Name: Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniej konwersji fibroblastów skórnych na komórki progenitorowe neuronów i astrocyty. Technika ta umożliwia szybkie modelowanie chorób neurologicznych i neurodegeneracyjnych z próbek pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim pacjentom i zdrowym ochotnikom za przekazanie ważnych próbek do badań naukowych. Ponadto dziękujemy Rochelle Rodrigo za ciągłą ekspercką pomoc techniczną w zakresie hodowli tkankowej oraz Laurze Ferraiuolo za niezależne potwierdzenie techniki w jej laboratorium jako współpracownik. Praca ta została sfinansowana z amerykańskich grantów National Institutes of Health R01 NS644912-4 i RC2 NS69476-01 (dla A.L.S.) oraz Packard Center for ALS Research Grant P2ALS i Helping Link Foundation. K.M. otrzymał również finansowanie ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki, a także nagrodę Young Investigator Development Award od Muscular Dystrophy Association, The Rett Syndrome Research Trust i fundacji Families of SCN2A.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>media</td>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość do wymieszania</td>
			<td>Stężenie końcowe (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Podłoża fibroblastów</td>
			<td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, GlutaMAX</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>Rozdział 89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surowica bydlęca płodu</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Nośnik podstawowy</td>
			<td>DMEM/F12 + Glutamax</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>97 Rozdział 97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Media konwersji</td>
			<td>Nośnik bazowy</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>99,9</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Współczynnik FGF</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>0,02 (20 ng/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EFG (EFG</td>)
			<td>1 μL</td>
			<td>0,02 (20 ng/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparyna</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>0,1 (5 μg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Nośniki komórek progenitorowych (NPC)</td>
			<td>DMEM/F12 + Glutamax</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>96,9</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Współczynnik FGF</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>0,002</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Pożywka astrocytowa</td>
			<td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, GlutaMAX</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>Rozdział 89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surowica bydlęca płodu</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>0,2</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Media muszą zostać przefiltrowane po zmieszaniu wszystkich składników. Podłoża konwersyjne (z czynnikami) muszą być przygotowywane świeże co tydzień. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Receptury pożywek dla wszystkich typów komórek zawartych w protokole. Media należy przefiltrować po zmieszaniu wszystkich składników za pomocą sterylnego systemu filtracji próżniowej dla dużych objętości lub filtrów strzykawkowych i strzykawkowych 0,2 μm. Podłoża konwersyjne (z czynnikami) muszą być przygotowywane świeże co tydzień.
1. Bezpośrednia konwersja dorosłych ludzkich fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych
UWAGA: Schematyczny harmonogram tego protokołu można przejrzeć w Meyer (2014)19.
<ol>
	<li>Używaj pierwotnych fibroblastów ludzkiej skóry, które można uzyskać z banków komórek lub biopsji skóry31. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5%CO2. Komórki pasażowe przez co najmniej 1-2 pasaże po rozmrożeniu przed użyciem w eksperymencie. Gdy komórki będą gotowe, pokryj studzienkę 6-dołkowej płytki ludzką fibronektyną (1:200 rozcieńczoną w PBS) w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut.</li>
	<li>Gdy komórki są gotowe do powlekania, wyjmij fibronektynę z naczynia i natychmiast dodaj roztwór komórek lub 2 ml pożywki z fibroblastów (Tabela 1) - nie pozwól, aby naczynie wyschło przed dodaniem pożywki. W zależności od tego, jak szybko rosną komórki, umieść 150 000 (szybko rosnących) - 200 000 (wolno rosnących) fibroblastów w dwóch dołkach ludzkiej płytki 6-dołkowej pokrytej fibronektyną każdy. 
	UWAGA: Komórki powinny być w około 70% zlewające się do transdukcji wirusa, aby móc utrzymać je na tej samej płytce przez kilka kolejnych dni po transdukcji. Korzystne może być wysiewanie nasion o dwóch różnych gęstościach, aby następnego dnia mieć wybór do konwersji.</li>
	<li>Dzień po wysiewie sprawdź fibroblasty pod mikroskopem i sprawdź gęstość komórek (między 70-85%), a równomierny siew w całej studni, aby uzyskać optymalne wyniki.</li>
	<li>Transdukuj jeden dołek ze wszystkimi czterema wektorami retrowirusowymi (Oct3/4, Klf4, Sox2 i c-Myc) - użyj wielokrotności infekcji (MOI) 10 dla szybko rosnących lub 15 dla wolno rosnących fibroblastów (wydajność transdukcji powinna przekraczać 70% lub więcej komórek dodatnich dla każdego wektora). Dodać zwykłą pożywkę fibroblastową do mieszanki wirusowej o łącznej objętości 1 ml na studzienkę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5% CO2 . Pozostawić drugi studzienek nieleczony i wstawić komórki z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych. 
	UWAGA: Wektory retrowirusowe można zakupić u dostawcy lub wyprodukować we własnym zakresie, protokoły są dostępne online32.</li>
	<li>Następnego dnia po transdukcji przemyj komórki 1x PBS i dodaj 1 ml świeżej pożywki fibroblastowej.</li>
	<li>Następnego dnia zmień medium na medium konwersji. Umyj komórki 1x PBS, aby pozbyć się pozostałej pożywki fibroblastowej, a następnie dodaj 1 ml pożywki konwersyjnej. Zmień również pożywki dobrze leczone na pożywki konwersyjne. 
	UWAGA: Niektóre zmiany morfologiczne można zaobserwować nawet poprzez zmianę pożywki na fibroblastach, które nie były leczone wektorem retrowirusowym, dlatego posiadanie nieleczonej studni (opcjonalnie) będzie pomocne przy określaniu efektów wektorów wirusowych. Komórki powinny zacząć zmieniać morfologię 2-4 dni po przełączeniu na pożywkę konwersyjną.</li>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem i obserwuj zmiany w morfologii (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Pożywki komórkowe powinny być wymieniane codziennie przez cały proces konwersji (1-2 ml pożywki konwersyjnej, Tabela 1) oraz do kolejnej hodowli iNPC. Zmień pożywkę, ostrożnie usuwając 70% pożywki ze studzienki, upewniając się, że komórki pozostają pokryte pozostałymi 30% pożywki. 
	UWAGA: Pożywkę z czynnikami wzrostu należy spożyć w ciągu 1 tygodnia od przygotowania.
	<ol>
		<li>Kontynuuj obserwację komórek i codziennie zmieniaj pożywkę (1-2 ml pożywki konwersyjnej).</li>
		<li>Niektóre linie komórkowe zaczynają tworzyć luźne, wypukłe, okrągłe formacje rosnące w kulistych strukturach lub luźnych sferach neuronalnych (Rysunek uzupełniający 1 i 19,33). Uważaj, aby nie odłączyć tych komórek. Jeśli kulki oderwą się, można je zebrać i ponownie posiać w nowej studzience pokrytej fibronektyną na płytce 6-dołkowej. 
