Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej w tylnej kończynie myszy

Owrzodzenie skóry z niewystarczającym gojeniem się ran jest główną przyczyną amputacji u ludzi. Odpowiednie gojenie się ran wymaga wyższych poziomów obfitości tętnic, które są potrzebne do utrzymania nienaruszonej skóry, która jest zagrożona u pacjentów z chorobą tętnic obwodowych. Kilka innych schorzeń reumatologicznych i cukrzyca mogą również prowadzić do zaburzenia i niewystarczającego mikrokrążenia skórnego do gojenia się ran.

Wielu pacjentów z cukrzycą ma współistniejącą chorobę tętnic obwodowych, co naraża ich na szczególnie wysokie ryzyko amputacji. Laserowe obrazowanie perfuzyjne dopplerowskie lub LDPI jest stosowane w sytuacjach klinicznych do oceny mikrokrążenia skórnego, a także w sytuacjach badawczych do oceny przepływu krwi i odzyskiwania przepływu krwi po eksperymentalnym niedokrwieniu kończyn tylnych, reperfuzji niedokrwiennej i płatach mikrochirurgicznych. System LDPI emituje wiązkę laserową o niskiej mocy, która jest odchylana przez lustro skanujące, aby przesunąć się nad obszarem zainteresowania.

Różni się to od laserowej przepływomierza dopplerowskiej, która zapewnia pomiar perfuzji dla małego obszaru tkanki w bezpośrednim kontakcie z sondą przepływometryczną. Kiedy wiązka laserowa oddziałuje z poruszającą się krwią w mikrokrążeniu, ulega przesunięciu częstotliwości Dopplera, które jest fotowykrywane przez skaner i przekształcane w dowolne jednostki perfuzji. Ponieważ LDPI jest techniką opartą na świetle, jest ograniczona pod względem głębokości penetracji do 0,3 do 1 milimetra, co oznacza, że w większości ocenia się perfuzję skórną.

Przepływ przez skórę może być zmieniony przez temperaturę skóry i współczulny układ nerwowy, na który mogą wpływać różne środki znieczulające. Na pomiary z lasera optycznego mają również wpływ warunki oświetlenia otoczenia, pigmentacja skóry i mogą być blokowane przez nakładającą się sierść lub włosy. LDPI jest najczęściej stosowaną techniką badawczą do monitorowania odzyskiwania profuzji po niedokrwieniu, ponieważ jest nieinwazyjna, nie wymaga podawania kontrastu i ma krótki czas skanowania, co pozwala na zbieranie danych na wielu zwierzętach.

To sprawia, że idealnie nadaje się do określenia, czy terapie mające na celu terapeutyczną arteriogenezę lub angiogenezę są skuteczne w modelach małych zwierząt. Odzyskanie przepływu krwi po niedokrwieniu kończyn tylnych, mierzone za pomocą LDPI, dobrze koreluje z rozwojem tętnicy obocznej, gdy ocenia się je za pomocą innych metod, takich jak odlewanie mikrowypełnienia lub mikrotomografia komputerowa. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie oceny perfuzji kończyn tylnych za pomocą LDPI. Dostosuj wysokość skanera tak, aby odległość od skanowanego obiektu wynosiła około 30 centymetrów.

Włącz imager i uruchom powiązane oprogramowanie. Otwórz program pomiarowy. Jeśli oprogramowanie poprawnie komunikuje się ze skanerem, pojawi się ostrzeżenie o włączeniu lasera na podczerwień.

Dostosuj ustawienia skanera tak, aby były odpowiednie do materiału tła i konfiguracji oświetlenia w pomieszczeniu. Ustaw próg tła, kierując wiązkę lasera na materiał tła i naciśnij Auto BK Set. Ustawić komorę indukcyjną izofluranu z odpowiednim odfiltrowywaniem gazów odlotowych.

Umieszczenie komory indukcyjnej na podkładce grzewczej pomoże zapobiec utracie temperatury myszy podczas indukcji znieczulenia. Włącz koc homeotermiczny, który jest umieszczony w obszarze skanowania pod nieodblaskową powierzchnią. W tym przypadku tkanina neoprenowa.

