Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Używamy tego protokołu do tworzenia nerwowych komórek progenitorowych z fibroblastów skóry pacjenta i badania chorób neurologicznych i neurodegeneracyjnych. Uważamy, że ten protokół ma wiele zalet w porównaniu z klasyczną technologią IPS, w tym szybkość, ale także w niektórych przypadkach uzyskanie cięższego fenotypu choroby. Badamy choroby neurologiczne i neurodegeneracyjne, a wykorzystanie próbek skóry pozwala nam naprawdę ocenić różnorodność pacjentów.

Moje laboratorium jest szczególnie zainteresowane rolą astrocytów w chorobach i używamy astrocytów, które wytwarzamy z NPC, do testowania leków, a także do badania mechanizmów chorobowych, ale także w kokulturach z neuronami ludzkimi i myszymi. Mamy nadzieję, że ten protokół będzie pouczający i prosimy o kontakt, jeśli masz jakiekolwiek pytania. Dziękuję.

Używaj pierwotnych fibroblastów ludzkiej skóry, które można uzyskać z banków komórek lub biopsji skóry. Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych 5% CO2. Komórki pasażowe przez co najmniej jeden do dwóch pasaży po rozmrożeniu przed użyciem w eksperymencie.

Gdy komórki będą gotowe, pokryj studzienkę sześciodołkową ludzką fibronektyną o stężeniu 1:200 rozcieńczoną w PBS w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut. Przygotuj pożywkę fibroblastyczną, jak pokazano w tabeli pierwszej. Gdy komórki są gotowe do powlekania, wyjmij fibronektynę z naczynia i natychmiast dodaj roztwór komórkowy lub dwa mililitry pożywki fibroblastów.

Nie pozwól, aby naczynie wyschło przed dodaniem podłoża. W zależności od tego, jak szybko rosną komórki, umieść 150 000 do 200 000 fibroblastów w dwóch dołkach ludzkiej sześciodołkowej płytki pokrytej fibronektyną. Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych 5% CO2.

Dzień po wysiewie sprawdź fibroblasty pod mikroskopem i sprawdź, czy gęstość komórek wynosi od 70 do 85% Przeprowadź jedną studnię ze wszystkimi czterema wektorami retrowirusowymi: Oct3/4, Klf4, Sox2 i c-Myc. Użyj wielokrotności infekcji 10 dla szybko rosnących lub 15 dla wolno rosnących fibroblastów. Wydajność transdukcji musi przekraczać 70% lub więcej dodatnich komórek dla każdego wektora.

Dodaj zwykłą pożywkę fibroblastową do mieszanki wirusowej, aby uzyskać całkowitą objętość jednego promila na studzienkę. Pozostawić drugi studzienkę nieleczoną i wrzucić komórki z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowej w celu inkubacji przez noc. Dzień po transdukcji przemyj komórki jeden raz PBS i dodaj jeden milion świeżej pożywki fibroblastów.

Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych 5% CO2. Następnego dnia przygotuj pożywkę konwersyjną, jak pokazano w tabeli pierwszej i umyj komórki jeden raz PBS, aby pozbyć się pozostałej pożywki fibroblastów, a następnie dodaj jeden mil pożywki konwersyjnej. Zmień również pożywki dobrze leczone na pożywki konwersyjne.

Obserwuj komórki pod mikroskopem i obserwuj zmiany w morfologii. Pożywki komórkowe powinny być wymieniane codziennie przez cały proces konwersji na jeden do dwóch mil pożywki konwersyjnej oraz do późniejszej hodowli iNPC. Zmień pożywkę, ostrożnie usuwając 70% pożywki ze studzienki, upewniając się, że komórki pozostają pokryte pozostałymi 30% pożywki.

Kontynuuj obserwację komórek i codziennie zmieniaj pożywkę za pomocą jednego do dwóch mil pożywki konwersyjnej. Po około pięciu do sześciu dniach w pożywce konwersyjnej lub gdy komórki staną się bardzo gęste, przejdź je od jednego do dwóch lub maksymalnie jednego do trzech. Rozgrzej Accutase i pokryj odpowiednią liczbę dołków na płytce sześciodołkowej jednym milionem fibronektyny całkowitej rozcieńczonej w stosunku 1:200 w PBS przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej.

Ostrożnie umyj komórki PBS, nie odrywając żadnych komórek. Użyj ściany studzienki, aby delikatnie nałożyć PBS na komórki. Ostrożnie usunąć PBS za pomocą pipet lub przez zasysanie.

Dodać 500 mikrolitrów Accutase i inkubować dwie do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych. Sprawdź pod mikroskopem, czy większość komórek się odłączyła. Jeśli komórki odpadły, dodaj dwa mililitry świeżej pożywki konwersyjnej i delikatnie pipetuj w górę iw dół dwa do trzech razy, aby zdysocjować grudki.

Zbierz komórki w probówce o grubości 15 mil i dodaj pożywkę o grubości trzech mililitrów, aby jeszcze bardziej rozcieńczyć Accutase. Wirować przez cztery minuty w temperaturze 200 G w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżego podłoża.