		UWAGA: Jeśli zostaną rozprężone samodzielnie, komórki będą miały zmniejszoną różnorodność w porównaniu z początkową płytką i mogą reprezentować wyraźnie inną linię komórkową. Zalecamy połączenie tych komórek z resztą przekonwertowanych komórek w następnej rundzie dzielenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po około 5-6 dniach w pożywce konwersyjnej (do 12 dni w przypadku trudnych linii komórkowych) lub gdy komórki staną się bardzo gęste, należy je przepuścić w stosunku 1:2 lub maksymalnie 1:3, 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby komórki utrzymywały wysoką gęstość przez cały proces konwersji.</li>
</ol>
2. Procedura konwersji i podziału iNPC
<ol>
	<li>Podgrzej roztwór do oddzielania komórek (np. Accutase) i pokryj odpowiednią liczbę studzienek 6-dołkowej fibronektyną (1:200 w PBS, 1 ml objętości powłoki) przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej. Powłoka fibronektyny może być dłuższa bez negatywnego wpływu, ale należy uważać, aby nie skrócić czasu powlekania.</li>
	<li>Ostrożnie umyj komórki PBS, nie odrywając żadnych komórek (użyj ścianki studzienki, aby delikatnie nałożyć PBS na komórki). Ostrożnie usunąć PBS za pomocą pipet lub przez aspirację.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml roztworu do oddzielania komórek i inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych. Sprawdź pod mikroskopem, czy większość komórek się odłączyła. Jeśli wszystkie komórki odpadły, dodaj 2 ml świeżej pożywki konwersyjnej i delikatnie pipetuj w górę i w dół 2-3 razy, aby rozdzielić grudki (jeśli to konieczne).</li>
	<li>Zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml i dodać dodatkowe 3 ml pożywki, aby jeszcze bardziej rozcieńczyć roztwór do oddzielania komórek. Najpierw umyj studzienkę dodatkowym podłożem, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.</li>
	<li>Wirować przez 4 minuty przy 200 x g w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Komórki konwertujące lub iNPC są niezwykle wrażliwe na obecność roztworu oddzielającego komórki w pożywce. Bezwzględnie konieczne jest usunięcie pozostałości enzymu przez odwirowanie i wycofanie supernatantu.</li>
	<li>Usunąć supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki. Delikatnie pipetuj w górę i w dół 2-3 razy, aby usunąć grudki komórek. Usuń fibronektynę z powlekanych 6 dołków i natychmiast dodaj 1 ml świeżej pożywki do każdej studzienki (nie pozwól, aby fibronektyna wyschła). Aby uzyskać proporcję podziału 1:2, dodaj 0,5 ml zawiesiny komórek do jednego dołka, a drugi 0,5 ml do drugiego dołka.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozprowadź komórki, delikatnie potrząsając 6-dołkiem w kierunku północ-południe-wschód-zachód (nie okrężnie) i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Następnego dnia obserwuj komórki pod mikroskopem i zmień pożywkę (1-2 ml). Zmieniaj nośniki codziennie, aż komórki będą gotowe do ponownego podziału. 
	UWAGA: W tym momencie proliferacja komórek powinna zacząć przyspieszać, a komórki powinny być gotowe do drugiego podziału w ciągu 2-3 dni (4 dni w przypadku bardzo wolno rosnących linii).
	<ol>
		<li>Przy tym nowym podziale zasiej jedną studzienkę komórek w pożywce konwersyjnej, a drugą studzienkę w pożywce NPC zawierającej tylko FGF w zwiększonym stężeniu bez EGF / heparyny (Tabela 1). 
		UWAGA: Niektóre linie komórkowe osiągają stan stagnacji w pożywkach konwersyjnych po około 10 dniach, a przejście na pożywki NPC może pomóc we wzroście komórek. Ponadto, NPC mają bardziej specyficzny, mniejszy kształt, gdy są uprawiane w NPC media19. W tym momencie iNPC są gotowe do różnicowania i dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Codziennie zmieniaj pożywki (1-2 ml) iNPC.
	<ol>
		<li>Rozbuduj NPC do 10-centymetrowych naczyń, łącząc dwie lub trzy zlewające się studzienki z 6 dołkami. Objętość podłoża dla naczyń o średnicy 10 cm wynosi zwykle 12-15 ml.</li>
		<li>Przy następnym podziale należy dalej rozszerzać te komórki do trzech lub czterech 10-centymetrowych szalek (12-15 ml pożywki) dla pokoleń dużej liczby zapasów komórek. Szalki o średnicy 10 cm są zwykle dzielone w stosunku 1:3 lub 1:4 co 3-4 dni, w zależności od tempa proliferacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generowanie indukowanych astrocytów z NPC
<ol>
	<li>Aby wytworzyć astrocyty ze świeżych iNPC, należy wysiać iNPC (w 10 cm płytkach pokrytych fibronektyną) bezpośrednio w 10 ml pożywki astrocytowej (Tabela 1), tak aby następnego dnia osiągnęły około 10% zbieżności. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5% CO2 . 
	UWAGA: Zalecana gęstość wysiewu to zwykle 50 μl respiny komórek 10 cm naczynia NPC, pod warunkiem, że są one rozcieńczone do końcowej objętości w oparciu o ich stosunek podziału (np. 3 ml dla podziału 1:3, 4 ml dla podziału 1:4 itp.).</li>
	<li>Zmienić pożywkę (10 ml pożywki astrocytowej) iAs trzy dni po posiewie. Utrzymuj różnicowanie komórek przez 5-7 dni. 
	UWAGA: Nie tolerują dobrze wielokrotnych pasaży, dlatego lepiej jest tworzyć świeże astrocyty za każdym razem, gdy dzielisz NPC.</li>
	<li>Aby wysiać do eksperymentów, podziel astrocyty za pomocą trypsyny lub roztworu do odrywania komórek, jak opisano w krokach 2.1-2.7. Zalecane gęstości wysiewu podano w tabeli 2.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Typ płyty</td>
			<td>Astrocyty na studzienkę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-studniowy</td>
			<td>2500</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>96-dołkowy</td>
			<td>10000</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>24-dołkowy</td>
			<td>40000</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>6-dołkowy</td>
			<td>150000</td> szt.
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Zalecana gęstość wysiewu iAs na powierzchnię płytki. Typowa liczba iAs wysiewanych w celu wytworzenia monowarstwy na najpopularniejszych płytkach do hodowli tkankowych.
4. Przygotowanie i rozmrażanie porcji do odróżniania astrocytów od zamrożonych NPC (alternatywa dla kroku 3)
UWAGA: Jako alternatywa dla utrzymywania iNPC w hodowli, astrocyty mogą być również produkowane bezpośrednio z zamrożonego bulionu. Aby to zrobić, iNPC są zamrażane w mniejszych porcjach. Tabela 3 przedstawia sugerowane objętości zamrażania i rozmrażania porcji, które mają być rozmrożone w 10-centymetrowym naczyniu zawierającym 10 ml pożywki Astrocyte.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wielkość porcji</td>
			<td>Zawiesina komórek (μL)</td>
			<td>Środki do zamrażania (μl)</td>
			<td>Całkowita objętość (μL)</td>
			<td>Rozmraża się do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x</td>
			<td>400</td> szt.
			<td>400</td> szt.
			<td>800</td> szt.
			<td>Dwie 10-centymetrowe szalki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x</td>
			<td>200</td> szt.
			<td>200</td> szt.
			<td>400</td> szt.
			<td>Jedno naczynie 10 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Instrukcje, jak porcjować iNPC w celu wygenerowania iAs. Proporcja zawiesiny iNPC i pożywki do zamrażania w celu wytworzenia porcji. Należy pamiętać, że końcowe stężenie DMSO wynosi 10%, gdy zawiesina komórek jest mieszana z pożywką do zamrażania.
<ol>
	<li>Aby zrobić astrocyty z zamrożonych zapasów iNPC, wyjmij fiolkę z porcjami zapasu ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu i szybko rozmroź w temperaturze 37 °C. Jak tylko komórki zostaną rozmrożone, pipetować roztwór komórek w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki astrocytowej.</li>
	<li>Wirować przez 4 minuty w temperaturze 200 x g i temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml świeżej pożywki dla astrocytów.</li>
	<li>Dodaj 9 ml świeżej pożywki astrocytowej do 10-centymetrowego naczynia pokrytego fibronektyną i dodaj 1 ml roztworu komórkowego. Delikatnie rozprowadzające komórki w ruchu północ-południe-wschód-zachód. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5%CO2</li>.