Koc homeotermiczny jest ustawiony tak, aby utrzymywać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza. Ustaw sondę temperatury i smary tak, aby były gotowe do włożenia. Umieść również znieczulającą maskę na twarz i system oczyszczania w obszarze skanowania.

Znieczul mysz waporyzatorem izofluranowym. Szybkość tlenu jest ustawiona na jeden litr na minutę przepływu. A izofluran jest dostosowany do 4% do indukcji znieczulenia.

Przepływ jest włączany do komory indukcyjnej znieczulenia, a tempo oddychania myszy zwalnia. Odpowiednie znieczulenie uzyskuje się, gdy mysz traci odruch prostowania. Przenieś mysz do stożka nosowego maski anestezjologicznej z dołączonym pochłaniaczem gazów odlotowych i dostosuj izofluran do 1,5%Ten poziom znieczulenia jest ogólnie wystarczający, aby mysz leżała stosunkowo nieruchomo podczas skanowania, ale nie ma na celu zapewnienia chirurgicznego poziomu znieczulenia.

Tak więc głębokość znieczulenia nie jest sprawdzana. Zmiana poziomu izofluranu powoduje zmiany w częstości akcji serca, oddychaniu i obfitości skórnej. Tak więc spójna wartość procentowa powinna być stosowana przez cały czas trwania eksperymentu i dla wszystkich badanych eksperymentalnych.

Można również zastosować alternatywne techniki znieczulające, takie jak wstrzyknięcie ksylazyny ketaminy IP, ale ta sama technika znieczulenia powinna być stosowana przez cały czas trwania badania, ponieważ różne środki znieczulające w różny sposób wpływają na obfitość skóry. Jeśli obszar zainteresowania planem, który ma zostać zeskanowany, jest pokryty sierścią, użyj małego elektrycznego trymera i/lub kremu do depilacji, aby usunąć włosy z obszaru zainteresowania. Kremy do depilacji należy całkowicie usunąć, a skórę myszy wysuszyć przed skanowaniem, ponieważ mokra skóra może powodować odbicia od lasera Włóż nasmarowaną sondę temperatury doodbytnicy powiązaną z kocem homeotermicznym do odbytnicy myszy.

Zrównoważ temperaturę myszy do żądanej temperatury skanowania, 37 stopni Celsjusza. Może to potrwać od pięciu do 10 minut. Wybierz opcję Scanner Setup (Ustawienia skanera), do której można uzyskać dostęp z górnego menu lub z ikony Scanner Setup (Ustawienia skanera).

Obszar skanowania należy dostosować, zmieniając współrzędne X, Y, aby dostosować się do obszaru zainteresowania. Szybkość skanowania zależy od rozdzielczości skanowania. Wyższa rozdzielczość spowoduje wydłużenie czasu skanowania.

W przypadku wielokrotnego skanowania, skupiającego się na globalnej obfitości, w przeciwieństwie do wyższej rozdzielczości skupiającej się na perfuzji anatomicznej, wystarczająca jest najwyższa prędkość skanowania wynosząca cztery milisekundy na piksel. Jeśli wykonujesz powtórne skanowanie, wybierz kartę Repeat and Line Scan (Powtarzanie i skanowanie liniowe). Liczbę skanów można zmienić.

W tym przypadku trzy skany, a także interwał powtarzania. Minimalny czas interwału powtarzania to szacowany czas skanowania pokazany w wyszarzonym obszarze po prawej stronie pola, określony przez obszar skanowania i rozdzielczość skanowania. Dodanie kilku sekund pozwala użytkownikowi na wstrzymanie i potencjalną zmianę położenia myszy w razie potrzeby między skanowaniami.

Całkowity czas skanowania w tym przypadku wynosi trzy minuty i 21 sekund. Wybierz kartę Skanowanie obrazu i wybierz przycisk Oznacz. Spowoduje to, że laser obrysuje obszar skanowania.

Dostosuj pozycję myszy tak, aby skanowany cel znajdował się w zaznaczonym obszarze. Rozpocznij powtarzanie pomiaru, wybierając ikonę Powtórz skanowanie i naciskając przycisk Odtwórz, aby rozpocząć skanowanie. Pojawi się wyskakujące okienko potwierdzające odległość skanowania.

Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć skanowanie. Początkowy skan myszy przed indukcją niedokrwienia kończyn tylnych jest wyświetlany w czasie rzeczywistym. Drugie i trzecie powtórzenie skanowania jest przyspieszane do 16-krotnej prędkości.

W oknie głównym wyświetlane są wyniki skanowania w takiej postaci, w jakiej są one generowane przez oprogramowanie. Wstawka w prawym dolnym rogu pokazuje laserowe skanowanie podnóżków myszy. W przypadku skanowania opuszki stopy lub podnóżka i grzbietu łydki, pozycja na brzuchu z tylnymi kończynami wyciągniętymi w kierunku ogona zapewnia bardziej spójny obszar zainteresowania w pozycji leżącej.

Tętnica udowa, tętnica odpiszczelowa i boczne znajdują się bardzo blisko brzusznej powierzchni uda i łydki. Dlatego preferowane jest ułożenie na plecach w przypadku korzystania z tych obszarów zainteresowania. Monitoruj mysz podczas skanowania pod kątem ruchu myszy.

Jeśli mysz poruszy się na tyle, że podnóżki nie znajdują się już w obszarze skanowania w trakcie skanowania, uruchom ponownie skanowanie. W oprogramowaniu analitycznym można uwzględnić niewielkie różnice w położeniu podnóżka myszy. Monitoruj również temperaturę myszy podczas procesu skanowania, ponieważ może się ona wahać nawet przy użyciu koca homeotermicznego.

Jeśli temperatura myszy jest zbyt duża, może to spowodować znaczne różnice między skanami. Ogólnie rzecz biorąc, zakres temperatur od 36,8 do 37,2 spowoduje uzyskanie akceptowalnych danych. Zapisz przechwycony skan w oknie Zapisz jako z nazwą pliku, która zawiera identyfikator myszy i punkt czasowy, aby ułatwić analizę danych.

W razie potrzeby wprowadź szczegóły myszy i punktu czasowego w oknie Szczegóły tematu. Skanowanie brzusznych kończyn tylnych z myszą w pozycji leżącej jest pokazane tutaj po dostosowaniu obszaru skanowania. Zauważ, że propozycja z leżeniem na plecach myszy powoduje skanowanie zmiennej części boku stopy.

Wyjmij sondę temperatury doodbytniczej i zdezynfekuj ją 70% etanolem, aby była gotowa na następną mysz. Zmniejsz izofluran do 0%Mysz szybciej się zregeneruje, jeśli nadal będzie otrzymywać tlen, ale można go również odzyskać bez dodatkowego tlenu. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu do punktu, w którym wykazuje odruch prostowania, przewracając się z pozycji leżącej do pozycji leżącej przed powrotem do klatki.

Rekonwalescencja może być przeprowadzona albo na kocu rozgrzewającym w przypadku izofluranu, ponieważ rekonwalescencja jest bardzo szybka, albo w ciepłej klatce regeneracyjnej dla ketaminy ksylazyny. Otwórz program do przeglądania obrazowania. Otworzy się nowe okno do przeglądania skanów.

Przejdź do menu Plik, otwórz i zlokalizuj zapisany plik. Wybierz ikonę ROI na pasku narzędzi. Wybierz ikonę Dodaj wielokąt.

Śledź obszar wokół obszaru zainteresowania za pomocą myszy. Po zakończeniu wróć do paska narzędzi i wybierz ikonę Statystyki. Spowoduje to wyświetlenie okna pokazującego statystyki z interesującego Cię regionu.

Po przejrzeniu danych wartości średniej jednostki profuzji (PU) nie różnią się o więcej niż 100 do 150 PU w powtarzających się skanach dla każdej poduszki stopy. Jest to akceptowalny skan i wskazuje, że mysz była dobrze zrównoważona podczas skanowania. Średnie wartości PU z odchyleniem większym niż 100 do 150 PU, co odpowiada więcej niż 10% średniej perfuzji dla nieobsługiwanej podkładki myszy w porównaniu z powtarzanymi skanami, wskazywałyby, że mysz nie była dobrze zrównoważona i zdecydowanie zaleca się powtórzenie skanowania.