Delikatnie pipetuj w górę i w dół dwa do trzech razy, aby usunąć grudki komórek. Usuń fibronektynę z pokrytych sześciu studzienek i natychmiast dodaj jedną świeżą pożywkę do każdej studzienki. Aby uzyskać stosunek podziału 1:2, dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny komórek do jednego dołka, a drugi 500 do drugiego dołka.

Rozprowadź komórki, delikatnie potrząsając sześcioma studzienkami w kierunku północ-południe, wschód-zachód i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni. Następnego dnia obserwuj komórki pod mikroskopem i zmieniaj pożywkę z prędkością od jednego do dwóch mil. Zmieniaj nośniki codziennie, aż komórki będą gotowe do ponownego podziału.

Przygotować pożywkę NPC zawierającą FGF w zwiększonym stężeniu bez EGF lub heparyny, jak pokazano w tabeli pierwszej. W tym nowym podziale zasiej jedną studzienkę komórek w pożywce konwersyjnej, a drugą studzienkę w pożywce NPC. Zmieniaj media iNPC codziennie za pomocą jednego do dwóch milionów mediów NPC.

Przygotuj pożywkę astrocytową zgodnie z tabelą pierwszą. Aby stworzyć astrocyty ze świeżych iNPC, wysiewaj iNPC bezpośrednio w 10 mililitrach pożywki astrocytów na 10-centymetrowych płytkach pokrytych fibronektyną, tak aby następnego dnia osiągnęły około 10% zbieżności. Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych 5% CO2.

Zmień pożywkę za pomocą 10 mililitrów pożywki astrocytowej trzy dni po posiewie. Utrzymuj różnicowanie komórek przez pięć do siedmiu dni. Aby wysiać do eksperymentów, podziel astrocyty za pomocą trypsyny lub Akutazy, jak opisano w krokach od 2 do 2.6.

Zalecane gęstości wysiewu podano w tabeli drugiej. Instrukcje dotyczące dzielenia iNPC w celu wytworzenia indukowanych astrocytów znajdują się w tabeli trzeciej. Aby zrobić astrocyty z zamrożonych zapasów iNPC, wyjmij plik z porcjami ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu i szybko rozmroź w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Jak tylko komórki zostaną rozmrożone, odpipetuj roztwór komórek w probówce o grubości 15 mil zawierającej pięć mililitrów pożywki astrocytowej. Wirować przez cztery minuty w temperaturze pokojowej 200 G. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w jednym mili świeżej pożywce astrocytów.

Dodaj dziewięć mililitrów świeżej pożywki astrocytów do pokrytego fibronektyną 10-centymetrowego naczynia i dodaj jeden roztwór komórek mil, delikatnie rozprowadzając komórki w ruchu północ-południe, wschód-zachód. Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych 5% CO2. Protokół ten pozwala na szybkie i łatwe generowanie iNPC bezpośrednio z fibroblastów ludzkiej skóry przy użyciu retrowirusów zawierających czynniki Yamanaka.

Metoda ta pozwala ominąć stan komórek macierzystych i potrzebę selekcji klonalnej, unikając w ten sposób zmienności klonalnej. Ważnymi krokami, o których należy pamiętać, gdy komórki przechodzą proces konwersji, są gęstość wysiewu fibroblastów, pH pożywki i utrzymywanie komórek w optymalnym zbiegu. Przykłady optymalnej konfluencji i zmian morfologii podczas procesu konwersji można znaleźć na rysunku pierwszym.

Po zakończeniu procesu konwersji NPC będą wykazywać znacznie zmniejszoną ekspresję lub brak ekspresji markerów fibroblastów i morfologii oraz ekspresję markerów komórkowych specyficznych dla NPC. Co więcej, mogą być również wykorzystywane do generowania różnych linii komórkowych, takich jak indukowane neurony, oligodendrocyty i astrocyty. Z naszego doświadczenia wynika, że indukowane astrocyty są szczególnie cenne do testowania leków i mechanizmów chorobowych, ponieważ mogą być generowane w czystych populacjach w powtarzalnych dużych liczbach.

Indukowane astrocyty można odróżnić od iNPC, pobierając niewielką porcję komórek podczas podziału lub wcześniej zamrożoną porcję iNPC i bezpośrednio posiewając je w pożywce astrocytów. Ważnymi kwestiami podczas tego procesu są utrzymanie początkowej gęstości wysiewu iNPC na niskim poziomie, ponieważ wykazano, że wysoka gęstość wysiewu utrudnia proces różnicowania, oraz zwrócenie dodatkowej uwagi na pH pożywki, ponieważ zakwaszenie może aktywować nawet zdrowe astrocyty. Podsumowując, protokół bezpośredniej konwersji jest bardzo szybką metodą, aby móc wytworzyć neuronalne komórki progenitorowe z próbek skóry pacjenta.

Pozwala to na badanie większej liczby próbek komórek w tym samym czasie i rzeczywiste przyjrzenie się różnorodności w kontekście choroby. Uważamy, że jest to bardzo silny test, który można wykorzystać do stworzenia neuronalnych komórek progenitorowych, neuronów, ale także astrocytów, które mogą być następnie wykorzystane w kokulturze lub samodzielnie do testów narkotykowych lub badań mechanistycznych.