</ol>

<ol><li>Leenaars, C. H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+to+human+translation%3A+a+systematic+scoping+review+of+reported+concordance+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates.</a> Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223(2019).</li>
<li>Rhrissorrakrai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+limits+of+animal+models+as+predictors+of+human+biology%3A+lessons+learned+from+the+sbv+IMPROVER+Species+Translation+Challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge.</a> Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).</li>
<li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoughts+on+limitations+of+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+%26+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Thoughts on limitations of animal models.</a> Parkinsonism & Related Disorders. 14, Suppl 2 81-83 (2008).</li>
<li>Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveling+Waddington%3A+the+emergence+of+direct+programming+and+the+loss+of+cell+fate+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+to+pluripotency+can+conceal+somatic+cell+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability.</a> PLoS Genetics. 8 (8), 1002913(2012).</li>
<li>Stricker, S. H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+neural+lineage+elaboration%3A+Implications+for+therapeutic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming.</a> Neurobiology of Disease. 148, 105174(2020).</li>
<li>Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+Rather+than+iPSC-Based+Reprogramming+Maintains+Aging+Hallmarks+in+Human+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359(2017).</li>
<li>Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+adult+cells%3A+avoiding+the+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Cloning%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state.</a> Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).</li>
<li>Kim, E., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+and+biomaterials+for+controlling+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Research%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate.</a> Biomaterials Research. 20, 39(2016).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+dermal+fibroblasts+into+neural+progenitor+cells+by+a+novel+cocktail+of+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors.</a> Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).</li>
<li>Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell+reprogramming%2C+differentiation+and+conversion+technologies+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).</li>
<li>Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming+to+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming to neural cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li>
<li>Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+human+fibroblasts+into+hepatocyte-like+cells+by+defined+transcriptional+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+International%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors.</a> Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).</li>
<li>Grath, A., Dai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+reprogramming+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of Biological Engineering. 13, 14(2019).</li>
<li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+patient+fibroblasts+demonstrates+non-cell+autonomous+toxicity+of+astrocytes+to+motor+neurons+in+familial+and+sporadic+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+to+Human+Induced+Neuronal+Progenitors+from+Fibroblasts+of+Familial+and+Sporadic+Parkinson%27s+Disease+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson's Disease Patients.</a> International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).</li>
<li>Meyer, K., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-neuron+interactions+in+neurological+diseases%3A+Testing+non-cell+autonomy+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish.</a> Brain Research. 1656, 27-39 (2017).</li>
<li>Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Biochemical Society Transactions. 42 (5), 1291-1301 (2014).</li>
<li>Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+and+Myelin+in+Neurodegenerative+Diseases%3A+More+Than+Just+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).</li>
<li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes+contribute+to+motor+neuron+death+in+ALS+via+SOD1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).</li>
<li>Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+and+Astrocytes+in+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington's Disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258(2019).</li>
<li>Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+astrocytes+are+abnormal+and+spread+MeCP2+deficiency+through+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).</li>
<li>Hautbergue, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1-dependent+nuclear+export+inhibition+of+C9ORF72+repeat+transcripts+prevents+neurodegeneration+and+associated+motor+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits.</a> Nature Communications. 8, 16063(2017).</li>
<li>Almad, A., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stocked+toolbox+for+understanding+the+role+of+astrocytes+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).</li>
<li>Gatto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+converted+astrocytes+retain+the+ageing+features+of+the+donor+fibroblasts+and+elucidate+the+astrocytic+contribution+to+human+CNS+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease.</a> Aging Cell. , (2020).</li>
<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+functional+astrocytes+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+methods+for+preparation+of+high-titer+retroviral+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9 Unit 9 11(2001).</li>
<li>Boczonadi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+glycyl-tRNA+synthetase+impair+mitochondrial+metabolism+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons.</a> Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).</li>
<li>Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+analysis+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podsumowując, bezpośrednia konwersja jest szybką i łatwą metodą generowania indukowanych neuronalnych komórek progenitorowych z fibroblastów skóry pacjenta. Ta metoda jest korzystna ze względu na jej szybkość, a także dużą liczbę generowanych komórek, które są łatwe w utrzymaniu. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że metody bezpośredniego przeprogramowania usuwają mniej znaczników epigenetycznych w porównaniu z klasyczną technologią przeprogramowania iPSC, pozostawiając w ten sposób środowisko chorobowe bardziej nienaruszone 4,7,8. Różnicowanie iNPC do astrocytów jest bardzo proste i wysoce powtarzalne nawet między wieloma niezależnymi laboratoriami 19,29,33. iNPC mogą być zamrażane w małych porcjach i rozmrażane bezpośrednio w celu różnicowania, co pomaga zmniejszyć różnice między eksperymentami, ponieważ liczby pasaży mogą być podobne. Astrocyty odgrywają kluczową rolę w postępie choroby w wielu chorobach neurologicznych i dlatego są interesującym typem komórek do pracy. Astrocyty mogą być wykorzystywane do badań mechanistycznych, metabolicznych lub testów leków i są zwykle hodowane jako monowarstwy. Co więcej, astrocyty można łączyć w systemach kohodowlanych z neuronami myszy lub ludzi, aby ocenić wpływ astrocytów na przeżycie i morfologię neuronów, które są dobrymi odczytami dla testów narkotykowych34.
Aby z powodzeniem korzystać z tego protokołu, należy pamiętać o kilku punktach i potencjalnych ograniczeniach. Na przykład fibroblasty ludzkiej skóry różnią się znacznie pod względem szybkości podziałów komórkowych, a także odpowiedzi na wektory wirusowe. Ponieważ nie są to ustandaryzowane linie komórkowe, są tak zmienne jak sama ludzkość, każda linia jest inna. Podobnie jak w przypadku wielu metod przeprogramowywania, łatwiej jest przeprogramować fibroblasty, które mają umiarkowane lub szybkie tempo podziału komórek, w porównaniu z komórkami, które ledwo się replikują. Na szybkość replikacji może mieć wpływ jakość biopsji skóry i samo przetwarzanie, liczba pasaży fibroblastów, a także obchodzenie się z nimi. Podczas pracy z pierwotnymi fibroblastami skóry ważne jest, aby nie dopuścić do zbytniego zagęszczenia komórek, aby uniknąć indukcji starzenia. Jeśli fibroblasty nie rosną dobrze, najlepiej jest wypróbować nowy zapas lub dolne pasaże, chociaż w niektórych przypadkach sama choroba może również odgrywać rolę. Podział komórek można czasami poprawić, stosując 15% lub 20% FBS w pożywce fibroblastów w porównaniu ze standardowymi 10%.
