Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

Protokół ten zapewnia prostą strategię generowania modeli hodowli komórkowych białych i brązowych adipocytów, które wiernie odwzorowują in vitro, fizjologię tkanki tłuszczowej, którą mamy in vivo. Protokół ten umożliwia jednoczesną izolację zarówno białych, jak i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy, a komórki, które izolujemy tą metodą, oceniają wysoką zdolność proliferacyjną i potencjał różnicowania. Komórki wyizolowane przy użyciu tego podejścia lepiej odzwierciedlają złożoność tkanki tłuszczowej niż inne modele hodowli.

I może być wykorzystany do dokładniejszego badania funkcji adipocytów w otyłości i cukrzycy. Skupiamy się przede wszystkim na zrozumieniu dysfunkcji tkanki tłuszczowej w otyłości. Jednak komórki przygotowane tą metodą mogą być również wykorzystywane do badania podstawowych pytań dotyczących komórki w biologii rozwoju.

Kluczem do udanego eksperymentu jest ustalenie, jak zidentyfikować białe magazyny tłuszczu, ponieważ te magazyny, które są małe, ale bardzo bogate i proliferujące preadipocyty, mogą być trudne do odróżnienia u młodych. Demonstracja wizualna ilustruje, jak prosty jest ten protokół i pozwala na dostarczenie wskazówek dotyczących lokalizacji i analizy białych i brązowych składów tłuszczu. Zobaczenie izolacji zajezdni jest bardzo pomocne.

Aby pobrać podskórną białą tkankę tłuszczową, przetnij skórę wokół brzucha nowonarodzonego szczeniaka, który został poddany eutanazji i delikatnie pociągnij skórę poniżej nóg. Nie zbierając żadnej tkanki skórnej, ostrożnie zbierz magazyn tłuszczu, który pojawi się jako przezroczysta lub biała, cienka wydłużona tkanka przyczepiona do wnętrza skóry lub na szczycie mięśnia czworogłowego. Przepłucz zebrany magazyn w PBS i umieść tkankę tłuszczową w 1,5 mililitrowej probówce zawierającej 250 mikrolitrów PBS i 200 mikrolitrów buforu izolacyjnego 2X na lodzie.

Aby zebrać brunatną tkankę tłuszczową między łopatkami, należy naciągnąć skórę od łopatek nad głowę i unieść ciemnoczerwoną brązową tkankę tłuszczową znajdującą się między łopatkami. Ostrożnie wykonaj nacięcia wokół tkanki tłuszczowej, aby oderwać ją od ciała i sprawdź tkankę pod kątem konsystencji i koloru. Po spłukaniu umieść tkankę w drugiej 1,5 mililitrowej probówce zawierającej 250 mikrolitrów PBS i 200 mikrolitrów buforu izolacyjnego 2X na lodzie.

Kiedy wszystkie magazyny zostaną zebrane, użyj nożyczek, aby delikatnie zmielić każdy magazyn cztery do sześciu razy bezpośrednio w probówkach i dodaj 50 mikrolitrów kolagenazy 10X w buforze izolacyjnym 2X do każdej probówki. Następnie szybko odwróć probówki, aby wymieszać i umieść chusteczki w mikserze o kontrolowanej temperaturze na 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1400 obrotach na minutę. Pod koniec trawienia umieść probówki z powrotem na lodzie i przefiltruj tkanki trawienne przez sitka do komórek o średnicy 100 mikronów do nowych probówek o pojemności 50 mililitrów.

Aby zmaksymalizować wydajność komórek, przepłucz każdą probówkę jednym mililitrem pożywki izolacyjnej i przefiltruj to płukanie przez sitko. Rozcieńczyć brązowe i białe roztwory tkanki tłuszczowej do dwóch mililitrów zawiesiny tkankowej na studzienkę na dołek w świeżej pożywce izolacyjnej. Następnie umieść dwa mililitry zawiesiny białej tkanki tłuszczowej w każdym z czterech do sześciu dołków i dwa mililitry zawiesiny brązowej tkanki tłuszczowej w każdym z dwóch do trzech dołków sześciodołkowej płytki przez jeden filtr 100 mikronów na studzienkę.

