Name: Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej w tylnej kończynie myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Poznaj technikę laserowego obrazowania perfuzji dopplerowskiej do pomiaru przepływu krwi w tylnej kończynie myszy. Ta metoda pozwala ocenić mikrokrążenie skórne w badaniach nad gojeniem ran.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została przeprowadzona przy użyciu obiektów i zasobów w Centrum Opieki Zdrowotnej VA Puget Sound. Praca jest pracą autora i niekoniecznie odzwierciedla stanowisko lub politykę Departamentu ds. Weteranów lub rządu Stanów Zjednoczonych. Dr Tang jest obecnie finansowany przez VA (Merit 5 I01 BX004975-02).

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego.
1. Przygotowanie skanera
<ol>
	<li>Dostosuj wysokość skanera tak, aby odległość od skanowanego obiektu wynosiła około 30 cm.</li>
	<li>Włącz imager i uruchom powiązane oprogramowanie.</li>
	<li>Otwórz program Pomiar. Jeśli oprogramowanie poprawnie komunikuje się ze skanerem, pojawi się ostrzeżenie o włączeniu lasera na podczerwień.</li>
	<li>Skalibruj maszynę zgodnie ze standardami dostarczonymi przez producenta (nie pokazanymi na filmie i będzie zależeć od konkretnego modelu używanej maszyny).</li>
	<li>Dostosuj ustawienia skanera tak, aby były odpowiednie do materiału tła i konfiguracji oświetlenia w pomieszczeniu.
	<ol>
		<li>Ustaw poziomy wzmocnienia DC FLUX i CONC zgodnie z instrukcjami producenta (nie pokazano na filmie).</li>
		<li>Ustaw próg tła, kierując wiązkę lasera na materiał tła, a następnie naciśnij przycisk Auto BK Set.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie do wstępnego skanowania myszy
<ol>
	<li>Ustawić komorę indukcyjną izofluranu z odpowiednim oczyszczaniem gazów odlotowych. 
	UWAGA: Umieszczenie komory indukcyjnej na podkładce grzewczej pomoże zapobiec utracie temperatury myszy podczas indukcji znieczulenia.</li>
	<li>Włącz koc homeotermiczny, który jest umieszczony w obszarze skanowania pod nieodblaskową powierzchnią (w tym przypadku czarną tkaniną neoprenową). Ustaw koc homeotermiczny tak, aby utrzymywał temperaturę ciała 37 °C.</li>
	<li>Umieść sondę temperatury dla koca homeotermicznego i smaru tak, aby były gotowe do włożenia.</li>
	<li>Umieść maskę anestezjologiczną i system oczyszczania w obszarze skanowania.</li>
	<li>Znieczul mysz waporyzatorem izofluranowym. Ustaw szybkość tlenu na 1 l/min przepływu i dostosuj izofluran do 4% w celu indukcji znieczulenia. Włącz przepływ do komory indukcyjnej znieczulenia, a tempo oddychania myszy zwolni. Odpowiednie znieczulenie uzyskuje się, gdy mysz traci odruch prostowania.</li>
	<li>Przenieś mysz do maski anestezjologicznej/stożka na nos z dołączonym pochłaniaczem gazów odlotowych i dostosuj izofluran do 1,5%. 
	UWAGA: Ten poziom znieczulenia jest na ogół wystarczający, aby mysz leżała względnie nieruchomo podczas skanowania, ale nie ma na celu zapewnienia chirurgicznego poziomu znieczulenia, więc głębokość znieczulenia nie jest sprawdzana. Zmiana poziomu izofluranu powoduje zmiany w biciu serca, oddychaniu i perfuzji skórnej, dlatego w każdym eksperymencie w czasie i dla wszystkich uczestników eksperymentu należy stosować stałą wartość procentową. Można również zastosować alternatywne techniki znieczulające, takie jak wstrzyknięcie ksylazyny ketaminy IP, ale ta sama technika znieczulenia powinna być stosowana przez cały czas trwania badania, ponieważ różne środki znieczulające w różny sposób wpływają na perfuzję skórną.</li>
	<li>(Opcjonalnie w zależności od obszaru skanowania) Jeśli planowany obszar zainteresowania do skanowania jest pokryty sierścią, użyj małego elektrycznego trymera lub kremu do depilacji, aby usunąć włosy z obszaru zainteresowania. 
	UWAGA: Krem do depilacji należy całkowicie usunąć, a skórę myszy wysuszyć przed skanowaniem.</li>
	<li>Umieść mysz w odpowiedniej pozycji skanowania na czarnej, nieodblaskowej powierzchni pokrywającej koc homeotermiczny, upewniając się, że obie tylne kończyny pozostają na źródle ciepła podczas równoważenia i skanowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Ważne jest, aby utrzymać obie stopy na kocu homeotermicznym, aby zapobiec regionalnym wahaniom temperatury.</li>
	<li>Włóż nasmarowaną sondę temperatury doodbytniczej powiązaną z kocem homeotermicznym</li>.
	<li>Zrównoważ temperaturę myszy do żądanej temperatury skanowania (37 °C); około 5-10 minut.</li>
	<li>Wybierz opcję Scanner Setup (Ustawienia skanera), do której można uzyskać dostęp z górnego menu lub z ikony konfiguracji skanera. Dostosuj obszar skanowania, zmieniając współrzędne X-Y, aby uwzględnić obszar zainteresowania. Szybkość skanowania zależy od rozdzielczości skanowania. Wyższa rozdzielczość spowoduje wydłużenie czasu skanowania. W przypadku powtórnego skanowania z ostrością na perfuzji globalnej, w przeciwieństwie do wyższej rozdzielczości skupiającej się na perfuzji anatomicznej, wystarczająca jest prędkość skanowania 4 ms/piksel. 