Jakość przeprogramowania wektorów wirusowych ma duże znaczenie dla sukcesu. W naszych rękach wektory retrowirusowe były bardziej skuteczne w porównaniu z wektorami lentiwirusowymi lub innymi wirusami nieintegrującymi; Może to jednak zależeć od jakości i czystości wektora wirusowego. Komercyjne zestawy wektorów retrowirusowych zwykle określają stężenie wektora wirusowego, a często także wielokrotność infekcji dla określonej linii komórkowej. Ważne jest, aby pamiętać, że pierwotne fibroblasty różnią się od linii komórkowej używanej przez firmy do określania wychwytu wektora wirusowego. Co więcej, nawet przy zamawianiu tego samego zestawu komercyjnego różnice między partiami są powszechne. Co więcej, wychwyt wektorów wirusowych różni się również między liniami komórkowymi fibroblastów. Niektóre linie mogą być bardziej wrażliwe i dlatego transdukowane komórki mogą umrzeć, podczas gdy inne linie komórkowe mogą być bardziej odporne na wychwyt wirusa. W związku z tym określenie wydajności transdukcji dla danej linii komórkowej może być ważne, zwłaszcza jeśli linia komórkowa rośnie powoli lub poprzednie próby konwersji nie powiodły się. W naszych rękach najlepszym sposobem oceny, ile określonego wektora retrowirusowego jest potrzebne do konwersji, jest wykonanie barwienia immunofluorescencyjnego kilkoma rozcieńczeniami wektora wirusowego. Następnie można policzyć liczbę komórek wykazujących ekspresję transgenu dla każdego wektora, mając na celu uzyskanie wydajności transdukcji na poziomie 70% lub wyższym. Z naszego doświadczenia wynika, że podobne MOI mogą być stosowane dla większości linii komórkowych, jednak MOI można dostosować w razie potrzeby.
Podczas procesu konwersji bardzo ważne jest, aby nie dzielić komórek zbyt wcześnie. Czas, w którym komórki są gotowe do podziału, zależy od wielu czynników, w tym pierwotnej linii komórkowej i jej charakterystyki, jakości użytego wektora wirusowego i jakości pożywki. Co ważne, wskaźnik powodzenia konwersji jest znacznie wyższy, gdy komórki są utrzymywane w dużej gęstości. Nawet jeśli komórki zaczną zmieniać morfologię, lepiej jest pozostawić komórki w pierwszej studni dłużej niż je przedwcześnie podzielić. Jeśli podział nastąpi zbyt wcześnie, konwersja może zatrzymać swój postęp i doprowadzić komórki do różnicowania się z powrotem do kształtu i zachowania przypominającego fibroblasty. Co więcej, ich zbyt wczesne rozcieńczenie może skutkować bardziej wydłużonymi ciałami komórkowymi w porównaniu z obserwowanymi wcześniej małymi i zwartymi ciałami komórkowymi NPC. Dlatego pierwsze podziały powinny być zawsze konserwatywne; Lepiej jest utrzymywać komórki zbyt gęste z podziałem 1:1 lub 1:2 niż je zbyt mocno rozcieńczać. Po początkowym podziale spodziewana jest pewna śmierć komórki. Warto zauważyć, że komórki zawsze wyglądają gorzej (bardziej płasko) pierwszego dnia po rozszczepieniu, co jest normalne. Najlepszą ocenę kształtu komórki należy podjąć 2-3 dni później. Co ważne, kluczowa jest również jakość czynników wzrostu i składników pożywki. Ważne jest, aby przygotować niewielkie ilości pożywki zawierającej czynniki wzrostu, tak aby w pełni przygotowane podłoża były używane maksymalnie przez 5-7 dni. Nie przechowuj mediów w temperaturze pokojowej lub 37°C przez dłuższy czas. Używaj szybko i wstaw do lodówki, gdy tylko zostanie wykonana zmiana nośnika. Ponadto utrzymywanie objętości pożywki na niskim poziomie 1 ml zamiast 2 ml może pomóc, szczególnie w przypadku linii komórkowych, które są bardziej odporne na konwersję. Jeśli komórki szybko zużywają pożywkę, co można zaobserwować po zmianie koloru pożywki z czerwonego na żółty (szybkość zakwaszenia), dostosuj objętość pożywki do 2 ml. Szybka konsumpcja mediów jest pozytywnym znakiem i często obserwuje się ją na późniejszych etapach konwersji wraz ze zwiększoną proliferacją.
NPC są również bardzo wrażliwe na obecność akutazy w pożywce i bardzo ważne jest, aby czas inkubacji akutazy był krótki. Zalecamy okres inkubacji wynoszący 2-4 minuty, często sprawdzaj komórki pod mikroskopem, aby zobaczyć, kiedy się odłączyły. Konieczne jest odwirowanie komórek po rozszczepieniu w celu usunięcia mieszaniny enzymów z pożywki. Ważne jest również, aby pamiętać o liczbie pasaży, ponieważ linie komórkowe mogą się zmieniać po przedłużeniu hodowli, co prowadzi do zmiany profili ekspresji. Dlatego ważne jest, aby zamrozić wiele zasobów komórkowych we wczesnych pasażach. Komórki należy zamrozić w 10% pożywkach DMSO i 90% NPC i przechowywać przez długi czas w ciekłym azocie. Ze względu na brak surowicy w tym pożywce bardzo ważne jest, aby zapewnić powolne zamrażanie za pomocą komór zamrażania, a po zamrożeniu przez noc natychmiast przenieść do ciekłego azotu. Chociaż w tym protokole nie przeprowadza się selekcji klonalnej, możliwe jest, że przedłużona hodowla i pasażowanie prowadzi do naturalnej selekcji początkowej populacji komórek o korzystnym wskaźniku wzrostu i przeżycia. Dlatego ważne jest, aby podczas przeprowadzania eksperymentów pamiętać o numerze przejścia i obsłudze. Do eksperymentów wolimy używać dolnych pasaży, jeśli to możliwe, nie przekraczamy pasażowania linii komórkowych więcej niż 20 razy. Ponieważ NPC szybko się rozwijają, duża liczba zapasów może zostać zamrożona w dolnych przejściach w celu przeprowadzenia eksperymentów. Linie komórkowe o szczególnie wysokich wskaźnikach wzrostu są bardziej narażone na zakwaszenie pożywki. W związku z tym, ponieważ linie komórkowe rosną z różną prędkością, może być konieczne dostosowanie ilości pożywki w zależności od proliferacji. Jeśli komórki są stale pozostawione w silnie zakwaszonym podłożu, może to wpływać na zdrowie zarówno kontrolnych, jak i chorobowych linii komórkowych. Powoduje to, że nawet zdrowe astrocyty stają się reaktywne, co wpływa na ich wykorzystanie w dalszym różnicowaniu i eksperymentach.
Dla różnicowania astrocytów ważne jest, aby utrzymywać komórki o niskiej gęstości, ponieważ wysoka gęstość uniemożliwi różnicowanie się komórek i będą się one rozmnażać w szybszym tempie. W związku z tym gęstość wysiewu należy dostosować do każdej linii komórkowej w zależności od tempa ich proliferacji. Zalecamy wypróbowanie różnych gęstości wysiewu i wykonanie barwień/RT-PCR z markerami astrocytów, aby zapewnić prawidłowe różnicowanie. Jakość IAs można oceniać wraz ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej za pomocą testów współhodowlanych z neuronami. Pod warunkiem, że patologia choroby nie prowadzi do reaktywnego fenotypu, neurony powinny pozostać żywotne w kontakcie z iAs przez kilka dni. Morfologia astrocytów może się znacznie różnić między poszczególnymi liniami komórkowymi i może mieć na nią wpływ fenotyp choroby. Co więcej, w chorobach, w których astrocyty są silnie dotknięte, mogą wykazywać reaktywny fenotyp z dużymi, wydłużonymi przedłużeniami.

Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw chorób jest kluczowe dla chorób neurologicznych, ponieważ pomaga w rozwoju potencjalnych strategii terapeutycznych. Podczas gdy modele zwierzęce były historycznie złotym standardem w badaniach nad chorobami układu nerwowego, bezpośrednie przełożenie potencjalnych terapii na warunki kliniczne często wykazuje ograniczony sukces1,2,3. Przyczynami braku translacji są brak zmienności tła genetycznego i mutacji u myszy, niepełne przedstawienie fenotypów choroby oraz różnice w wrażliwości na leki lub dawkowaniu u ludzi, które nie są dobrze zobrazowane w wsobnych szczepach myszy. Ponadto w przypadku wielu rzadkich zaburzeń neurologicznych nie są dostępne żadne modele zwierzęce lub jest ich niewiele. Badanie mechanizmów chorobowych bezpośrednio w odpowiednich typach komórek ludzkich może ułatwić badania i usprawnić translację do celów klinicznych. W przypadku zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego pierwotne komórki ludzkie są trudne do pobrania i stanowią bardzo ograniczone źródło, ponieważ biopsje są inwazyjne lub można je pobrać dopiero po sekcji zwłok w końcowej fazie choroby. W ciągu ostatnich 15 lat rozwój technologii przeprogramowania komórkowego gwałtownie rozszerzył możliwości modelowania ludzkich chorób neurologicznych i neurodegeneracyjnych in vitro.
Tradycyjne metody przeprogramowania komórek polegają na przeprogramowaniu fibroblastów lub innych typów komórek na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) zdolne do różnicowania się na typy komórek ze wszystkich trzech listków zarodkowych4. Takahashi i Yamanaka jako pierwsi wykazali, że ponowna ekspresja czterech czynników transkrypcyjnych komórek macierzystych jest wystarczająca, aby przekierować komórki somatyczne do iPSCs5. Komórki iPS można następnie dalej różnicować w określone typy komórek. Jednak wadą tego procesu jest to, że generowanie i izolowanie stabilnych klonów komórek macierzystych jest pracochłonne i czasochłonne. Mutacje somatyczne lub specyficzne nieprawidłowości komórki macierzystej są również utrzymywane w klonie komórki macierzystej i mogą mieć wpływ na wyniki badania6. Ponadto coraz więcej dowodów sugeruje, że proces przeprogramowania komórek macierzystych usuwa cenne zmiany epigenetyczne, które mogą wpływać na mechanizmy chorób komórkowych4,7,8. W ostatnich latach naukowcy skupili się na zmodyfikowanych metodach przeprogramowywania, które pozwalają na bardziej bezpośrednie generowanie różnych typów komórek przy jednoczesnym ominięciu stanu pluripotencjalnych komórek macierzystych9,10,11,12 (recenzja w 13,14). Początkowe przełomy ujawniły in vitro kombinatoryczne przeprogramowanie fibroblastów na kardiomiocyty15, neurons16 i hepatocytes17 poprzez ektopową ekspresję wielu czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii lub mikroRNAs18. Następnie przeprowadzono badania bezpośrednio przeprogramowujące komórki w celu modelowania zaburzeń neurologicznych19,20. Jak wspomniano powyżej, takie protokoły bezpośredniego przeprogramowania lub konwersji mają potencjalne zalety w porównaniu z klasycznymi protokołami iPSC, w tym szybkość i ablację etapu izolacji klonalnej. Co więcej, dowody sugerują, że protokoły te pozwalają na utrzymanie większej ilości informacji epigenetycznych związanych z wiekiem pacjenta i prawdopodobnie to samo dotyczy markerów istotnych dla choroby7,8.
Do tej pory, większość badań in vitro nad zaburzeniami neurologicznymi koncentrowała się głównie na neuronach. Jednak dobrze wiadomo, że inne typy komórek, takie jak astrocyty, mikroglej i oligodendrocyty, odgrywają kluczową rolę w patologii choroby i progresji zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Parkinsona (PD), choroba Huntingtona (HD), stwardnienie rozsiane (SM) i inne patologie neurologiczne, takie jak zespół Retta (RTT), zaburzenia snu, uzależnienie, epilepsja, lizosomalne zaburzenia spichrzeniowe, depresja, migrena i patologiczny ból21,22,23,24,25,26. Astrocyty są najliczniejszym typem komórek w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i do niedawna były szeroko zaniedbywane z patologicznego punktu widzenia7. Obecnie wiadomo, że odgrywają one kluczową rolę we wspieraniu prawie wszystkich funkcji homeostatycznych zdrowego OUN. Dodatkowo oczywiste jest, że mają one istotny wpływ patologiczny i są bardzo cenne w zrozumieniu mechanizmu choroby i ocenie strategii terapeutycznych19.
W obecnym opisie szczegółowo opisujemy protokół bezpośredniej konwersji ludzkich fibroblastów pacjenta w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC) za pomocą wektorów retrowirusowych wyrażających czynniki przeprogramowania Yamanaka (Klf4, Oct3/4, Sox2 i c-Myc) oraz późniejszej ekspozycji na media neuralizujące. Poprzednie badania wykorzystywały różne kombinacje czynników transkrypcyjnych do bezpośredniego przeprogramowania komórek nerwowych (recenzowane w 14), ale czynniki użyte w opisanym protokole są szeroko dostępne albo jako plazmidy do własnej produkcji wektorów wirusowych, albo jako komercyjnie dostępne gotowe do użycia zestawy do przeprogramowania wirusów. Powstałe w ten sposób iNPC mogą być dalej różnicowane na indukowane neurony (iNs)27, oligodendrocyty (iOs)24 i astrocyty (iAS)19 w celu zbadania ich roli w chorobach neurologicznych. Nasz protokół nie wymaga czasochłonnego generowania iPSC, które większość dostępnych protokołów wykorzystuje do wyprowadzania ludzkich astrocytów28. Około 98% do 100% bezpośrednio przeprogramowanych iNPC może różnicować się w astrocyty GFAP-dodatnie29 w porównaniu do zaledwie 2% przy użyciu metody bezpośredniej konwersji z fibroblastów do astrocytów30. Niedawne porównawcze badanie transkryptomiczne z wykorzystaniem opisanej przez nas metody przeprogramowania wykazało, że iNPC przeprogramowane z fibroblastów dawcy mogą zachować cechy starzenia na poziomie transkrypcyjnym i funkcjonalnym, podobnie jak astrocyty pośmiertne i astrocyty pierwotne o dopasowanym wieku29. W związku z tym ten protokół konwersji jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów chorobowych i oceny nowych podejść terapeutycznych w zaburzeniach neurodegeneracyjnych i neurologicznych związanych z wiekiem.
Tutaj opisujemy protokół używany do generowania iNPC i dalszego różnicowania na iAs, które są najbardziej odpowiednie do wielkoskalowych testów przesiewowych na małych molekularach. Mechanizmy chorobowe i testowanie leków za pomocą iAs można przeprowadzić przy użyciu różnych metodologii, takich jak współhodowle z neuronami lub analiza metaboliczna i biochemiczna. Zaletą tego systemu jest szybkość i łatwość utrzymania tych linii komórkowych w porównaniu z iPSC. Co więcej, iNPC mogą być zamrażane w małych porcjach w celu rozróżnienia iAs, co ułatwia testowanie narkotyków w stałych warunkach przez dłuższy czas. Ogólnie rzecz biorąc, w ten sposób możliwe staje się porównanie większej liczby próbek, co otwiera drzwi do oceny potencjału terapeutycznego związków w większej i bardziej reprezentatywnej populacji pacjentów.