Wykonanie szybkiej analizy natychmiast po zakończeniu skanowania pozwala na powtórzenie skanowania, gdy mysz jest nadal znieczulona, i pozwala uniknąć utraty punktu danych, co może wystąpić, jeśli skany zostaną przeanalizowane w późniejszym terminie, a skanowanie zostanie uznane za niedopuszczalne ze względu na znaczne różnice między powtarzanymi skanami. Wyniki są wyrażone jako stosunek chirurgicznej obfitości kończyn tylnych do kontrolnej perfuzji kończyn tylnych, ponieważ myszy początkowo rozszerzają naczynia krwionośne, a następnie rozwijają swoje wewnętrzne zabezpieczenia, przywrócenie przepływu krwi przez LDPI powinno być widoczne w czasie pooperacyjnym. Stopień rekonwalescencji zależy od szczepu myszy i nasilenia modelu niedokrwienia kończyn tylnych.

Rysunek ten przedstawia zakończony eksperyment w czasie trwający 28 dni, w którym LDPI użyto do pomiaru odzyskiwania przepływu krwi w opuszkach stóp w czasie po podwiązaniu tętnicy udowej i myszach z nokautem P27 i dzikim typie C57Bl / 6. Oba nokauty P27 u myszy typu dzikiego miały upośledzone odzyskiwanie przepływu krwi po leczeniu doustną doksycykliną, uogólnionym inhibitorem metaloproteinaz macierzy, co sugeruje, że aktywność MMP ułatwia arteriogenezę. Ustawienie wzmocnienia i próg tła powinny być utrzymywane na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu.

Jeśli próg tła jest ustawiony zbyt nisko, skanowanie materiału tła spowoduje niskie wartości obfitości. Spowoduje to, że wartości profuzji tła zostaną uśrednione do obszaru zainteresowania podczas wyboru wielokąta. Aby wyeliminować ten problem, próg tła można dostosować w oknie Ustawienia skanera na karcie Ogólne.

W takim przypadku zwiększenie progu tła do 118 jednostek obfitości powoduje powstanie szarego tła, które nie zostanie uwzględnione w żadnej analizie. Paletę lub skalę kolorów obrazu strumienia można dostosować zarówno w oprogramowaniu pomiarowym, jak i w oprogramowaniu do przeglądania obrazu. Wszystkie wartości profuzji większe niż maksymalna wartość na skali będą wyświetlane jako kolor o najwyższej obfitości.

W tym przypadku czerwony. Zwiększenie zakresu dynamicznego, na przykład zmiana skali na zakres od zera do 1500, sprawi, że zmienność powtarzanych skanów będzie bardziej widoczna dla oka, ponieważ obszary mierzące od 1000 do 1500 jednostek obfitości będą teraz wyświetlane przy użyciu gradientu kolorów, a nie wszystkie będą wyświetlane na czerwono. Pokazany tutaj skan został uzyskany u myszy, której temperatura ciała była początkowo niższa niż 36,8 na początku powtarzanego skanowania, a następnie wzrastała w trakcie powtarzanych skanów.

Należy zauważyć, że średnia obfitość poduszki kontrolnej była bardziej zależna od niższej temperatury ciała niż niedokrwiennej poduszki stopy. Pojedynczy skan chłodniejszej temperatury ciała skutkowałby zarejestrowaniem wyższego współczynnika obfitości dla tego punktu danych. Różnice w pigmentacji skóry myszy, takie jak obserwowane u myszy C57Bl/6, mogą spowodować, że obszar skanowania będzie poniżej wartości progowej tła, co utrudni analizę obszarów zainteresowania zawierających obszary pigmentowe.

Poduszki stóp myszy na ogół nie mają przebarwień, co czyni go najwygodniejszym obszarem do skanowania w poszukiwaniu tego szczepu myszy. Jeśli badacz chce zbadać brzuszną kończynę tylną, należy wybrać odmianę myszy białej. LDPI jest skuteczną, łatwą do wykonania i powtarzalną metodą pomiaru obfitości skórnej kończyn tylnych jako odzwierciedlenie ogólnej perfuzji tętnic.

W przypadku korzystania z LDPI w celu uzyskania wiarygodnych danych wymagana jest spójna technika.