Wytwarzanie platform magnetycznych do organizacji połączonych neuronów w skali mikronowej

Nasze podejście umożliwia kontrolowanie tworzenia sieci neuronowych za pomocą manipulacji magnetycznych. Jest to skuteczne narzędzie do badań in vitro sieci i oferuje nowatorski kierunek terapeutyczny dla urządzeń do biointerfejsów. Dzięki tej technice możemy kontrolować zarówno lokalizację, jak i wzrost komórki w skali mikronów, co pozwala na elastyczne projektowanie wzoru magnetycznego, a tym samym organizacji sieci.

Kluczowe znaczenie ma wydajna i nietoksyczna sterylizacja nanocząstek magnetycznych. Aby odnieść sukces, potrzebne są odpowiednie nanocząstki magnetyczne. Ważnymi cechami są rozmiar, powłoka i wartość namagnesowania sytuacji.

Procedury zademonstrują Reut Plen i Dafna Levenberg, mistrzynie mojego laboratorium. Na początek pokrój szkiełka szklane na kawałki o wymiarach dwa na dwa centymetry za pomocą pisaka. Szkiełka szklane należy oczyścić w acetonie, a następnie izopropanolu przez pięć minut w kąpieli ultradźwiękowej.

Następnie wysusz je azotem o ultra wysokiej czystości. Pokryj szkło fotorezystem za pomocą powłoki wirowej z prędkością 6 000 obr./min przez 60 sekund, aby uzyskać grubość 1,5 mikrometra i piecz w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 60 sekund. Wystaw próbkę na działanie źródła światła za pomocą fotomaski lub litografii bezmaskowej, aby uzyskać pożądany wzór.

Badać próbkę przez 40 sekund w wywoływaczu rozcieńczonym w wodzie destylowanej zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie umyj go w wodzie przez 45 sekund i wysusz azotem UHP. Sprawdź wzór pod mikroskopem optycznym.

Włożyć próbkę do komory blokady obciążenia systemu osadzania i poczekać na ciśnienie podstawowe. Przenieść próbkę do komory głównej i ustawić próbkę na odpowiedniej wysokości do osadzenia. Zwiększaj moc na każdym celu, aż do osiągnięcia żądanej szybkości.

Włącz obrót, a następnie umieść ferromagnetyczną warstwę wielowarstwową, na przemian z kobaltem, żelazem i palladem, otwierając i zamykając odpowiednio żaluzje celu. Umieść 14 dwuwarstw palladu kobaltowo-żelazowego i wykończ dodatkową warstwą wierzchnią z palladu. Po zakończeniu osadzania należy wyładować próbkę z systemu osadzania.

Zanurzyć próbkę w acetonie na 30 minut i przepłukać ją izopropanolem. Następnie wysuszyć go azotem UHP i zbadać pod mikroskopem. Przechowuj go w czystym i suchym miejscu do czasu użycia.

Użyj szkiełka podstawowego z prętem magnetycznym w kształcie krzyża o szerokości 100 mikrometrów osadzonym za pomocą wielowarstwowych ferromagnetyków. Przymocuj próbkę do uchwytu za pomocą taśmy dwustronnej. Użyj łącznika drutowego, aby przymocować cztery druty do próbki, po jednym na każdej nodze elektrody krzyżowej.

Ustawić uchwyt próbki i próbkę wewnątrz transportowego układu pomiarowego za pomocą pola magnetycznego tak, aby pole magnetyczne było prostopadłe do próbki. Wykonaj pomiary napięcia poprzecznego zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Przemiataj pole magnetyczne i zmierz napięcie poprzeczne w funkcji pola.

Wykreśl rezystancję poprzeczną jako funkcję pola magnetycznego, aby określić anomalny sygnał Halla, który jest proporcjonalny do prostopadłego namagnesowania w folii. Przygotować podstawową pożywkę wzrostową i pożywkę różnicującą do hodowli komórek PC12 zgodnie z opisem w manuskrypcie. Hoduj komórki w niepoddanej działaniu substancji kolbie hodowlanej z 10 mililitrami podstawowej pożywki wzrostowej, dodając 10 mililitrów pożywki do kolby co dwa do trzech dni.

Subkultura komórek po ośmiu dniach. W celu wypobrania komórkowego należy odwirować zawiesinę komórkową przez osiem minut w temperaturze 200 G i temperaturze pokojowej, a następnie wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w trzech mililitrach świeżej podstawowej pożywki wzrostowej.