<table><tbody><tr><td>Naczynie w stylu 100 mm x 2 mm, poddane hodowli komórkowej, niepirogenne</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Hodowla tkankowa</td></tr><tr><td>15 ml stożkowe probówki wirówkowe z zakrętką, kopolimer polipropylen</td><td>USA Scientific</td><td>1475-1611</td><td>Służy do podnoszenia i wirowania komórek</td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1811</td><td>Przygotowanie pożywki</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Antybiotyk o działaniu przeciwgrzybiczym do preparatu pożywki</td></tr><tr><td>B-27&nbsp; Suplement (50X), bez surowicy</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>Dla NPC i pożywek bazowych</td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne&nbsp; 1.2ML</td><td>Corning</td><td>CLS430658-500EA</td><td>Do zamrażania zapasów komórkowych</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAX&nbsp; Suplement, pirogronian</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td>Do pożywki z fibroblastami i astrocytami</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX&nbsp; suplement</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td>Dla NPC i podłoża bazowego</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438-50ML</td><td>Do zamrażania zapasów komórek</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>14190136</td><td>Określany w protokole jako PBS. Do rozcieńczania fibronektyny i mycia komórek</td></tr><tr><td>EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit</td><td>ALSTEM</td><td>RF101</td><td>Retrovirus zawierający czynniki Yamanaka. Wirus może być również wytwarzany we własnym zakresie.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, certyfikowana</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td>Określana w protokole jako FBS . Do pożywek fibroblastów i astrocytów</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterylne strzykawki do jednorazowego użytku</td><td>Fisher</td><td>14-955-461</td><td>Media filtracyjne (50 ml)</td></tr><tr><td>Heparyna sól sodowa z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma</td><td>H3149-10KU</td><td>Określane w protokole jako heparyna. Używany w mediach konwersji. Proszek rozcieńczony w ultraczystej wodzie. Końcowe stężenie zapasów 5000X</td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza Oczyszczone białko</td><td>Millipore Sigma</td><td>FC010-10MG</td><td>Określane w protokole jako Fibronektyna, stosowane w rozcieńczeniu 1:200 do powlekania.</td></tr><tr><td>Izopropanol (klasa techniczna)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372A</td><td>Do zamrażania zapasów komórek</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Fisher</td><td>5100-0001</td><td>Do zamrażania zapasów komórek</td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Dla astrocytów, NPC i pożywek zasadowych</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF Preprotech</td><td></td><td>AF-100-15</td><td>Określany w protokole jako EGF, używany w mediach konwersji. Proszek rozcieńczony w PBS, końcowe stężenie 1 mg / ml, przechowywany w małych zamrożonych podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-basic</td><td>Preprotech</td><td>100-18B</td><td>Określany w protokole jako FGF, stosowany w NPC i pożywkach konwersyjnych. Proszek rozcieńczony w PBS, końcowe stężenie 1 mg / ml, przechowywany w małych zamrożonych podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Określany w protokole jako Accutase. Służy do podnoszenia podczas procesu konwersji i NPC.</td></tr><tr><td>Stericup Quick Release-GP Sterylny system filtracji próżniowej</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU05RE</td><td>Filtracja mediów</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej, 6 dołków, Płaskie dno z pokrywką o niskiej parowaniu</td><td>Fisher</td><td>08-772-1B</td><td>Hodowla tkankowa</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td>Lifting fibroblastów i astrocytów</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe Whatman Puradisc 25, 0,2 i mu; m, PES sterylne</td> Media filtracyjne <td>Millipore Sigma</td><td>80-2502</td><td>(50 ml)</td></tr></tbody></table>

modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Badania nad zaburzeniami neurologicznymi koncentrują się przede wszystkim na wpływie neuronów na mechanizmy chorobowe. Ograniczona dostępność modeli zwierzęcych ma poważny wpływ na badanie wpływu poszczególnych typów komórek na choroby. Co więcej, modele zwierzęce zwykle nie odzwierciedlają zmienności mutacji i przebiegu choroby obserwowanej u ludzi. Metody przeprogramowania wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) zrewolucjonizowały badania specyficzne dla pacjentów i stworzyły cenne narzędzia do badania mechanizmów chorobowych. Jednak technologia iPSC ma wady, takie jak czas, zaangażowanie pracy, selektywność klonalna i utrata markerów epigenetycznych. Niedawne modyfikacje tych metod pozwalają na bardziej bezpośrednie generowanie linii komórkowych lub określonych typów komórek, z pominięciem izolacji klonalnej lub pluripotencjalnego stanu komórek macierzystych. Opracowaliśmy metodę szybkiej bezpośredniej konwersji w celu wygenerowania indukowanych neuronalnych komórek progenitorowych (iNPC) z fibroblastów skóry przy użyciu wektorów retrowirusowych w połączeniu z pożywkami neuralizującymi. INPC można różnicować na neurony (iNs), oligodendrocyty (iO) i astrocyty (iAs). Produkcja iAs ułatwia szybkie testowanie leków i mechanizmów chorobowych, ponieważ odróżnienie od iNPC zajmuje tylko 5 dni. Co więcej, iAs są łatwe w obsłudze i są generowane w czystych populacjach w dużych ilościach. Opracowaliśmy wysoce powtarzalny test współhodowli z wykorzystaniem mysich neuronów GFP+ i iAs pochodzących od pacjenta, aby ocenić potencjalne strategie terapeutyczne dla wielu zaburzeń neurologicznych i neurodegeneracyjnych. Co ważne, testy iA są skalowalne do formatu 384-dołkowego, co ułatwia ocenę wielu małych cząsteczek na jednej płytce. Takie podejście pozwala na jednoczesną ocenę terapeutyczną wielu linii komórkowych pacjentów o zróżnicowanym pochodzeniu genetycznym. Łatwa produkcja i przechowywanie iAs oraz możliwość badania przesiewowego wielu związków w jednym teście sprawiają, że metodologia ta może zostać dostosowana do medycyny spersonalizowanej.

Niniejszy protokół umożliwia szybką i łatwą generację iNPC bezpośrednio z ludzkich fibroblastów skóry z wykorzystaniem retrowirusów zawierających czynniki Yamanaki. Metoda ta pozwala na pominięcie stanu komórek macierzystych oraz konieczności selekcji klonalnej, co pozwala uniknąć zmienności klonalnej. Ważnymi etapami, na które należy zwrócić uwagę podczas procesu konwersji komórek, są gęstość siewu fibroblastów, pH pożywki oraz utrzymywanie komórek przy optymalnym stopniu konfluencji. Przykłady optymalnej konfluencji podczas pasażowania oraz zmiany morfologii w trakcie procesu konwersji przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Wzrost hodowli komórkowej w ciągu 15 dni, DPV, obrazy mikroskopowe, zmiany konfluencji komórek, wskazany dzień pasażowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy procesu konwersji po dodaniu retrowirusowej mieszaniny czynników Yamanaki. Fibroblasty zostały wysiane, a po dwudziestu czterech godzinach poddane transdukcji czynnikami Yamanaka. Dwa dni po infekcji wirusem (DPV) medium zmieniono na medium konwersyjne. Komórki hodowano w medium konwersyjnym aż do momentu przygotowania do pasażowania (13 DPV). Po pasażowaniu komórki wysiano tak, aby następnego dnia (14 DPV) osiągnęły 80% konfluencji. Kolejne pasażowania utrzymywały tę gęstość do czasu, aż komórki progenitorowe neuronów zaczęły się gwałtownie dzielić. Pasek skali wynosi 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Po zakończeniu procesu konwersji NPC wykażą silnie zredukowaną ekspresję lub brak ekspresji markerów i morfologii fibroblastów oraz będą wykazywać ekspresję markerów komórkowych specyficznych dla NPC (Rycina 2). Ponadto mogą one być wykorzystane do generowania różnych linii komórkowych, takich jak iNs, iOs i iAs.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, markery komórek macierzystych DAPI/Vimentin/Nestin, analiza ekspresji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Komórki podlegające procesowi konwersji wykazują ekspresję markerów specyficznych dla danego typu komórek. Fibroblasty pacjenta (A), indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPCs (B) oraz indukowane astrocyty (iAs (C) wysiano na szklane nakrywki w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Komórki poddano immunobarwieniu na: markery specyficzne dla fibroblastów (A), Vimentynę (zielony) i TE7 (czerwony), marker specyficzny dla iNPC (B), Nestynę (czerwony), oraz marker komórek iAs (C), GFAP (fioletowy) i marker iNPC Nestynę (zielony). Pasek skali wynosi 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
W naszym doświadczeniu iAs są szczególnie wartościowe do testowania leków i mechanizmów chorobowych, ponieważ mogą być generowane w czystych populacjach (98% lub więcej komórek GFAP-dodatnich29) w powtarzalnych, dużych ilościach. iAs można różnicować z iNPCs, pobierając niewielką alikwot komórek podczas pasażowania lub korzystając z wcześniej zamrożonej porcji iNPC i wysiewając je bezpośrednio na pożywkę dla astrocytów. Ważnymi kwestiami podczas tego procesu są utrzymanie niskiej początkowej gęstości wysiewu iNPCs (Rysunek 3 i Rysunek 4), ponieważ wykazano, że wysoka gęstość utrudnia proces różnicowania (Rysunek 4), oraz zwrócenie szczególnej uwagi na pH pożywki, gdyż zakwaszenie może aktywować nawet zdrowe astrocyty.