	UWAGA: Wyższa rozdzielczość i pojedynczy skan powinny być brane pod uwagę, jeśli badacz próbuje bezpośrednio zbadać rozwijające się krążenie oboczne (najlepiej zobrazowane w brzusznej części uda i łydki, gdzie jest bliżej skóry). Wielokrotne skanowanie w niższej rozdzielczości/prędkości (np. 4 ms/piksel) jest wystarczające do oceny globalnej perfuzji do narządu końcowego podkładki myszy. Oprogramowanie pokazane na filmie automatycznie ładuje poprzednio używany szablon obszaru skanowania, szybkości i rozdzielczości po ponownym uruchomieniu lub można go pobrać z zapisanego pliku, jeśli różne obszary zainteresowania są używane do różnych eksperymentów.</li>
	<li>Jeśli wykonujesz powtórne skanowanie, wybierz kartę Repeat and Line Scan (Powtarzanie i skanowanie liniowe). Można zmienić liczbę skanów (w tym przypadku 3 skany), a także interwał powtarzania. Minimalny czas interwału powtarzania to szacowany czas skanowania, który jest pokazany w wyszarzonym obszarze po prawej stronie pola, określonym przez obszar skanowania i rozdzielczość skanowania. Dodanie kilku sekund pozwala użytkownikowi na wstrzymanie i potencjalną zmianę położenia myszy w razie potrzeby między skanowaniami.</li>
</ol>
3. Skanowanie
<ol>
	<li>Wybierz kartę Skanowanie obrazu i wybierz przycisk Oznacz. Laser przesunie się, aby obrysować obszar skanowania. Dostosuj pozycję myszy tak, aby skanowany cel znajdował się w zaznaczonym obszarze. 
	UWAGA: W przypadku skanowania opuszki stopy lub opuszki stopy i łydki, pozycja na brzuchu z wyprostowanymi kończynami tylnymi zapewnia bardziej spójny obszar zainteresowania niż pozycja na plecach. Tętnica udowa i tętnica odpiszczelowa oraz boczne znajdują się bardzo blisko brzusznej powierzchni uda i łydki, dlatego preferowane jest ułożenie na plecach w przypadku korzystania z tych obszarów zainteresowania.</li>
	<li>Rozpocznij powtórzony pomiar, wybierając ikonę Powtórz skanowanie i naciśnij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć skanowanie.</li>
	<li>Potwierdź odległość skanowania w wyskakującym okienku i kliknij OK, aby rozpocząć skanowanie.</li>
	<li>Monitoruj mysz podczas skanowania pod kątem ruchu myszy; jeśli mysz porusza się na tyle, że tylne łapy nie znajdują się już w obszarze skanowania w trakcie skanowania, uruchom ponownie skanowanie. W oprogramowaniu analitycznym można uwzględnić niewielkie różnice w pozycji tylnej łapy myszy.</li>
	<li>Monitoruj temperaturę myszy podczas procesu skanowania, ponieważ może się ona wahać nawet przy użyciu koca homeotermicznego. Jeśli występują zbyt duże wahania temperatury myszy, może to spowodować znaczne różnice między skanami. Ogólnie rzecz biorąc, zakres temperatur 36,8-37,2 °C da akceptowalne dane.</li>
	<li>Zapisz przechwycony skan w oknie Zapisz jako z nazwą pliku, która zawiera identyfikator myszy i punkt czasowy, aby ułatwić analizę danych. W razie potrzeby wprowadź szczegóły myszy i punktu czasowego w oknie szczegółów tematu.</li>
	<li>Wyłącz izofluran i wyjmij sondę temperatury doodbytniczą.</li>
	<li>Zdezynfekuj sondę temperatury doodbytnicy 70% etanolem, aby była gotowa do użycia w następnej myszy.</li>
	<li>Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu do punktu, w którym wykazuje odruch prostowania, przewracając się z pozycji leżącej do pozycji leżącej przed powrotem do klatki. 
	UWAGA: Rekonwalescencja może być przeprowadzona albo na kocu rozgrzewającym dla izofluranu, ponieważ rekonwalescencja jest bardzo szybka, albo w ocieplonej klatce regeneracyjnej dla ketaminy/ksylazyny.</li>
</ol>
4. Przechwytywanie danych LDPI (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Otwórz program do przeglądania obrazowania.</li>
	<li>Przejdź do menu plików, otwórz i zlokalizuj zapisany plik.</li>
	<li>Wybierz ikonę ROI na pasku narzędzi.</li>
	<li>Wybierz przycisk Dodaj wielokąt.</li>
	<li>Śledź obszar zainteresowania (ROI) dla tylnej kończyny kontrolnej za pomocą myszy. Śledzenie wielokątów nie musi być dokładne, ponieważ szare tło nie zostanie uwzględnione w obliczonych średnich.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.3-4.5 dla chirurgicznej kończyny tylnej.</li>
	<li>Wybierz ikonę Statystyki, aby otworzyć okno Wyniki statystyk ROIs (PU) obrazu.</li>
	<li>Eksportuj wyniki dla wielokąta 1 (kontrolna kończyna tylna) i wielokąta 2 (chirurgiczna kończyna tylna) do arkusza zbierania danych za pomocą kopiowania/wklejania.</li>
</ol>
5. Analiza
<ol>
	<li>Uchwyć dane jako współczynnik chirurgiczny/kontrolny dla każdego skanowania.</li>
	<li>Użyj uśrednionej metody chirurgicznej/kontrolnej dla wszystkich trzech skanów dla punktu danych dla tej konkretnej myszy w tym punkcie czasu. Ze względu na biologiczną zmienność odpowiedzi na niedokrwienie kończyn tylnych, na ogół potrzeba 8-10 myszy na punkt czasowy, aby osiągnąć powtarzalne wyniki z ~10% błędem standardowym. 
	UWAGA: Zanim pozwolisz myszy dojść do siebie po znieczuleniu, warto przeprowadzić szybką analizę powtarzających się skanów, aby sprawdzić, czy dane nie są zbyt zmienne (np. więcej niż 100-150 jednostek perfuzji różni się między skanami 1-3). Duże różnice między powtórzonymi skanami sugerują, że mysz nie była w pełni zrównoważona podczas skanowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), a powtórne skanowanie można wykonać bez utraty punktu danych, co miałoby miejsce, gdyby obrazy nie były analizowane do późniejszej daty. Zmiana palety kolorów w celu optymalizacji zakresu dynamicznego wyświetlanych wartości strumienia może być konieczna, aby lepiej wyświetlić warianty skanowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>