Ponownie odwirować komórki przez pięć minut, następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w trzech mililitrach świeżej pożywki różnicującej. Odessać komórki 10 razy za pomocą strzykawki i igły, aby rozbić skupiska komórek, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru i zasiać milion komórek w zwykłym, niepowlekanym naczyniu o średnicy 35 milimetrów. Dodać obliczoną objętość zawiesiny MNP i pożywki różnicującej do naczynia, aby uzyskać pożądane stężenie MNP.

Wymieszaj komórki, MNP i pożywkę różnicującą, a następnie inkubuj naczynie w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Oczyść wzorzyste podłoże 70% etanolem i umieść je w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym w okapie. Umieść duży magnes pod wzorzystym podłożem na jedną minutę, a następnie usuń go, przesuwając naczynie w górę i od siebie, a następnie wyjmując magnes z okapu.

Włącz światło ultrafioletowe na 15 minut. Aby przygotować szklane podłoże pokryte kolagenem, rozcieńczyć kolagen typu 1 w stosunku jeden do 50 w 30% etanolu. Przykryj szklankę roztworem.

Pozostaw naczynie bez przykrycia w okapie na cztery godziny, aż cały roztwór wyparuje, a następnie umyj je trzy razy w sterylnym PBS. Wyjąć komórki z inkubatora, odwirować zawiesinę komórek przez pięć minut w temperaturze 200 G i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżej pożywki różnicującej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.

Wysiewaj od 10 do pięciu komórek na wierzchu podłoża w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym i dodaj dwa mililitry pożywki różnicującej. Inkubuj kulturę w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach dodaj do komórek od jednego do 100 świeżych mysich beta-NGF.

Odnowić pożywkę różnicującą i dodawać świeży beta-NGF co dwa dni. Obrazuj komórki co dwa dni za pomocą mikroskopii świetlnej i wykonuj barwienie immunologiczne komórek po utworzeniu sieci. Wyprodukowano platformy magnetyczne o różnych kształtach geometrycznych, a fluorescencyjne MNP tlenku żelaza zsyntetyzowano przez zarodkowanie.

Pomiary magnetometryczne MNP pokazują, że krzywa namagnesowania nie miała histerezy, niskie pole nasycenia i stosunkowo wysokie nasycenie namagnesowaniem. Komórki PC12 inkubowano w pożywce zmieszanej z fluorescencyjnymi MNP tlenku żelaza, przekształcając je w jednostki magnetyczne. MNP zostały zinternalizowane do somy komórek, ale nie do jąder.

Stężenie żelaza wewnątrz komórek wzrastało wraz ze wzrostem stężenia MNP w pożywce. Żywotność komórek PC12 obciążonych MNP dla różnych stężeń MNP oceniono, porównując parametry morfologiczne komórek obciążonych MNP za pomocą analizy Shoal, nie wykazując różnicy w stosunku do komórek kontrolnych. Testy oparte na XTT i resazurynie potwierdziły, że oceniane stężenia MNP nie wykazały istotnej cytotoksyczności w stosunku do komórek.

Komórki PC12 z obróbką MNP i bez niej hodowano i różnicowano na podłożu magnetycznym. Stwierdzono, że namagnesowane komórki przyczepiają się do wzorców magnetycznych i rozwijają gałęzie zgodnie z wzorami, podczas gdy komórki bez leczenia MNP rosły bez powinowactwa do urządzeń magnetycznych. Rozmieszczenie komórek na podłożu o geometrii sześciokątnej pokazano tutaj.

75% ciał komórek załadowanych MNP miało kontakt z paskami magnetycznymi, podczas gdy tylko 35% nienamagnesowanych ogniw znajdowało się na paskach. Oprócz efektu pozycjonowania komórek, odkryto, że te platformy magnetyczne kontrolują kierunkowość rosnących neurytów. Aby ocenić wpływ magnetyczny na kierunkowość wzrostu neuronów, zmierzono kąt między neurytami a paskami magnetycznymi, wykazując istotną korelację z orientacją pasków magnetycznych.

Procedura ta jest łatwo przystosowana do kierowania związków aktywnych, takich jak leki, po sprzężeniu ich z nanocząstkami magnetycznymi. Można to przełożyć na wysokoprzepustowe testy przesiewowe leków lub leczenie miejscowe w tkankach. To nowatorskie podejście otwiera nowe możliwości funkcjonalizacji innych podłoży lub urządzeń poprzez dodawanie magnetycznych struktur przyciągających.

Obecnie pracujemy nad ulepszonymi biokompatybilnymi interfejsami chipów neuronowych.