<img alt="Porównanie wzrostu komórek w hodowli; obrazy mikroskopowe w 1. DPS, linia zdrowa i chorobowa w 5. DPS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne obrazy procesu generowania iAs z iNPCs. iNPCs są wysiewane w pożywce dla astrocytów (Tabela 1) przy niskiej gęstości wysiewu. Odpowiednia gęstość wysiewu wynosi około 10% w pierwszym dniu po wysiewie (DPS) (lewo); gęstość tę można jednak dostosować do szybkości wzrostu komórek. Typową morfologię iAs można zaobserwować po 5 DPS (środek). W niektórych przypadkach może wystąpić aberrantna morfologia astrocytów z długimi, kolczastymi wypustkami. Zmiana ta wskazuje na aktywację astrocytów i może wynikać ze stanu chorobowego lub nieprawidłowych technik hodowli (prawo). Pasek skali: 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Immunofluorescencja komórek macierzystych neuronów o niskiej i wysokiej gęstości, markery GFAP/Nestin na obrazach mikroskopowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Gęstość wysiewu iNPC wpływa na wydajność różnicowania iAs. Kontrolne linie iNPC wysiano z niską (A) i wysoką (B) gęstością w pożywce dla astrocytów, aby wykazać wpływ gęstości wysiewu na różnicowanie. W 5 DPS linia o niskiej gęstości wykazywała ekspresję markerów specyficznych dla astrocytów, natomiast linia o wysokiej gęstości wykazywała mieszaninę markerów iNPC i iAs z wyraźną morfologią typu iNPC. Pasek skali wynosi 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1. Dodatkowe ryciny przedstawiające proces konwersji po dodaniu retrowirusowej mieszaniny czynników Yamanaki.Zdjęcia procesu konwersji w 12 DPV (1 dzień przed pasażowaniem) i 19 DPV (6 dni po pasażowaniu). Należy zwrócić uwagę na różnicę w morfologii komórek przed i po pasażowaniu; w 12 DPV komórki wykazują morfologię o strukturze kulistej. Po pasażowaniu i kilku dniach w pożywce do konwersji (tabela 1) komórki zaczynają wykazywać morfologię przypominającą NPC. Pasek skali wynosi 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/Supplemental%201.%20Additional%20Images%20Conversion.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

Używamy tego protokołu do tworzenia nerwowych komórek progenitorowych z fibroblastów skóry pacjenta i badania chorób neurologicznych i neurodegeneracyjnych. Uważamy, że ten protokół ma wiele zalet w porównaniu z klasyczną technologią IPS, w tym szybkość, ale także w niektórych przypadkach uzyskanie cięższego fenotypu choroby. Badamy choroby neurologiczne i neurodegeneracyjne, a wykorzystanie próbek skóry pozwala nam naprawdę ocenić różnorodność pacjentów.Moje laboratorium jest szczególnie zainteresowane rolą astrocytów w chorobach i używamy astrocytów, które wytwarzamy z NPC, do testowania leków, a także do badania mechanizmów chorobowych, ale także w kokulturach z neuronami ludzkimi i myszymi. Mamy nadzieję, że ten protokół będzie pouczający i prosimy o kontakt, jeśli masz jakiekolwiek pytania. Dziękuję.Używaj pierwotnych fibroblastów ludzkiej skóry, które można uzyskać z banków komórek lub biopsji skóry. Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych 5% CO2. Komórki pasażowe przez co najmniej jeden do dwóch pasaży po rozmrożeniu przed użyciem w eksperymencie.Gdy komórki będą gotowe, pokryj studzienkę sześciodołkową ludzką fibronektyną o stężeniu 1:200 rozcieńczoną w PBS w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut. Przygotuj pożywkę fibroblastyczną, jak pokazano w tabeli pierwszej. Gdy komórki są gotowe do powlekania, wyjmij fibronektynę z naczynia i natychmiast dodaj roztwór komórkowy lub dwa mililitry pożywki fibroblastów.Nie pozwól, aby naczynie wyschło przed dodaniem podłoża. W zależności od tego, jak szybko rosną komórki, umieść 150 000 do 200 000 fibroblastów w dwóch dołkach ludzkiej sześciodołkowej płytki pokrytej fibronektyną. Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych 5% CO2.Dzień po wysiewie sprawdź fibroblasty pod mikroskopem i sprawdź, czy gęstość komórek wynosi od 70 do 85% Przeprowadź jedną studnię ze wszystkimi czterema wektorami retrowirusowymi: Oct3/4, Klf4, Sox2 i c-Myc. Użyj wielokrotności infekcji 10 dla szybko rosnących lub 15 dla wolno rosnących fibroblastów. Wydajność transdukcji musi przekraczać 70% lub więcej dodatnich komórek dla każdego wektora.Dodaj zwykłą pożywkę fibroblastową do mieszanki wirusowej, aby uzyskać całkowitą objętość jednego promila na studzienkę. Pozostawić drugi studzienkę nieleczoną i wrzucić komórki z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowej w celu inkubacji przez noc. Dzień po transdukcji przemyj komórki jeden raz PBS i dodaj jeden milion świeżej pożywki fibroblastów.Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych 5% CO2. Następnego dnia przygotuj pożywkę konwersyjną, jak pokazano w tabeli pierwszej i umyj komórki jeden raz PBS, aby pozbyć się pozostałej pożywki fibroblastów, a następnie dodaj jeden mil pożywki konwersyjnej. Zmień również pożywki dobrze leczone na pożywki konwersyjne.Obserwuj komórki pod mikroskopem i obserwuj zmiany w morfologii. Pożywki komórkowe powinny być wymieniane codziennie przez cały proces konwersji na jeden do dwóch mil pożywki konwersyjnej oraz do późniejszej hodowli iNPC. Zmień pożywkę, ostrożnie usuwając 70% pożywki ze studzienki, upewniając się, że komórki pozostają pokryte pozostałymi 30% pożywki.Kontynuuj obserwację komórek i codziennie zmieniaj pożywkę za pomocą jednego do dwóch mil pożywki konwersyjnej. Po około pięciu do sześciu dniach w pożywce konwersyjnej lub gdy komórki staną się bardzo gęste, przejdź je od jednego do dwóch lub maksymalnie jednego do trzech. Rozgrzej Accutase i pokryj odpowiednią liczbę dołków na płytce sześciodołkowej jednym milionem fibronektyny całkowitej rozcieńczonej w stosunku 1:200 w PBS przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie umyj komórki PBS, nie odrywając żadnych komórek. Użyj ściany studzienki, aby delikatnie nałożyć PBS na komórki. Ostrożnie usunąć PBS za pomocą pipet lub przez zasysanie.Dodać 500 mikrolitrów Accutase i inkubować dwie do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych. Sprawdź pod mikroskopem, czy większość komórek się odłączyła. Jeśli komórki odpadły, dodaj dwa mililitry świeżej pożywki konwersyjnej i delikatnie pipetuj w górę iw dół dwa do trzech razy, aby zdysocjować grudki.Zbierz komórki w probówce o grubości 15 mil i dodaj pożywkę