<ol><li>Varma, P., Stineman, M. G., Dillingham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+limb+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Medicine+and+Rehabilitation+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of limb loss.</a> Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (1), 1-8 (2014).</li>
<li>Farber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Limb-Threatening+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chronic Limb-Threatening Ischemia.</a> New England Journal of Medicine. 379 (2), 171-180 (2018).</li>
<li>Abularrage, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+microcirculation+in+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the microcirculation in vascular disease.</a> Journal of Vascular Surgery. 42 (3), 574-581 (2005).</li>
<li>Houben, A., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Microvascular+Function+in+Humans+from+a+Chronic+Disease+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).</li>
<li>Mahe, G., Humeau-Heurtier, A., Durand, S., Leftheriotis, G., Abraham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+skin+microvascular+function+and+dysfunction+with+laser+speckle+contrast+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessment of skin microvascular function and dysfunction with laser speckle contrast imaging.</a> Circulation: Cardiovascular Imaging. 5 (1), 155-163 (2012).</li>
<li>Murray, A. K., Herrick, A. L., King, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Doppler+imaging%3A+a+developing+technique+for+application+in+the+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Laser Doppler imaging: a developing technique for application in the rheumatic diseases.</a> Rheumatology (Oxford). 43 (10), 1210-1218 (2004).</li>
<li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability%2C+reproducibility+and+standardisation+of+a+laser+Doppler+imaging+technique+for+the+evaluation+of+normal+mouse+hindlimb+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser Doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion.</a> Sensors (Basel). 13 (1), 500-515 (2012).</li>
<li>Sonmez, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+laser-Doppler+flowmetry+assisted+murine+model+of+acute+hindlimb+ischemia-reperfusion+for+free+flap+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel laser-Doppler flowmetry assisted murine model of acute hindlimb ischemia-reperfusion for free flap research.</a> PLoS One. 8 (6), 66498(2013).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+some+anesthetic+agents+on+skin+microcirculation+evaluated+by+laser+Doppler+perfusion+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of some anesthetic agents on skin microcirculation evaluated by laser Doppler perfusion imaging in mice.</a> BMC Veterinary Research. 9, 255(2013).</li>
<li>Ankri-Eliahoo, G., Weitz, K., Cox, T. C., Tang, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27%28kip1%29+Knockout+enhances+collateralization+in+response+to+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">p27(kip1) Knockout enhances collateralization in response to hindlimb ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 63 (5), 1351-1359 (2016).</li>
<li>McEnaney, R. M., Shukla, A., Madigan, M. C., Sachdev, U., Tzeng, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y2+nucleotide+receptor+mediates+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+hind+limb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">P2Y2 nucleotide receptor mediates arteriogenesis in a murine model of hind limb ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 63 (1), 216-225 (2016).</li>
<li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Acute+and+Subacute+Murine+Hindlimb+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54166(2016).</li>
<li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1035(2009).</li>
<li>Chalothorn, D., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+variation+in+collateral+circulatory+function+in+mouse+hindlimb%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent variation in collateral circulatory function in mouse hindlimb.</a> Physiological Genomics. 42 (3), 469-479 (2010).</li>
<li>Helisch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+mouse+strain+differences+in+innate+hindlimb+collateral+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of mouse strain differences in innate hindlimb collateral vasculature.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (3), 520-526 (2006).</li>
<li>Faber, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+causes+collateral+rarefaction+and+increased+severity+of+ischemic+injury+in+multiple+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (8), 1748-1756 (2011).</li>
<li>Forrester, K. R., Stewart, C., Tulip, J., Leonard, C., Bray, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+laser+speckle+and+laser+Doppler+perfusion+imaging%3A+measurement+in+human+skin+and+rabbit+articular+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Comparison of laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: measurement in human skin and rabbit articular tissue.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 40 (6), 687-697 (2002).</li>
<li>Briers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Doppler%2C+speckle+and+related+techniques+for+blood+perfusion+mapping+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Measurement%22%5BJournal%5D)">Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging.</a> Physiological Measurement. 22 (4), 35-66 (2001).</li>
<li>Heeman, W., Steenbergen, W., van Dam, G., Boerma, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+laser+speckle+contrast+imaging%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of laser speckle contrast imaging: a review.</a> Journal of Biomedical Optics. 24 (8), 1-11 (2019).</li>
<li>Nguyen, T., Davidson, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+Enhanced+Ultrasound+Perfusion+Imaging+in+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Contrast Enhanced Ultrasound Perfusion Imaging in Skeletal Muscle.</a> Journal of Cardiovascular Imaging. 27 (3), 163-177 (2019).</li>
<li>Zaccagnini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Resonance+Imaging+Allows+the+Evaluation+of+Tissue+Damage+and+Regeneration+in+a+Mouse+Model+of+Critical+Limb+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Magnetic Resonance Imaging Allows the Evaluation of Tissue Damage and Regeneration in a Mouse Model of Critical Limb Ischemia.</a> PLoS One. 10 (11), 0142111(2015).</li>
<li>Penuelas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+as+a+measurement+of+hindlimb+perfusion+in+a+mouse+model+of+peripheral+artery+occlusive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">PET as a measurement of hindlimb perfusion in a mouse model of peripheral artery occlusive disease.</a> Journal of Nuclear Medicine. 48 (13), 1216-1223 (2007).</li>
<li>Jia, Y., Qin, J., Zhi, Z., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+sensitive+optical+microangiography+reveals+depth-resolved+microcirculation+and+its+longitudinal+response+to+prolonged+ischemic+event+within+skeletal+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh sensitive optical microangiography reveals depth-resolved microcirculation and its longitudinal response to prolonged ischemic event within skeletal muscles in mice.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (8), 086004(2011).</li>
<li>Turaihi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Intravital+Microscopy+and+Contrast-enhanced+Ultrasonography+of+the+Mouse+Hindlimb+to+Study+Insulin-induced+Vasodilation+and+Muscle+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e54912(2017).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+autophagy+alleviates+injury+during+hindlimb+ischemia%2Freperfusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced autophagy alleviates injury during hindlimb ischemia/reperfusion in mice.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 18 (3), 1669-1676 (2019).</li>
<li>Liu, D. L., Svanberg, K., Wang, I., Andersson-Engels, S., Svanberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Doppler+perfusion+imaging%3A+new+technique+for+determination+of+perfusion+and+reperfusion+of+splanchnic+organs+and+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser Doppler perfusion imaging: new technique for determination of perfusion and reperfusion of splanchnic organs and tumor tissue.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 20 (4), 473-479 (1997).</li>
<li>Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Laser+Doppler+Imaging+and+Monitoring+to+Analyze+Spinal+Cord+Microcirculation+in+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e56243(2018).</li>
<li>Zhang, D., Li, S., Wang, S., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+effect+of+a+gastric+ischemia-reperfusion+model+with+laser+Doppler+blood+perfusion+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the effect of a gastric ischemia-reperfusion model with laser Doppler blood perfusion imaging.</a> Lasers in Medical Science. 21 (4), 224-228 (2006).</li>
<li>Fitzal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulatory+changes+after+prolonged+ischemia+in+the+epigastric+flap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reconstructive+Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Circulatory changes after prolonged ischemia in the epigastric flap.</a> Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (7), 535-543 (2001).</li>
</ol>