Po pokryciu wszystkich komórek umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 60 do 90 minut. Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę dwoma mililitrami pożywki wolnej od surowicy i delikatnie poruszyć płytkę, aby oderwać wszelkie komórki krwi od dna studzienek. Po trzech płukaniach dodać dwa mililitry świeżej pożywki izolacyjnej do studzienek i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.

Gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 90%, pokryj nowe płytki docelowe sterylną 0,1% żelatyną w wodzie destylowanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Podczas inkubacji płytek umyj komórki PBS przed traktowaniem trypsyną przez trzy minuty w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po odłączeniu komórek należy kilkakrotnie odpipetować zawiesinę komórek, aby zmaksymalizować odzysk komórek i przenieść komórki do nowej probówki.

Po zebraniu wszystkich komórek, przemyć każdą studzienkę jednym mililitrem pożywki izolacyjnej i wyciągnąć popłuczyny z zawiesiną komórek. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w trzech do pięciu mililitrach pożywki izolacyjnej do liczenia. Rozcieńczyć komórki do stężenia odpowiedniego do posiewu w świeżej pożywce izolacyjnej i umyć płytki pokryte żelatyną PBS w celu usunięcia nadmiaru żelatyny.

Następnie wysiewaj komórki na płytkach pokrytych żelatyną i włóż je z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną zbieg, zastąp pożywkę izolacyjną pożywką różnicującą. W przypadku różnicowania preadipocytów brunatnej tkanki tłuszczowej należy również dodać jedną nanomolową trójjodotyroninę.

Po 48 godzinach odświeżyć pożywkę odpowiednią objętością pożywki podtrzymującej na kulturę. W tym czasie nagromadzenie małych kropelek cieczy w komórkach powinno stać się widoczne pod mikroskopią w jasnym polu. Nawet po przefiltrowaniu niektóre szczątki komórkowe i komórki krwi pozostają w zawiesinie komórki.

Delikatne mycie godzinę po posiewie usunie nieistotne komórki, ponieważ preadipocyty szybko przyczepiają się do dna studzienki. Chociaż zarówno białe, jak i brązowe preadipocyty wyizolowane z nowonarodzonych szczeniąt mają wysoką zdolność proliferacyjną, wydajność białych preadipocytów jest na ogół dwukrotnie wyższa niż brązowych preadipocytów w przeliczeniu na depot. Dlatego, jeśli pożądane są zsynchronizowane hodowle, należy odpowiednio obliczyć tę początkową gęstość białych preadipocytów.

Pod koniec różnicowania komórki będą wydawać się naładowane kropelkami lipidów i będą wyrażać klasyczne markery odpowiednio białych i brązowych adipocytów. W tej analizie porównawczej zużycia tlenu w mitochondrialnym teście wysiłkowym pierwotnych białych i brązowych adipocytów w warunkach podstawowych, a także w odpowiedzi na znane stymulatory funkcji mitochondriów, można zaobserwować te specyficzne zdolności bioenergetyczne każdego typu komórki. Pamiętajmy, że izolujemy żywe komórki i chcemy je hodować przez kilka dni.

Dlatego należy pamiętać o utrzymaniu sterylnych warunków podczas izolacji, aby uniknąć zanieczyszczenia, które może zagrozić późniejszej hodowli. Metoda ta generuje w pełni dojrzałe adipocyty, które można wykorzystać do różnych zastosowań, w tym do testów funkcjonalnych, genetycznych lub chemicznych badań przesiewowych lub profilowania omicznego w celu zbadania autonomicznych mechanizmów komórkowych, które wpływają na funkcję adipocytów.