o grubości trzech mililitrów, aby jeszcze bardziej rozcieńczyć Accutase. Wirować przez cztery minuty w temperaturze 200 G w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżego podłoża.Delikatnie pipetuj w górę i w dół dwa do trzech razy, aby usunąć grudki komórek. Usuń fibronektynę z pokrytych sześciu studzienek i natychmiast dodaj jedną świeżą pożywkę do każdej studzienki. Aby uzyskać stosunek podziału 1:2, dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny komórek do jednego dołka, a drugi 500 do drugiego dołka.Rozprowadź komórki, delikatnie potrząsając sześcioma studzienkami w kierunku północ-południe, wschód-zachód i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni. Następnego dnia obserwuj komórki pod mikroskopem i zmieniaj pożywkę z prędkością od jednego do dwóch mil. Zmieniaj nośniki codziennie, aż komórki będą gotowe do ponownego podziału.Przygotować pożywkę NPC zawierającą FGF w zwiększonym stężeniu bez EGF lub heparyny, jak pokazano w tabeli pierwszej. W tym nowym podziale zasiej jedną studzienkę komórek w pożywce konwersyjnej, a drugą studzienkę w pożywce NPC. Zmieniaj media iNPC codziennie za pomocą jednego do dwóch milionów mediów NPC.Przygotuj pożywkę astrocytową zgodnie z tabelą pierwszą. Aby stworzyć astrocyty ze świeżych iNPC, wysiewaj iNPC bezpośrednio w 10 mililitrach pożywki astrocytów na 10-centymetrowych płytkach pokrytych fibronektyną, tak aby następnego dnia osiągnęły około 10% zbieżności. Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych 5% CO2.Zmień pożywkę za pomocą 10 mililitrów pożywki astrocytowej trzy dni po posiewie. Utrzymuj różnicowanie komórek przez pięć do siedmiu dni. Aby wysiać do eksperymentów, podziel astrocyty za pomocą trypsyny lub Akutazy, jak opisano w krokach od 2 do 2.6.Zalecane gęstości wysiewu podano w tabeli drugiej. Instrukcje dotyczące dzielenia iNPC w celu wytworzenia indukowanych astrocytów znajdują się w tabeli trzeciej. Aby zrobić astrocyty z zamrożonych zapasów iNPC, wyjmij plik z porcjami ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu i szybko rozmroź w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Jak tylko komórki zostaną rozmrożone, odpipetuj roztwór komórek w probówce o grubości 15 mil zawierającej pięć mililitrów pożywki astrocytowej. Wirować przez cztery minuty w temperaturze pokojowej 200 G. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w jednym mili świeżej pożywce astrocytów.Dodaj dziewięć mililitrów świeżej pożywki astrocytów do pokrytego fibronektyną 10-centymetrowego naczynia i dodaj jeden roztwór komórek mil, delikatnie rozprowadzając komórki w ruchu północ-południe, wschód-zachód. Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych 5% CO2. Protokół ten pozwala na szybkie i łatwe generowanie iNPC bezpośrednio z fibroblastów ludzkiej skóry przy użyciu retrowirusów zawierających czynniki Yamanaka.Metoda ta pozwala ominąć stan komórek macierzystych i potrzebę selekcji klonalnej, unikając w ten sposób zmienności klonalnej. Ważnymi krokami, o których należy pamiętać, gdy komórki przechodzą proces konwersji, są gęstość wysiewu fibroblastów, pH pożywki i utrzymywanie komórek w optymalnym zbiegu. Przykłady optymalnej konfluencji i zmian morfologii podczas procesu konwersji można znaleźć na rysunku pierwszym.Po zakończeniu procesu konwersji NPC będą wykazywać znacznie zmniejszoną ekspresję lub brak ekspresji markerów fibroblastów i morfologii oraz ekspresję markerów komórkowych specyficznych dla NPC. Co więcej, mogą być również wykorzystywane do generowania różnych linii komórkowych, takich jak indukowane neurony, oligodendrocyty i astrocyty. Z naszego doświadczenia wynika, że indukowane astrocyty są szczególnie cenne do testowania leków i mechanizmów chorobowych, ponieważ mogą być generowane w czystych populacjach w powtarzalnych dużych liczbach.Indukowane astrocyty można odróżnić od iNPC, pobierając niewielką porcję komórek podczas podziału lub wcześniej zamrożoną porcję iNPC i bezpośrednio posiewając je w pożywce astrocytów. Ważnymi kwestiami podczas tego procesu są utrzymanie początkowej gęstości wysiewu iNPC na niskim poziomie, ponieważ wykazano, że wysoka gęstość wysiewu utrudnia proces różnicowania, oraz zwrócenie dodatkowej uwagi na pH pożywki, ponieważ zakwaszenie może aktywować nawet zdrowe astrocyty. Podsumowując, protokół bezpośredniej konwersji jest bardzo szybką metodą, aby móc wytworzyć neuronalne komórki progenitorowe z próbek skóry pacjenta.Pozwala to na badanie większej liczby próbek komórek w tym samym czasie i rzeczywiste przyjrzenie się różnorodności w kontekście choroby. Uważamy, że jest to bardzo silny test, który można wykorzystać do stworzenia neuronalnych komórek progenitorowych, neuronów, ale także astrocytów, które mogą być następnie wykorzystane w kokulturze lub samodzielnie do testów narkotykowych lub badań mechanistycznych.

in-vitro-modeling-for-neurological-diseases-using-direct-conversion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje proces różnicowania indukowanych komórek progenitorowych neuronów (iNPC) w neurony i astrocyty za pomocą specjalistycznych pożywek.

Różnicowanie indukowanych nerwowych komórek progenitorowych w astrocyty

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Tutaj przedstawiamy metodę biodruku 3D mysich astrocytów korowych do biofabrykacji tkanek podobnych do neuronów w celu zbadania funkcjonalności astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym i mechanizmów obejmujących komórki glejowe w chorobach neurologicznych i leczeniu.

Biodrukowanie 3D mysich astrocytów korowych do inżynierii tkanki neuronalnej

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania wysoce wzbogaconych kultur astrocytów pochodzących z różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy po urodzeniu i ich bezpośredniej konwersji w funkcjonalne neurony przez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Izolacja i bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy

Poznaj metodę bezpośredniej konwersji fibroblastów skórnych na komórki progenitorowe neuronów i astrocyty. Technika ta umożliwia szybkie modelowanie chorób neurologicznych i neurodegeneracyjnych z próbek pacjentów.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty (Wideo) | JoVE Journal

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Przeglądaj więcej filmów