Dr Tang nie ma żadnych konfliktów interesów, które mógłby ujawnić.

Spójna technika ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników z LDPI. Te same środki znieczulające, ustawienia temperatury, pozycja myszy i obszar zainteresowania powinny być używane przez cały czas. Różne środki znieczulające spowodują wyższe lub niższe wartości perfuzji9. Znieczulenie izofluranem jest wygodne ze względu na jego szybki początek i pojawienie się, a także ogólne bezpieczeństwo. Należy stosować stałą zawartość procentową izofluranu, ponieważ głębokość znieczulenia tym śro...

Owrzodzenie skóry z niedostatecznym gojeniem się ran jest główną przyczyną amputacji u ludzi1. Odpowiednie gojenie się ran wymaga wyższego poziomu perfuzji tętniczej niż jest to potrzebne do utrzymania nienaruszonej skóry, która jest zagrożona u pacjentów z chorobą tętnic obwodowych2,3,4. Kilka innych schorzeń reumatologicznych i cukrzyca mogą również prowadzić do zaburzenia i niewystarczającego mikrokrążenia skórnego do gojenia się ran5,6. Wielu pacjentów z cukrzycą ma współistniejącą chorobę tętnic obwodowych, co naraża ich na szczególnie wysokie ryzyko amputacji. Laserowe obrazowanie perfuzyjne dopplerowskie (LDPI) jest stosowane w sytuacjach klinicznych do oceny mikrokrążenia skórnego, a także w sytuacjach badawczych do oceny przepływu krwi i odzyskiwania przepływu krwi po eksperymentalnym niedokrwieniu kończyn tylnych, niedokrwieniu reperfuzji i płatach mikrochirurgicznych<klasa sup="xref">7.
System LDPI emituje wiązkę laserową o niskiej mocy, która jest odchylana przez lustro skanujące, aby przesunąć się nad interesującym obszarem. Różni się to od laserowej przepływomierzy dopplerowskiej, która zapewnia pomiar perfuzji dla małego obszaru tkanki w bezpośrednim kontakcie z sondą przepływometryczną8. Kiedy wiązka laserowa oddziałuje z poruszającą się krwią w mikrokrążeniu, ulega przesunięciu częstotliwości Dopplera, które jest fotowykrywane przez skaner i przekształcane w dowolne jednostki perfuzji. Ponieważ LDPI jest techniką opartą na świetle, jest ograniczona pod względem głębokości penetracji do 0,3-1 mm, co oznacza, że w większości przypadków ocenia się perfuzję skórną7. Przepływ przez skórę może być zmieniony przez temperaturę skóry i współczulny układ nerwowy, na który mogą wpływać różne środki znieczulające9. Na pomiary z lasera optycznego mają również wpływ warunki oświetlenia otoczenia, pigmentacja skóry i mogą być blokowane przez nałożone futro lub włosy7.
LDPI jest najczęściej używaną techniką badawczą do monitorowania odzyskiwania perfuzji po niedokrwieniu, ponieważ jest nieinwazyjna, nie wymaga podawania kontrastu i ma krótki czas skanowania, co pozwala na zbieranie danych o wielu zwierzętach. To sprawia, że idealnie nadaje się do określenia, czy terapie mające na celu terapeutyczną arteriogenezę lub angiogenezę są skuteczne w modelach małych zwierząt. Odzyskanie przepływu krwi po niedokrwieniu kończyn tylnych, mierzone za pomocą LDPI, dobrze koreluje z rozwojem tętnicy obocznej, gdy jest oceniane za pomocą innych środków, takich jak odlew Microfil lub micro-CT10,11. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie oceny perfuzji kończyn tylnych za pomocą LDPI.

