjologicznych warunkach mikrośrodowiskowych.
- Umożliwienie kontrolowanego przyłożenia naprężeń ścinających, przepływu transendotelialnego oraz gradientów VEGF do ECs.
- Zapewnienie platformy odpowiedniej do badań mechanistycznych oraz przesiewowych badań toksykologicznych i lekowych.
Zastosowane metody
- Wytworzenie mikrofluidycznego chipa do badania kiełkowania z trzema kanałami: kanałem hodowli EC, centralnym kanałem hydrożelu oraz kanałem cieczy.
- Powlekanie kanałów fibronektyną i wysiew komórek śródbłonka w celu utworzenia konfluentnego śródbłonka.
- Złożenie zautomatyzowanego systemu sterowania mikrofluidycznego, obejmującego strzykawki i pompy perystaltyczne, pułapkę na pęcherzyki powietrza oraz programowalny sterownik przepływu.
- Zastosowanie kontrolowanego naprężenia ścinającego w świetle naczynia, fizjologicznego przepływu transśródbłonkowego oraz gradientów VEGF.
- Ocena funkcji bariery naczyniowej za pomocą testów przepuszczalności z użyciem FITC-dekstranu.
- Ilościowe określenie kiełkowania śródbłonka w zmiennych warunkach naprężenia ścinającego.
Główne wyniki
- Model pomyślnie utworzył przepływowe, endotelizowane mikrokanały naśladujące wczesną neowaskularyzację.
- Funkcję barierową wykazano poprzez niskie współczynniki przepuszczalności w kanałach wyścielonych komórkami w porównaniu z kanałami pustymi.
- Po 24 godzinach hodowli statycznej zaobserwowano pączkowanie endotelialne do hydrożelu.
- Zwiększenie naprężenia ścinającego w świetle kanału znacząco zredukowało zakres i długość pączkowania endotelialnego.
- System umożliwił dynamiczną modulację naprężenia ścinającego przy zachowaniu fizjologicznego przepływu transendotelialnego.
Wnioski
- Model MIEN skutecznie odtwarza in vitro początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji.
- Naprężenie ścinające jest kluczowym regulatorem pączkowania śródbłonka w tym kontekście.
- Platforma ta jest obiecująca w badaniach nad mechanizmami neowaskularyzacji oraz jako niskokosztowe narzędzie do przesiewania leków i badań toksykologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modelowanie neowaskularyzacji we wczesnym stadium jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka w hipotezach dotyczących celów naczyniowych oraz optymalizacji pewności prognostycznej w procesach odkrywania leków. Mikrofluidyczna platforma MIEN umożliwia precyzyjną symulację początkowego mikrośrodowiska naczyniowego, wspierając analizę mechanistyczną i ilościową ocenę odpowiedzi śródbłonka. Możliwość ta zwiększa ciągłość translacyjną i dostarcza danych niezbędnych do selekcji projektów w portfelu terapeutyków celowanych naczyniowo.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad celami naczyniowymi poprzez odtwarzanie fizjologicznego naprężenia ścinającego i gradientów VEGF.
- Wspiera funkcjonalną walidację zachowania komórek śródbłonka w kontrolowanych warunkach mikrośrodowiskowych.
- Zwiększa wiarygodność predykcyjną hipotez we wczesnych etapach badań nad biologią naczyń.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę do testów 3D w celu oceny wpływu związków na kiełkowanie komórek śródbłonka.
- Generuje dane ilościowe, takie jak współczynniki przepuszczalności i parametry kiełkowania, umożliwiające wiarygodne porównania.
- Umożliwia skalowalny screening kandydatów na leki oraz analizę profili toksykologicznych w kontekście fizjologicznie istotnym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia wyniki in vitro z istotnymi dla choroby mechanizmami naczyniowymi w celu usprawnienia translacyjnych strategii poszukiwania biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez modelowanie wczesnych zdarzeń neowaskularyzacji.
- Ogranicza niejednoznaczność biologiczną w podejmowaniu decyzji dotyczących rozwoju przedklinicznego programów ukierunkowanych na układ naczyniowy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model MIEN integruje się z continuum od fazy odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, przesiew ilościowy oraz walidację mechanistyczną celów naczyniowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez kontrolowaną manipulację mikrośrodowiskiem.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wskaźników do oceny związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Zapewnia odczyty przepuszczalności i kiełkowania w celu porównania warunków doświadczalnych i wsparcia podejmowania decyzji.
- Badania translacyjne: Łączy mechanistyczne spostrzeżenia in vitro z przedklinicznymi modelami naczyniowymi, gdy są one zgodne z charakterystyką danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako platforma wielokrotnego użytku dla różnorodnych zastosowań w biologii naczyniowej i przesiewaniu leków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy śródbłonkowe i wspiera powtarzalność w zespołach B+R.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji do podejmowania decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczanie ryzyka we wczesnych fazach programów naczyniowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów celujących w układ naczyniowy.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu mikrofluidyki, hodowli komórek śródbłonka oraz ilościowej analizy testów.
- Wymaga dostępu do pomp programowalnych, chipów mikrofluidycznych oraz infrastruktury do obrazowania.
- Wymaga standaryzacji konfiguracji testów i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Może być konieczna adaptacja dla różnych źródeł komórek śródbłonka lub modeli chorób.
- Ograniczenia obejmują przepustowość oraz konieczność specjalistycznego przeszkolenia technicznego.
![Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