<table><tbody><tr>materiał <td></td><td></td><td>nieodblaskowy</td><td>Sklep z tkaninami, neopren polecany przez firmę</td></tr><tr><td>F / kanister powietrza</td><td>A.M. Bickford Inc</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Koc homeotermiczny ze sztywną metalową sondą</td><td>Aparat</td><td></td> Harvarda <td>Jest również wyposażony w elastyczną sondę, ale jest to mniej trwałe</td></tr><tr><td>Maszyna do znieczulenia izofluranem</td><td>Dräger</td><td></td><td>Wielu producentów</td></tr><tr><td>Komora indukcyjna izofluranu</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Laserowy obraz perfuzyjny dopplerowski Moor</td><td>Instruments</td><td>MoorLDI2-IR</td><td>Imager o wyższej rozdzielczości (MoorLDI2-HIR)</td></tr><tr><td>Stożek</td><td></td><td></td> nosowy anestezjologiczny myszy <td>Wielu producentów</td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik</td><td></td><td></td> tlenu <td>Wielu producentów</td></tr><tr><td>Surgilube</td><td>Wielu dystrybutorów</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej w tylnej kończynie myszy

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Przywrócenie przepływu krwi jest krytycznym wskaźnikiem wyniku po eksperymentalnym niedokrwieniu kończyn tylnych lub niedokrwieniu reperfuzji. Laserowe obrazowanie perfuzyjne Dopplera (LDPI) jest powszechną, nieinwazyjną i powtarzalną metodą oceny przywrócenia przepływu krwi. Technika ta oblicza całkowity przepływ krwi w pobranej tkance na podstawie dopplerowskiego przesunięcia częstotliwości spowodowanego, gdy laser uderza w poruszające się czerwone krwinki. Pomiary są wyrażane w dowolnych jednostkach perfuzji, więc kontralateralna nieinterwencyjna na nodze jest zwykle używana do pomocy w pomiarach kontrolnych. Głębokość pomiaru mieści się w zakresie 0,3-1 mm; W przypadku niedokrwienia kończyn tylnych oznacza to, że ocenia się perfuzję skórną. Perfuzja skórna zależy od kilku czynników - przede wszystkim temperatury skóry i środka znieczulającego, które muszą być dokładnie kontrolowane, aby uzyskać wiarygodne odczyty. Co więcej, pigmentacja włosów i skóry może zmienić zdolność lasera do dotarcia lub wniknięcia do skóry właściwej. W artykule przedstawiono technikę LDPI w tylnej kończynie myszy.

Prawidłowo wykonane badanie LDPI powinno przynieść spójne wyniki w powtórzonych pomiarach, z odchyleniem nie większym niż 100-150 jednostek perfuzji (co odpowiada około 10% zwykłej średniej perfuzji poduszeczki stopy myszy) pomiędzy trzema skanami (Rysunek 2). Jak pokazano na Rysunku 2, powtórne skany pomagają ustalić, czy mysz została odpowiednio wyrównana termicznie, tak aby stosunek obszaru niedokrwionego do kontrolnego najlepiej odzwierciedlał rzeczywisty pr...

Tutaj prezentujemy protokół, który demonstruje technikę i niezbędne kontrole dla laserowego obrazowania perfuzjowego Dopplera do pomiaru przepływu krwi w tylnej kończynie myszy.

Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej w tylnej kończynie myszy

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

Owrzodzenie skóry z niewystarczającym gojeniem się ran jest główną przyczyną amputacji u ludzi. Odpowiednie gojenie się ran wymaga wyższych poziomów obfitości tętnic, które są potrzebne do utrzymania nienaruszonej skóry, która jest zagrożona u pacjentów z chorobą tętnic obwodowych. Kilka innych schorzeń reumatologicznych i cukrzyca mogą również prowadzić do zaburzenia i niewystarczającego mikrokrążenia skórnego do gojenia się ran.Wielu pacjentów z cukrzycą ma współistniejącą chorobę tętnic obwodowych, co naraża ich na szczególnie wysokie ryzyko amputacji. Laserowe obrazowanie perfuzyjne dopplerowskie lub LDPI jest stosowane w sytuacjach klinicznych do oceny mikrokrążenia skórnego, a także w sytuacjach badawczych do oceny przepływu krwi i odzyskiwania przepływu krwi po eksperymentalnym niedokrwieniu kończyn tylnych, reperfuzji niedokrwiennej i płatach mikrochirurgicznych. System LDPI emituje wiązkę laserową o niskiej mocy, która jest odchylana przez lustro skanujące, aby przesunąć się nad obszarem zainteresowania.Różni się to od laserowej przepływomierza dopplerowskiej, która zapewnia pomiar perfuzji dla małego obszaru tkanki w bezpośrednim kontakcie z sondą przepływometryczną. Kiedy wiązka laserowa oddziałuje z poruszającą się krwią w mikrokrążeniu, ulega przesunięciu częstotliwości Dopplera, które jest fotowykrywane przez skaner i przekształcane w dowolne jednostki perfuzji. Ponieważ LDPI jest techniką opartą na świetle, jest ograniczona pod względem głębokości penetracji do 0,3 do 1 milimetra, co oznacza, że w większości ocenia się perfuzję skórną.Przepływ przez skórę może być zmieniony przez temperaturę skóry i współczulny układ nerwowy, na który mogą wpływać różne środki znieczulające. Na pomiary z lasera optycznego mają również wpływ warunki oświetlenia otoczenia, pigmentacja skóry i mogą być blokowane przez nakładającą się sierść lub włosy. LDPI jest najczęściej stosowaną techniką badawczą do monitorowania odzyskiwania profuzji po niedokrwieniu, ponieważ jest nieinwazyjna, nie wymaga podawania kontrastu i ma krótki czas skanowania, co pozwala na zbieranie danych na wielu zwierzętach.To sprawia, że idealnie nadaje się do określenia, czy terapie mające na celu terapeutyczną arteriogenezę lub angiogenezę są skuteczne w modelach małych zwierząt. Odzyskanie przepływu krwi po niedokrwieniu kończyn tylnych, mierzone za pomocą LDPI, dobrze koreluje z rozwojem tętnicy obocznej, gdy ocenia się je za pomocą innych metod, takich jak odlewanie mikrowypełnienia lub mikrotomografia komputerowa. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie oceny perfuzji kończyn tylnych za pomocą LDPI. Dostosuj wysokość skanera tak, aby odległość od skanowanego obiektu wynosiła około 30 centymetrów.Włącz imager i uruchom powiązane oprogramowanie. Otwórz program pomiarowy. Jeśli oprogramowanie poprawnie komunikuje się ze skanerem, pojawi się ostrzeżenie o włączeniu lasera na podczerwień.Dostosuj ustawienia skanera tak, aby były odpowiednie do materiału tła i konfiguracji oświetlenia w pomieszczeniu. Ustaw próg tła, kierując wiązkę lasera na materiał tła i naciśnij Auto BK Set. Ustawić komorę indukcyjną izofluranu z odpowiednim odfiltrowywaniem gazów odlotowych.Umieszczenie komory indukcyjnej na podkładce grzewczej pomoże zapobiec utracie temperatury myszy podczas indukcji znieczulenia. Włącz koc homeotermiczny, który jest umieszczony w obszarze skanowania pod nieodblaskową powierzchnią. W tym przypadku tkanina neoprenowa.Koc homeotermiczny jest ustawiony tak, aby utrzymywać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza. Ustaw sondę temperatury i smary tak, aby były gotowe do włożenia. Umieść również znieczulającą maskę na twarz i system oczyszczania w obszarze skanowania.Znieczul mysz waporyzatorem izofluranowym. Szybkość tlenu jest ustawiona na jeden litr na minutę przepływu. A izofluran jest dostosowany do 4% do indukcji znieczulenia.Przepływ jest włączany do komory indukcyjnej znieczulenia, a tempo oddychania myszy zwalnia. Odpowiednie znieczulenie uzyskuje się, gdy mysz traci odruch prostowania. Przenieś mysz do stożka nosowego maski anestezjologicznej z dołączonym pochłaniaczem gazów odlotowych i dostosuj izofluran do 1,5%Ten poziom znieczulenia jest ogólnie wystarczający, aby mysz leżała stosunkowo nieruchomo podczas skanowania, ale nie ma na celu zapewnienia chirurgicznego poziomu znieczulenia.Tak więc głębokość znieczulenia nie jest sprawdzana. Zmiana poziomu izofluranu powoduje zmiany w częstości akcji serca, oddychaniu i obfitości skórnej. Tak więc spójna wartość procentowa powinna być stosowana przez cały czas trwania eksperymentu i dla wszystkich badanych eksperymentalnych.Można również zastosować alternatywne techniki znieczulające, takie jak wstrzyknięcie ksylazyny ketaminy IP, ale ta sama technika znieczulenia powinna być stosowana przez cały czas trwania badania, ponieważ różne środki znieczulające w różny sposób wpływają na obfitość skóry. Jeśli obszar zainteresowania planem, który ma zostać zeskanowany, jest pokryty sierścią, użyj małego elektrycznego trymera i/lub kremu do depilacji, aby usunąć włosy z obszaru zainteresowania. Kremy do depilacji należy całkowicie usunąć, a skórę myszy wysuszyć przed skanowaniem, ponieważ mokra skóra może powodować odbicia od lasera Włóż nasmarowaną sondę temperatury doodbytnicy powiązaną z kocem homeotermicznym do odbytnicy myszy.Zrównoważ temperaturę myszy do żądanej temperatury skanowania, 37 stopni Celsjusza. Może to potrwać od pięciu do 10 minut. Wybierz opcję Scanner Setup (Ustawienia skanera), do której można uzyskać dostęp z górnego menu lub z ikony Scanner Setup (Ustawienia skanera).Obszar skanowania należy dostosować, zmieniając współrzędne X, Y, aby dostosować się do obszaru zainteresowania. Szybkość skanowania zależy od rozdzielczości skanowania. Wyższa rozdzielczość spowoduje wydłużenie czasu skanowania.W przypadku wielokrotnego skanowania, skupiającego się na globalnej obfitości, w przeciwieństwie do wyższej rozdzielczości skupiającej się na perfuzji anatomicznej, wystarczająca jest najwyższa prędkość skanowania wynosząca cztery milisekundy na piksel. Jeśli wykonujesz powtórne skanowanie, wybierz kartę Repeat and Line Scan (Powtarzanie i skanowanie liniowe). Liczbę skanów można zmienić.W tym przypadku trzy skany, a także interwał powtarzania. Minimalny czas interwału powtarzania to szacowany czas skanowania pokazany w wyszarzonym obszarze po prawej stronie pola, określony przez obszar skanowania i rozdzielczość skanowania. Dodanie kilku sekund pozwala użytkownikowi na wstrzymanie i potencjalną zmianę położenia myszy w razie potrzeby między skanowaniami.Całkowity czas skanowania w tym przypadku wynosi trzy minuty i 21 sekund. Wybierz kartę Skanowanie obrazu i wybierz przycisk Oznacz. Spowoduje to, że laser obrysuje obszar skanowania.Dostosuj pozycję myszy tak, aby skanowany cel znajdował się w zaznaczonym obszarze. Rozpocznij powtarzanie pomiaru, wybierając ikonę Powtórz skanowanie i naciskając przycisk Odtwórz, aby rozpocząć skanowanie. Pojawi się wyskakujące okienko potwierdzające odległość skanowania.Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć skanowanie. Początkowy skan myszy przed indukcją niedokrwienia kończyn tylnych jest wyświetlany w czasie rzeczywistym. Drugie i trzecie powtórzenie skanowania jest przyspieszane do 16-krotnej prędkości.W oknie głównym wyświetlane są wyniki skanowania w takiej postaci, w jakiej są one generowane przez oprogramowanie. Wstawka w prawym dolnym rogu pokazuje laserowe skanowanie podnóżków myszy. W przypadku skanowania opuszki stopy lub podnóżka i grzbietu łydki, pozycja na brzuchu z tylnymi kończynami wyciągniętymi w kierunku ogona zapewnia bardziej spójny obszar zainteresowania w pozycji leżącej.Tętnica udowa, tętnica odpiszczelowa i boczne znajdują się bardzo blisko brzusznej powierzchni uda i łydki. Dlatego preferowane jest ułożenie na plecach w przypadku korzystania z tych obszarów zainteresowania. Monitoruj mysz podczas skanowania pod kątem ruchu myszy.Jeśli mysz poruszy się na tyle, że podnóżki nie znajdują się już w obszarze skanowania w trakcie skanowania, uruchom ponownie skanowanie. W oprogramowaniu analitycznym można uwzględnić niewielkie różnice w położeniu podnóżka myszy. Monitoruj również temperaturę myszy podczas procesu skanowania, ponieważ może się ona wahać nawet przy użyciu koca homeotermicznego.Jeśli temperatura myszy jest zbyt duża, może to spowodować znaczne różnice między skanami. Ogólnie rzecz biorąc, zakres temperatur od 36,8 do 37,2 spowoduje uzyskanie akceptowalnych danych. Zapisz przechwycony skan w oknie Zapisz jako z nazwą pliku, która zawiera identyfikator myszy i punkt czasowy, aby ułatwić analizę danych.W razie potrzeby wprowadź szczegóły myszy i punktu czasowego w oknie Szczegóły tematu. Skanowanie brzusznych kończyn tylnych z myszą w pozycji leżącej jest pokazane tutaj po dostosowaniu obszaru skanowania. Zauważ, że propozycja z leżeniem na plecach myszy powoduje skanowanie zmiennej części boku stopy.Wyjmij sondę temperatury doodbytniczej i zdezynfekuj ją 70% etanolem, aby była gotowa na następną mysz. Zmniejsz izofluran do 0%Mysz szybciej się zregeneruje, jeśli nadal będzie otrzymywać tlen, ale można go również odzyskać bez dodatkowego tlenu. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu do punktu, w którym wykazuje odruch prostowania, przewracając się z pozycji leżącej do pozycji leżącej przed powrotem do klatki.Rekonwalescencja może być przeprowadzona albo na kocu rozgrzewającym w przypadku izofluranu, ponieważ rekonwalescencja jest bardzo szybka, albo w ciepłej klatce regeneracyjnej dla ketaminy ksylazyny. Otwórz program do przeglądania obrazowania. Otworzy się nowe okno do przeglądania skanów.Przejdź do menu Plik, otwórz i zlokalizuj zapisany plik. Wybierz ikonę ROI na pasku narzędzi. Wybierz ikonę Dodaj wielokąt.Śledź obszar wokół obszaru zainteresowania za pomocą myszy. Po zakończeniu wróć do paska narzędzi i wybierz ikonę Statystyki. Spowoduje to wyświetlenie okna pokazującego statystyki z interesującego Cię regionu.Po przejrzeniu danych wartości średniej jednostki profuzji (PU) nie różnią się o więcej niż 100 do 150 PU w powtarzających się skanach dla każdej poduszki stopy. Jest to akceptowalny skan i wskazuje, że mysz była dobrze zrównoważona podczas skanowania. Średnie wartości PU z odchyleniem większym niż 100 do 150 PU, co odpowiada więcej niż 10% średniej perfuzji dla nieobsługiwanej podkładki myszy w porównaniu z powtarzanymi skanami, wskazywałyby, że mysz nie była dobrze zrównoważona i zdecydowanie zaleca się powtórzenie skanowania.Wykonanie szybkiej analizy natychmiast po zakończeniu skanowania pozwala na powtórzenie skanowania, gdy mysz jest nadal znieczulona, i pozwala uniknąć utraty punktu danych, co może wystąpić, jeśli skany zostaną przeanalizowane w późniejszym terminie, a skanowanie zostanie uznane za niedopuszczalne ze względu na znaczne różnice między powtarzanymi skanami. Wyniki są wyrażone jako stosunek chirurgicznej obfitości kończyn tylnych do kontrolnej perfuzji kończyn tylnych, ponieważ myszy początkowo rozszerzają naczynia krwionośne, a następnie rozwijają swoje wewnętrzne zabezpieczenia, przywrócenie przepływu krwi przez LDPI powinno być widoczne w czasie pooperacyjnym. Stopień rekonwalescencji zależy od szczepu myszy i nasilenia modelu niedokrwienia kończyn tylnych.Rysunek ten przedstawia zakończony eksperyment w czasie trwający 28 dni, w którym LDPI użyto do pomiaru odzyskiwania przepływu krwi w opuszkach stóp w czasie po podwiązaniu tętnicy udowej i myszach z nokautem P27 i dzikim typie C57Bl / 6. Oba nokauty P27 u myszy typu dzikiego miały upośledzone odzyskiwanie przepływu krwi po leczeniu doustną doksycykliną, uogólnionym inhibitorem metaloproteinaz macierzy, co sugeruje, że aktywność MMP ułatwia arteriogenezę. Ustawienie wzmocnienia i próg tła powinny być utrzymywane na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu.Jeśli próg tła jest ustawiony zbyt nisko, skanowanie materiału tła spowoduje niskie wartości obfitości. Spowoduje to, że wartości profuzji tła zostaną uśrednione do obszaru zainteresowania podczas wyboru wielokąta. Aby wyeliminować ten problem, próg tła można dostosować w oknie Ustawienia skanera na karcie Ogólne.W takim przypadku zwiększenie progu tła do 118 jednostek obfitości powoduje powstanie szarego tła, które nie zostanie uwzględnione w żadnej analizie. Paletę lub skalę kolorów obrazu strumienia można dostosować zarówno w oprogramowaniu pomiarowym, jak i w oprogramowaniu do przeglądania obrazu. Wszystkie wartości profuzji większe niż maksymalna wartość na skali będą wyświetlane jako kolor o najwyższej obfitości.W tym przypadku czerwony. Zwiększenie zakresu dynamicznego, na przykład zmiana skali na zakres od zera do 1500, sprawi, że zmienność powtarzanych skanów będzie bardziej widoczna dla oka, ponieważ obszary mierzące od 1000 do 1500 jednostek obfitości będą teraz wyświetlane przy użyciu gradientu kolorów, a nie wszystkie będą wyświetlane na czerwono. Pokazany tutaj skan został uzyskany u myszy, której temperatura ciała była początkowo niższa niż 36,8 na początku powtarzanego skanowania, a następnie wzrastała w trakcie powtarzanych skanów.Należy zauważyć, że średnia obfitość poduszki kontrolnej była bardziej zależna od niższej temperatury ciała niż niedokrwiennej poduszki stopy. Pojedynczy skan chłodniejszej temperatury ciała skutkowałby zarejestrowaniem wyższego współczynnika obfitości dla tego punktu danych. Różnice w pigmentacji skóry myszy, takie jak obserwowane u myszy C57Bl/6, mogą spowodować, że obszar skanowania będzie poniżej wartości progowej tła, co utrudni analizę obszarów zainteresowania zawierających obszary pigmentowe.Poduszki stóp myszy na ogół nie mają przebarwień, co czyni go najwygodniejszym obszarem do skanowania w poszukiwaniu tego szczepu myszy. Jeśli badacz chce zbadać brzuszną kończynę tylną, należy wybrać odmianę myszy białej. LDPI jest skuteczną, łatwą do wykonania i powtarzalną metodą pomiaru obfitości skórnej kończyn tylnych jako odzwierciedlenie ogólnej perfuzji tętnic.W przypadku korzystania z LDPI w celu uzyskania wiarygodnych danych wymagana jest spójna technika.

laser-doppler-perfusion-imaging-in-the-mouse-hindlimb

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiono procedurę chirurgiczną indukcji jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej, z potwierdzeniem niedokrwienia za pomocą obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera.

Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

Opisujemy metodę programowania komórek macierzystych do nadekspresji czynników terapeutycznych dla angiogenezy za pomocą biodegradowalnych nanocząsteczek polimerowych. Opisane procesy obejmują syntezę polimerów, transfekcję komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro oraz walidację skuteczności zaprogramowanych komórek macierzystych w promowaniu angiogenezy w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych.

Programowanie komórek macierzystych do angiogenezy terapeutycznej z wykorzystaniem biodegradowalnych nanocząstek polimerowych

Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest przydatna do badania angiogenezy, jednak jest ona zagrożona u niektórych szczepów myszy wsobnych, które wykazują wyraźną nekrozę tkanek wywołaną niedokrwieniem. Opisano metody wywoływania podostrego niedokrwienia kończyn za pomocą ameroidowych zwężaczy w celu obejścia tego problemu poprzez indukcję stopniowej niedrożności tętnic.

Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Wywołane insuliną rozszerzenie naczyń krwionośnych reguluje perfuzję mięśni i zwiększa powierzchnię mikrokrążenia (rekrutację mikronaczyniową) dostępną do wymiany substancji rozpuszczonej między krwią a śródmiąższem tkankowym. Przedstawiono połączoną mikroskopię przyżyciową i ultrasonografię ze wzmocnieniem kontrastowym w celu jednoczesnej oceny działania insuliny na większe naczynia i mikrokrążenie in vivo.

Połączona mikroskopia przyżyciowa i ultrasonografia tylna myszy ze wzmocnieniem kontrastowym w celu zbadania rozszerzenia naczyń krwionośnych i perfuzji mięśni wywołanego insuliną

Mikrowazomotoryka naczyń trzustkowych wysp trzustkowych reguluje dystrybucję krwi w wyspach trzustkowych i utrzymuje fizjologiczną funkcję komórek β wysp trzustkowych. Protokół ten opisuje użycie laserowego monitora dopplerowskiego w celu określenia stanu funkcjonalnego naczyń mikronaczyniowych wysp trzustkowych in vivo oraz oceny udziału mikrokrążenia wysp trzustkowych w chorobach związanych z trzustką.

Doppler laserowy: narzędzie do pomiaru mikrokrążenia naczynia krwionośnego wysp trzustkowych in vivo

Tutaj prezentujemy kombinację laserowego obrazowania perfuzji dopplerowskiej (LDPI) i laserowego monitorowania perfuzji dopplerowskiej (LDPM) do pomiaru lokalnych przepływów krwi w rdzeniu kręgowym i nasycenia tlenem (SO2), a także ustandaryzowaną procedurę wprowadzania urazu rdzenia kręgowego u szczura.

Wykorzystanie laserowego obrazowania dopplerowskiego i monitorowania do analizy mikrokrążenia rdzenia kręgowego u szczurów

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.

Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych

Ultraszybkie ultrasonografie dopplerowskie (UFUS) o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (100 μm) i czułości stanowi odpowiednią nieinwazyjną metodę obrazowania w celu uzyskania kompleksowego jakościowego przeglądu naczyń wątrobowych. UFUS ułatwia również ilościowe pomiary mikrokrążenia, mając na celu pogłębienie naszej wiedzy na temat mechanizmów chorób naczyniowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja unaczynienia wątroby myszy za pomocą ultraszybkich ultradźwięków dopplerowskich

Pokazano tutaj minimalnie inwazyjną procedurę chirurgiczną, która polega na umieszczeniu laserowej sondy dopplerowskiej na czaszce nad dystalnym obszarem środkowej tętnicy mózgowej (MCA), miejscem okołooczodołowym odpowiednim dla szczurów i myszy, w celu oceny przepływu krwi podczas przejściowej okluzji MCA.

Okołooczodołowe umieszczenie laserowej sondy dopplerowskiej do monitorowania przepływu krwi w mózgu przed niedrożnością tętnicy środkowej mózgu w modelach gryzoni

Do monitorowania zmian przepływu krwi mikronaczyniowej nerki podczas jednostronnej niedokrwienności nerki po resekcji prawej nerki u myszy zastosowano laserowy system obrazowania z kontrastem plamkowym (plamkowatym).

Perfuzja mikronaczyniowa monitorowana za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym podczas uszkodzenia niedokrwienia nerek i reperfuzji u myszy

Poznaj technikę laserowego obrazowania perfuzji dopplerowskiej do pomiaru przepływu krwi w tylnej kończynie myszy. Ta metoda pozwala ocenić mikrokrążenie skórne w badaniach nad gojeniem ran.

Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej w tylnej kończynie myszy

Przeglądaj więcej filmów